DK148262B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 1n-(alfa-hydroxy-omega-aminoalkanoyl)-6'n-methyl-3',4'-dideoxykanamycin b - Google Patents

Description

1Λ8262

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendt 1N-(a-hydroxy-ui-aminoalkanoyl)-6'N-methyl-SVA'-dideoxykanamycin B eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

05 Kanamycin B er en kendt antibiotisk forbindelse beskrevet i IVierck Index, 8. udgave, side 597-598. Kanamycin B har formlen 6' HO-^ fa"1»» 10 \\I5L_o

AyA, nh2 I 4 nh2 is 0 \xk__? VH As ! H0 ~ir\A_5jl_ / “2 2o H2N-A—yA^“ / HO \ ' 0

Kanamycin B har fundet vid udbredelse som kemoterapeutisk 25 middel. Inden for de senere år er der imidlertid udviklet mange kanamycin-resistente bakteriestammer. For eksempel har det vist sig, at visse R-faktorbærende stammer af gram-negative bakterier såsom Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa er blevet isoleret fra patienter, som er resistente overfor den antibakterielle virkning 30 af kanamycinerne. Resistensmekanismen af de kanamycin-resistente bakterier overfor de kendte aminoglycoside antibiotika har været studeret af H. Umezawa et al., Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 30, side 183-225, 1974, Academic Press. Det har vist sig, at kanamycin resi stente bakterier produ-35 cerer enzymer, som er i stand til at phosphorylere 3'-hydroxyl- gruppen i kanamycinerne og inaktivere disse via sådanne phospho-transferaser, samt at visse kanamycin-resistente bakterier produ- 148262 2 cerer et enzym, der er i stand til at nucleotidylere 2"-hydroxyl-gruppen i kanamycinerne og herved inaktivere kanamycinerne via en nucleotidyltransferase, og endvidere at visse andre kanamycin-resistente bakterier producerer enzymer, som er i stand til at 05 acylere 6‘-aminogruppen i kanamycinerne og herved inaktivere kanamycinerne via sådanne acetyltransferaser. På denne måde har man undersøgt relationen mellem de aminoglycoside antibioticas molekylstruktur og deres antibakterielle aktivitet samt den biokemiske resistensmekanisme for de kanamycin-resistente bakterier over 10 for de aminoglycoside antibiotica.

Adskillige semisyntetiske derivater af kanamycinerne, som er aktive overfor de kanamycin-resistente bakterier er blevet syntetiseret ud fra basis-kanamycinerne. På denne måde syntetiseres eksempelvis 3‘, 4'-dideoxy kanamycin B (USA Patentskrift nr.

15 3.753.973); 6'N-methy I-3l, 4'-dideoxy kanamycin B (Britisk Patent skrift nr. 1.384.221), 1N-(L-4-amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin A og -kanamycin B (USA Patentskrift nr. 3.781.268) samt 1N-(a-hydroxy-iu-aminoalkanoyO-S'^'-dideoxykanamycin B (tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.350.169). Disse semisyntetiske kanamycin-20 derivater har vist sig at være aktive overfor et stort antal kanamycin-resistente bakterier.

Som baggrund for den foreliggende opfindelse er der udført yderligere forsøgsarbejde med henblik på at tilvejebringe nye og værdifulde derivater af 3',4'-dideoxykanamycin B, som ikke alene er 25 effektive overfor de gram-negative og gram-positive kanamycin- følsomme bakterier men også overfor de kanamycin-resistente bakterier. Det har herved vist sig, at selektiv acylering af 1-amino-gruppen i 6'N-methyI-3',4'-dideoxykanamycin B med en ot-hydroxy-w-aminosyre, udvalgt fra gruppen bestående af isoserin 4-amino-2-30 hydroxy-smørsyre eller 5-amino-2-hydroxyvalerianesyre, enten i racemisk form eller i form af L-isomeren eller i form af D-isomeren giver hidtil ukendte og værdifulde kanamycin B derivater, der i forhold til de ovennævnte kendte forbindelser udviser uventet høj antibakteriei aktivitet overfor såvel gram-negative og gram-positive 35 kanamycin-følsomme bakterier som overfor de kanamycin-resistente bakterier.

De ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede derivater af 148262 3 kanamycin B, som har formlen 6" 4" ?H2°H o 05 H-N,,i H2N_7^\_ 3 ® \ OH 1^/'°\5^CH2NH0H3 v^fc-r° 5' . ioTr-r^«, CHOH 5 Φ*2>η wh2

(O

15 hvori n betegner 1, 2 eller 3 eller er farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, fremstilles ifølge opfindelsen ved, at man selektivt acylerer 1-aminogruppen i et aminobeskyttet derivat af 6'N-methyl-3' ,4‘-dideoxykanamycin B med formlen 20 6" 4" CH-OH λ o, 2* 4» H2N\^^V c vL·^ °^^/οΗ2Ν<·η1 25 0H 5* 6|2 XCH^

HpN ---'J\A/ NH2 1 3. (IV) • 30 hvori R1 er en monovalent aminobeskyttende gruppe, og R2 er et hydrogenatom eller en monovalent aminobeskyttende gruppe, med en a-hydroxy-w-aminosyre med formlen 35 R3

^>N-(CH2)n-CH(0H)-C00H

R4 (V) 148262 4 eller et hermed funktionelt, ækvivalent acyleringsmiddel, hvori R3 er en monovalent aminobeskyttende gruppe, og R4 er et hydrogenatom, eller R3 og R4 danner tilsammen en di-valent aminobeskyttende gruppe, og n er et helt tal pi 1, 2 eller 3, til fremstilling af 05 en 1N-acyleret forbindelse med formlen 6" ή» ho0 10 Η,λ^τ-Λΐ'· Z-" °'AAh2h<'B„ 2 6’ ^ \ ^ \ hn * 15 i 1 3

CO

CHOH 3 i- % (CH2>nNC 4 R (VI) 20 hvori R1, R2, R3, R4 og n har de ovenfor anførte betydninger, hvorefter man fjerner de aminobeskyttende grupper fra den 1N-acy-lerede forbindelse og isolerer den opnåede forbindelse med formlen (I).

25 α-Hydroxy-uj-aminoalkanoyl-gruppen, d.v.s. isoserylgruppen, 4-amino-2-hydroxybutyrylgruppen eller 5-amino-2-hydroxyvaleryl-gruppen, som er tilstede i molekylet i forbindelsen med ovenstående formel (I), kan være på enten DL-form (nemlig den racemiske form), på L-form eller D-form.

30 De foretrukne forbindelser, som fremstilles ifølge opfindelsen er: 1) IN-iDL-isoseryD-B'N-methyl-SS^-dideoxykanamycin B, 2) IN-iL-isoseryO-B'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B, 3) 1N - ( L-4-amino-2-hyd roxybuty ry I) -6' N -methyl -3', 4' - 35 dideoxykanamycin B og

4) IN-iL-S-amino^-hydroxyvaleryO-ø'N-methyl-S'^'-dideoxy-kanamycin B

148262 5 eller et farmaceutisk acceptabelt ikke-toksisk syreadditionssalt deraf.

Eksempler pi de farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af forbindelserne med formel (I) omfatter hydrochloridet, hydrobro-05 midet, sulfatet, phosphatet, nitratet, carbonatet, acetatet, maleatet, fumaratet, succinatet, tartratet, oxalatet, citratet, methansulfo-natet, ethansulfonatet, ascorbatet og tilsvarende salte, som kan være et mono-, di-, tri-, tetra- eller pentasalt dannet ved interaktion af et molekyle af forbindelsen med formlen (I) med 1-5 mol af 10 en ikke-toksisk farmaceutisk acceptabel syre. Den farmaceutisk acceptable syre omfatter for eksempel salt-, hydrogen bromid-, svovl-, phosphor-, salpeter-, carbon-, eddike-, malein-, fumar-, rav-, vin-, oxal-, methansulfon-, ethansulfon- og ascorbinsyre.

De hidtil ukendte forbindelser, som fremstilles ifølge den fore-15 liggende opfindelse har følgende fysiske, kemiske og biologiske egenskaber: 1N-(DL-isoseryl)-64^-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B er et stof af form som et farveløst krystallinsk pulver med et dekompone-20 ringspunkt pi 165-169°C, [d]^4 = +96° (c, 1,175, vand). Elementæranalysen er i overensstemmelse med de teoretiske værdier for C22H44N6O10 (C, 47,81%, H, 8,03%, N, 15,21%). Forbindelsen giver en enkelt plet (positiv overfor ninhydrin-reaktionen) ved en Rf-værdi på 0,51 ved tyndtlagskromatografi på silicagel (tilgængelig 25 under varemærket "ART 5721" fra Merck Co., Tyskland) ved udvikling med n-butanol-ethanol-chloroform-28% vandig ammoniak (4:5:2:8 efter volumen).

1N-(L-isoseryl)-6lN-methyl-3l,4l-dideoxykanamycin B er et stof 30 af form som et farveløst krystallinsk pulver med et dekompone-ringspunkt på 162-166°C, [a]^4 = +80° (c, 1,02, vand). Elementæranalysen er i overensstemmelse med de teoretiske værdier for c22H44Ne°io (C, 47,81%, H, 8,03%, N, 15,21%). Forbindelsen giver en enkelt plet (positiv overfor ninhydrin-reaktionen) ved en Rf-35 værdi pi 0,51 ved ovennævnte tyndtlagskromatografi pi silicagel.

148262 6 1N-(L-4-amino-2-hydroxybutyryl)-6lN-methyl-3l/4l-dideoxy-kanamycin B er et stof af form som et farveløst krystallinsk pulver med et dekomponeringspunkt pi 158-161°C, [a]^5 = +71° (c, 0,8, vand). Elementæranalysen er i overensstemmelse med de teoretiske 05 værdier for C23H46N6O10 (C, 48,75%, H, 8,18%, N, 14,83%). Forbindelsen giver en enkelt plet (positiv overfor ninhydrin-reak-tionen) ved en Rf-værdi på 0,38 ved ovennævnte tyndtlagskromato-grafi på silicagel.

10 1N-(L-5-amino-2-hydroxyvaleryl)-6lN-methyl-3l,4l-dideoxy- kanamycin B er et stof af form som et farveløst krystallinsk pulver med et dekomponeringspunkt på 152-155°C, [a]^4 = +79° (c, 0,71, vand). Elementæranalysen er i overensstemmelse med de teoretiske værdier for C24H48N6O10 (C, 49,64%, H, 8,33%, N, 14,47%). For-15 bindeisen giver en enkelt plet (positiv overfor ninhydrin-reak- tionen) ved en Rf-værdi på 0,39 ved ovennævnte tyndtlagskromato-grafi på silicagel.

De hidtil ukendte forbindelser med formel (I), som fremstilles 20 ifølge opfindelsen, udmærker sig ved, at de ikke undergår alle de enzymatiske, inaktiverende reaktioner med de ovennævnte enzymer, som inaktiverer kanamycin A og kanamycin B. Således undergår de omhandlede forbindelser ifølge opfindelsen hverken inaktivering ved 6'-acetyltransferasen, fordi 6'-aminogruppen er blevet methyleret, 25 eller inaktivering ved 2"-nucleotidyltransferasen og 3'-phospho-transferasen, fordi 1-aminogruppen er blevet acyleret med cf-hydroxy-iu-aminoacylgruppen, ligesom de heller ikke undergår en aktivering ved den anden type 3'-phosphotransferase, fordi 3'- og 4‘-hydroxylgrupperne, der er tilstede i kanamycin B, er blevet 30 fjernet. De omhandlede hidtil ukendte forbindelser er således bemærkelsesværdigt fordelagtige ved, at de udviser høj antibakteriel aktivitet ikke blot overfor forskellige typer af gram-negative og gram-positive bakterier, der er følsomme overfor kanamycinerne, men også overfor de kanamycin-resistente stammer af disse bak-35 terier, især de kanamycin-resistente stammer af Escherichia coll og Pseudomonas aeruginosa.

De minimale inhiberende koncentrationer (pg/ml) af 1N-(DL- 148262 7 isoseryl)-6,N-methyl-3'i4,-dideoxykanamycin B (forkortet som DL-IS-MDKB), 1N-(L-isoseryl)-6'N-methyl-3,/4,-dideoxykanamycin B (forkoret som L-IS-MDKB), 1N-(L-4-amino-3-hydroxybutyryl)-6'N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B (forkortet som AHB-MDKB) og 05 1N-(L-5-amino-2-hydroxyvaleryl)-6,N-methyl-3,/4,'-dideoxykanamycin B (forkortet som AHV-MDBK) overfor forskellige organismer bestemtes i overensstemmelse med serie-fortyndingsmetoden under anvendelse af næringsagarmedium ved 37°C og iagttagelse efter 18 timers inkubering. Til sammenligningsformil bestemtes på samme måde som 10 ovenfor anført de minimale inhiberende koncentrationer (pg/ml) af 1N-(L-4-amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin A (forkortet som AHB-KMA) og 1N-(L-4-amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin B (forkortet som AHB-KIVIB), der kendes fra USA Patentskrift nr.

3.781.268.

15 De antibakterielle spektre for de betragtede forbindelser er vist ί tabel 1 nedenfor.

148262 8 < 2 tc οα)0(000003030(ΠΟ(ΟΦβ«Ι®(£) I NMNrWNtVII>f'Wrrl/)01h>l'l,)in frt r· OOOOOOOOOOOCOCOr-OOOOi— "j| < V V ν' ν' V ν' \ 0) 5 * <U ip c S o (D o oootflinoocomroooooooooco

5 i ojcncMLnojc\jrvjinojrvt-<-r-rvrvrvrvr Ί-> C oOOCVJOOOr-COOMCOOOOOOOM

(D -1- j— £ < V V V V ν' c 0) C $

O

Q

0) S ocoocoooocooooooooinooiococooo

T3 1 CVII^-C\Jr-CMC\JCVlT— t— CMt— ¢- CVJr-LDLDrvr-§ ^ OOOCOOOOCOCOOOOOOtOOOr-T-OOO

gj < v V v v \/ xi Έ

c CD — ^ a> Q

(D 2 OOOCOOOOCDOOOTCOCOOOOTCOOOOOCD P I NWNrNMNinNMrLnrnNNNli) .= (/)

*" C — OOOCOOOOr-OOCOr-COOOOOr-_ — I

aj 2 —i v v v v v v

XI

ro

*“ CD

*

D

2 ,n ocooinooocococnincr>co<oco{0<flco

52 OjrvCMCvJPJCMOJr-T-OOCVJr-T-Lnr-tninr-OOOtOOOOOOOOOCOCOOOr-OQi-r-CQ Q V V V V V

I".

S oo

CL ® S

g g u ® 8 :1 00 j!or S .

<2 8 S ° < g 5 <° | Q ro i rv oo II r- j- —

U.H æC0Or«rre ® UN

s§ss υ's r " r ! , r » « ω p <u g noi^ooJQ’n1'··^ 5 X .2 .2 3 2 5 — zc £ !_ 52 ro oo ϊ »“"^ϊΙΙ^ΙεΙϊιΙϊΐΙΙ I § § 8 i f § 1 11 € i s ! * s ? & - c 88S2(D(n tflUro3Ot,-w^^>roro o x:x:x:.= =: = = =:b-2rororooo<u<nt/i ft α α a u - ·- ·- — >> g οι σι ο» ε £ +e ό xi to mmmt.LiUUUi.v.— __o<UQ) <d ™™™njrorororoo>x:x:x:roroi- — — h inwcnwcacflCQCflU2iowcO(/ii/)Q.5X^ U8262 9 < 2 ooo5oicocoMifloj»o)OfflnnM in 1 i^· eo t^-r^-r^Lnr^oofO<\iunv— c\i m ή

-F Ο Ο Ο Ο Ο O i— OOOOr-OOOOOOOCO

J- o £ < ~ s U) a *

s- Q

<u 5?

c ^ OOOOCOCOIOCOCOCOOTOTOOCDOO LO

o 1 ^1^10^1010101^00001^100- cm to ·— ^ ·«· *>.

*± i- oor-Oi-t-T-ooooT-oomtnciiLn

jo >5 CM r- CM

L. ^ +J ^

C

a) c 5 o *:

Q

a) 2 cDcocococoiococoaooocoooooooinin

n 1 l/)NinifiNininNr'NNi-rrWW

«— (YJ SSSV.k.V*.S*»'s**‘»^l,»s‘*

55 X r-Oo-r-Or-r-OOOOOOCOOOCOlOlO

s- <r ™

-Q

Έ C 03 — X.

a> Ω (D S (flfflll)Ifl(DtfltD(Offlai03(Drt in 5 * lor'inininininior'-cor'-inr- cm •—if) » C — τ-Or-i-r-r-r-i-OOOv-COiniOinin

.-1 CM CM CM

2 -i

CO

Q

2 Λ iDioniDtooonncoooeMrti/i X ininr-Lnr-r-T-r-r~i^.tni-r-CMinin *1 r-'r^OOr-COOOOOOQOOr-OOrOlOCUCUin

“Γ t— r- CM

Q

Γ ΟΟ a ~ __ Iri

05 O O O ui TT

CM 00 ti— . I £2 (D (O t oo O — Z m r· r r 1- ID (1) r^<f7T|— Om in w id ^^.^.1—1^05 C£2222„__ 5 η m « » »i ooo \ooooo

1ftlWNWWCM®®®hlD C C C C C

X r- r- r- r- r- r- CM CM CM Γ'- CO ·- ·— ·— ·— — — i i i i i i <<<uJq;0)OIO)OIO) ^ ZiCiCiCiCiCillJJJioPP??? m , ~~~ = — — — — — <u Φ ω a) a> V) φ oooooooooooora(orait,<0 t £ uuuuuuuuuuuuwwwww <2 .- 2 ^ .2 .2 .2 2 .2 .2 .2 .2 .2 c c c c c c x:!EZ!c!c!cx!c!c!cx!cooooo 2. υ u u y υ y u .y ,y ,y ,y .y £ Ξ £ £ £ u ‘iu T " Έ T T Έ 'l. ‘l. Έ ’s_ ο ο ο ο o

— o <Da>a>a)<D(u<Da>a)(D(D<uOOOOTJ

2 4-> χχχχχχχχχχχχ 3 D 3 =3 □ Ω W OUUOUUUUUUUU(DQ)Q)Q)Q> m Φ ωΐΛΐΛΐηιηιηιηΐΛίΛσιιηιηΐΛΐηΐΛΐΛΐΛ I- I- LULUI_ULUlULUlULUUJUJLULUQ.Q-a.CLa.

148262 10

Endvidere foretoges en bestemmelse af følsomheden overfor gentamicin-resistente stammer for følgende forbindelser: 1) IN-iL-^amino^-hydroxybutyryO-S'N-methyl-S'^'-dideoxy-kanamycin B (forkortet som 1-AHB-6'N-methyl-DKB),

05 2) IN-CL-^amino-Z-hydroxybutyryl-S'/^-dideoxykanamycin B

(forkortet som 1-AHB-DKB; DEB2 2.350.169) og 3) S'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B (forkortet som 6'N-methyl-DKB; UK 1.384.221).

Af resultaterne, der er sammenfattet i tabel 2 fremgår det, at 10 1-AHB-6‘N-methyl-DKB har kraftigere aktivitet end de to sammenligningsforbindelser overfor de resistente bakterier.

11 14826 2 o

r- CO r- ID

ΛΙΙ <- σι C O I h- T— O 5— 00 ”3" (Ί r \ in I r- σ> 3.

, Λ I r- CQ r- LO r CO 1/1 CM W CD Is r £ CM I c- .2 οι in

P CM r- in N r in (O <t in h-OO^J· c- CO

C r" r- τ— τ- 0) u

o tn 5? CM

“ - l'-'io o^o CO CD CO CO CO CO ·4 r CO r- CM r— r- S.

(U

£ co £ r" m in r- 't CO tn M CM 00 CM v— 5— +j co c— in Q> a cd 4-* i/o rc^CDCM CM Oh- CO CM CM 4— * r CM CM I- 3 — co .JS r-cm c o

_ < VII h ω r- r- ID LO

ω

jQ

03

I- CQ CQ 00 00 CO

^ x x ^

Q Q Q Q Q

-L J|_ j_ j_ j_ £:oa£co£m$aD£co

£ Ω £ Ω SCI εο S _ O

i 03 i i qQ i i CO i ICO· i CQ i S z *: > Z * >, Z * >, ?*>- ? * > ·= tb O J= i Q £ co O .c co O -C coQx: ti 1 i ti ''ti ''ti ''ti I ' ti .2 cq DQ ® cq in 2 oa 00 2 a no 2 co oa 2 5 x x F x x f x x F x x r χ x f r ^ ^ Z < < 2 < < 2 < <t 2 < < 2 9 1 1 - Ilf- II- II- i I -

v- r~ CD r~ r*“ CO ’T" c” CO r™ ^ CO r“ T“ CO

Ι Ο - s 03 C 4-> Jg

c ™ co CO CO CD CD

< in "-Γ CM 5— r- O .2

03 _ Ο O

+± J5 03 c

St; 7 ω J3 in Φ .2 2 .2 +j p 3 -a w c in to s- <u 'r in g -¾ s. p 0 0 ω β — <D C s. s- Q£ </) cn LU CL 0- 148262 12

De omhandlede ukendte forbindelser har lav toksicitet overfor dyr og mennesker, eftersom de udviser LD50-værdier på mere end 100 mg/kg ved intravenøs injektion af forbindelserne i mus.

De omhandlede forbindelser kan administreres oralt, 05 intraperitonealt, intravenøst, subkutant eller intramuskulært under anvendelse af en hvilken som helst til sådan administrering kendt farmaceutisk form og på tilsvarende måde som kanamyciner. For eksempel kan forbindelserne nied formel (I) administreres oralt under anvendelse af en hvilken som helst til oral administrering 10 kendt farmaceutisk form. Eksempler på farmaceutiske former til oral administrering er pulvere, kapsler, tabletter, sirup og lignende. En egnet dosis af forbindelsen til effektiv behandling af bakterielle injektioner ligger i området 0,25 til 2 g pr. person pr. dag ved oral indgivelse. Det foretrækkes, at denne dosis administreres oralt 15 i 3 til 4 portioner dagligt. Forbindelserne kan også administreres ved intramuskulær injektion ved en dosis pi 50 til 500 mg pr. dosis 2 til 4 gange dagligt. Endvidere kan forbindelserne formuleres i en salve til ekstern applikation, hvor salven indeholder forbindelsen i en koncentration pi 0,5 til 5 vægtprocent i blanding med et kendt 20 salvegrundlag såsom polyethylenglycol.

I princippet kunne de hidtil ukendte forbindelser med formel (I) tænkes fremstillet ud fra en kendt forbindelse S'N-methyl-S'^'-dide-oxykanamycin B med formlen 25 6"

25 lf" CH_0H

Η2Ν-Λ-2" \ H2N^7-- 30 Μ\Γ i > Λ~·° 5 35 (II) ved selektiv acylering af 1-aminogruppen af 6'N-methyl-3^- 148262 13 dideoxykanamycin B med en α-hydroxy-m-aminosyre med formlen H2N-(CH2)n-CH(OH)-COOH (III) 05 hvori n er et helt tal på 1, 2 eller 3, på i og for sig kendt måde fra acyleringen af en aminogruppe i syntesen af peptider. 6'N-methyl--3'^'-dideoxykanamycin B med formlen (II) indeholder fire frie primære aminogrupper (1-, 3-, 2'- og 3"-aminogrupper) og en sekundær methylaminogruppe i 6'-stillingen. Til fremstilling af 10 forbindelserne med formel (I) er det nødvendigt, at 1-aminogruppen i 6'N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B acyleres selektivt med ot-hy-droxy-tu-am?nosyre med formel (III) uden at der sker acylering af de øvrige 3 aminogrupper og af 6'-methylaminogruppen. De nye forbindelser med formel (I) opnås i bedste udbytte, når or-hydroxy-15 -to-aminosyre-udgangsforbindelse med formel (III) omsættes med et aminobeskyttet derivat af forbindelse (II), hvori 6'-methylaminogruppen og de frie aminogrupper (d.v.s. 3-, 2‘- og 3"-aminogrupperne) bortset fra 1-aminogruppen er blevet blokeret med en kendt aminobe-skyttende gruppe, således at kun 1-aminogruppen forbliver fri.

20 Fremstillingen af det aminobeskyttede derivat er vanskelig men mulig, og et antal reaktionstrin kræves til fremstillingen. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes imidlertid som udgangsmateriale et aminobeskyttet derivat af forbindelse (II), hvori kun 6'-methylaminogruppen og eventuelt 2'-aminogruppen er blevet 25 blokeret ved hjælp af den aminobeskyttende gruppe, mens de øvrige aminogrupper bibeholdes i den frie tilstand. Fremstilling af den sidstnævnte type mono- og diaminobeskyttet derivat af forbindelse (II) er forholdsvis enklere som følge af, at 6'-methylamino- og 2'-aminogrupperne er mere reaktionsdygtige end de øvrige amino-30 grupper i forbindelse (II) og således kan blokeres præferencemæssigt ved hjælp af den aminobeskyttende gruppe, mens de øvrige aminogrupper bibeholdes ublokerede. Da reaktiviteten af 2'-amino-gruppen er en lille smule lavere end af 6'-methylaminogruppen men højere end af 1-, 3- og 3"-aminogrupperne, kan 2'-aminogruppen 35 om ønsket også blokeres.

Når det aminobeskyttede derivat fremstillet ud fra forbindelse (II), hvori 6'-methylaminogruppen og eventuelt 2'-aminogruppen er 148262 14 blevet blokeret, omsættes med a-hydroxy-u>-aminosyren (III), hvori m-aminogruppen fortrinsvis kan være blokeret med en aminobeskyt-tende gruppe, dannes et reaktionsprodukt omfattende hovedsageligt det ønskede 1N-monoacylerede derivat sammen med mindre mængder 05 af de mono- og poly-N-acylerede derivater, hvori én eller flere af aminogrupperrie udover 1-aminogruppen-og undertiden 2'-amino-gruppen er blevet acyleret med ot-hydroxy-iu-aminosyren (III). Acyieringsproduktet, som er resultatet af ovennævnte reaktion, opnås således i virkeligheden i form af en blanding af forskellige 10 N-acylerede derivater inklusive det ønskede 1N-monoacylerede derivat. Det er muligt at isolere det ønskede 1N-mono-acylerede derivat fra de blandede N-acylerede derivater ved at underkaste blandingen en kromatografisk adskillelse. De blandede N-acylerede derivater kan imidlertid behandles direkte til fjernelse af de amino-15 beskyttende grupper derfra. Dette giver en blanding af det ønskede 1N-monoacylerede produkt med formel (I) og de ellers uønskede mono- og poly-N-acylerede biprodukter afledt fra den selektivt aminobeskyttede udgangsforbindelse. Det ønskede produkt (I) kan isoleres fra de uønskede biprodukter ved at underkaste blandingen 20 deraf en kromatografisk adskillelse.

Til fremstilling af forbindelsen med formlen (IV) med den blokerede 6'-methylaminogruppe og den eventuelt blokerede 2'-amino-gruppe, der anvendes som udgangsmateriale ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, behandles forbindelsen med formel (II) med et 25 reagens, der sædvanligt anvendes i den konventionelle syntese af peptider med det formål at indføre en kendt aminobeskyttende gruppe i den anvendte aminosyre. Således kan den aminobeskyttende gruppe, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, være en hvilken som helst blandt de kendte aminopeptider, 30 så længe den let kan fjernes fra det acylerede derivat (VI), som fremstilles i acylermgstrinet for den omhandlede fremgangsmåde.

Når det acylerede derivat med de -blokerede aminogrupper behandles på kendt måde til fjernelse af den aminobeskyttende gruppe, skal de anvendte aminobeskyttende. grupper fjernes let uden ugunstigt at 35 indvirke pi amidbindingen, som er blevet dannet mellem a-hydroxy--tu-aminoalkanoylradikalet og 1-aminogruppen i det acylerede derivat (VI). .

148262 15

Som egnede eksempler på de monovalente aminobeskyttende grupper for R1, R2, R3 og R4 kan nævnes en alkyloxycarbonylgruppe med 2-6 carbonatomer såsom ethoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl og t-amyloxycarbonyl, en cycloalkyloxycarbonylgruppe med 4-7 carbon-05 atomer såsom cyclopentyloxycarbonyl og cyclohexyloxycarbonyl, en aralkyloxycarbonyl-gruppe såsom benzyloxycarbonyl og p-nitrobenzyl-oxycarbonyl, en- aryloxycarbonylgruppe såsom phenoxycarbonyl og furfuryloxycarbonyl og en acylgruppe såsom o-nitrophenoxyacetyl og lignende. Når to af grupperne R3 og R4 tilsammen danner en 10 kendt divalent aminobeskyttende gruppe, kan denne være en phthal-oylgruppe eller en salicylidengruppe og i almindelighed en alkyliden-eller arylidengruppe med formlen =CHR5, hvori Rs er en alkylgruppe med 1-6 carbonatomer såsom methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl eller pentyl eller en arylgruppe såsom phenyl, tolyl, p-methoxyphenyl 15 eller o-hydroxyphenyl.

Kendte monovalente aminobeskyttende grupper såsom en alkyl-oxycarbonyl-, aralkyloxycarbonyl- eller aryloxycarbonylgruppe kan vises ved formlen -CO-OR6, hvori R6 betegner en alkylgruppe med 1-5 carbonatomer såsom methyl, ethyl, t-butyl og t-amyl eller en 20 cycloalkylgruppe med 3-6 carbonatomer såsom cyclopentyl og cyclo-hexyl, en aralkylgruppe såsom phenylalkylgruppen indeholdende al kyl med 1-4 carbonatomer, for eksempel benzyl og p-nitrobenzyl, en arylgruppe såsom phenyl eller en heterocyclisk gruppe såsom furfuryl.

25 Til fremstilling af det aminobeskyttede S'N-methyl-S'^'-dideoxy- kanamycin B derivat (IV) af den type, hvori 6'-methylaminogruppen og of'-aminogruppen er blevet blokeret med en monovalent aminobeskyttende gruppe med formlen -CO-OR6, kan B'-methyl-S'^'-dideoxykana-mycin B (II) omsættes med 2-3 moldele af et chlorformiat med formlen 30 CI-CO-OR6 (VII) eller et p-nitrophenylcarbonat med formlen 35 p-N02-C6H5-0-C0-0R6 (VII1) 148262 16 eller en N-hydroxysuccinimidester med formlen O0 X.N-O-CO-OR6 05 Ό (VII") eller et azidoformiat med formlen N3-CO-OR6 (VII'") 10

eller et S-4/6-dlmethylpyrimid-2-ylthiocarbonat med formlen H3C

15 ff \—S-CO-OR6 HSC N (VII"") hvori R6 har den ovenfor anførte betydning, i et passende opløs-20 ningsmiddel sisom vand, ethanol, acetone, dimethoxyethan eller en blanding deraf under neutrale eller basiske betingelser pi i og for sig kendt mide fra syntesen af peptider. De således opnåede reaktionsprodukter består sædvanligvis af en blanding af forskellige aminobeskyttede derivater af forbindelsen (II), hvori hovedforbin-25 delsen er et aminobeskyttet derivat, hvori 6'-methylaminogruppen og Z'-aminogruppen er blevet fuldstændig blokeret af den beskyttende gruppe -C0-0R6, og en mindre mængde af et aminobeskyttet derivat, hvori kun 6'-methylaminogruppen er blevet blokeret, plus små mængder af uønskede aminobeskyttede derivater, hvori 1-amino-30 gruppen er blevet blokeret sammen med de blokerede aminogrupper.

Såfremt forbindelsen (II) omsættes med det acylerende reagens (VII), (VII1), (VII") eller (Vil111) i praktisk taget ækvimolære mængdeforhold, forøges mængden af det aminobeskyttede derivat, hvori kun 6'-methylaminogruppen er blevet blokeret.

35 De mest foretrukne aminobeskyttende grupper er t-butoxy- carbonylgruppen og benzyloxycarbonylgruppen, da disse er i stand til med præference at reagere med 6'-methylaminogruppen og under 148262 17 tiden med 2'-aminogruppen i G'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B forbindelsen (II) og derefter let kan fjernes fra de acylerede derivater (VI), som fremstilles i acyleringstrinet af den omhandlede fremgangsmåde.

05 For eksempel kan 2lN,6lN-di-t-butoxycarbonyl-6lN-methyl-3,,4l- dideoxykanamycin B, der er et foretrukkent udgangsmateriale for den omhandlede fremgangsmåde, fremstilles i højt udbytte ved, at man omsætter e'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B i opløsning i en blanding af pyridin, vand og triethylamin med 2-3 moldele t-butoxy-10 carbonylazid tilsat dråbevis dertil under omrystning, omrøring af den resulterende blanding ved omgivelsernes temperatur natten over, koncentrering af reaktionsblandingen til tørhed i vakuum og påfølgende rensning af den faste remanens ved søjlekromatografi; eller alternativt ved at man omsætter S'N-methyl-S'^'-dideoxykana-15 mycin B i form af en vandig opløsning deraf med 2-3 moldele t-butyl S-4,6-dimethylpyrimid-2-ylthiocarbonat, der sættes dertil under omrystning, omrøring af den resulterende blanding ved omgivelsernes temperatur natten over, koncentrering af reaktionsblandingen til tørhed i vakuum og påfølgende rensning af den faste 20 remanens ved søjlekromatografi. Rensningen af den faste remanens ved søjle kromatografi kan udføres under anvendelse af en cation-bytterharpiks med carboxyfunktioner, for eksempel en copolymer af methacrylsyre med divinylbenzen, for eksempel produktet der kendes som "Amberlite" CG 50 (ammoniumform; kommercielt til-25 gængelig fra Rohm & Haas, U.S.A.). Den ved ovenstående fremgangsmåde opnåede faste remanens omfatter i det væsentlige den ønskede 2'N,6'N-di-t-butoxycarbonyl-61N-methyl-31,4'-dideoxykana-mycin og S'N-mono-t-butoxycarbonyl-S'N-methyl-S'^'-dideoxykana-mycin B og kan direkte anvendes som råmateriale til acyleringstrinet 30 ved den omhandlede fremgangsmåde.

Med hensyn til a-hydroxy-u)-aminosyre (V), der anvendes som acyleringsmidlet i den omhandlede fremgangsmåde, kan der som aminobeskyttende gruppe R3 anvendes sådanne, der almindeligvis anvendes i den konventionelle syntese af peptider. Det foretrækkes, • 35 at den aminobeskyttende gruppe, som er tilstede i acyleringsmidlet med formlen (V), er den samme, som er tilstede i det som udgangsmateriale anvendte aminobeskyttede S'N-methyl-S'^'-dideoxykanamy- 148262 18 cin B derivat (IV). Fremstillingen af a-hydroxy-ui-aminosyrereak-tanten (V), hvori ω-aminogruppen er blevet blokeret med en monovalent aminobeskyttende gruppe, kan udføres på samme måde som til fremstilling af det aminobeskyttede 6lN-methyl-3,/41-dideoxykanamy-05 cin B derivativ (IV). Når grupperne R3 og R4 tilsammen danner en divalent aminobeskyttende gruppe, kan denne fortrinsvis være en phthaloyl- eller salicylidengruppe og kan i almindelighed være en alkyliden- eller aryiidengruppe med formlen =CHR5, hvori R5 er en alkylgruppe med 1-6 carbonatomer såsom methyl, ethyl, propyl, 10 isopropyl, butyl eller pentyl eller en arylgruppe såsom phenyl, toly!, p-methoxyphenyl eller o-hydroxyphenyl. Fremstilling af α-hydroxy-ui-aminosyrereaktanten (V), hvori ω-aminogruppen er blevet blokeret med en bivalent aminobeskyttende gruppe med formlen =CHR5, kan udføres ved alkylidenering eller arylidenering 15 af ω-aminogruppen ved, at man omsætter a-hydroxy-tu-aminosyre-reaktanten (V) med en i det væsentlige ækvimolær mængde af et aldehyd med formlen OHC-R5 (VIII) 20 hvori R5 har den ovenfor anførte betydning, på i og for sig kendt måde til fremstilling af Schiff-baser. Egnede aldehyder til dette formål omfatter acetaldehyd, anisaldehyd, tolualdehyd, p-nitrobenz-aldehyd og salicylaldehyd.

25 ot-Hydroxy-tu-aminosyren (V), som anvendes til den omhandlede fremgangsmåde, kan enten være i form af en racemisk blanding eller i en optisk aktiv form, L-isomeren eller D-isomeren. Det foretrækkes imidlertid, at ot-hydroxy-y-aminosmørsyre, som er en forbindelse med formlen (III), hvori n er 2, og or-hydroxy-6-aminovaleriane-30 syre, som er en forbindelse med formel (III), hvori n er 3, anvendes i form af den optisk aktive L-isomer, eftersom det deraf afledte slutprodukt udviser en højere antibakteriel aktivitet end slutproduktet, som afledes af D-isomeren.

I acyleringstrinet er fremgangsmåden ifølge den foreliggende 35 opfindelse den, at det aminobeskyttede S'N-methyl-S'^'-dideoxy-kanamycin B derivat (IV) omsættes med a-hydroxy-w-aminosyre-reaktant (V) på i og for sig kendt måde fra den konventionelle 148262 19 fremstilling af amider. Således kan udgangsforbindelsen (IV) omsættes med acyleringsreagens (V) i opløsning i vandfri dimethyl-formamid, acetone eller tetrahydrofuran under isafkøling og i nærværelse af et dehydratiserende middel såsom dicyclohexylcarbodi-05 imid. Naturligvis kan a-hydroxy-ui-aminosyrereaktant (V) også anvendes i form af et funktionelt ækvivalent, reaktionsdygtigt derivat deraf såsom syrechloridet, det blandede syreanhydrid, de aktive estere eller azidderivatet deraf. For eksempel kan a-hydroxy--ω-aminosyrereaktanten (V) først omsættes med N-hydroxysucciimid 10 i nærværelse af dicyclohexylcarbodiimid som det dehydratiserende middel til fremstilling af dens aktive ester med formlen /--?0 /R3

< N-OOC-CH(OH)-(CH2)nN

15 ^R4 (V) som igen omsættes med udgangsforbindelsen (IV) til N-acylering af sidstnævnte forbindelse. Det foretrækkes, at udgangsforbindelsen (IV) omsættes i et 0,5 til 3 molforhold og fortrinsvis i et 0,5 til 1,5 20 molforhold af den aktive esterform af a-hydroxy-aminosyreforbin-delse (V) i et reaktionsmedium bestående af vand og et organisk opløsningsmiddel såsom dimethoxyethan.

I acyleringstrinet af den omhandlede fremgangsmåde fremstilles sædvanligvis en blanding af N-acylerede derivater af udgangsforbind-25 elsen (IV). Blandingen består i almindelighed af det ønskede IN-mono-acylerede derivat og andre uønskede mono-N-acylerede derivater og uønskede poly-N-acylerede derivater. Den således fremstillede blanding kan dernæst behandles direkte til fjernelse af eventuelle aminobeskyttende grupper derfra, d.v.s. til omdannelse af de 30 resterende aminobeskyttende grupper til hydrogenatomer.

Fjernelsen af de aminobeskyttende grupper fra de ovennævnte blandede N-acylerede derivater, der fremstilles ved acyleringstrinet ifølge den omhandlede fremgangsmåde, kan udføres på følgende i og for sig kendte måder. Når således den aminobeskyttende gruppe er 35 en alkyloxycarbonylgruppe såsom t-butoxycarbonyl, en cycloalkyl- 148262 20 -oxycarbonylgruppe, en aryloxycarbonylgruppe, en alkyliden- eller arylidengruppe, kan fjernelsen af denne type aminobeskyttende gruppe foretages ved at underkaste de blandede N-acylerede derivater en mild hydrolysebehandling med en syre såsom vandig tri-05 fluoreddikesyre, vandig eddikesyre og fortyndet saltsyre. Når de aminobeskyttende grupper er en aralkyloxycarbonylgruppe såsom benzyloxycarbonyl kan fjernelsen af denne type aminobeskyttende gruppe udføres ved at underkaste de blandede N-acylerede derivater en hydrogenolysebehandling i nærværelse af en palladium-10 carbon eller platinsort katalysator eller en behandling med hydro-genbromid i eddikesyre ved lav temperatur. o-Nitrophenoxyacetyl kan som aminobeskyttende gruppe fjernes ved en reducerende behandling. Når den aminobeskyttende gruppe er phthaloylgruppen, kan fjernelsen af denne foretages ved behandling af de blandede 15 N-acylerede derivater med hydrazinhydrat i ethanol. Når de N-acylerede derivater indeholder forskellige typer aminobeskyttende grupper, kan de N-acylerede derivater underkastes samtidige eller successive behandlinger til fjernelse af de forskellige aminobeskyttende grupper derfra.

20 Fjernelsen af de resterende aminobeskyttende grupper giver en blanding af de forskelligt N-acylerede produkter afledt af B'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B. Blandingen består af det ønskede slutprodukt, 1N-(oi-hydroxy^-aminoalkanoyl)-6'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B, dets positions isomerer og de poly-N-25 acylerede produkter sammen med noget uomsat O'N-methyl-S',^-dideoxykanamycin B. Isolering af det ønskede slutprodukt med formel (I) kan effektivt foretages ved at underkaste den nævnte blanding søjlekromatografi under anvendelse af, for eksempel, silicagel eller en cationbytterharpisk med carboxylfunktioner såsom 30 "Amberlite" IRC 50 eller “Amberlite" CG 50 (Rohm & Haas, Co., U.S.A.), en svag cationbytter såsom CM-"SephadexM C-25 (Pharmacia Co., Sverige) eller CM-cellulose. Eluatet fra denne kromatografiske proces opsamles i fraktioner, og den antibakterielle aktivitet af disse fraktioner påvises ved anvendelse af følsomme og resi-35 stente bakterier som test mikroorganismer. Ved påvisning af den antibakterielle aktivitet af hver fraktion er det forholdsvis simpelt at bestemme de aktive fraktioner, som indeholder den ønskede 148262 21 forbindelse med formlen (I). En del af disse aktive fraktioner underkastedes tyndtlagskromatografi med silicagel under anvendelse af for eksempel et opløsningsmiddelsystem af butanol-ethanol -chloroform-17% vandig ammoniak. Det var på denne måde muligt at 05 bestemme de fraktioner, som giver en enkelt plet ved den specifikke Rf-værdi af den ønskede IN-Coi-hydroxy-ui-amino-alkanoyO-e'N-methyl-S'^'dideoxykanamycin B med formel (I), og den indeholder således kun det ønskede produkt (I). Sådanne fraktioner kan forenes og koncentreres til tørhed under reduceret tryk til ind-10 vinding af den ønskede forbindelse (I).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1 15 Syntese af 1N-(L-4-amino-2-hydroxybutyrvl)-6lN-methyt-3l,4>- dideoxykanamycin B (en forbindelse med formlen (I), hvori n er 2) a) Til en opløsning af 930 mg (2 mmol) 6'N-methyl-3^41-dideoxy-kanamycin B i 5 ml vand sattes en opløsning af 960 mg (4 mmol) 20 t-butyl S-4,6-dimethylpyrimid-2-ylthiocarbonat i 5 ml dioxan. Blandingen omrørtes natten over ved omgivelsernes temperatur for at bevirke t-butoxycarbonyleringen. Dernæst koncentreredes reaktionsblandingen til tørhed under reduceret tryk til dannelse af en fast remanens. Dette faste stof opsamledes i 40 ml vand, og det 25 uopløselige stof frafiltreredes. Opløsningen (filtratet) ledtes gennem en kolonne (20 x 290 mm) af 100 ml cationbytterharpiks "Amberlite" CG 50 (NH4-form) for at bevirke adsorption af t-butoxycarbonyle-ringsprodukterne ved hjælp af harpiksen. Harpikskolonnen vaskedes med vand (500 ml) og elueredes dernæst med 0,1N vandig 30 ammoniak. De fraktioner af eluatet, som var positive overfor nin-hydrin-reaktionen og overfor Rydon-Smith-reaktionen, og som også gav en hovedplet ved Rf 0,60 ved tyndtlagskromatografi på silicagel under anvendelse af butanol-ethanol-chloroform-17% ammoniak (4:5:2:3 efter volumen) som udviklingsopløsningsmiddel, forenedes 35 og koncentreredes til tørhed under reduceret tryk, hvilket gav 538 mg af et farveløst pulver hovedsageligt omfattende 2'N,6'N-di-t-butoxycarbonyI -6' N -methyl -3', 4' -dideoxykanamycin B.

/ Udbytte 41%.

148262 22 b) Dette farveløse pulver (100 mg) hovedsageligt omfattende 2,N/8lN-di-t-butoxycarbonyl-6'N-methyl-3,/4'-dideoxykanamycin B (0,15 mmol) opløstes i en blanding af 1 ml vand og 1 ml dimethoxy-ethan, og til den resulterende opløsning sattes en opløsning af 54 05 mg (0,17 mmoi) N-hydroxysuccin?midester af L-4-t-butoxycarbonyl-amido-2-hydroxysmørsyre i 2 ml dimethoxyethan. Blandingen omrør-tes i 22 timer ved omgiveisernes temperatur for at bevirke acylering af det aminobeskyttede B'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B materiale. Reaktionsblandingen koncentreredes dernæst til tørhed 10 under reduceret tryk for tilvejebringelse af en fast remanens omfattende de blandede N-acylerede derivater af det N-beskyttede é'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B materiale.

c) Den faste remanens fra trin b) opløstes i 2,4 ml vandig 90% 15 trifluoreddikesyre, og opløsningen henstod i 1 time ved omgivelsernes temperatur for at bevirke fjernelse af t-butoxycarbonyl-gruppén. Reaktionsbfandingen koncentreredes til tørhed under reduceret tryk, og remanensen opsamledes i 4 ml vand. Opløsningen indstilledes pi pH-værdi 8 ved tilsætning af koncentreret ammoniak- 20 vand og ledtes dernæst gennem en kolonne (8 x 400 mm) af 20 ml af en cationbytterharpiks, "Amberlite" CG 50 (NH4-form) for at bevirke adsorption af de blandede N-acylerede 6'N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B produkter ved hjælp af harpiksen. Efter successiv vaskning af harpikskolonnen med 100 ml vand, 100 ml 0,3 25 N vandig ammoniak og 0,5 N vandig ammoniak, elueredes harpiks-/ kolonnen med 0,75 N vandig ammoniak. Eluatet opsamledes i 2 ml fraktioner, og hver fraktion testedes i henhold til en sædvanlig plademetode for antibakteriel aktivitet overfor den kanamycin-følsomme stamme Bacillus subtilis PCI 219 og den kanamycin-30 . resistente stamme Escherichia coli JR66/W677. De fraktioner, som udviste høj antibakteriel aktivitet overfor begge de ovennævnte stammer, forenedes (til et volumen på 26 ml) og koncentreredes dernæst til tørhed til dannelse af 39 mg farveløst pulver hovedsageligt omfattende det ønskede produkt 1N-(L-4-amino-2-hydroxy-35 butyryO-S'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B. Til yderligere rensning opløstes dette farveløse pulver i 0,5 ml methanol-chloroform -17% vandig ammoniak (4:1:2 efter volumen), og den resulterende 148262 23 opløsning underkastedes søjlekromatografi på 3 g silicagel under anvendelse af methanol-chloroform-17% vandig ammoniak (4:1:2 efter volumen) som elueringsmiddel. Eluatet opsamledes i 1 ml fraktioner, og fraktionsnumre 46-78 viste sig kun at indeholde 1N-(L-4-amino-05 E-hydroxybutyryO-e'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B, der gav en enkelt plet ved Rf-værdi 0,38 ved tyndtlagskromatografi på silicagel ("ART" 5721) under anvendelse af butanol-ethanol-chloroform-28% vandig ammoniak (4:5:2:8 efter volumen) som elueringsmiddel. Disse fraktioner forenedes og koncentreredes til tørhed, hvilket gav 15 10 mg ren 1N-(L-4-amino-2-hydroxybutyryl)-6'N-methyl-3,,4l-dideoxy- kanamycin B som et farveløst pulver.

Dekomponeringspunkt 158-161°C.

Eksempel 2 15 Syntese af IN^DL-isoseryD-S'N-methyl-SM'-dideoxykanamycin B (en forbindelse med formel (I), hvori n er 1) a) Det farveløse pulver (403) hovedsageligt omfattende Z'N^'N-di-t-butoxycarbonyl-S'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B 20 (0,6 mmol), der opnåedes i eksempel 1 a), opløstes i en blanding af 4 ml vand og 4 ml dimethoxyethan. Den således opnåede opløsning blandedes med en opløsning på 221 mg (0,66 mmol) N-hydroxysucci-nimidester af N-t-butoxycarbonyl-DL-isoserin i 8 ml dimethoxyethan.

Blandingen omrørtes i 23½ time ved omgivelsernes temperatur for at 25 bevirke acyleringen. Reaktionsblandingen koncentreredes dernæst til tørhed under reduceret tryk for tilvejebringelse af en fast remanens hovedsageligt omfattende de blandede N-acylerede derivater af E'N^'N-di-t-butoxycarbonyl-S'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B.

30 b) Dette farveløse remanensprodukt opløstes i 7,5 ml vandig 90% trifluoreddikesyre, og opløsningen fik lov at henstå i 1 time ved omgivelsernes temperatur for at bevirke fjernelse af t-butoxycarbo-nylgruppen. Reaktionsblandingen koncentreredes til tørhed under reduceret tryk, og remanensen opsamledes i 16 ml vand. Den 35 således opnåede vandige opløsning indstilledes på en pH-værdi pi 8 ved tilsætning af koncentreret vandig ammoniak og ledtes dernæst * gennem en kolonne (10 x 560 mm) af 43 ml af en cationbytterharpiks, 148262 24 "Amberlite" CG 50 (NH4-form) for at bevirke adsorption af de blandede N-acylerede produkter ved hjælp af harpiksen. Harpiks-kolonnen vaskedes med 200 ml vand og dernæst med 400 ml 0,3 N vandig ammoniak og blev derefter elueret med 0,5 N vandig 05 ammoniak. Eluatet opsamledes i 4 ml fraktioner, og hver fraktion testedes i henhold til en sædvanlig plademetode for antibakteriel aktivitet overfor den kanamycin-følsomme stamme Bacillus subtilis PCI 219 og den kanamycin-resistente stamme Escherichia colt JR66/W677. De fraktioner, som udviste høj antibakteriel aktivitet 10 overfor begge de ovennævnte stammer, forenedes (til et volumen pi 100 ml) og koncentreredes dernæst til tørhed til dannelse af 135 mg farveløst pulver hovedsageligt omfattende det ønskede produkt 1N-(DL-isoseryl)-6lN-methyl-3',4,-dideoxykanamycin B. Til yderligere rensning opløstes dette farveløse pulver i 2,6 ml methanol-15 chloroform-17% vandig ammoniak (4:1:2 efter volumen), og den resulterende opløsning underkastedes søjlekromatografi på silicagel (8 g) under anvendelse af methanol-chloroform-17% vandig ammoniak (4:1:2 efter volumen) som elueringsmiddel. Eluatet opsamledes i 2 ml fraktioner, og fraktionsnumre 20-27 viste sig kun at indeholde det 20 ønskede produkt, der gav en enkelt plet på 0,51 ved tyndtlagskro-matografi på silicagel ("ART" 5721) ved anvendelse af butanol-ethanol-chloroform-28% vandig ammoniak (4:5:2:8 efter volumen) som elueringsmiddel. Disse fraktioner forenedes og koncentreredes til tørhed, hvilket gav 38 mg ren IN-iDL-isoseryO-e'N-methyl-S'^1-25 . -dideoxykanamycin B som et farveløst pulver.

Dekomponeringspunkt 165-169°C.

Eksempel 3

Syntese af 1N-(L-isoseryl)-6lN-methyl-3l,4l-dideoxykanamycin B 30 (en forbindelse med formlen (I), hvor? n er 1) a) t-Butoxycarbonylazid (465 mg, 3,2 mmol) sattes til en opløsning af 500 mg (1,1 mmol) S'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B i en blanding af 21 ml pyridin, 21 ml triethylamin og 12,6 ml vand.

35 Blandingen omrørtes natten over ved omgivelsernes temperatur for at bevirke t-butoxycarbonyler?ngen. Reaktionsblandingen koncentreredes til tørhed under reduceret tryk, hvilket gav 727 mg farve- 148262 25 løst pulver hovedsageligt omfattende en blanding af 2,N,6'N-di-t-butoxycarbonyl-e'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B og 6'N-t-butoxycarbonyl-S'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B.

05 b) Det ovenfor nævnte farveløse pulver (510 mg) hovedsageligt omfattende en blanding af de til dels aminobeskyttede derivater af e'N-methyl-S'/^-dideoxykanamycin B blev, uden rensning deraf, opløst i en blanding af 5 ml vand og 5 ml dimethoxyethan. Til den resulterende opløsning sattes en opløsning af 254 mg (0,84 mmol) 10 N-hydroxysuccinimidester af N-t-butoxycarbonyl-L-isoserin i 10 ml dimethoxyethan. Blandingen omrørtes i 19 timer ved omgivelsernes temperatur for at bevirke acyleringen. Reaktionsblandingen koncentreredes til tørhed under reduceret tryk til dannelse af 794 mg fast remanens omfattende de blandede N-acylerede derivater af 2'N-di-t-15 butoxycarbonyl- og S'N-t-butoxycarbonyl-S'N-methyl-S'^'-dideoxy- kanamycin B.

c) Det faste remanensprodukt behandledes med vandig 90% trifluoreddikesyre til fjernelsen af t-butoxycarbonylgruppen og blev 20 dernæst underkastet rensningen ved søjlekromatografi med "Amberlite" CG 50 og følgelig rensning ved søjlekromatografi på silicagel på samme mide som i eksempel 2 b). Ren IN-(L-isoseryl)-6' N -methyl-3', 4' -dideoxykanamycin B opnåedes som et farveløst ' pulver.

25 Udbytte 34 mg. Dekomponeringsprodukt 162-166°C.

Eksempel 4

Syntese af IN-d.-S-amino^-hydroxyvaleryQ-S'N-methyl-SM1-dideoxykanamycin B (en forbindelse med formlen (I), hvori n er 3) 30 a) Det farveløse pulver (510 mg) hovedsageligt omfattende en blanding af 2,N,6lN-di-t-butoxycarbonyl-6'N-methyl-3',4,-dideoxy-kanamycin B og S'N-t-butoxycarbonyl-ø'N-methyl-S'^'-dideoxykana-mycin B, som fremstilledes på samme måde som i eksempel 3 a), 35 blev, uden rensning deraf, opløst i en blanding af 5 ml vand og 5 ml dimethoxyethan. Til den resulterende opløsning sattes en opløsning af 278 mg (0,84 mmol) N-hydroxysuccinimidester af L-5-t- 148262 26 butoxycarbonylamido-2-hydroxyvalerianesyre i 10 ml dimethoxy-ethan. Blandingen omrørtes I 18 timer ved omgivelsernes temperatur for at bevirke acyleringen. Reaktionsblandingen koncentreredes til tørhed undér reduceret tryk til dannelse af 834 mg fast remanens 05 omfattende de blandede N-acylerede derivater af 2'N/6'N-di-t- butoxycarbony I - og 6' N -t-butoxycarbon.y I -6' N -methyl -3', 4' -dideoxy-kanamycin B.

c) Det faste remanensprodukt opløstes i 8 ml vandig trifluoreddike-10 syre, og opløsningen fik lov at henstå 1 time ved omgivelsernes temperatur for at bevirke fjernelsen af t-butoxycarbonylgruppen. Reaktionsblandingen koncentreredes til tørhed under reduceret tryk, og den således opnåede remanens opsamledes i 16 ml vand.

Den resulterende vandige opløsning indstilledes til en pH-værdi på 15 8,4 ved tilsætning af koncentreret vandig ammoniak og blev derefter adsorberet på kolonne {10 x 560 mm) af 40 ml ''Amberlite" CG 50 harpiks (NfU-form). Efter at harpikskolonnen var vasket successivt med 200 ml vand, 250 ml 0,3 N vandig ammoniak og 240 ml 0,5 N vandig ammoniak, elueredes harpikskolonnen med 0,75 N vandig 20 ammoniak. Eluatet opsamledes i 4 ml fraktioner, og sådanne fraktioner, som udviste en høj antibakteriel aktivitet overfor Bacillus subtilis PCI 219 og Escherichia coli JR66/W677, påvistes, forenedes (til et volumen på 60 ml), koncentreredes til tørhed og kromatogra-feredes dernæst på en silicagelsøjle på samme måde som i eksempel 1 25 c). Ren 1N-(L-5-amino-2-hydroxyvaleryl)-6,N-methyl-3,,4,-dideoxy- kanamycin B opnåedes som et farveløst pulver.

Udbytte 29 mg. Dekomponeringspunkt 152-155°C.

Claims (4)

148262

1. Analogifremgangsmide til fremstilling af IN-(a-hydroxy-u)-aminoalkanoyO-e'N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B med formlen 05 4" 6" Htr \ a> H,H —HoN—7^ 4' 2 -2 II Atr > 1 d / ^7

10. OH r °HN^S—*r-o 5 io 1 CHOH 5 15 «?H2>n NH 2 (I) hvori n er 1, 2 eller 3, eller farmaceutisk acceptable syreadditions-20 salte deraf KENDETEGNET ved, AT man selektivt acylerer 1-amino-gruppen i et amino-beskyttet derivat af B'N-methyl-S'^'-dideoxy-kanamycin B med formlen 6” 4» CH50H n 2* 25 r2hm r / 5‘ «· Xch3 (V) 148262 R3 \ N-(CH2) -CH(OH)-COOH 05 eller et hermed funktionelt, ækvivalent acyleringsmiddel, hvori R3 er en monovalent aminobeskyttende gruppe, og R4 er et hydrogenatom, eller R3 og R4 danner tilsammen en divalent aminobeskyttende gruppe, og n er et helt tal på 1, 2 eller 3, til fremstilling af en 1N-acyIeret forbindelse med formlen 10 6" ,, J" ch2°“ o \ B / '^3· / 15 2 3" 5'6’ \ ^ \ .HH- hn2^y 2 i l 3 20 ?° CHOH o ^ x (CH2>nNC 4 (vi) 25 hvori R1, R2, R3, R4 og n har de ovenfor anførte betydninger, hvorefter man fjerner de aminobeskyttende grupper fra den 1N-acy-lerede forbindelse og isolerer den opnåede forbindelse med formlen (I).

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1 KENDETEGNET ved, AT man 30 ud fra tilsvarende udgangsmaterialer fremstiller IN-(DL-isoseryl)- S’N-methyl-S'^-dideoxykanamycin B eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 KENDETEGNET ved, AT man ud fra tilsvarende udgangsmaterialer fremstiller IN-(L-isoseryl)-

35 S'N-methyl-S'^’-dideoxykanamycin B eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 KENDETEGNET ved, AT man