CH615685A5

CH615685A5 - Process for the preparation of 1-N-(alpha-hydroxy-omega-aminoalkanoyl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanam ycin B

Info

Publication number: CH615685A5
Application number: CH1303375A
Authority: CH
Inventors: Hamao Umezawa; Kenji Maeda; Shinichi Kondo; Sumio Umezawa
Original assignee: Microbial Chem Res Found
Priority date: 1974-10-08
Filing date: 1975-10-07
Publication date: 1980-02-15
Also published as: HU173702B; IE42354L; NL181503B; DK148262C; YU39659B; SE7511229L; LU73533A1; DK451475A; DE2543535C3; AU8518975A; BE834236A; FR2287233A1; IE42354B1; SU965359A3; FR2287233B1; DE2543535A1; CA1050537A; NL181503C; DE2543535B2; NL7511662A

Description

Die Erfindung setzt sich zum Ziel, neue und wirksame Derivate von 3',4'-Dideoxykanamycin B aufzufinden, welche nicht nur wirksam sind gegenüber Gram-negativen und Grampositiven Bakterien mit der üblichen Kanamycinsensitivität, sondern auch gegenüber kanamycinresistenten Bakterien.

10

Dabei wurde gefunden, dass selektive Acylierung der 1-Ami-nogruppe von ó'-N-Methyl-S'^'-dideoxykanamycin B mit einer a-Hydroxy-co-aminosäure, vorzugsweise mit Isoserin, 4-Amino-2-hydroxybuttersäure oder 5-Amino-2-hydroxyvale-riansäure, sowohl in racemischer Form als auch in Form der L-Isomeren oder der D-Isomeren zu neuen nützlichen Kanamycin B Derivaten führt, welche hochgradig antibakteriell wirksam sind gegen Gram-negative und Gram-positive Kanamycin-empfindliche und Kanamycin-resistente Bakterien. Dabei sollte sich die Wirksamkeit bei den penicillinresistenten Bakterien insbesondere auch auf solche erstrecken, welche die oben genannten inaktivierenden Enzyme produzieren. Weiterhin sollte das neue Verfahren leicht durchzuführen sein und mit guter Ausbeute zu den erwünschten Produkten führen.

Die neuen Verbindungen weisen die Formel I

CO . CHOH

NH-

auf, worin n 1,2 oder 3 ist. Weiterhin auch pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon. Dabei kann der a-Hydroxy-co-aminoalkanoylrest, d. h. vorzugsweise die Isoseryl-gruppe, 4-Amino-2-hydrocybutyrylgruppe oder 5-Amino-2-hydroxyvalerylgruppe im Molekül der neuen Verbindungen der obigen Formel I sowohl in der DL-Form (der racemischen Form), der L-Form oder der D-Form vorkommen.

Die am meisten bevorzugten Verbindungen dieser Art sind:

1. l-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-methyl-3/,4'-dideoxykanamycin B;

2. l-N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxy]canamycin B;

3. l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B und

4. l-N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B,

bzw. die pharmazeutisch verträglichen ungiftigen Säureadditionssalze davon.

Beispiele erfindungsgemässer pharmazeutisch verträglicher Säureadditionssalze der neuen Verbindungen der Formel I sind die Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Phosphate, Nitrate, Carbonate, Acetate, Maleate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Oxalate, Citrate, Methansulfonate, Äthansulfonate, Ascorbate und dergleichen, wobei es sich um ein Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder Pentasalz handeln kann, entstanden durch Einwirkung von einem Molekül der neuen Verbindung der Formel I auf 1 bis 5 Moleküle ungiftiger pharmazeutisch verträglicher Säuren. Solche pharmazeutisch verträgliche ungiftige Säuren sind z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Kohlensäure, Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Oxalsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Ascorbinsäure und dergleichen.

40

45

50

Die neuen erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen zeigen die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaftem:

l-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B ist eine Substanz in Form eines farblosen kristallinen Pulvers mit einer Zersetzungstemperatur von 165 bis 169°C (d)j=,4 = + 96° (c 1,175, Wasser). Seine Elementaranalyse stimmt überein mit theoretischen Werten für C22H44N6O10 (C, 47,81%, H, 8,03%, N, 15,21 %). Die Substanz gibt bei der Dünnschichtchromatographie einen einzelnen Fleck von Rf 0,51 auf Silicagel (erhältlich unter dem Handelsnamen «ART 5721», einem Produkt von Merck Co, Deutschland), wenn das Chromato-gramm entwickelt wird mit n-Butanol-Äthanol-Chloroform-28% wässrigem Ammoniak (4:5:2:8 Volumenteile).

l-N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-3/,4'-dideoxykanamycin B ist eine Substanz in Form eines farblosen kristallinen Pulvers mit einer Zersetzungstemperatur von 162 bis 166°C [a]g* = -I- 80° 55 (c, 1,02, Wasser). Seine Elementaranalyse stimmt überein mit den theoretischen Werten von C22H44N6O10 (C = 47,81 %, H = 8,03%, N = 15,21%). Die Substanz ergibt bei der auf vorgenannte Weise durchgeführten Dünnschichtchromatographie einen einzelnen Fleck (positiv auf die Ninhydrinreaktion) mit 60 einem Rf Wert von 0,51.

l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-3',4'-di-deoxykanamycin B ist eine Substanz in Form eines farblosen kristallinen Pulvers mit einer Zersetzungstemperatur von 158 bis 16l°C[ag5 = +71° (c, 0,8, Wasser). IhreElementarana-65 lyse stimmt überein mit den theoretischen Werten für C23H46N6O10 (C = 48,75%, H = 8,18%, N = 14,83%). Diese Substanz ergibt bei der in obengenannter Weise durchgeführten Dünnschichtchromatographie einen einzelnen Fleck

7

(positiv auf die Ninhydrinreaktion) mit einem Rf Wert von 0,38.

l-N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryI)-6/-N-methyl-3/,4/-dide-oxykanamycin B ist eine Substanz in Form eines farblosen kristallinen Pulvers mit einer Zersetzungstemperatur von 152 s bis 155°C. [aß4 = +79° (c 0,71, Wasser). Ihre Elementaranalyse stimmt überein mit den theoretischen Werten für C24H48N6O10 (C = 49,64%, H = 8,33%, N = 14,47%). Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel in der oben beschriebenen Weise ergibt sich ein einzelner Fleck (positiv 10 auf die Ninhydrinreaktion) mit einem Rf Wert von 0,39.

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen gemäss der Formel I sind dadurch charakterisiert, dass sie den enzy-matischen inaktivierenden Reaktionen der oben genannten Enzyme, welche Kanamycin A und Kanamycin B inaktivieren, 15 nicht unterliegen. Insbesondere werden die neuen Verbindungen nicht inaktiviert durch die 6 ' -Acetyltransferase, weil die 6 ' -Aminogruppe der neuen Verbindungen methyliert wurde,

noch werden sie inaktiviert durch die 2"-Nukleotidyltransfe-rase und die 3'-Phosphortransferase, weil die 1-Aminogruppe 20 der neuen Verbindung acyliert wurde mit der a-Hydroxy-o-aminoacylgruppe. Auch können sie nicht inaktiviert werden durch andere Arten von S'-Phosphortransferase, weil die 3'-und 4'-Hydroxylgruppen, die in Kanamycin B vorhanden sind, in den neuen Verbindungen gemäss der Erfindung nicht vor- 2s kommen. Demzufolge sind die neuen Verbindungen ausge-

615 685

sprachen vorteilhaft insofern, als sie hochgradige antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, nicht nur gegenüber den verschiedenen Arten von Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien, welche an sich auf die Kanamycine ansprechen, sondern auch auf die Kanamycin-resistenten Stämme dieser Bakterien, insbesondere auf Kanamycin-resistente Stämme von Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa.

Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen ((ig/ml) von l-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycinB abgekürzt DL-IS-MDKB); l-N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B (abgekürztL-IS-MDKB); l-N-(L-4-Amino-3-hydroxybutyryl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B (abgekürzt AHB-MDKB) und 1-N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-6'-N-methyl-3/,4/-dideoxyka-namycin B (abgekürzt AHV-MDBK) gegenüber verschiedenen Organismen wurden bestimmt nach der Verdünnungsreihenmethode unter Verwendung von Agar-Nährmedien bei 37°C, wobei die Ablesungen nach 18 Stunden Inkubationszeit durchgeführt wurden. Zu Vergleichszwecken wurden die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (|x/ml) von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin A (abgekürzt AHB-KMA) und l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryI)-kanamycin B (abgekürzt AHB-KMB), aus dem US-Patent 3 781 268 bekannte Verbindungen, in gleicher Weise bestimmt.

Die antibakteriellen Spektren, die sich hierbei ergaben, sind in der nachfolgenden Tabelle 1 enthalten.

Tabelle 1

Minimale inhibitorische Konzentration (fig/ml)

Test-Organismen

DL-IS-

L-IS-

AHB-

AHV-

AHB-

MDKB

KMA

Staphylococcus aureus

<0.20

Staphylococcus aureus FDA 209P

0.78

<0.20

0.78

0.39

Staphylococcus aureus Terajima

<0.20

Sarcina lutea PCI 1001

6.25

3.13

12.5

3.13

Bacillus anthracis

<0.20

Bacillus subtilis PCI 219

<0.20

Bacillus subtilis NRRL B-558

<0.20

Bacillus cereus ATCC10702

3.13

1.56

3.13

1.56

0.78

Corynebacterium bovis 1810

3.13

0.78

3.13

6.25

0.78

Mycobacterium smegmatis ATCC 607

0.39

0.20

0.78

<0.20

Shigella dysenteriae JS 11910

6.25

3.13

Shigella flexneri 4b JS 11811

3.13

1.56

3.13

Shigella sonnei JS 11746

3.13

6.25

3.13

1.56

Salmonella typhosa T-63

1.56

0.39

3.13

0.78

0.39

Salmonella enteritidis 1891

3.13

0.78

1.56

0.78

Proteus vulgaris OX19

1.56

0.78

1.56

0.78

Klebsiella pneumoniae PCI 602

1.56

0.78

0.39

Klebsiella pneumoniae 22 No. 3038

3.13

1.56

3.13

1.56

Escherichia coli NIH J

1.56'

1.56

0.78

Escherichia coli K-12

1.56

0.78

Escherichia coli K-12 R5

3.13

1.56

0.39

Escherichia coli K-12 ML 1629

1.56

0.78

Escherichia coli K-12 ML 1630

3.13

1.56

0.78

1.56

0.78

Escherichia coli K-12 ML 1410

3.13

1.56

0.78

Escherichia coli K-12 ML 1410 R81 ■

3.13

1.56

Escherichia coli LA290 R55

3.13

1.56

0.78

Escherichia coli LA290 R56

0.78

0.39

Escherichia coli LA290 R64

0.78

0.39

0.78

0.39

Escherichia coli W677

1.56

0.78

<0.20

Escherichia coli JR66/W677

3.13

1.56

3.13

1.56

Pseudomonas aeruginosa A3

3.13

Pseudomonas aeruginosa No. 12

6.25

25

3.13

25

3.13

Pseudomonas aeruginosa TI-13

12.5

6.25

3.13

Pseudomonas aeruginosa GN315

12.5

25

6.25

12.5

100

Pseudomonas aeruginosa 99

25

6.25

615 685 8

Die erfindungsgemäss hergestellten neuen Verbindungen zeigen niedrige Giftwirkung gegenüber Tieren und gegenüber den Menschen. Bei intravenöser Injektion in Mäuse liegen die LDso-Werte oberhalb von 100 mg/kg Körpergewicht. Weiterhin zeigen die neuen Verbindungen hochgradige antibakterielle s Wirkung gegenüber verschiedenen Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien, welche auf Kanamycin ansprechen, wie auch gegenüber verschiedenen kanamycinresistenten Stämmen, wie sie vorstehend aufgeführt wurden, so dass mit den neuen Verbindungen wertvolle therapeutische Behand- io lungsmittel zur Bekämpfung von verschiedenen Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien vorliegen.

Die neuen Verbindungen können oral, intraperitoneal, intravenös, subkutan oder intramuskulär verabfolgt werden,

unter Verwendung der hierbei für Kanamycine üblichen Tech- is niken. Zum Beispiel können die Verbindungen oral verabfolgt werden in jeder bekannten pharmazeutischen Form für solche Zwecke, wie z. B. als Pulver, Kapseln, Tabletten, Sirupe und

3

durch selektive Acylierung der 1-Aminogruppe darin mit einer Mono- und Diamino-geschützten Derivaten der Verbindung II a-Hydroxy-w-aminosäure der Formel III ' ist verhältnismässig einfacher zufolge der Tatsache, dass die 6'-

Methylamino- und die 2/-Aminogruppen reaktionsfähiger sind 40 als die anderen Aminogruppen der Verbindung II und demzufolge vorzugsweise durch die Aminoschutzgruppe blockiert werden können, wogegen die anderen Aminogruppen unblok-kiert bleiben. Da die Reaktionswilligkeit der 2'-Aminogruppe etwas geringer ist als diejenige der 6'-Aminogruppe, jedoch 45 grösser ist als diejenige der 1-, 3- und 3 "-Aminogruppen, kann gewünschtenfalls die 2'-Aminogruppe gleichfalls blockiert werden.

Wenn die aminogeschützten Derivate, hergestellt aus der Verbindung II, worin die ó'-Methylaminogruppe und gegebe-50 nenfalls die 2'-Aminogruppe blockiert sind, umgesetzt werden mit der a-Hydroxy-co-aminosäure (III), worin die co-Aminogruppe vorzugsweise ebenfalls blockiert ist durch die Aminoschutzgruppe, so entsteht ein Reaktionsprodukt, welches zur Hauptsache besteht aus dem erwünschten 1-N-monoacylierten 55 Derivat, zusammen mit geringeren Anteilen der mono- und poly-N-acylierten Derivate, in welchen eine oder mehrere der Aminogruppen neben der 1-Aminogruppe und gegebenenfalls der 2'-Aminogruppe acyliert sind mit der a-Hydroxy-to-ami-nosäure III. Demgemäss wird bei der obgenannten Reaktion 60 das Acylierungsprodukt in Form eines Gemisches verschiedener N-acylierter Derivate erhalten unter Einschluss des erwünschten 1-N-monoacylierten Derivates. Es ist möglich, das erwünschte 1-N-monoacylierte Derivat aus dem Gemisch der N-acylierten Derivate zu erhalten, indem man das 65 Gemisch einer chromatographischen Trennung unterwirft. Indessen können die gemischten N-acylierten Derivate auch direkt einer Abspaltung der Aminoschutzgruppen daraus unterworfen werden. Dabei entsteht ein Gemisch des dergleichen. Geeignete Dosen der Verbindung zur Behandlung bakterieller Infektionen liegen im Bereich von 0,25 bis 2 g pro Person und Tag bei oraler Verabreichung. Vorzugsweise wird diese Dosis aufgeteilt in drei bis vier gleiche, täglich zu verabfolgende Teile. Bei intramuskulärer Injektion empfiehlt sich eine Dosierung von 5 bis 500 mg pro Dosis mit zwei bis vier Verabfolgungen pro Tag. Weiterhin können die neuen Verbindungen eingearbeitet werden in eine Salbe für externe Anwendung in einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gew.%, z. B. im Gemisch mit einer bekannten Salbengrundlage wie Polyäthy-lenglykol.

Ferner lassen sich die neuen Verbindungen verwenden zur Sterilisierung chirurgischer Instrumente, wenn die Sterilisierung begleitet wird von einer geeigneten mechanischen Reinigung.

Im Prinzip können die neuen Verbindungen der Formel I hergestellt werden aus der bekannten Verbindung 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B der Formel II

H2N-(CH2)n-CH(OH)-COOH (III)

worin n 1, 2 oder 3 ist. Diese Acylierung kann nach an sich bekannter Art durchgeführt werden, beispielsweise wie bei der Acylierung einer Aminogruppe im Verlaufe der Synthese von Peptiden. Das 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B der Formel II enthält vier freie primäre Aminogruppen in 1-, 3-, 2'- und 3"-Stellung und eine sekundäre Methylaminogruppe in ó'-Stellung. Zur Herstellung von Verbindungen der Formel I ist es erforderlich, dass die 1-Aminogruppe des 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B selektiv acyliert wird mit der a-Hydroxy-to-aminosäure der Formel III ohne Acylierung der anderen drei Aminogruppen und der ó'-Methylaminogruppe. Die neuen Verbindungen der Formel I werden in bester Ausbeute erhalten, wenn das a-Hydroxy-o-aminosäure-Reagenz der Formel III umgesetzt wird mit einem aminogeschützten Derivat der Verbindung II, worin die ó'-Methylaminogruppe und die freien Aminogruppen (d. h. diejenigen in 3-, 2'- und 3"-StelIung) blockiert sind durch eine an sich bekannte Aminoschutzgruppe, wobei lediglich die 1-Aminogruppe frei ist. Die Herstellung des aminogeschützten Derivats ist schwierig, jedoch möglich und es ist hierfür eine Anzahl von Verfahrensschritten notwendig. Anstelle hiervon ist es vorteilhaft, ein derartiges aminogeschütztes Derivat der Verbindung II herzustellen, worin lediglich die ó'-Methylaminogruppe und gegebenenfalls die 2'-Aminogruppe blockiert sind durch Aminoschutzgruppen, wogegen die anderen Aminogruppen im freien Zustand verbleiben. Die Herstellung der letzteren Art von

9

615 685

erwünschten 1-N-monoacylierten Produktes der Formel I mit den anderen mono- und poly-N-acylierten unerwünschten Nebenprodukten, entstanden aus der selektiv-aminogeschütz-ten Ausgangsverbindung. Das erwünschte Produkt I kann von den unerwünschten Nebenprodukten abgetrennt werden, indem das Gemisch einer chromatographischen Trennung unterworfen wird. Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von l-N-(a-Hydroxy-a)-aminoalkanoyl)-6/-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B Verbindungen der Formel I ist gekennzeichnet durch die selektive Acylierung der 1-Amino-s gruppe eines aminogeschützten Derivates von 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B der Formel IV

** ch2oh 0

* ^CH,

worin Ri eine einwertige Aminoschutzgruppe und R2 Wasser- 25 0der einem funktionellen Derivat davon als Acylierungsmittel.

stoff oder eine einwertige Aminoschutzgruppe darstellt, mit einer a-Hydroxy-co-aminosäure der Formel V R3

N-(CH2)ii-CH(OH)-COOH (V)

R^

30

In der letzteren Formel ist R3 eine einwertige Aminoschutzgruppe und R4 ist Wasserstoff bzw. R3 und R4 bilden zusammen eine zweiwertige Aminoschutzgruppe und n ist 1,2 oder 3. Bei dieser Umsetzung entsteht eine 1-N-acylierte Verbindung der Formel VI

worin Ri, R2, R3, R4 und n die vorgenannten Bedeutungen aufweisen. Aus der letzteren 1-N-acylierten Verbindung werden die Aminoschutzgruppen abgespalten, wobei die erwünschte Verbindung der Formel I entsteht. Gegebenenfalls kann an diesen Verfahrensschritt ein zusätzlicher Schritt zur Isolierung der erwünschten Verbindung der Formel I aus dem Gemisch mit den unerwünschten N-acylierten Nebenprodukten angeschlossen werden.

Zur Herstellung der Verbindung der Formel IV mit der blockierten ó'-Methylaminogruppe und der gegebenenfalls gleichfalls blockierten 2'-Aminogruppe, welche als Ausgangsmaterial im erfindungsgemässen Verfahren dient, kann die Verbindung der Formel II behandelt werden mit einem Reagens, wie es üblich ist bei der Peptidsynthese zur Einführung ss bekannter Aminoschutzgruppen in die verwendete Aminosäure. Demgemäss kann die erfindungsgemäss verwendete Aminoschutzgruppe eine solche sein, wie sie üblicherweise bei der Synthese von Peptiden Anwendung findet, sofern sie nur aus den erhaltenen acylierten Derivaten VI leicht abspaltbar 60 ist. Wenn das acylierte Derivat mit den blockierten Aminogruppen in an sich bekannter Weise zur Abspaltung der Aminoschutzgruppe behandelt wird, so müssen die Aminoschutzgruppen leicht entfernbar sein, ohne dass eine merkliche Einwirkung aud die Amidbindung eintritt, welche entstanden ist 65 zwischen dem a-Hydroxy-co-aminoalkanoylrest und der 1-Aminogruppe in besagtem acyliertem Derivat VI.

Geeignete Beispiele für einwertige Aminoschutzgruppen Ri, R2, R3 und R4 sind z. B. Alkyloxycarbonylreste mit 2 bis 6

615 685

10

Kohlenstoffatomen, wie Äthoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl und t-Amyloxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonylreste mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen wie Cyclopentyloxycarbonyl und Cyclo-hexyloxycarbonyl, Aralkyloxycarbonylreste wie Benzyloxycar-bonyl und p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Aryloxycarbonylreste wie Phenoxycarbonyl und Furfuryloxycarbonyl sowie ein Acyl-rest nach Art des o-Nitrophenoxyacetyls und dergleichen. Falls die Gruppen R3 und R4 zusammen eine an sich bekannte zweiwertige Aminoschutzgruppe bilden, so kann diese zweiwertige Aminoschutzgruppe z. B. sein Phthaloyl oder Salicyli-den oder allgemein eine Alkyliden- oder Arylidengruppe der Formel =CHRs, worin Rs ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist wie z. B. Methyl, Äthyl, Propyl, Isipropyl,

Butyl oder Pentyl oder ein Arylrest wie Phenyl, Tolyl, p-Methoxyphenyl oder o-Hydroxyphenyl.

Derartige an sich bekannte einwertige Aminoschutzgruppen wie Alkyloxycarbonyl, Aralkyloxycarbonyl oder Aryloxycar-bonyl können dargestellt werden durch eine Formel -CO-OR6, worin Rô Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, wie Äthyl, Methyl, t-Butyl und t-Amyl, oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen wie Cyclopentyl oder Cyclohexyl. Ferner Aralkyl wie Phenylalkyl, wobei der Alkylrest 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, z. B. Benzyl oder p-Nitrobenzyl; weiter Aryl wie Phenyl oder schliesslich ein heterocyclischer Rest wie Furfuryl.

Zur Herstellung des aminogeschützten 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B-Derivates IV dieser Art, worin die 6'-Aminogruppe und die 2/-Aminogruppe blockiert sind durch eine einwertige Aminoschutzgruppe der Formel -CO-ORfi, kann die ó'-N-MethyW^'-dideoxykanamyxin B (II) umgesetzt werden mit 2- bis 3-fach molaren Anteilen an einem Chlorformiat der Formel

Cl-CO-ORe (VII)

oder einem p-Nitrophenylcarbonat der Formel

P-NO2-C6H5-O-CO-OR6 (VII')

oder einem N-Hydroxysuccinimidester der Formel

N-O-CO-ORe (Vn")

oder einem Azidof ormiat der Formel

N3-CO-OR6 (VII"')

oder einem S-4,6-Dimethylpyrimid-2-ylthiocarbonat der Formel

S-CO-OR

worin Rö die vorgenannte Bedeutung aufweist und die Umsetzung stattfindet in einem geeigneten Lösungsmittel wie Wasser, Äthanol, Aceton, Dimethoxyäthan oder einem Gemisch davon, bei neutraler oder basischer Reaktion in an sich für die Peptidsynthese bekannter Art und Weise. Die derart erhaltenen Reaktionsprodukte bestehen aus einem Gemisch verschiedener aminogeschützter Derivate der Verbindung II, wobei der Hauptanteil ein aminogeschütztes Derivat ist, worin die ó'-Methylaminogruppe und die 2'-Aminogruppe vollständig blockiert sind durch die Schutzgruppe -CO-ORô und ein geringer Anteil an aminogeschützten Derivaten enthalten ist, in welchen nur die ó'-Methylaminogruppe blockiert ist. Neben geringen Anteilen an unerwünschten aminogeschützten Derivaten, worin die 1-Aminogruppe blockiert ist, zusammen mit den übrigen blockierten Aminogruppen. Wenn die Verbindung II umgesetzt wird mit den Acylierungsreagenzien VII, VII', VII" oder VII"', in im wesentlichen äquimolaren Anteilen, so steigert sich der Anteil am aminogeschützten Derivat, worin lediglich die ó'-Methylaminogruppe blockiert ist.

Die am meisten bevorzugten Aminoschutzgruppen sind die t-Butoxycarbonylgruppe und Benzyloxycarbonylgruppe, da sie befähigt sind zur Umsetzung vorzugsweise mit der ó'-Methylaminogruppe und gegebenenfalls mit der 2'-Aminogruppe der 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B-Verbindung II und in der Folge leicht abspaltbar sind aus den acylierten Derivaten VI, wie sie beim erfindungsgemässen Acylierungsschritt entstehen.

Zum Beispiel kann 2'-N-6'-di-t-Butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B ein vorzugsweise verwendetes Ausgangsmaterial in guter Ausbeute erhalten werden durch Umsetzung von ó'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B in Lösung mit einem Gemisch von Pyridin, Wasser und Triäthyl-amin mit dem 2- bis 3-fach molaren Anteil an t-Butoxycarbo-nylazid, welches tropfenweise unter Schütteln hinzugefügt wird, Rühren des erhaltenen Gemisches bei Zimmertemperatur über Nacht, Einengen des Reaktionsgemisches zur Trockne im Vakuum und hernach Reinigen der festen Rückstände vermittels Säulenchromatographie oder alternativ durch Umsetzung von ó'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B in Form seiner wässrigen Lösung mit der 2- bis 3-fach molaren Menge an t-Butyl-S-4,6-dimethylpyrimid-2-yl-thiocarbonat, welches dazu unter Schütteln hinzugefügt wird, Rühren des erhaltenen Gemisches bei Zimmertemperatur über Nacht, Einengen des Reaktionsgemisches zur Trockne im Vakuum und Reinigen des erhaltenen Rückstandes durch Säulenchromatographie. Die Reinigung des dabei erhaltenen festen Rückstandes vermittels Säulenchromatographie kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Kationaustauschharzes mit Carboxylfunktionen, z. B. einem Copolymeren aus Methacryl-säure mit Divinylbenzol, wie es beispielsweise bekannt ist als « Amberlite CG 50» (Ammoniumform, handelsüblich erhältlich von Röhm und Haas, USA). Der in vorgenannter Weise erhaltene feste Rückstand besteht im wesentlichen aus den erwünschten 2'-N,6'-N-di-t-Butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4/-dideoxykanamycin B und ó'-N-mono-t-Butoxycarbonyl-ó'-N-methyl-3',4'dideoxykanamycin B und kann direkt als Ausgangsprodukt für den erfindungsgemässen Acylierungsschritt verwendet werden.

In der a-Hydroxy-co-aminosäure V, welche als Acylierungs-reagens verwendet wird, kann die Aminoschutzgruppe R3 gleichfalls eine solche sein, wie sie üblicherweise bei der Peptidsynthese Anwendung findet. Vorzugsweise wird im Acylie-rungsreagens der Formel V die gleiche Aminoschutzgruppe verwendet, wie im als Ausgangsstoff gebrauchten, aminogeschützten 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B-Derivat IV. Die Herstellung des a-Hydroxy-co-aminosäurereagens V mit der blockierten Aminogruppe kann in gleicher Weise durchgeführt werden wie die Herstellung des aminogeschützten 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B-Derivates IV. Falls die Gruppen R3 und R4 zusammen eine zweiwertige Aminoschutz-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

615 685

grappe bilden, so kann es sich hierbei vorzugsweise um Phtha-loyl oder Salicyliden handeln oder allgemein gesprochen um einen Alkyliden- oder Arylidenrest der Formel = CHRs, worin Rs Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wie Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl oder Pentyl. In Frage kommt auch Aryl, wie Phenyl, Tolyl, p-Methoxyphenyl oder Hydroxyphe-nyl. Die Herstellung des a-Hydroxy-to-aminosäurereagens V, worin die co-Aminogruppe blockiert ist durch eine zweiwertige Aminoschutzgruppe der Formel = CHRs kann durchgeführt werden durch Alkylidenierung oder Arylidenierung der co-Aminogruppe, indem man das a-Hydroxy-co-aminosäurerea-gens V umsetzt mit einer im wesentlichen äquimolaren Menge eines Aldehyds der Formel VIII

OHC-Rs (VIII)

in an sich bekannter Weise zur Herstellung von Schiff-Basen. R5 hat die oben angegebene Bedeutimg. Geeignete Aldehyde für diesen Zweck sind z. B. Acetaldehyd, Anisaldehyd, Tolual-dehyd, p-Nitrobenzaldehyd und Salicylaldehyd.

Die a-Hydroxy-oa-aminosäure-Verbindung V, wie sie im vorliegenden Verfahren verwendet wird, kann entweder in Form des racemischen Gemisches oder in optisch aktiver Form vorliegen, wie dem L-Isomeren und dem D-Isomeren. Indessen ist vorzuziehen, dass die a-Hydroxy-y-aminobuttersäure, eine Verbindung der Formel III, worin n = 2 ist, und die a-Hydroxy-ö-aminovaleriansäure, eine Verbindung der Formel III, worin n = 3 ist, Verwendung findet in Form des optisch aktiven L-Isomeren, da das hierbei entstandene Produkt höhere antibakterielle Wirksamkeit aufweist als das aus dem D-Isomeren abgeleitete Endprodukt.

Im erfindungsgemässen Acylierungsschritt kann das Amino-geschützte ó'-N-Methyl-S'^'-dideoxykanamycin B-Derivat IV mit dem a-Hydroxy-co-aminosäurereagens V in an sich bekannter, zur Herstellung von Amiden, üblicher Weise umgesetzt werden. Demgemäss kann die Ausgangsverbindung IV umgesetzt werden mit dem Acylierungsreagens V in Lösung von wasserfreiem Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahy-drofuran unter Eiskühlung und in Gegenwart eines Entwässerungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid. Selbstverständlich kann das a-Hydroxy-co-aminosäurereagens V gleichfalls angewendet werden in Form eines funktionellen Derivats, wie dem Säurechlorid, dem Mischanhydrid, einem aktiven Ester oder einem Azidderivat davon. Zum Beispiel kann das a-Hydroxy-co-aminosäurereagens V zuerst umgesetzt werden mit n-Hydrosuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid als Entwässerungsmitte], wobei zunächst der aktive Ester der Formel V' entsteht

^r3

N-00C-CH(0H)-(CH2) NT

x,0 X <*•>

Diese Verbindung wird hernach umgesetzt mit dem Ausgangsprodukt IV zur N-Acylierung der letzteren Verbindung. Dabei ist vorzuziehen, dass die Ausgangsverbindung IV umgesetzt wird mit einem 0,5- bis 3-fachen molaren Anteil und vorzugsweise mit dem 0,5- bis 172-fachen molaren Anteil des aktiven Esters der a-Hydroxy-aminosäure-Verbindung V' in einem Reaktionsmedium, welches aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel wie Dimethoxyäthan besteht.

Beim erfindungsgemässen Acylierungsschritt entsteht in der Regel ein Gemisch von gemischten N-acylierten Derivaten der Ausgangsverbindung IV. Dieses Gemisch enthält in der Regel ein Gemenge des erwünschten 1-N-mono-acylierten Derivates und anderer unerwünschter mono-N-acylierter Derivate sowie unerwünschter poly-N-acylierter Derivate. Das so erhaltene Gemisch kann direkt behandelt werden zur Entfernung aller Aminoschutzgruppen daraus, d. h. zur Umwandlung der verbliebenen Aminoschutzgruppen in Wasserstoffatome. Die Abspaltung der Aminoschutzgruppen aus den vorerwähnten gemischten N-acylierten Derivaten, wie sie beim Acylierungsschritt entstanden sind, kann auf die nachfolgenden verschiedenen, an sich bekannten Arten, erfolgen. Falls die Aminoschutzgruppe ein Alkyloxycarbonylrest wie t-Butoxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, Alkyliden oder Aryliden ist, so kann die Abspaltung von Aminoschutzgruppen dieser Art erfolgen, indem man die gemischten N-acylierten Derivate einer milden Hydrolyse unterwirft, wie z. B. mit wässriger Trifluoressigsäure, wässriger Essigsäure oder verdünnter Salzsäure. Falls die Aminoschutzgruppe Aralkyloxy-carbonyl ist, wie z. B. Benzyloxycarbonyl, so kann die Abspaltung dieser Art Aminoschutzgruppen durchgeführt werden, indem man die gemischten N-acylierten Derivate einer Hydrierung in Gegenwart von Palladium-Kohle oder Platinschwarz als Katalysator unterwirft, oder indem man eine Behandlung mit Bromwasserstoff in Essigsäure bei niedriger Temperatur durchführt. Die o-Nitrophenoxyacetylamino-Schutzgruppe kann entfernt werden durch Reduktion. Falls die Aminoschutzgruppe Phthaloyl ist, so kann die Phthaloylgruppe abgespalten werden durch Behandlung der gemischten N-acylierten Derivate mit Hydrazinhydrat in Äthanol. Falls die N-acylierten Derivate verschiedene Arten von Aminoschutzgruppen enthalten, so können die N-acylierten Derivate gleichzeitig oder nacheinander verschiedenen Behandlungen zur Abspaltung der verschiedenen Aminoschutzgruppen daraus unterworfen werden.

Die Abspaltung der verbliebenen Aminoschutzgruppen ergibt ein Gemisch aus den verschiedenen N-acylierten Produkten, entstanden aus ó'-N-Methyl-S'^'-dideoxykanamycin B. Dieses Gemisch besteht aus dem erwünschten Endprodukt l-N-(a-Hydroxy-co-aminoalkanoyl)-6/-N-methyl-3/,4'-dide-oxykanamycin B der Formel I, seinen Stellungsisomeren und den poly-N-acylierten Produkten, zusammen mit einem Anteil nicht umgesetzten ó'-N-Methyl-S'^'-dideoxykanamycin B. Die Abtrennung des erwünschten Endproduktes der Formel I lässt sich wirkungsvoll durchführen, indem man das Gemisch der Säulenchromatographie unterwirft, z. B. am Silicagel oder einem Kationenaustauschharz mit Carboxylfunktionen, wie z. B. «Amberlite IRC 50» oder «Amberlite CG 50» (Produkte von Röhm & Haas USA), einem schwachen Kationenaustauscher, wie z. B. «CM-Cephadex C-25» (ein Produkt der Pharmacia Schweden) oder Carboxymethylcellulose. Dabei wird das Eluat aus dem chromatographischen Verfahren in einzelnen Fraktionen gesammelt, deren antibakterielle Aktivität bestimmt wird unter Verwendung empfindlicher und resistenter Bakterien als Testmikroorganismen. Durch die Bestimmung der antibakteriellen Aktivität jeder Fraktion ist es verhältnismässig einfach, die aktiven Fraktionen zu erhalten,

worin die erwünschte Verbindung der Formel I ist. Ein Anteil dieser aktiven Fraktionen wurde der Dünnschichtchromatographie an Silicagel unterworfen, wobei als Lösungsmittelsystem z. B. ein Gemisch aus Butanol-Äthanol-Chloroform-17% wässrigem Ammoniak verwendet wurde. Auf diese Weise war es möglich, diejenigen Fraktionen zu bestimmen, welche einen einzigen Fleck mit dem spezifischen Rf-Wert des erwünschten l-N-(a-Hydroxy-to-aminoalkanoyl)-6/-N-methyl-3/,4/-dide-oxykanamycin B der Formel I ergaben und damit das erwünschte Produkt zu isolieren. Diese Fraktionen können vereinigt werden und nachfolgend zur Trockne konzentriert unter vermindertem Druck, wobei die erwünschte Verbindung I erhalten wird.

s

10

IS

20

25

3»

35

40

45

50

55

60

65

615 685

12

Beispiel 1

Herstellung von l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6M^-methyl-3^4'-dideoxykanamycin B (eine Verbindung der Formel I, worin n = 2 ist)

(a) Zu einer Lösung von 930 mg = 2 mMol ö'-N-Methyl-S'^'-dideoxykanamycin B in 5 ml Wasser wurde eine Lösung von 960 mg (4 mMol) t-Butyl-S-4,6-dimethylpyrimid-2-ylthio-carbonat in 5 ml Dioxan hinzugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, um die t-Butoxy-carbonylierung durchzuführen. Nachher wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt und ergab einen festen Rückstand. Dieser Rückstand wurde aufgenommen in 40 ml Wasser und der unlösliche Anteil abfiltriert. Das Filtrat wurde durch eine Säule (20 X 290 mm) von 100 ml Kationenaustauschharz «Amberlite CG 50» (NHt-Form) durchlaufen gelassen zwecks Adsorption des t-Butoxycarbony-lierungsproduktes am Harz. Die Harzsäule wurde gewaschen mit 500 ml Wasser und hernach eluiert mit 0,1-n wässrigem Ammoniak. Diejenigen Fraktionen des Eluates, welche positive Ninhydrinreaktion bzw. Rydon-Smith-Reaktion ergaben und die gleichfalls einen Hauptfleck mit dem Rf-Wert 0,60 bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung von Butanol-Äthanol-Chloroform-17%igem Ammoniak (4:5:2:3 Volumteile) zeigten, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt. Dabei wurden 538 mg eines farblosen, zur Hauptsache aus 2'-N-6'-N-di-t-Butoxycarbonyl-ö'-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B bestehenden Pulvers erhalten. Ausbeute 41%.

b) 100 mg dieses farblosen Pulvers, entsprechend 0,15 mMol, wurden aufgelöst in einem Gemisch von 1 ml Wasser und 1 ml Dimethoxyäthan und die erhaltene Lösung hinzugefügt zu einer Lösung von 54 mg, entsprechend 0,17 mMol, N-Hydroxysuccinimidester der L-4-t-Butoxycarbonylamido-2-hydroxybuttersäure in 2 ml Dimethoxymethan. Das Gemisch wurde 22 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt zwecks Durchführung der Acylierung des aminogeschützten 6'-N-Methyl-S'^'-dideoxykanamycin B. Anschliessend wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft und ergab einen festen Rückstand, welcher aus den gemischten N-acylierten Derivaten des N-geschützten 6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B bestand.

(c) Der feste Rückstand aus dem Verfahrensschritt (b)

wurde aufgelöst in 2,4 ml wässriger Trifluoressigsäure und die Lösung eine Stunde lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, zwecks Abspaltung der t-Butoxycarbonylgruppe. Das Reaktionsgemisch wurde hernach zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand aufgenommen in 4 ml Wasser. Die Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem wässrigem Ammoniak auf pH 8 eingestellt und anschliessend durchlaufen gelassen durch eine Säule (8 X 400 mm) aus 20 ml Kationaustauschharz «Amberlite CG 50» (NHt-Form) zur Adsorption des gemischten N-acylierten ó'-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B am Harz. Nachher wurde die Harzsäule nacheinander gewaschen mit 100 ml Wasser, mit 100 ml 0,3-n wässrigem Ammoniak und mit 0,5-n wässrigem Ammoniak. Schliesslich wurde die Harzsäule eluiert mit 0,75-n wässrigem Ammoniak. Das Eluat wurde gesammelt in 2 ml-Fraktionen, wobei jede Fraktion getestet wurde mit einem üblichen Plattentest auf ihre antibakterielle Wirksamkeit gegenüber kanamycinempfindlichem Bacillus subtilis PCI 219 und kanamycinresistentem Escherichia coli JR66/W677. Diejenigen Fraktionen, welche hohe antibakterielle Wirksamkeit gegenüber beiden der vorgenannten Stämme aufweisen, wurden miteinander auf ein Volumen von 26 ml vereinigt und hernach zur Trockne eingeengt. Erhalten wurden dabei 39 mg eines farblosen Pulvers, welches zur Hauptsache aus dem erwünschten l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B bestand. Zur weiteren Reinigung wurde dieses farblose Pulver aufgelöst in 0,5 ml Methanol-Chloroform-17%igem wässrigem Ammoniak (4:1:2 Volumteile) und die erhaltene Lösung der Säulenchromatographie an 3 g Silicagel unter Verwendung des gleichen Lösungs-mittelgemisches als Eluierlösung unterworfen. Das Eluat wurde gesammelt in 1 ml-Fraktionen und die Fraktionen Nr. 46 bis 78 enthielten dabei das l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybu-tyryty-ö'-N-methyl-S'^'dideoxykanamycin B. Diese Substanz ergab einen einzelnen Flecken mit dem Rf-Wert 0,38 bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel («ART» 5721)

unter Verwendung von Butanol-Äthanol-Chloroform-28%igem wässrigem Ammoniak (4:5:2:8 Volumteile) als Elu-iermittel. Diese Fraktionen wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt. Erhalten wurden dabei 15 mg reines 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxy-kanamycin B als farbloses Pulver. Zersetzungstemperatur 158 bis 161°C.

Beispiel 2

Herstellung von l-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B (eine Verbindung der Formel I, worin n = 1 ist)

(a) 403 mg des farblosen Pulvers, zur Hauptsache bestehend aus 2'-N-6'-di-t-Butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxyka-namycin B (0,6 mMol), erhalten gemäss Beispiel 1 (a), wurden aufgelöst in einem Gemisch von 4 ml Wasser und 4 ml Dimethoxyäthan. Die so erhaltene Lösung wurde vermischt mit einer Lösung von 221 mg (0,66 mMol) des N-Hydroxysuc-cinimidesters von N-t-Butoxycarbonyl-DL-isoserin in 8 ml Dimethoxyäthan. Das Gemisch wurde 23V2 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt zwecks Ausführung der Acylierung. Dann wurde das Reaktionsgemenge unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei eine feste Substanz zurückblieb, die zur Hauptsache aus den gemischten N-acylierten Derivaten von 2'-N-6'-N-di-t-Butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B bestand.

(b) Der so erhaltene feste Rückstand wurde aufgelöst in 7,5 ml wässriger Trifluoressigsäure und die Lösung eine Stunde lang bei Zimmertemperatur zur Abspaltung der t-Butoxycarbonylgruppe stehen gelassen. Dann wurde das Reaktionsgemenge unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der Rückstand aufgelöst in 16 ml Wasser. Die so erhaltene wässrige Lösung wurde mit konzentriertem Ammoniak auf den pH-Wert 8 gebracht und hierauf aufgebracht auf eine Säule von 43 ml Kationaustauschharz (10X560 mm) «Amberlite CG 50» (NH4-Form) zur Adsorption des gemischten N-acylierten Produktes. Nim wurde die Harzsäule gewaschen mit 200 ml Wasser und dann mit 400 ml 0,3-n wässrigem Ammoniak und schliesslich eluiert mit 0,5-n wässrigem Ammoniak. Das Eluat wurde gesammelt in 4 ml-Fraktionen, wobei jede Fraktion nach einer üblichen Plattenmethode getestet wurde auf ihre antibakterielle Aktivität gegenüber Bacillus subtilis PCI 219 und Escherichia coli JR66/ W677. Diejenigen Fraktionen, welche hohe antibakterielle Aktivität gegenüber diesen beiden Stämmen zeigten, wurden miteinander vereinigt auf ein Volumen von 100 ml und hernach zur Trockne eingedampft. Dabei blieben 135 mg eines farblosen Pulvers zurück, welches hauptsächlich aus dem erwünschten Produkt l-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4/-dideoxykanamycin B bestand. Zur weiteren Reinigung wurde dieses farblose Pulver aufgelöst in 2,6 ml Methanol-Chloro-form-17%igem wässrigem Ammoniak (4:1:2 Volumteile) und die erhaltene Lösung der Säulenchromatographie an 8 g Silicagel unterworfen unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelgemisches als Buiermittel. Das Éluat wurde gesammelt in

2 ml-Fraktionen, wobei die Fraktionen Nr. 20 bis 27 offensichtlich das gewünschte Produkt allein enthielten. Dieses Produkt ergab einen einzelnen Fleck mit dem Rf-Wert 0,51 bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel («ART»

s

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

SS

«0

65

13

615 685

5721) unter Verwendung von Butanol-Äthanol-Chloroform-28 %igem Ammoniak (4:5:2:8 Volumteile) als Eluiermittel.

Diese Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Sie ergaben 38 mg reines l-N-(DL-Isoseryl)-6'-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B als farbloses Pulver. Zersetzungs- s temperarur 165 bis 169°C.

Beispiel 3

Herstellung von l-N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B (eine Verbindung der Formel I, w worin n = 1 ist)

(a) 465 mg = 3,2 mMol t-Butoxycarbonylazid wurden hinzugefügt zu einer Lösung von 500 mg = 1,1 mMol 6'-N-Methyl-3 ',4'-dideoxykanamycin B in einem Gemisch von

21 ml Pyridin, 21 ml Triäthylamin und 12,6 ml Wasser. Das is Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt zwecks Durchführung der t-Butoxycarbonylierung. Dann wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt und ergab 727 mg eines farblosen Pulvers, welches zur Hauptsache eine Mischung von 2/-N-6/-N-di-t- m Butoxycarbonyl- 6 ' -N-methyl-3 ' ,4 ' -dideoxykanamycin B und 6 ' -N-t-Butoxycarbonyl-6 ' -N-methyl- 3 ' ,4 ' -dideoxykanamycin B darstellte.

(b) 510 mg des so erhaltenen farblosen Pulvers, bestehend zur Hauptsache aus den aminogeschützten Derivaten von 6'- 25 N-MethyW^'-dideoxykanamycin B wurden ohne weitere Reinigung aufgelöst in einem Gemisch von 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan. Zur erhaltenen Lösung wurden 254 mg = 0,84 mMol des N-Hydroxysuccinimidesters von N-t-Butoxy-carbonyl-L-isoserin in 10 ml Dimethoxyäthan hinzugegeben. 30 Dieses Gemisch wurde 19 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt zur Durchführung der Acylierung. Das Reaktionsgemenge wurde hernach unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und ergab 794 mg eines festen Rückstandes, bestehend aus den gemischten N-acylierten Derivaten von 35 2'-N-6'-N-di-t-Butoxycarbonyl- und 6'-N-t-Butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3 ',4'-dideoxykanamycin B.

(c) Der erhaltene feste Rückstand wurde behandelt mit wässriger Trifluoressigsäure zur Abspaltung der t-Butoxycar-bonylgruppe und hernach einer Reinigung unterworfen vermit- 40 tels Säulenchromatographie mit «Amberlite CG 50» und anschliessend einer Reinigung vermittels Säulenchromatographie an Silicagel in gleicher Weise wie in Beispiel 2 (b). Mit einer Ausbeute von 34 g wurde reines 1 -N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-SVt'-dideoxykanamycin B als farbloses Pulver erhalten. 45

Zersetungstemperatur 162 bis 166°C.

Beispiel 4

Herstellung von l-N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-

ó'-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B (eine Verbindung der Formel I, worin n = 3 ist.

(a) 500 mg des farblosen Pulvers, bestehend zur Hauptsache aus einem Gemisch von 2/-N-6'-N-di-t-Butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycinB und 6'-N-t-Butoxycarbonyl-ó'-N-methyW^'-dideoxykanamycin B, hergestellt gemäss Beispiel 3 (a), wurde ohne weitere Reinigung aufgelöst in einem Gemenge von 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan. Zur erhaltenen Lösung wurde eine Lösung von 278 mg = 0,84 mMol des N-Hydroxysuccinimidesters von L-5-t-Butoxycarbo-nylamido-2-hydroxyvaleriansäure in 10 ml Dimethoxyäthan hinzugefügt. Das Gemenge wurde 18 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt zur Ausführung der Acylierung. Dann wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und ergab 834 mg festen Rückstand, bestehend aus den gemischten N-acylierten Derivaten des 2/-N-6/-N-di-t-Butoxycarbonyl- und ó'-N-t-Butoxycarbonyl-ó'-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B.

(b) Der erhaltene feste Rückstand wurde aufgelöst in 8 ml wässriger Trifluoressigsäure und die Lösung eine Stunde lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen zwecks Abspaltung der t-Butoxycarbonylgruppe. Das erhaltene Reaktionsgemenge wurde zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt und der so erhaltene Rückstand aufgenommen in 16 ml Wasser. Die erhaltene wässrige Lösung wurde auf den pH-Wert 8,4 durch Zugabe von konzentriertem Ammoniak gebracht und hernach adsorbiert an einer Säule (10 X 560 mm) aus 40 ml «Amberlite CG 50» (NHt-Form). Nachdem die Säule gewaschen worden war, nacheinander mit 2 ml Wasser, 250 ml 0,3-n wässrigem Ammoniak und mit 240 ml 0,5-n wässrigem Ammoniak, wurde eluiert mit 0,75-n wässrigem Ammoniak. Das Eluat wurde gesammelt in 4 ml-Fraktionen und diejenigen Fraktionen, welche hohe antibakterielle Aktivität gegenüber Bacilus subtilis PCI 219 und Escherichia coli JR66/W677 zeigten, wurden miteinander auf ein Volumen von 60 ml vereinigt. Anschliessend wurde zur Trockne konzentriert und hernach chromatographiert auf einer Silicagelsäule in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (c). Mit einer Ausbeute von 29 mg wurde reines l-N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-6/-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B als farbloses Pulver erhalten. Zersetzungstemperatur 152 bis 155°C.

B

Claims

615 685 PATENTANSPRÜCHE

.1

X30*

choh' .

(CHa)X^

die Amino-Schutzgrappen abgespalten werden. Rj, N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-6'-N-methyl-3/,4/-dideoxy-

1. Verfahren zur Herstellung eines l-N-(a-Hydroxy-co- aminoalkanoyl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycins B der Formel

. .. 6"

ot2°h^0

CO CHOH

CÇ«2>n

NH_

worin n 1,2 oder 3 ist, oder eines pharmazeutisch vertrag- dass die 1-Aminogruppe eines aminogeschützten Derivats von liehen Säureadditionssalzes davon, dadurch gekennzeichnet, ó'-N-Methyl-S'^'-dideoxykanamycins B der Formel

6"

CH^OH
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- kanamycin B oder eines pharmazeutisch verträglichen Säurenet, dass zur selektiven Acylierung ausgegangen wird von 2'-N-6/-N-di-t-Butoxycarbonyl-6/-N-methyl-3/,4/-dideoxykana-mycinB oder von 6'-N-t-Butoxycarbonyl-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B oder einem Gemisch davon.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Acylierung als funktionelles Derivat der a-Hydroxy-aj-aminosäure der Formel V, deren Säurechlorid,

Mischanhydrid, aktiver Ester oder Azid verwendet wird, vorzugsweise der aktive N-Hydroxysuccinimidester.

3

615 685

6"

H" CHgOH 0

h2n

(VI)

additionssalzes davon.

25

HN-
4. Verfahren nach Patentanspruch 1 zur Herstellung von 1-N^DL-Isoseryty-ó'-N-methyW^'-dideoxykanamycin B oder eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon.
5

615 685

E) Die gemäss der vorliegenden Erfindung herstellbaren Verbindungen sind beschrieben in The Journal of Antibiotics, die Formel 28, 340 (1975).

0

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen haben

CHOH HH„

In dieser Formel ist n 1, 2 oder 3. Die Erfindung betrifft auch die Herstellung pharmazeutisch verträglicher Säureadditionssalze dieser Verbindungen. Bei den so hergestellten Verbindungen handelt es sich um wertvolle antibakterielle Agenzien, die zur Behandlung infektiöser bakterieller Erkrankungen bei Tieren benutzt werden können.

Die Kanamycine A und B sind bekannte Aminoglykosid-Antibiotika und haben weitverbreitete Anwendung gefunden als chemotherapeutische Agenzien. Indessen haben sich in den letzten Jahren manche kanamycinresistente Bakterienstämme entwickelt. So wurde zum Beispiel gefunden, dass einige den R-Faktor aufweisende Stämme Gram-negativer Bakterien, wie Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa, aus Patienten isoliert werden konnten, welche sich als resistent erwiesen gegenüber der antibakteriellen Wirkung der Kanamycine. Die Wirkungsweise der kanamycinresistenten Bakterien gegenüber den bekannten aminoglykosidischen Antibiotika wurde studiert von H. Umezawa und Mitarbeitern, Advances in Carbo-hydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 30, Seiten 183-225,

ss

«0

1974, Academic Press. Dabei wurde entdeckt, dass gewisse kanamycinresistente Bakterien Enzyme produzieren, welche die 3'-Hydroxylgruppe der Kanamycine phosphorylieren und die Kanamycine über diese Phosphortransferase inaktivieren. Weiter produzieren gewisse kanamycinresistente Bakterien ein Enzym, welches die 2 "-Hydroxylgrupp e der Kanamycine nukleotiert und hierdurch die Kanamycine inaktiviert über eine Nukleotid-Transferase. Schliesslich zeigte sich, dass gewisse andere kanamycinresistente Bakterien Enzyme produzieren, welche die ó'-Aminogruppe der Kanamycine acetylie-ren und auf diese Weise die Kanamycine über solche Acetyl-transferasen inaktivieren. Auf diese Weise wurde die Molekülstruktur der aminoglykosidischen Antibiotika in Beziehung zu ihrer antibakteriellen Wirksamkeit aufgeklärt, ebenso wie der biochemische Mechanismus der Widerstandsfähigkeit von kanamycinresistenten Bakterien gegenüber den aminoglykosidischen Antibiotika.

Verschiedene halbsynthetische Derivate von Kanamycinen, welche gegenüber kanamycinresistenten Bakterien wirksam

615 685

5. Verfahren nach Patentanspruch 1 zur Herstellung von 1-(N-(L-Isoseryl)-6'-N-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B oder eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon.

6. Verfahren nach Patentanspruch 1 zur Herstellung von 1-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6/-N-methyl-3/,4'-dideoxy-kanamycin B oder eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon.

7. Verfahren nach Patentanspruch 1 zur Herstellung von 1-

30

40

45

Es hat sich gezeigt, dass eine Anzahl von Verbindungen des Typs l-N-(a-Hydroxy-(ü-aminoalkanoyl)-6/-N-methyl-3/,4'-dideoxykanamycin B ausgezeichnete antibakterielle Wirksamkeit aufweist gegenüber den meisten auf Kanamycin ansprechenden bzw. dagegen resistenten Organismen. Insbesondere besitzen diese erwünschte Eigenschaft die Verbindungen 1-N-(DL-IsoserylJ-ö'-N-methyl-S'^-dideoxykanamycin B, 1-N-(L-Isoseryty-ó'-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B, l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-6'-N-methyl-3/,4/-dideoxykanamy-cin B und l-N-(L-5-Amino-2-hydroxyvaleryl)-6'-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B bzw. die Säureadditionssalze dieser Verbindungen.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung neuer semisynthetischer in 1-Stel-lung substituierter Derivate von ó'-N-methyl-S'^'-dideoxykanamycin B der Formel I durch selektive Acylierung der 1-Aminofunktion mit einem entsprechenden a-Hydroxy-co-aminoalkanoylderivat.

Zum Stand der Technik A) Kanamycin B ist eine bekannte antibiotische Verbindung, beschrieben im Merck Index 8. Auflage, Seiten 597-598. Sie hat die Formel nh2

HO —Tfr h2n:

615 685 4

B) 6'-N-Methyl-3',4'-dideoxykanamycin B ist eine bekannte Verbindung, beschrieben im britischen Patent Nr. 1 384 221. Sie hat die Formel

C) 3',4'-Dideoxykanamycin B ist beschrieben im US Patent Nr. 3 753 973 und hat die Formel

, D)- i-ML^-Ämmo^-hydroxybutyryO-kanamycin A und 1- N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin B sind beschrieben im US Patent Nr. 3 781 268 und haben die Formel

5» 6,2 XCH3

worin Ri eine einwertige Amino-Schutzgruppe und R2 Was- ss selektiv aeyliert wird mit einer a-Hydroxy-co-aminosäure der serstoff oder eine einwertige Amino-Schutzgruppe darstellt, Formel

R3

^N-(CH2)n-CH(OH)-COOH (V)

RV

oder einem funktionellen Derivat davon, worin R3 eine bedeuten, worauf aus dem so erhaltenen 1-N-acylierten Pro-

Amino-Schutzgruppe und R4 Wasserstoff ist, oder worin R3 diikt: der Formel und R4 zusammen eine zweiwertige Amino-Schutzgruppe
6

sind, wurden synthetisiert aus verwandten Kanamycinen. So wurden z. B. hergestellt das 3',4'-Dideoxykanamycin B (US Patent Nr. 3 753 973), das ö'-N-Methyl-S'^'-dideoxykanamy-cin B (britisches Patent Nr. 1 384 221), das l-N-(L-4-Amino-2-hydroxybutyryl)-kanamycin A und -kanamycin B (US Patent Nr. 3 781268) und ein l-N-(a-Hydroxy-m-aminoalkanoyl)-3',4'-dideoxykanamycin B (DT-OS Nr. 2 350 169). Diese halbsynthetischen Kanamycinderivate haben sich als wirksam erwiesen gegenüber einer grossen Zahl von kanamycinresistenten Bakterien.