DK149775B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 6'-n-methylkanamycin a- og b-derivater - Google Patents

Description

149775

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte derivater af kanamycin A og B med den almene formel 2 6, 149775 HOJ· ,CH2-HilCH3 nh AJ1.

/vrr\ 6" o /

CH20H X

h°41^^V y/ 2 0 (IV) hvori k betegner -OH eller -NH2 og R betegnerL - (-)-Y-amino-a- hydroxybutyryl, L~ (-) -β-amino-a-hydroxypropionyl ellerL-(-)-δ-amino-å-hydroxyvaleryl, eller et farmaceutisk acceptabelt ikke-toksisk salt deraf.

Fra beskrivelsen til US-patentskrift nr. 3.781.268 er det kendt, at 1-(L-(-)-γ-amino-ct-hydroxybutyryl)-derivaterne af ka-namycin A og B udviser antibakteriel aktivitet over for en række Gram-positive og Gram-negative bakterier, herunder sådanne, der er resistente over for kanamycin A. Disse kendte forbindelser indeholder en fri aminogruppe på 61-carbonatomet. Det er endvidere kendt, at visse R-faktor positive kanamycin-resistente organismer, fx. E. coli K-12 R-5 og Ps. aeruginosa GN 315 in-aktiverer kanamycinerne ved 6'-N-acetylering. Det har overraskende vist sig, at indføring af en methylgruppe på 6'-carbonatomet svarende til formel (IV) medfører en kraftigere og mere bredspektret antibakteriel aktivitet.

Særligt foretrukne forbindelser ved formel (IV) er ifølge opfindelsen sådanne, hvori 1) R betegner L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryl og R3 betegner OH (IVa),

O

2) R betegner L-(-)-&-amino-o-hydroxypropionyl og R betegner OH (iVc), og 3 3) R betegner L-(-)-6-amino-o-hydroxyvaleryl og R betegner OH (IVe).

I den foreliggende beskrivelse betegner udtrykket "ikke-toksisk farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt" et mono-, di-, tri- eller tetrasalt dannet ved interaktion af 1 molekyle forbindelse IV og 1-4 mol af en ikke-toksisk, farmaceutisk acceptabel syre. Omfattet af disse syrer er eddikesyre, saltsyre, svovlsyre, maleinsyre, phos-phorsyre, salpetersyre, hydrogenbromidsyre, ascorbinsyre, æblesyre og cintronsyre og sådanne andre syrer der sædvanligvis anvendes til at fremstille salte af aminholdige lægemidler.

149775 3

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er karakteriseret ved, at man i rækkefælge A) acylerer en forbindelse med formlen H0-. CH2NH-CH3 HO-V V\

CHo0H HO-A-tsA

HO— T 2 _NH2 B”2 hvori R3 betegner -OH eller NH2 med et acyleringsmiddel med formlen OH 0

I II

W-NH-(CH2)n-CH-C-M (VII) hvori W betegner en gruppe med formlen 0 CH- 0 f~\ II I 3II f~\ // Ny»CH2-0-C-, CH3-C-0-C-, o2n—nV- CH X=f N02 o ° °

I II

ryl-, q^-™2-ch2-c- "ό 149775 4 eller resten af et syrehalogenid eller syreanhydrid, M betegner en gruppe med formlen

O

r .°|yN°2, -°-N ^ , -ί-0-C-N^J eller 0 l| \ j \j_o- men fortrinsvis 0 CO"· .U„ φ

O O

og n betegner et helt tal på 1-3, i et forhold på mindst 0,5 mol forbindelse VII pr. mol forbindelse II, men fortrinsvis i et forhold på mindst ca. 0,5 til ca. 1,4 i et opløsningsmiddel, fortrinsvis udvalgt fra gruppen omfattende en blanding af vand og ethylenglycoldimethylether, dioxan, dimethylacetamid, dimethyl-formamid, tetrahydrofuran og propylenglycoldimethylether til fremstilling af en forbindelse med formlen 5 149775 H0-. CH2NH-CH3 -¾ Γ· 'Wi jrz'i—r

—Q. / HC-OH

y' ^H2)n NHj HO / I * n

tr NH

m i 3 hvori n, R og W har de ovenfor anførte betydninger, og B) fjerner den blokerende gruppe W fra forbindelse III på i og for sig kendt måde og om ønsket omdanner en opnået forbindelse med formlen (IV) til et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf.

Under A) er det mest foretrukne et forhold på ca. 0,8 til ca.

1,1 og omsætningen sker fortrinsvis i vandig tetrahydrofuran. Under B) fjernes den blokerende gruppe W, når den har formlen 0-ch2-o-1 ved hydrogenering af forbindelse III med hydrogen i nærværelse af en metalkatalysator fortrinsvis udvalgt fra gruppen omfattende palladium, platin, Raney nikkel, rhodium, ruthenium og nikkel, men især palladium og særligt foretrukkent palladium-på-trækul, i et vand-vand blandbart opløsningsmiddelsystem, fortrinsvis udvalgt fra gruppen omfattende vand og dioxan, tetrahydrofuran, ethylenglycol-dimethylether, propylenglycoldimethylether eller lignende, men fortrinsvis 1:1 vand-dioxan og fortrinsvis i nærværelse af en katalytisk mængde iseddikesyre.

Det vil være klart for fagmanden, at andre midler kan anvendes i ovenstående fremgangsmåde til acylering af aminfunktionerne i 149775 6 mellemprodukterne ifølge den foreliggende opfindelse. Opfindelsen omfatter anvendelsen af alle acyleringsmidler som tilvejebringer labile amin-blokerende grupper, der sædvanligvis anvendes i syntesen af peptider. De labile blokerende grupper skal let kunne fjernes på i og for sig kendt måde. Eksempler på sådanne labile blokerende grupper og deres fjernelse kan findes i oversigten af A. Kapoor, J. Pharm. Sciences, 59, sider 1-27 (1970). Funktionelle ækvivalenter som acyleringsmiddel for primære amingrupper vil omfatte tilsvarende carboxylsyrechlorider, -bromider, -syreanhydrider herunder blandede anhydrider og især de blandede anhydrider fremstillet ud fra stærkere syrer såsom de lavere alifatiske monoestere af carbonsyre, af alkyl- og arylsulfonsyrer og af mere hindrede syrer såsom diphenyl-eddikesyre. Desuden kan anvendes et syreazid eller en aktiv ester eller thio-ester (for eksempel med p-nitrophenol, 2,4-dinitrophenol, thiophenol, thioeddikesyre) eller selve den frie syre kan kobles med kanamycin-derivatet (II) efter forudgående omsætning af den frie syre med Ν,Ν'-dimethylchlorforminiumchlorid [jf. engelsk 1.008.170 og Novak og Weight, Experientia XXI/6, 360 (1965)] eller ved anvendelse af enzymer eller af en Ν,Ν'-carbonyldiimidazol eller en Ν,Ν'-carbonylditriazol [jf. Sheehan og Hess, J. Arner. Chem. Soc., 77, 1067 (1955)] eller af alkynylaminreagens [jf. R. Budjile og H. G. Viehe, Angew. Chem., International Edition 3, 582 (1964)] eller af et keteiiminreagens (jf. C. L. Stevenes og Μ. E. Monk, J. Amer. Chem. Soc., 80, 4065 (1958)] eller af et isoxazoliumsalt-reagens [jf. R. B. Woodward, R. A. Olofson og H. Mayer, J. Amer.

Chem. Soc., 83, 1010 (1961)]. En anden ækvivalent af syrechloridet er et tilsvarende azolid dvs. et amid af den tilsvarende syre, hvis amidnitrogen indgår i en kvasiaromatisk femleddet ring indeholdende mindst to nitrogenatomer, dvs. imidazol, pyrazol, triazo-lerne, benzimidazol, benzotriazol og deres substituerede derivater. Som et eksempel på den almene fremgangsmåde til fremstilling af et azolid omsættes Ν,Ν'-carbonyldiimidazol med en carboxylsyre i ækvimolære mængder ved stuetemperatur i tetrahydrofuran, chloroform, dimethylformamid eller et lignende inert opløsningsmiddel til dannelse af carboxylsyre-imidazolidet i praktisk taget kvantitativt 7 14 9775 udbytte under frigørelse af carbondioxid og 1 mol imidazol. Dicar-boxylsyrer giver diimidazolider. Biproduktet imidazol udfælder og kan fraskilles og imidazolidet isoleres, men dette er ikke kritisk. Disse omsætninger er i og for sig kendte (jf. USA Patentskrifter nr. 3.079.314, 3.117.126 og 3.129.224 og Britiske Patentskrifter nr. 932.644, 957.570 og 959.054).

Den mest foretrukne fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med formel IV omfatter at man i rækkefølge A) acylerer forbindelsen med formel II med et acylerings-middel med formlen <^3-CH2-o-Lnh- (CH2>n-g-*-°-^X£j) eller

^ Ϊ ?H ? V

^ vy_CH2-0-C-NH- (CH2 ) n-C - C- O -li hvori n er et helt tal på 1 - 3 i et vandigt tetrahydrofuran-eller vandigt dimethylformamid-acetone opløsningsmiddelsystem ved omkring stuetemperatur til fremstilling af forbindelsen med formlen 149775 8 HO~"VJH2NH’CH3 -£!=Λ

^V\IL

Cfl,OH HO—^-7«. \

HO—I ^ NH-C-O

V——ϊΟν X HC-OH

røiHdW^ <CH2,n

V III NH

C=0 0 hvori n er et helt tal på 1 - 3 og B) hydrogenerer forbindelse III i vandig tetrahydrofuran i nærværelse af palladium-på-trækul ved omkring atmosfæretryk til fremstilling af forbindelse IV.

Alternativt kan i trin A acyleringsmidlet VII dannes in situ ved blanding af forbindelsen med formlen _ 0 OH 0 r~\ « i ii y—CH -O-C-NH- (CH„) -C—C—OH \=/ 2 2 n med ækvimolære mængder af N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid og dicyclohexylcarbodiimid i en lille mængde vandfri tetrahydrofuran.

Den resulterende blanding filtreres og filtratet sættes til en vandig tetrahydrofuranblanding af 6'-N-kanamycin A- eller B-deriva-tet til fremstilling af den passende forbindelse III.

149778 9

Forbindelserne IV er værdifulde som antibakterielle midler, profylaktisk ernæringstilskud til dyrefoder, terapeutiske midler for fjerkræ, pattedyr og mennesker, og de er særlig værdifulde til behandling af infektionssygdomme forårsaget af gram-positive og gram-negative bakterier.

Forbindelserne IV er ved oral administrering værdifulde til supplerende behandling for pre-operativ sterilisering af tarmen. Såvel aerob som anaerob flora der er følsom overfor disse lægemidler reduceres i tyktarmen. Ledsaget af adækvat mekanisk rensning er de værdifulde til forberedelse for kolonisk kirurgi.

Forbindelserne IV er effektive til behandling af systemiske bakterielle infektioner ved parenteral administrering i et dosisinterval fra ca. 250 mg til ca. 3.000 mg pr. dag i opdelte doser 3 til 4 gange daglig. I almindelighed er forbindelserne effektive ved administrering i en dosis på ca. 5.0 til ca. 7.5 mg pr. kg legemsvægt hver 12. time.

Forbindelserne med formel IV, specielt BB-K28, 142, 148, 162 og 163, besidder alle væsentligt forbedrede aktiviteter overfor et bredere spektrum af mikroorganismer end stamforbindelserne, hvoraf de er afledt, nemlig kanamycin A og B.

Tabel I nedenfor belyser de minimale inhiberende koncentrationer (MIK-værdier) for dels kanamycin A og B og dels BB-K28, 142, 148, 162 og 163 overfor en lang række gram-positive og gramnegative bakterier, opnået ved Steers agar-fortyndingsmetode på Mueller-Hinton Agar Medium.

Tabel II (se side 14) belyser de minimale inhiberende koncentrationer (MIK-værdier) for kanamycin A, BB-K 25, BB-K 8 (ifølge USA-patent 3.781.268) og BB-K 28 (fremstillet ifølge opfindelsen) over for en række aminoglycosid-resistente bakterier.

10- 149775 c Ο VO ΙΟ VO ΡΟ VO VO Η · · ·· . « Ε ηηοογΙόοηοοο η ο m ιηιηοοοοοοοο «ο οο ο οοο ο NNomoimnooo C Η Η Η ΗΗΗ Η Η Η Η Η Η 0 Α ΑΛΛΑ Λ ΛΑ β •Η Ο "*Τ 03 Π *3· Η CO ΓΊ VD 1Λ Π ΙΛ ^ « · * · · · ····· É οοονοοηοοοοο ο ο η ΝνοοίΊΟίηιηοοο C0 Ο ΙΠ ΟΟΟ Ο Η ΟΗΟΝΝίηΟΟ C <—I ΗΗΗ Η Η Η Η Η <0Λ ΑΛΑ Λ ΛΑ Η & 3 "" « (. ι m nininninnmtn η u> m ιη »η ιη ιη (Q VC ««*#···· ·· · ♦ · · ·

ζ Μ Η VD(MNU)MVD>CVOOOOm HOVO NnONinONOO

,3 HH Η ΟΟΟ tn Η OHNUlHtno ti Η Η Η Η Η ffi ΛΑ > η I γμ m en m η m m η η η co t n η η η ιη η *£< CQV0 ·*·····* «··«.. · · ' (Q η lovQfNmioiommooom ο m ιο vomomtnmiomo η Η in ιη ο η ΟΗΝΝ mm Η η Η to ri! Ui ΗΗΗΝΊΓ^·^ΜΊηιη ro νο η μ· η ιη η ιη ιη Εη 100 ····»»·< . « . . . . * . * pj«j· nnnooooowNo ο m Η mooionionnoc CQ η riHin« οι ιη η η H in in Λ Λ Λ ^covDN^Tftftonn m in vo η ό· in in m in

I M ······«»·· ··· · f · ··· A

(a OOHOOOOOlDVOO* OOJH Π O OM HIN (M N O O

CQ Η in H OHNHHHino

Η H

\ W Ό* 00 CO CM TT ΤΓ ’O' CO oo m *3· VO 03 Η CN (inHHin ι ........· « * ... .· ..... o

Woo oooooooooo vo oho noinvovonnwino

W m m h cm H

<n ro m ^in^Mvoco om o r» co m η η h ΗΙΟΙΟίΝΙΟΙΟΟΟΟΟΙοσι OO Η Ο ΙΛΗΗΠΟ^Ν

HnnniovovoioMa vo o m h t" ro vo r· vo ιηοονοοοοοοο oo σι moooooo

Hncsoinmnncmn mn men ηννμπινν <<<<<<<<<»3; h < <; Η«;σΐι<»3;<<;«;<;<

I I

I Q W

Q (0 o —» mem m« * ø m ø w ho H vo ( Ctf 0 m O 0 W Λ h 2 o r- η me U Pi H3 i S t" o r. m c ø ø ·η tt vo vo vo m O CL u tn s 2 s sos ue>.nm ϋϋ

•H \\ V. 3 & <ϋ U

H m in en m vo mø g ø O H H M*)N vo H C id 0. D I I tf K vo ft l ft · .

E «WSbSbW M · td 01 * . 0 01 tu •H W = ε = ε ε ε = ε = Ϊ4 = l/l CL ε sstsst β o m m en o m mvooHrto ø kJ m tn i"oo en h m m m vo m η «η h m m η h m m m h

& I I I I I I 1 I I I I I III I I I I I I I I I I

u ϋϋϋουυυοϋϋϋϋ cl cl 6 000000000*

O WWWWWWWWWWWW « K CO CLCLfLCLCLCLCLCLfLCL

149775 11 tt

C

•Η Ο >, Η Η Η V Ο ΜΗ Η ΙΟ ρ ····· « « « « ία ro ro ro ο η ο ο ο η ο ο η η c in ο ο ο «J Η ΗΗ « ΛΑ «< •Η _ ϋ »η »P 00 03 in οο ο «ρ οο οο

c III I · ·· I I

5 ooo o oooo ooooo c in o o o

a H HH

^ V Λ V Λ Λ Η Λ g \ tn 3- , Η η ιο ιη οο η ιο η Η Λ J ' ··# · · · t · ^ ^ Sil ro VD Η ΙΛΜΟΟ ηΟΟΗΛ •ρ -η (ΜΗΐη οο "Ό _| Μ Μ Λ Λ 4J fij Λ Λ Μ >

Ο I

!ϋ Η rin w mm if η ιο η 0 1” .......

Λ Η'S ΠΙΟ Η Ν(Ν Ο Ο fOOOrltn μ. w 1-1 HHU1 οο Η ΗΗ Ρ) Λ Λ κ _ m J2 ν' I ^ S . —I 00 ΙΟ ΙΟ Η 00 ιο ιη O CO *Ρ οο Λ03! » · · · .... . ·.

5 "*Ί Ο Η Η Ο Ο Η IN Ο OOOOO

WHI Η ν ιη ιη Λ Λ „ m

Κ τρ 10 00 «ρ ιο ιο η Ο ΟΟ τρ CO

I οϊ ... . .... · ..

tt*T Ο Η Ο Ο Η Η ιο Ο ΟΟΟΟΟ tt Η ν ο ο Η Η

Ui ιη I (Ν οο οο 04 οο ιο η ο co η æ (0 οο ... . .... . ..

CQ CM Ο Ο Ο Ο Ο Η οο Ο ΟΟΟΟΟ V ο ο Η Η Λ Λ ρ- σι ο ΙΟ ΊΤ 00 10 00 »P Λ ro ιη ιη η μ μ Pi

ίγ ιη ιη ιη ο ο cn I

σι σι σι η ν νη Ε < C < < < < Μ tf ιο I I .

η υ § 2 ΜΉΗ Οι -------Η 0) ηηη Ρι — cj ια

U-H C σι Pi «Ρ» Η C

itfAns μ οι ho ^ m tniODi ΟΛΜΕ Η IOS & Ο,Μ Η Μ VI 0) -Ρ Μ ·Η 3ΉΟ H ·<Η < ^ +1 · > Ε Ε 3 EQ Λ Λ Ο) <3 W Cn 3 0 g ... ή υ Μ Pi Vi VI · >ι •Η 0« Οι C. W = = W - - - - 5 ρί Η Η Ν <f Η if Η ΗΝΙΟΗΗ

6 III I I I I I I I I I I

ij > g tn «3 «OHJnlM ιοιοιοαΜ O OifiPi w tnwww sssss 149775 12

Tabel II

Kanamydin A og tre af dets derivaters aktivitet over for aminoglycosid-resistente organismer _MIK i u g/ml*______

Bristol Kanamycin

Organisme -Registrerings—nr. A BB—K25 BB—K8 BB—K28 - S.-marcescens — 20460. - >125 >32 2 4 5. marcescens 21226 22,6 4 8 1 S. marcescens 21235 63 16 32 4 S. marcescens 21974 32 5,7 22,6 2,8 S. marcescens 21975 45 8 16 5,7 S. marcescens 22288 >125 >32 16 4 S. marcescens 22302 >125 >32 32 8 5. marcescens 22382 32 16 16 8 S. marcescens 22426 >125 >32 2,8 4 S. marcescens 22478 >125 >32 4 4 E. coli 20665 >125 >32 2 4 E. coli 20732 63 32 1 1,4 E. cloacae 21006 >125 >32 4 8 E. cloacae 21136 63 16 32 5,7 K. pneumoniae 21236 >125 >32 4 5,7

Antal følsomme stammer q 3 8 15

Geometrisk middelværdi af resultaterne af to separate forsøg.

MIK = minimal inhiberende koncentration BB-K 25 er 6'-N-methylderivatet af kanamycin A

BB-K 8 er (det kommercielt tilgængelige aminoglycolsid amicasin) 149775 13 1-N-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryrj-derivatet af kanamycin A BB-K 28 er 1-N-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryij-6'-N-methyl-derivatet af kanamycin A.

149775 14 På grundlag af de betydelige erfaringer med kanamycin A og B og den kemiske reaktivitet deraf måtte det forventes, at det blandt de 4 eller 5 primære aminfunktioner i henholdsvis kanamycin A og B af steriske grunde ville være 6'-amino-funktionen som var mest reaktiv. Det antoges derfor at 6'-amino-funktionens reaktivitet med et acyleringsmiddel ville blive væsentligt formindsket ved omdannelse af 6'-amino-funktionen til en 6'-N-methyl-sekundær-amin, og at den 1-N-primære amin-funktion af steriske grunde ville blive den mest reaktionsdygtige blandt de resterende primære amingrupper. Derfor acyleredes 6'-N-methylkanamycin A eller B direkte med et passende sidekæde-acylerende middel uden først at blokere de øvrige amin-funktioner i molekylet. Kontrol af de molære mængder anvendt acyleringsmiddel bestemmer graden af acylering, som forekommer i andre positioner.

Af tabel II ses det, at alle 15 bakteriestammer er resistente (MIK i. 16 pg/ml) over for kanamycin A, 12 stammer er resistente over for BB-K 25, og 7 stammer er resistente over for BB-K 8, mens ingen af de 15 stammer er resistente over for BB-K 28.

UDGANGSMATERIALER.

Fremstilling af L-(-)-Y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmørsyre (VI). 1 L-(-)-Y-amino-a-hydroxysmørsyre (7.4 g, 0.062 mol) sattes til en opløsning af 5.2 g (0.13 mol) natriumhydroxid i 50 ml vand.

Til den omrørte opløsning sattes dråbevis ved 0 - 5° C over et tidsrum af 0.5 time 11.7 g (0.068 mol) carbobenzoxychlorid og blandingen omrørtes fortsat i én time ved samme temperatur. Reaktionsblandingen vaskedes med 50 ml ether, pH værdi indstilledes på 2 med fortyndet saltsyre og ekstraheredes med fire 80 ml portioner ether. De etheriske ekstrakter forenedes, vaskedes med en lille smule mættet natrium-chloridopløsning, tørredes med vandfri natriumsulfat og filtreredes. Filtratet inddampedes i vakuum, og den tilbageblevne remanens ud-krystalliseredes fra benzen, hvilket gav 11.6 g (74%) farveløse plader, smeltepunkt 78.5 - 79-5° C, [a]n - 4.5° (c. = 2, CH_OH).

υ -i -3

Infrarød (IR) [KBr]: IR (KBr) γσ=ο 1740, 1690 cm . Kernemagnetisk resonans (NMR) (acetone-dg) δ (i p.p.m. fra TMS) 2.0 (2H, m.), 3.29 (2H, d-d, J=6.7 og 12 Hz), 4.16 (IH, d-d, J=4.5 og 8 Hz.), 4.99 (2H, s.), 6.2 (2H, bred), 7.21 (5H, s.).

15 149775

Analyse beregnet for ci2H15N®5 (Procent): C, 56.91; H, 5.97; N/ 5.53. Fundet (procent): C, 56.66; Η, 5.97; N, 5.47.

2) N-hydroxysuccinimidesteren af L-(-)-γ-benzyloxycarbonyl-amino-a-hydroxysmørsyre (Vil). - En opløsning af 10.6 g (0.042 mol) VI og 4.8 g (0.042 mol) N-hydroxysuccinimid1 i 200 ml ehtyl-acetat afkøledes til 0° C og dernæst tilsattes 8.6 g (0-042 mol) dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen holdtes natten over i køleskab. Dicyclohexylurinstoffet som udskilte frafiltreredes, og filtratet koncentreredes til ca. 50 ml under reduceret tryk, hvilket gav farveløse krystaller af VII, der opsamledes ved filtrering; 6.4 g, smeltepunkt 121 - 122.5° C. Filtratet inddampedes til tørhed i vakuum, og den krystallinske remanens vaskedes med 20 ml af en blanding af benzen og n-hexan, hvilket gav en yderligere mængde VII. Det totale udbytte var 13.4 g (92%). [α]^ 1.5° (c.= 2, CHC13). IR (KBr) vc=o 1810, 1755, 1740, 1680 cm"1. NMR (acetone-dg) δ (i p.p.m. fra TMS) 2.0 (2H, m.), 2.83 (4H, s.), 3.37 (2H, d-d, J=6.5 og 12.5 Hz.), 4.56 (IH, m.), 4.99 (2H, s.), 6.3 (2H, bred), 7.23 (4H, s.).

Analyse beregnet for cigHi8N2°7 (Procent): cr 54.85; H, 5.18; N, 8.00. Fundet (procent): C, 64.79, 54.70; H, 5.21, 5.20; N, 8.14, 8.12.

3) Fremstilling af N-(benzyloxycarbonyloxy)-succinimid.

2 N-hydroxysuccinimid (23 g, 0.2 mol) opløstes i en opløsning af 9 g (0.22 mol) natriumhydroxid i 200 ml vand. Til den omrørte opløsning sattes dråbevis 34 g (0.2 mol) carbobenzoxychlorid under vandafkøling, og blandingen omrørtes dernæst ved stuetemperatur natten over til fraskillelse af carbobenzoxy-derivatet der opsamledes ved filtrering, vaskedes med vand og lufttørredes. Udbytte 41.1 g (82%). Omkrystallisation fra benzen-n-hexan (10:1) gav farveløse prismer der smeltede ved 78 - 79° C.

4) Fremstilling af 61-carbobenzoxykanamycin A.

En opløsning af 42.5 g (90 mmol) kanamycin A som fri base i 450 ml vand og 500 ml dimethylformamid (DMF) afkøledes under 0° C

G. W. Anderson et al., J. Am. Chem. Soc., 86, 1839 (1964).

2 149775 16 og omrørtes kraftigt. Til opløsningen sa-tfcéS dfåbøvis OVør et tidsrum af ca. 2 timer en opløsning af 22.4 g (90 mmol) N-(benzyl-oxycarbonyloxy)succinimid i 500 ml DMF. Blandingen omrørtes ved -10° - 0° C natten over og dernæst ved stuetemperatur i én dag. Reaktionsblandingen inddampedes under reduceret tryk under ca. 50° C. Den olieagtige remanens opløstes i en blanding af 500 ml vand og 500 ml butanol, og blandingen filtreredes til fjernelse af uopløseligt materiale og deltes i to lag. Butanol- og vandlagene behandledes med henholdsvis butanol-mættet vand (500 ml x 2) og vandmættet butanol (500 ml x 2), under anvendelse af en art modstrømsfordelingsteknik. De tre vandige lag forenedes og inddampedes til tørhed under reduceret tryk til opnåelse af en olieagtig remanens, hvoraf en del udkrystalliserede ved henstand ved stuetemperatur.

Til remanensen inklusive krystallerne sattes ca. 100 ml methanol, der opløste olien og skilte den fra krystallerne. Efter tilsætning af ca. 300 ml ethanol, holdtes blandingen ved stuetemperatur natten over hvilket gav en krystallinsk masse, der opsamledes ved filtrering. Den vejede 44 g. Produktet indeholdt en lille smule kanamycin A som påvist ved tyndt lags kromatografi under anvendelse af n-propanol-pyridin-eddikesyre-vand (15:10:3:12) som opløsningsmiddelsystem og ninhydrin som spray-reagens.

Det rå produkt opløstes i 300 ml vand og kromatograferedes på en kolonne (30 mm diameter) af "CG-50" ionbytter-harpiks (NH^+ type, 500 ml). Kolonnen skylledes med 0.1 N ammoniumhydroxidopløsning, og eluatet opsamledes i 10 ml fraktioner. Det ønskede produkt var indeholdt i glas nr. 10-100, mens kanamycin A vandtes fra de langsommere fraktioner, og de (n) positionsisomerer af produktet synes at være indeholdt i de hurtigere fraktioner. Fraktionerne 10-110 forenedes og inddampedes til tørhed under reduceret tryk, hvilket gav 24.6 g (45%) af et farveløst produkt 6-carbobenzoxykanamycin A (II) [61-Cbz-kanamycin A], der begyndte at smelte og farves ved 204° C og sønderdeltes ved 212° C under gasudvikling. [a]D + 106° (c.=2, h20> .

149775 17

C

G

•H

0 S' S* O S' >. o H tn o g · · · · (3 o o o o G n

ni X

in <! r—l

•H GO

·γ-ϊ es μ α fB > g i nj en ^ vo es m G en es es

Pi (U · · · · Λ! o o o o r>j en

N XJ

U es 1 S' vo o

iH

III I

I I I I

I I I I · I I I I Q) I I I I ^ I I I I >i

I I I I W

I I I I η I I I I >

I I I I P

I I I I > I I I I 01

I I I I I

— III I G

G I I I I o

•Η I I I I

M III Λ

Ti O I +»

•M >, g es i O G

*H Æ <U a I es G

G G -P I I a ® _ μ -π ω a i i o

Cn G > O es i a s’ — G

O 0) OH Offio S

+) m H al ·· O λ 2 io

Gs<<D len es ·η< a H ··· O +> g uva G·· ar" 2·· om >d Μ oi

0 es TJ -H o i · es i o d) Ό -H

Mfxi-H TJH avo o·· an > G > li g -r| ·· O · I ^ O · O -H 0(0 H to Min oo a·· Min xiga οίΦΟι >, H < (s OH Di s*

Bi d G Di'-' lw <d '—· i -- Hesen

G G -Μ I G g G

H o G a G I I

P -ri to o O en <U

Ό h -S M 4J H g

G -H r-l di <U U O

>ι οι α i o a y gi — O Κί U < 149775 18

Slutproduktet viste sig at være ledsaget af to mindre komponenter ved tyndtlags kromatografi med det ene af de afprøvede opløsningsmiddelsy s terner. Slutproduktet anvendtes dog uden yderligere rensning til fremstilling af forbindelse II.

5) Fremstilling af L-(-)-γ-amino-a-hydroxysmørsyre ud fra ambufyrosin A eller B eller blandinger deraf.

Ambutyrosin A (5.0 g) (USA Patentskrift nr. 3.541.078] til-bagesvaledes med 160 ml 0.5 N natriumhydroxid i én time. Hydroly-satet neutraliseredes med 6N HCl og kromatograferedes på en kolonne af "CG-50" (NH4+type). Den ønskede L-(-)-γ-amino-a-hydroxysmørsyre isoleredes ved udvikling af kolonnen med vand og fjernelse af vandet ved frysetørring. L-(-)-γ-amino-a-hydroxysmørsyren kan karakteriseres som et krystallinsk materiale med smeltepunkt 212.5-214.5°C [spalte 2, linie 31-38 af USA Patentskrift nr. 3.541.078].

6) Fremstilling af 61-carbobenzoxykanamycin B.

Til en afkølet opløsning af 8.1 g (0.0168 mol) kanamycin B i 120 ml vand og 80 ml 1,2-dimethoxyethan sattes dråbevis under omrøring en opløsning af 4.2 g (0.0168 mol) N-(benzyloxycarbonyloxy)-succinimid i 40 ml 1,2-dimethoxyethan. Reaktionsblandingen omrørtes natten over og inddampedes under reduceret tryk. Remanensen opløstes i 100 ml vand og udrystedes to gange med 50 ml vandmættet n-butanol. Det vandige lag fraskiltes og adsorberedes på en kolonne af 100 ml "CG-50" (NH^t type). Kolonnen vaskedes med 200 ml vand, elueredes med 0.05 N NH^ OH. Eluatet opsamledes i 10 ml fraktioner. Fraktionerne 121 - 180 opsamledes, inddampedes og frysetørredes, hvilket gav 1.58 g (15 %) af det ønskede produkt. Fraktionerne 1 - 120 inddampedes og re-kromatograferedes på "CG-50" (NH.+) hvilket gav 1.21 g (12 %) af produktet. Smeltepunkt 151-152 C (dek.).

[a]D24 + 104° (c. = 2.5, H20). yc=o 1710 cm-1.

Analyse beregnet for C26H43N5°12 (Procent): C' 50.56; H, 7.02; N, 11.34.

Fundet (procent): C, 50.71; H, 7.38; N, 11.48.

149775 19

Tyndtlags kromatografi (silicagel F254), Rf 0.03 i n-PrOH-pyridin-AcOH-H20 (15:10:3:12); Rf 0.16 i acetone-AcOH-H20 (20:6:74).

7) Fremstilling af L-(-)-γ-amino-g-hydroxysmørsyre ud fra DL-g-hydroxy-Y-phthalimidsmørsyre.

A) Dehydroabietylammonium-L-a-hydroxy-Y-phthalimidbutyrat: 3

Til en opløsning af 25 g (0.1 mol) a-hydroxy-y-phthalimidsmørsyre i 200 ml ethanol sattes en opløsning af 29 g (0.1 mol) dehydroabi-etylamin i 130 ml ethanol. Opløsningen rystedes kraftigt i et minut og henstod ved stuetemperatur i fem timer, hvorunder fine nåle udkrystalliserede. Krystallerne opsamledes ved filtrering, vaskedes med 50 ml ethanol og lufttørredes til opnåelse af 30.1 g (56%) af en diastereomer af dehydroabiethylaminsaltet. Smeltepunkt 93 -94° C [a]^+ 15° (c. = 2.5, MeOH). Omkrystallisation fra 300 ml ethanol gav 23.2 g (43%) af det rene produkt, smeltepunkt 94 - 95° C

[a]D24 + 10.8° (c. = 2.5, MeOH). Yderligere omkrystallisation ændrede ikke smeltepunktet og den specifikke rotation.

Analyse beregnet for C32H42N2°5*H2® (procent): C, 69.54; H, 8.02; N, 5.07. Fundet (procent): C, 69.58; H, 8.08, N, 5.07.

B) L-(-)-γ-amino-a-hydroxysmørsyre:

Til en opløsning af 1.5 g (0.014 mol) natriumcarbonat i 40 ml vand sattes 5.3 g (0.01 mol) dehydroabiethylammonium L-a-hydroxy-γ-phthalimidbutyrat og 60 ml ether. Blandingen rystedes kraftigt indtil alt det faste stof var opløst. Etherlaget fraskiltes. Den vandige opløsning vaskedes to gange med 20 ml portioner ether og inddampedes til 15 ml under reduceret tryk. Til koncentratet sattes 10 ml koncentreret saltsyre, og blandingen tilbagesvaledes i 10 timer. Efter afkøling fjernedes fraskilt phthalsyre ved filtrering. Filtratet inddampedes under reduceret tryk. Remanensen opløstes i 10 ml vand, og opløsningen inddampedes til tørhed. Denne operation gentoges to gange til fjernelse af overskydende saltsyre. Den tilbageblevne sirup opløstes i 10 ml vand og filtreredes til fjernelse af en lille smule uopløselig phthalsyre. Filtratet adsorberedes 149775 20 på en kolonne af "IR-120" (H+, 1 cm x 35 xm), kolonnen vaskedes med 300 ml vand og elueredes med 1 N ammoniumhydroxidopløsning. De ninhydrin-positive fraktioner 10 til 16 forenedes og inddampedes under reduceret tryk til dannelse af en sirup der krystalliserede gradvist. Krystallerne tritureredes med ethanol, filtreredes og tørredes i en vakuum-ekssiccator hvilket gav 0.78 g (66%) L—(—)— γ-amino-a-hydroxysmørsyre. Smeltepunkt 206-207° C [a]^ -29° (c. = 2.5, H20). IR-spektret var identisk med spektret for en autentisk prøve opnået fra ambutyrosin.

8) Fremstilling af L-g-benzyloxycarbonylamino-ct-hydroxypropionsyre XX.

uf Ιι-β-amino-a-hydroxypropionsyre (8.2 g, 0.078 mol) opløstes i en opløsning af 6.56 g (0.0164 mol) natriumhydroxid i 60 ml vand.

Til den omrørte opløsning sattes dråbevis 14.7 g (0.086 mol) carbo-benzoxychlorid under 5° C. Blandingen omrørtes i én time ved stuetemperatur, vaskedes med 60 ml ether og indstilledes på pH værdi 2 med fortyndet HC1. Bundfaldet opsamledes ved filtrering, vaskedes med vand og lufttørredes, hvilket gav 9.65 g (52%) XX. Filtratet ekstraheredes med fem 100 ml portioner ether. Den etheriske opløsning vaskedes med vand, tørredes over natriumsulfat og inddampedes til tørhed i vakuum hvilket gav yderligere 2.0 g (11%) XX. Ialt 11.65 g VI udkrystalliseredes fra 500 ml benzen-ethylacetat (4:1) hvilket gav 9.36 g (50%) ren XX, smeltepunkt 128.5-129.5° C.Infrarød (IR) (KBr) : yc=()1745, 1690 cm"1, [a]^5 + 2.9° (c 5.0, MeOH). Kernemagnetisk resonans spektrum [NMR (DMSO-dg)]: δ (i ppm) 3.05- 3.45 (2H, m, CH2N), 4.05 (IH, d-d, -0-CH-C0-), 5.03 (2H, s, CH2Ar) 7.18 (IH, bred, NH), 7.36 (5H, s, ring H).

Analyse beregnet for ciiHi3N05: C, 55.23; H, 5.48; N, 5.86.

Fundet: C, 55.34; H, 5.49; N, 5.87.

* K. Freudenberg, Ber., AT_, 2027 (1914).

9) N-hydrosuccinimidester af L-g-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsyre XXI.

Til en afkølet og omrørt opløsning af 478 g (2 mmol) XX og 230 mg 149775 21 (2 mmol) N-hydroxysuccinimid i 10 ml tetrahydrofuran (THF) sattes 412 mg (2 mmol) dicyclohexylcarbodimid. Blandingen omrørtes i én time ved 0-5° C, i to timer ved stuetemperatur og filtreredes dernæst til fjernelse af Ν,Ν'-dicyclohexylurinstoffet. Filtratet indeholdende overskriftsforbindelsen anvendtes til den efterfølgende omsætning uden isolering.

10) Fremstilling af L-6-benzyloxycarbonylamino-q-hydroxyvalerianesyre XXII.

Til en opløsning af 400 mg (3.0 mmol) L-5-amino-a-hydroxyvale-rianesyre og 250 mg (6.5 mmol) natriumhydroxid i 25 ml vand sattes dråbevis 580 mg (3.3 mmol) carbobenzoxychlorid over et tidsrum af 30 minutter ved 0-5° C. Blandingen omrørtes i en time ved 5-15° C, vaskedes med 25 ml ether, indstilledes på pH værdi 2 med saltsyre og ekstraheredes med tre 30 ml portioner ether. Den forenede etheri-ske opløsning rystedes med 10 ml af en mættet natriumchloridopløs-ning, tørredes over vandfri natriumsulfat og inddampedes i vakuum til dannelse af krystaller der omkrystalliseredes fra benzen til dannelse af 631 mg (78%) XXII, smeltepunkt 110-111° C; infrarød spektrum [IR(KBr)]: 3460, 3350, 1725, 1685, 1535, 1280, 730, 690 cm"1. Kernemagnetisk resonans spektrum [NMR (acetone-dg)]: δ (i ppm) 1.70 (4H, m) 4.14 (2H, q, J=4.5Hz), 4.19(1H, m), 4.82 (2H, S), 6.2(3H, bred), 7.25(5H, s), [a]^5 +1.6 (c 10, MeOH).

Analyse beregnet for : ct 58.42; H.6.41; N, 5.24.

Fundet: C, 58.36; H, 6.50; N, 5.27.

# S. Ohshiro et al., Yakugaku Zasshi, 87, 1184 (1967).

11) N-hydroxysuccinimidester af L-6-benzyloxycarbonyl-amino-ct-hydroxyvalerianesyre XXIII.

Til en omrørt og afkølet opløsning af 535 mg (2.0 mmol) XXII og 230 mg (2.0 mmol) N-hydroxysuccinimid i 55 ml ethylacetat sattes 412 mg (2.0 mmol) Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid (DCC).Blandingen omrørtes i 3 timer ved stuetemperatur og filtreredes til fjernelse af udfældet Ν,Ν'-dicyclohexylurinstof. Filtratet inddampedes i vakuum 149775 22 hvilket gav 780 mg (100%) viskost sirup XXIII. IR (ren):YC=0 1810, 1785, 1725 cm"1.

UDFØRELSESEKSEMPLER.

Eksempel 1.

6'-methylkanamycin Å (BB-K 25) ved fremgangsmåde A.

1) Til en suspension af 610 mg LiAlH^ i 10 ml tør dioxan sattes dråbevis ved 70° C en suspension af 618 mg 61-N-carbobenzoxy-kanamycin A (6'-N-Cbz-kanamycin A) i 30 ml tørt dioxan. Blandingen omrørtes ved 70° C i 20 timer og afkøledes dernæst til -5 - 0° C.

Til reaktionsblandingen sattes forsigtigt 20 ml koldt vand. Da tilsætningen var afsluttet, neutraliseredes blandingen med 2 N HCl og inddampedes dernæst til tørhed under reduceret tryk. Remanensen, vaskedes med en stor portion EtOH til dannelse af 536 mg af det rå produkt, som opløstes i en lille smule vand og £romatograferedes på en kolonne af "CG-50" ionbytter-harpiks (NH^ type, 20 ml). Kolonnen skylledes med vand, 1 liter 0.1 N NH^OH, 600 ml 0.2 N NH^OH og endelig 500 ml 0.5 N NH^OH. 10 ml fraktioner opsamledes og underkastedes ninhydrin-plettest, pladesubstrat-undersøgelse (B. subtilis PCI 219) og tyndtlags kromatografi på silicagel plade; opløsningsmiddelsystem, S-110 (CHCl3-MeOH-28% NH40H-H20 =1 : 4 : 2 : 1). Fraktionerne som gav en ninhydrin-positiv og bio-aktiv plet ved Rf 0.50 ved tyndtlags kromatografering forenedes og inddampedes til tørhed under reduceret tryk, hvilket gav 137 mg (27%) BB-K 25, smeltepunkt 183-187° C (dek.).

NMR(D20): δ (ppm), 2.51 (3 H, s, δ'-Ν-Ο^), 4.95 (IH, d, Hz, 1"-H) , 5.01 (IH, d, 3 Hz, l'-H).

Analyse beregnet for ci9H38N40n*H2C03: C’ 4^.85; H, 7.19; N, 9.99.

Fundet: C, 42.97; H, 7.27; N, 9.63.

2. Til en suspension af 8.8 g LiAlH^ i 100 ml tørt dioxan sattes en suspension af 9.0 g 6'-N-Cbz-kanamycin A i 200 ml tørt dioxan, og reaktionsblandingen omrørtes i 4 dage ved 80° C. Reak- 149775 23 tionsblandingen afkøledes til 10° C, behandledes forsigtigt med 200 ml vand og filtreredes til fjernelse af uopløseligt materiale. Filtratet neutraliseredes med N HC1 og inddampedes i vakuum. Remanensen udvaskedes adskillige gange med EtOH og opløstes i en lille smule vand. Den vandige opløsning kromatograferedes på en kolonne af "CG-50" (NH^ + , 200 ml) som vaskedes med 100 ml vand og eluere-des successivt med 2.0 liter 0.1 N NH^OH og 1.5 liter 0.2 N NH^OH. Eluatet opsamledes i 20 ml fraktioner. Fraktionerne gav en bioaktiv og ninhydrin-positiv plet ved Rf 0.45 ved tyndtlags kromato-grafering (silicagel plade* 01101^-011-28% NH^OH-^O = 1:4:2:1). Fraktionerne forenedes, koncentreredes under reduceret tryk og lyo-filiseredes endeligt hvilket gav 1.139 g (16%) BB-K 25 som var identisk med stoffet som fremstilledes ved fremgangsmåde A-(1J.

Eksempel 2.

6'-N-methylkanamycin A (BB-K 25) ved fremgangsmåde B.

Til en omrørt suspension af 618 mg (1 mmol) 6'-N-Cbz-kanamycin i 30 ml tør pyridin sattes 7 ml trimethylchlorsilan og 14 ml hexa-methyldisilazan ved 70° C. Reaktionsblandingen omrørtes natten over ved samme temperatur og inddampedes i vakuum. Remanensen behandledes med tør tetrahydrofuran (THF). Det uopløselige materiale frafiltre-redes og vaskedes med tør THF. Filtratet og vaskevæskerne forenedes og inddampedes i vakuum hvilket gav 1.567 g af det trimethylsilyle-rede produkt, som opløstes i 30 ml tør THF. Opløsningen sattes til en suspension af 758 mg lithiumaluminiumhydrid i 70 ml tør THF. Blandingen tilbagesvaledes i 22 timer under omrøring. Efter afkøling til ca. 0° C behandledes reaktionsblandingen forsigtigt med 20 ml isvand og filtreredes til fjernelse af uopløseligt materiale. Filtratet neutraliseredes med 6 N HC1 og inddampedes til tørhed i vakuum. Remanensen vaskedes adskillige gange med ethanol, opløstes i en lille smule vand og kromatograferedes på en kolonne af "CG-50" (NH^ +, 50 ml). Kolonnen vaskedes med 50 ml vand og elueredes successivt med 1 liter 0.1 N NH^OH og 600 ml 0.2 N NH^OH. Eluatet opsamledes i 20 ml fraktioner og undersøgtes som beskrevet under fremgangsmåde A-(l). Fraktionerne 47-72 som gav en ninhydrin-positiv og bio-aktiv plet ved Rf 0.50 ved tyndtlags kromatografering forene U9775 24 des, inddampedes under reduceret tryk og lyofiliseredes hvilket gav 258 mg (52% fra 61-Cbz-kanamycin A) af BB-K 25, smeltepunkt 183-187° C.

Eksempel 3.

1-N-(L(-)-γ-amino-g-hydroxybutyryl)-6 *-N-methyl- kanamycin A (BB-K 28).

Til en opløsning af 750 mg 6'-N-methylkanamycin A (BB-K 25) i 30 ml 60% vandig tetrahydrofuran sattes 525 mg N-hydroxysuccin-imidester af N-Cbz-L-Y-amino-a-hydroxysmørsyre. Reaktionsblandingen hydrogeneredes natten over ved stuetemperatur under atmosfæretryk i nærværelse af 500 mg 10% palladium-på-trækul. Reaktionsblandingen filtreredes og inddampedes under reduceret tryk. Remanensen opløstes i en lille smule vand og adsorberedes på en kolonne af "CG-50" (NH^ +, 70 ml). Kolonnen vaskedes med vand og skylledes successivt med 850 ml 0.1 N ammoniak, (glas nr. 1-43 opsamledes i 20 ml fraktioner), 1450 ml 0.2 N ammoniak (glas nr. 44-115 i 20 ml fraktioner) og endelig 100 ml 0.5 N ammoniak (glas nr. 116-215 i 10 ml fraktioner) . Fraktionerne 152 - 161 som udviste en bio-aktiv og ninhy-drin-positiv plet ved Rf 0.17 i tyndtlags kromatografi (silicagel, CHClg-CH20H-28% NH^OH-I^O = 1:4:2:1) forenedes, inddampedes under reduceret tryk og lyofiliseredes, hvilket gav 149 mg (16%) BB-K 28, smeltepunkt 187-189° (dek,).

Infrarød [IR(KBr)]: UC=0 1650 cm NMR (D20): 2.70 ppm (3H, s, N-CH3).

Analyse beregnet for ^-23^5^5°]^ 2H2CH3 ’ 2^0: C, 39.52; H, 7.03; N, 9.23.

Fundet: C, 39.26, 39.00; H, 6.69, 6.54; N, 9.69, 9.20.

Til fjernelse af spor af BB-K 11 type isomer (3"-N-acyleret isomer) underkastedes BB-K 28 kolonne-kromatografi med tetramin-kobber (TACu)-type "Amberlite CG-50" ionbytter-harpiks. BB-K 28 (73 mg) opløstes i en lille smule vand og kromatograferedes på en kolonne af "CG-50" (TACu-type, 3 ml). Kolonnen vaskedes med 20 ml vand og elueredes dernæst med 100 ml 0.2 N NH^OH og endelig med 149775 25 100 ml 1.0 N NH^OH. Eluatet opsamledes i 7 ml fraktioner og bestemtes ved ninhydrin-plettest pladesubstrat-undersøgelse (B. subtillis PCI 219 og Pseudomonas aeruginosa) og tyndtlags kromatografi på silica-gel (S-110, ninhydrin). Fraktionerne 21-24 viste en ninhydrin-positiv og bio-aktiv (overfor P. aeruginosa stammen) plet ved Rf 0.2. Disse forenedes og inddampedes i vakuum til dannelse af 30 mg blåt pulver. Den blåfarvede remanens (30 mg) opløstes i en lille smule vand og adsorberedes på en kolonne af "CG-50" (NH^+, 3 ml), som skylledes med 20 ml 0.2 N NH40H og 200 ml 0.5 N NH^OH. Eluatet opsamledes i 7 ml fraktioner. Fraktionerne 19-23 som viste positiv ninhydrintest forenedes, inddampedes i vakuum og frysetørredes, hvilket gav 20 mg ren BB-K 28; smeltepunkt 187-189° C (dek.).

Eksempel 4.

1-N-[L(-)-β-amino-a-hydroxyproplonyl]-6'-N-methyl- kanamycin A (BB-K 162).

En blanding af 218 mg (0.912 mmol) N-Cbz-L-isoserin, 163 mg (0.912 mmol) N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dicarboximid (HONB) og 188 mg (0.912 mmol) dicyclohexylcarbodiimid (DCC) i 10 ml tetrahydrofuran holdtes ved 5° C natten over og filtreredes dernæst. Filtratet sattes til en opløsning af 441 mg (0.892 mmol) 6'-N-methylkanamycin A i 20 ml 50% vandig tetrahydrofuran, blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer og koncentreredes under reduceret tryk til ca.

2 ml. Koncentratet adsorberedes på en kolonne af "Amberlite CG-50" (NH4+, 26 ml), som vaskedes med 40 ml vand og elueredes med 500 ml 0.1 N NH4OH. Eluatet opsamledes i 10 ml fraktioner. Fraktionerne 11-16 forenedes og inddampedes i vakuum, hvilket gav 231 mg af det N-acylerede produkt. Fra 0.3 N NH4OH-eluatet vandtes 175 mg (40%) af udgangsmaterialet BB-K 25.

Til en opløsning af acyl-derivatet i 20 ml 50% vandig EtOH sattes 130 mg 10% pd-på-trækul, og blandingen hydrogeneredes under sædvanligt tryk ved stuetemperatur. Katalysatoren frafiltreredes, og filtratet inddampedes til fjernelse af det organiske opløsningsmiddel. Den resulterende vandige opløsning underkastedes kolonnekromatografi på "CG-50" (NH4+, 25 ml). Kolonnen elueredes succes- 149775 26 sivt med 40 ml vand, 240 ml 0.1 N NH^OH, 500 ml 0.2 N NH^OH, 300 ml 0.4 N NH^OH og eluatet opsamledes i 10 ml fraktioner. De bioaktive fraktioner forenedes og inddampedes i vakuum, hvilket gav 127 mg af det rå produkt, som re-kromatograferedes på en kolonne af "CH-50" (tetraminkobber-type, 4 ml) og elueredes med 200 ml 0.3 N NHjOH, 300 ml 0.5 N NH^OH og endelig med 300 ml 1 N NH^OH. Eluatet opsamledes i 10 ml fraktioner.

Glas nr. Elueringsmiddel Mængde Rf Bemærkninger 4 0.3 N NH^OH 27 mg 0.33 inaktiv 19-24 0.5 N NH.OH 38 mg 0.33 inaktiv, formentlig en positions-isomer 50-54 1.0 N NH.OH 35 mg 0.37 det ønskede produkt BB-K162.

Glas nr. 50 - 54 forenedes og inddampedes til tørhed, hvilket gav 35 mg (6.8%) af det ønskede bio-aktive produkt BB-K 162; smeltepunkt 178-185° C (dek.). v^q 1630 cm

Eksempel 5.

1-N-[L(-)-S-amino-a-hydroxyvaleryl]-61-N-methyl-kanamycin A (BB-K 163).

En blanding af 94 mg (0.353 mmol) N-Cbz-L-y-amino-a-hydroxy-valerianesyre, 64.5 mg {0.353 mmol) HONB og 74.5 mg (0.353 mmol) DCC i 5 ml tør THF holdtes ved 4° C natten over og filtreredes. Filtratet sattes til en opløsning af 175 mg (0.351 mmol) 6'-N-methylkanamycin A i 10 ml 50% vandig tetrahydrofuran og blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 5 timer. Reaktionsblandingen hydrogeneredes ved stuetemperatur under nærværelse af 70 mg 10% palla-dium-på-trækul. Katalysatoren frafiltreredes, og filtratet inddampedes til fjernelse af THF. Det resulterende vandige koncentrat kroma tograf eredes på en kolonne af "Amb.erlite CG-50" (NH^+ type, 20 ml), som elueredes successivt med vand (50 ml), 0.1 N NH4OH (250 ml), 0.2 N NH^OH (450 ml) og 0.5 N m^OE (400 ml).

149775 27

Eluatet opsamledes i 10 ml fraktioner. De bio-aktive fraktioner forenedes og inddampedes til tørhed til dannelse af 40 mg af det rå produkt, som re-kromatogråferedes på en kolonne af "CG-50" (tetraminkobber-type. 1.5 ml) og elueredes med 10 ml vand og 100 ml 0.5 N NH^OH. Eluatet opsamledes i 5 ml fraktioner.

Glas nr. Elueringsmiddel Mængde Rf Bemærkninger 7-8 0.5 N NH40H 5 mg 0.21 inaktiv 9 0.5 N NH^OH 9 mg 0.21, en blanding af 0.29 to komponenter 10-14 0.5 N NH.OH 24 mg 0.29 det ønskede produkt BB-K 163.

Glas nr. 10-14 forenedes og inddampedes til tørhed, hvilket gav 24 mg (11%) af det ønskede bio-aktive produkt, BB-K 163; smeltepunkt 167 - 174° C (dek.). 1620 cm -1.

Eksempel 6.

61-N-methylkanamycin B, BB-K 140.

Til en suspension af 2.0 g (3.25 mmol) 61-N-Cbz-kanamycin B i 100 ml tørt pyridin sattes 20 ml trimethylsilylchlorid og 50 ml hexamethyldisilazan ved 70° C under omrøring, og omrøring af blandingen fortsatte natten over ved samme temperatur. Bundfaldet fjernedes ved filtrering og vaskedes med tørt THF. Filtratet forenedes med vaskevæskerne og inddampedes til tørhed. Den olieagtige remanens opløstes i 80 ml tør THF. Opløsningen sattes dråbevis til en omrørt suspension af 4.4 g lithiumaluminiumhydrid i 200 ml tør THF, og blandingen opvarmedes under tilbagesvaling natten over. Efter afkøling behandledes reaktionsblandingen forsigtigt med isvand, indstilledes på pH værdi 7 med 2 N HCl og inddampedes til tørhed under reduceret tryk. Efter grundig vaskning med ethanol opløstes remanensen (2.7 g) i 5 ml vand og kromatograferedes på en kolonne af "Amberlite CG-50" (BH^ +, 40 ml). Kolonnen vaskedes med 300 ml vand og elueredes med 0.1 N ammoniak. Eluatet opsamledes med 10 ml 149775 28 fraktioner og underkastedes ninhydrin-plettest, pladesubstrat-undersøgelse (B. subtilis PCI 219) og tyndtlags kromatografi (silicagel plade, CHCl3-CH3OH-28% NH40H-H20 = 1:4:2:1). Fraktionerne 70-134 som gav en ninhydrin-positiv og bio-aktiv plet ved Rf 0.47 ved tyndtlags kromatografering, forenedes, inddampedes under reduceret tryk og gav 889 mg (55%) af BB-K 140; smeltepunkt 177-181° C (dek.).

NMR (D20): 2.74 ppm (3H, s, N-CH-j).

Analyse beregnet for ci9H39N50io*H2C03: C, 42.93; H, 7.39; N, 12.52.

Fundet: C, 42.93; H, 7.13; N, 11.86.

Eksempel 7.

1-N-[L(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]-61-N-methyl- kanamycin B (BB-K 142).

En blanding af 253 mg (1 mmol) N-Cbz-L-Y-amino-a-hydroxysmør-syre, 115 mg (1 mmol) N-hydroxysuccinimid (HOSu) og 206 mg (1 mmol) DCC omrørtes i 3 timer ved 5° C og filtreredes til fjernelse af bundfaldet som adskiltes under reaktionen. Den resulterende aktive esteropløsning sattes til en opløsning af 497 mg (1 mmol) 6'-N-methylkanamycin B (BB-K 140) i 10 ml vand, og blandingen omrørtes natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen filtreredes og inddampedes i vakuum. Remanensen opløstes i 5 ml vand og adsor-beredes på en kolonne af "CG-50" ionbytter-harpiks (NH^ type, 45 ml) som elueredes successivt med 200 ml vand, 1500 ml 0.05 N ammoniak og 500 ml 0.3 N ammoniak. Eluatet opsamledes i 10 ml fraktioner.

Det ønskede mellemprodukt-derivat indeholdtes i fraktioner 58-72, som elueredes med 0.05 N ammoniak, medens 163 mg (33%) BB-K 140 vandtes fra fraktioner elueret med 0.3 N ammoniak.

En opløsning af mellem-derivatet i 20 ml 50% THF hydrogeneredes natten over under normalt tryk i nærværelse af 30 mg 10% palla-dium-på-trækul. Reaktionsblandingen filtreredes og koncentreredes til ca. 4 ml. Koncentratet adsorberedes på en kolonne af "Amberlite CG-50" (NH^ + type, 10 ml), som vaskedes med 150 ml vand og elueredes successivt med 350 ml 0.05 N NH^OH, 300 ml 0.1 N NH^OH, 150 ml 149775 29 0.3 N NH^OH og 300 ml 0.5 N NH^OH. Eluatet opsamledes i 15 ml fraktioner. Fraktioner 67 og 68 som gav en bio-aktiv plet ved Rf 0.22 på tyndtlags kromatografering (silicagelplade), CHCl^-CH^OH^eSi 11^011-^0=1:4:2:1) forenedes og re-kromatograferedes på en kolonne af "CG-50" (den lavere del NH^+ type, lml), den øverste del tetraminkobber-type 2ml). Kolonnen elueredes med 100 ml 0.5 N NH^OH og dernæst med 50 ml 1.0 N HH^OH og eluatet opsamledes i 5 ml fraktioner. Fraktioner 15-33 forenedes og inddampedes i vakuum og gav 29.4 mg (5%) af det ønskede bio-aktive produkt, BB-K 142; smeltepunkt 188-192® C (del.) IR(KBr): vc=Q 1640 cm

Analyse beregnet for C23H46N6°i2 .

C, 41.55; H, 6.97; N, 11.63.

Fundet: C, 41.52; H, 6.72; N, 10.95.

En lille prøve af BB-K opvarmedes ved 100° C i én time i 0.5 N NaOH til dannelse af 6' -N-methylkanamycin B og L-HABA som bekræftedes af TLC.

Eksempel 8.

1-N-[L·(-)-β-amino-g-hydroxypropiony1]-61-N-methyl- kanamycin B (BB-K 148).

En omrørt blanding af 120 mg (0.5 mmol) N-Cbz-L-isoserin, 58 mg (0.5 mmol) HOSu og 103 mg (0.5 mmol) DCC i 5 ml THF holdtes natten over ved 5° C. Blandingen filtreredes, filtratet tilsattes en opløsning af 248 mg (0.5 mmol) BB-K 140 i 5 ml vand og omrørtes natten over. Efter fjernelse af THF, adsorberedes den vandige opløsning på en kolonne af "Amberlite CG-50" (NHj+ type, 10 ml). Elueringen udførtes med 300 ml 0.5 N NH^OH efterfulgt af 300 ml 0.1 N NH^ CH og 10 ml fraktioner opsamledes. Det ønskede mellemprodukt-derivat (68 mg) opnåedes ved inddampning af fraktionerne 18-31, som elueredes med 0.05 N NH^CH, medens 69 mg (28%) BB-K 140 vandtes fra fraktioner elueret med 0.1 N ammoniak.

En opløsning af mellemprodukt-derivatet i 10 ml vand hydrogeneredes natten over i nærværelse af 20 mg 10% Pd-C, og reaktionsblandingen filtreredes og koncentreredes til ca. 5 ml. Koncentratet kromatograferedes på en kolonne af "Amberlite CG-50" (NH4+, 8 ml) og elueredes successivt med 280 ml 0.05 N NHjCH, 340 mlQ.l N NHjOH og 200 ml 0.2 N NH^OH. Den ønskede bio-aktive komponent (35 mg) 149775 30 opnåedes fra fraktioner elueret med 0.2 N NH^OH. Produktet som stadig viste to til tre ninhydrin-positive pletter rensedes ved re-kromatografering på en kolonne af "CG-50" (den laveste del, NH.

type, 1 ml; den øverste del tetraminkobber-type 2 ml), elueredes successivt med 60 ml 0.3 N NH^OH, 110 ml 0.5 N NH^OH og 100 ml 1.0 N NH^OH. Det ønskede produkt BB-K 148 opnåedes fra fraktioner 40-50 som elueredes med 1.0 N NHjOH.

Udbytte: 8.1 mg (3%); smeltepunkt 190 - 198^ C (dek.).

IR(KBr): vc=01630 cm-1.

Eksempel 9.

1-N-[L-(-)-S-amino-g-hydroxyvaleryl]-6'-N- methylkanamycin N.

Ved i fremgangsmåden i Eksempel 5 i stedet for det der anvendte 6'-N-methylkanamycin A at anvende en ækvimolær mængde 6'-N-methylkanamycin B fås titelforbindelsen.

"Amberlite CG-50" er handelsnavnet for kromatograferings kvaliteten af en svagt sur cationbytter-harpiks af en carboxylisk-polymethacrylisk type.

Cupra-ammonium-formen af "Amberlite CG-50" fremstilles på følgende måde: til en omrørt suspension af "CG-50" (NH^+) i vand sattes 10% cupricsulfat-opløsning til dannelse af kobbersaltet af "CG-50", som filtreredes. Harpiksen vaskedes adskillige gange med vand, behandledes dernæst med IN NH^OH under omrøring, filtreredes og vaskedes adskillige gange med vand til dannelse af dybtblå cupraammonium-form af "CG-50".

Eksempel 10.

Fremstilling af monosulfatsaltet af l-[L-(-)-Y-amino- g-hydroxybutyryl]-6'-N-methylkanamycin A eller B.

Et mol 1-[L-(-)-γ-amino-a-hydroxybutyryl]-61-N-methylkanamycin A eller B opløstes i 1 - 3 liter vand. Opløsningen filtreredes til fjernelse af eventuelle uopløste faststoffer. Til den afkølede og omrørte opløsning sattes et mol svovlsyre opløst i 500 ml vand.

1A977S

31

Blandingen omrørtes i 30 minutter, hvorefter kold ethanol sattes til blandingen, indtil udfældning forekom. De faste stoffer opsamledes ved filtrering og bestemmes at være det ønskede monosulfat-salt.

Eksempel 11.

Fremstilling af disulfatsaltet af 1-[L-(-)-β- amino-α-hydroxypropiony1j-6'-N-methylk anamycin A eller B.

35 g 1- [L- (-)-β-amino-a-hydroxy-propionyl]-61-N-methyl-kanamycin A eller B opløstes i 125 ml deioniseret vand. pH værdien sænkes til 7-7.5 med 50% v/v svovlsyre.

8.5 g "Darco G-60" (aktiveret trækul) tilsættes og blandingen opslæmmes ved omgivende stuetemperatur i 0.5 time. Carbonet fjernes ved passende filtrering og udvaske- med 40 ml vand. Den vandige vaskevæske sættes til filtratet.

Denne kombination af filtrat og vaskevæske indstilles på pH værdi 2-2.6 med 50% v/v svovlsyre. En stor mængde carbondioxid udvikles. Opløsningen henstår ved forhåndenværende vakuum under omrøring i 20 minutter til uddrivning af yderligere carbondioxid.

8.5 g "Darco G-60" sættes til den afgassede opløsning. Blandingen opslæmmes i 0.5 time ved omgivende stuetemperatur. Carbonet fjernes ved passende filtrering og udvaskes med 35 ml deioniseret vand. Vaskevæsken sættes til filtratet.

Kombinationen af filtrat og vaskevæske indstilles på pH værdi 1-1.3 med 50% v/v svovlsyre. Denne opløsning sættes under kraftig omrøring over et tidsrum af 10 minutter til 600.800 ml methanol (3-4 volumen methanol). Blandingen omrøres i 5 minutter ved en pH værdi på 1 - 1.3, ledes gennem en 100 mesh sigte, omrøres i 2 minutter, og henstår til udfældning i 5 minutter. Det meste af den ovenstående væske kasseres. Den tilbageblevne opslæmning filtreres på passende måde, udvaskes med 200 ml methanol og vakuumtørres ved 50° C i 24 timer til dannelse af det ønskede disulfatsalt.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af l-(N-substitueret) -6' -N-methylkanamycin A eller B med formlen HO—. CHjjNHCHj ηοΑΖ=Λ, CH-OH )-7s\ „„ _ h6/ ^-NH“R ν' CT (IV) hvori R betegner L- (-)-γ-amino-w-hydroxybutyryl, L-(-)-p-amino--α-hydroxypropionyl eller L-(-)-6-amino-a-hydroxyvaleryl, og O R betegner -OH eller -NH2, eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, KENDETEGNET ved, at man i rækkefølge A) acylerer en forbindelse med formlen HO-. ch2nh-cb3 /ΓΑ r* R UL CHo0H HO—i- H0-— I 2 ν' ^_NH2 NHz λΓί σ li 149775 . 3 hvori R betegner -OH eller -NH2' med et acylenngsmiddel med formlen OH O I II W-NH- ( CH2) n-CH-C-M (VII) hvori W betegner en labil, aminoblokerende gruppe i form af / V_CH,-0-C-, CK.-C-O-C-, o,N-f V \=/ CH^ W K P J I Or· 6 eller resten af et syrehalogenid eller syreanhydrid, M betegner en gruppe O -o—f ^ r Λ T30 ' IJ-Q - Oic>-0- o