DE2818992C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die durch die Ansprüche gekennzeichneten Gegenstände.

Kanamycine sind bekannte Antibiotika. Sie sind beispielsweise im Merck Index, 8. Ausgabe, Seiten 597 bis 598, beschrieben. Es gibt auch zahlreiche Derivate der Kanamycine. Die Strukturformeln der Kanamycine A und B sind nachstehend angegeben. Dort findet sich auch das allgemein verwendete Standardnumerierungssystem. Nachstehend werden die verschiedenen Kanamycinderivate der Einfachheit halber als Derivate des Kanamycins A oder B bezeichnet.

Kanamycin A:R = OH Kanamycin B:R = NH₂

Die US-Patentschrift 37 81 268 offenbart das 1-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyl]kanamycin A (Amikacin) und B, sowie deren Mono- und Dicarbobenzyloxy-geschützten Derivate. Höhere und niedrigere Homologe sind in den US-Patentschriften 38 86 139 und 39 04 597 offenbart. Die Verbindungen werden hergestellt, indem man ein 6′-N-geschütztes Kanamycin A oder B mit einem acylierenden Derivat einer N-geschützten L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybuttersäure in einem wässerigen Medium acyliert und anschließend eine oder beide N-schützenden Gruppen entfernt.

Die US-Patentschrift 39 74 137 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von 1-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, das darin besteht, daß man 6′-Carbobenzyloxykanamycin A mit mindestens 3 Mol Benzaldehyd, einem substituierten Benzaldehyd oder Pivaldehyd umsetzt, um das 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A, welches Schiff'sche Baseneinheiten an den 1,3- und 3′′-Positionen enthält, herzustellen und dann dieses Tetra-geschützte Kanamycin A-Derivat mit dem N-Hydroxysuccinimidester der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure acyliert und anschließend die Schutzgruppen entfernt.

Die belgische Patentschrift 8 28 192 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von 1-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A durch Herstellung desselben Tetra-geschützten Kanamycin A-Derivats wie in der US-Patentschrift 39 74 137 beschrieben, anschließendes Acylieren mit dem N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure und schließlich Entfernen der Schutzgruppen.

In Anal. Chem. 42, 1970, 1661-3; Chem. Abstr. 79, 1973, Referat Nr. 83 498 und in J. Antibiotics 24, 1971, 430-4 sind silylierte Kanamycin-Derivate beschrieben. Es handelt sich dabei jedoch um persilylierte Derivate.

In den Chemical Abstracts 83, 1975, Referat Nr. 43 692 und 83, 1975, Referat Nr. 179 524 ist die Acylierung von Kanamycin-Derivaten beschrieben. Es wird dabei jedoch nicht von silylierten Derivaten ausgegangen.

Erfindungsgemäß wird ein verbessertes und wirtschaftlich durchführbares Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I bereitgestellt. Die erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial eingesetzten Kanamycine A und B sind polysilyliert und dadurch in organischen Lösungsmittelsystemen gut löslich. Die Reaktion kann daher bei hohen Konzentrationen durchgeführt werden. Obgleich man die Reaktion üblicherweise in Lösungen durchführt, die ungefähr 10 bis 20% polysilyliertes Kanamycin-Ausgangsmaterial enthalten, erzielt man auch ausgezeichnete Ergebnisse bei Konzentrationen von ungefähr 50 g/100 ml Lösungsmittel.

Wie bei den Arbeitsweisen des Standes der Technik ergibt das erfindungsgemäße Verfahren eine Mischung acyclierter Produkte. Das gewünschte 1-N-acylierte Produkt wird von den anderen Produkten durch Chromatographie abgetrennt. Gewünschtenfalls kann man die Nebenprodukte zum Ausgangskanamycin hydrolysieren, um dieses wieder einzusetzen. Im Gegensatz hierzu wurde bei den Arbeitsweisen des Standes der Technik festgestellt, daß jegliches gebildetes in 3′′-Stellung N-acyliertes Material den Verlust einer ungefähr gleichen Menge des gewünschten In 1-Stellung N-acylierten Produkts bedeutete und zwar aufgrund der großen Schwierigkeit, letzteres von der ersten Verbindung abzutrennen. Erfindungsgemäß wird nur eine extrem geringe Menge an unerwünschtem in 3′′-Stellung N-acylierten Produkt gebildet (üblicherweise läßt sich die Anwesenheit dieses Produkts überhaupt nicht feststellen).

Wenn man das 1-[L-(-)-α-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, d. h. das Amikacin nach verschiedenen Arbeitsweisen des Standes der Technik herstellt, wird üblicherweise auch das in 3′′-Stellung N-acylierte Produkt (BB-K11), das in 3-Stellung N-acylierte Produkt (BB-K29), das in 6′-Stellung N-acylierte Produkt (BB-K6) und polyacyliertes Material gebildet. Ferner fällt unumgesetztes Kanamycin A an. Es wurde somit bei der Herstellung von Amikacin in industriellem Maßstab durch Acylierung von 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A in einem wässerigen Medium, gefolgt von Entfernen der Schutzgruppe, festgestellt, daß ungefähr 10% des gewünschten Amikacins (2,5 kg bei einem Ansatz von 25 kg) üblicherweise verlorengeht, und zwar aufgrund der Anwesenheit von BB-K11 als Nebenprodukt. Wenn man dagegen Amikacin durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellt, läßt sich üblicherweise das BB-K11 in der Reaktionsmischung noch nicht einmal nachweisen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von 1-N-(ω-Amino-α-hydroxyalkanoyl)kanamycinen A oder B der allgemeinen Formel I:

in der

Rfür OH oder NH₂ steht und neine ganze Zahl von 0 bis 2 darstellt,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

• a) in einem organischen Lösungsmittel und gegebenenfalls in Gegenwart eines Sliylierungskatalysators,
  • a₁) Kanamycin A oder B oder
  • a₂) Kanamycin A oder B, das an der 6′-Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe aufweist, mit einem Silylierungsreagens umsetzt,
• b) das erhaltene Produkt mit einem acylierenden Derivat einer Säure der allgemeinen Formel II: in derneine ganze Zahl von 0 bis 2 und Beine Aminoschutzgruppe darstellt,in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und
• c) sämtliche Schutzgruppen abspaltet

Die nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze dieser Verbindungen können auf übliche Weise hergestellt werden.

Bei den zum Schützen der 6′-Aminogruppe des Kanamycins und der Aminogruppe der acylierenden Säure (Gruppe B in Formel II) verwendeten Schutzgruppe handelt es sich um übliche Schutzgruppen für primäre Aminogruppen. Diese sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören Alkoxycarbonylgruppen, beispielsweise tert.-Butoxycarbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl, Aralkoxycarbonylgruppen, beispielsweise Benzyloxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonylgruppen, beispielsweise Cyclohexylcarbonyl, Halogenalkoxycarbonylgruppen, beispielsweise Trichloräthoxycarbonyl, Acylgruppen, beispielsweise Phthaloyl und α-Nitrophenoxyacetyl, und andere bekannte Blockierungsgruppen, beispielsweise die α-Nitrophenylthiogruppe, und die Tritylgruppe.

Die acylierende Säure der allgemeinen Formel II kann in ihrer (+) oder (-) isomeren Form oder als Mischung der beiden Isomeren (d,1-Form) vorliegen. Auf diese Weise wird die entsprechende Verbindung der allgemeinen Formel I gebildet, in der die 1-N-[ω-Amino-α-hydroxyalkanoyl]-Gruppe in ihrer (+) [oder (R)]-Form oder ihrer (-) [oder (S)]-Form, oder in einer Mischung davon, vorliegt. Jede isomere Form, und deren Mischung fallen in den Rahmen der Erfindung. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt die acylierende Säure der allgemeinen Formel II in ihrer (-)-Form vor. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt die acylierende Säure der allgemeinen Formel II in ihrer (+)-Form vor.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Ausgangsmaterial polysilyliertes Kanamycin A oder B (und vorzugsweise polysilyliertes Kanamycin A). In einer anderen Ausführungsform handelt es sich beim Ausgangsmaterial um polysilyliertes Kanamycin A oder B (und vorzugsweise polysilyliertes Kanamycin A), das an der 6′-Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe enthält. Diese Schutzgruppe ist vorzugsweise ausgewählt unter den Gruppen der nachfolgenden Formeln:

worin R¹ und R² gleich oder verschieden sind und jeweils für H, F, Cl, Br, NO₂, OH, (niedrig)Alkyl) oder (niedrig)Alkoxy stehen und X für Cl, Br, F oder J steht und Y die Bedeutungen H, Cl, Br, F oder J besitzt. Die bevorzugteste Schutzgruppe ist die Carbobenzyloxygruppe.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich beim acylierenden Derivat der Säure der allgemeinen Formel II um einen aktiven Ester. Vorzugsweise handelt es sich um den aktiven Ester mit N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid oder N-Hydroxyphthalimid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim acylierenden Derivat der Säure der allgemeinen Formel II um ein Gemisch des Säureanhydrids, vorzugsweise um das Gemisch des Säureanhydrids mit Pivalinsäure, Benzoesäure, Isobutylkohlensäure oder Benzylkohlensäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren findet insbesondere Anwendung zur Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, wobei man polysilyliertes Kanamycin A mit einem gemischten Säureanhydrid der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure (vorzugsweise sein gemischtes Säureanhydrid mit Pivalinsäure, Benzoesäure, Isobutylkohlensäure oder Benzylkohlensäure) in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend sämtliche Schutzgruppen entfernt.

Das erfindungsgemäße Verfahren findet insbesondere zur Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, wobei man polysilyliertes Kanamycin A, das an der 6′-Aminogruppe eine Carbobenzyloxygruppe aufweist, mit einem gemischten Säureanhydrid der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure (vorzugsweise sein gemischtes Anhydrid mit Pivalinsäure, Benzoesäure, Isobutylkohlensäure oder Benzylkohlensäure) in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend alle Schutzgruppen entfernt.

Das erfindungsgemäße Verfahren findet insbesondere zur Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A, wobei man polysilyliertes Kanamycin A mit einem aktiven Ester der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure (und vorzugsweise ihrem aktiven Ester mit N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-nobornen-2,3-dicarboximid oder N-Hydroxyphthalimid) in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend sämtliche Schutzgruppen entfernt.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamaycin A, wobei man polysilyliertes Kanamycin A, das an der 6′-Aminogruppe eine Carbobenzyloxygruppe enthält, mit einem aktiven Ester der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure (und vorzugsweise ihrem aktiven Ester mit N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid oder N-Hydroxyphthalimid) in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend sämtliche Schutzgruppen entfernt.

Erfindungsgemäß herstellbar sind somit das polysilierte Kanamycin A oder B, das an der 6′-Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe enthält. Es handelt sich dabei insbesondere um polysilyliertes Kanamycin A oder B (und vorzugsweise polysilyliertes Kanamycin A), das eine durchschnittliche Anzahl von 4 bis 8 Silylgruppen (vorzugsweise Trimethylsilylgruppen) pro Molekül enthält. Es handelt sich dabei insbesondere um polysilyliertes Kanamycin A oder B (vorzugsweise polysilyliertes Kanamycin A), das an der 6′-Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe aufweist und eine durchschnittliche Anzahl von 3 bis 7 Silylgruppen (vorzugsweise Trimethylsilylgruppen) pro Molekül enthält.

Der hier verwendete Begriff "nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz" einer Verbindung der allgemeinen Formel I bedeutet ein Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasalz, das durch Reaktion eines Moleküls einer Verbindung der allgemeinen Formel I mit 1 bis 4 Äquivalenten einer nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure gebildet ist. Zu derartigen Säuren gehören Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Axscorbinsäure, Apfelsäure und Zitronensäure, sowie alle anderen Säuren, die üblicherweise zur Bildung von Salzen mit Amin enthaltenden Pharmazeutika gebraucht werden.

Die Acylierung des polysilylerten Kanamycin A oder B-Ausgangsmaterials (mit oder ohne eine von Silyl verschiedene, übliche Schutzgruppe an der 6′-Aminogruppe) kann im allgemeinen in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, indem das Ausgangsmaterial eine ausreichende Löslichkeit besitzt. Die Ausgangsmaterialien sind gut löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören beispielsweise Aceton, Diäthylketon, Methyl-n-propylketon, Methylisobutylketon, Methyläthylketon, Acetonitril, Glyme, Diglyme, Dioxan, Toluol, Tetrahydrofuran, Cyclohexanon, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Mischungen aus Aceton/Butanol oder Diäthylketon/Butanol. Die Wahl des Lösungsmittels hängt vom jeweils eingesetzten Ausgangsmaterial ab. Im allgemeinen sind Ketone bevorzugte Lösungsmittel. Das jeweils günstigste Lösungsmittel für eine bestimmte Kombination von Reaktionspartnern kann durch Routineuntersuchungen leicht herausgefunden werden.

Geeignete Silylierungsmittel zur Verwendung bei der Herstellung der hier verwendeten polysilylierten Kanamycin-Ausgangsmaterialien sind die der nachfolgenden allgemeinen Formeln IV und V:

worin R⁵, R⁶ und R⁷ jeweils für Wasserstoff, Halogen, (niedrig)- Alkyl, Halogen(niedrig)alkyl und Phenyl stehen können, wobei mindestens eine der Gruppen R⁵, R⁶ und R⁷ von Halogen oder Wasserstoff verschieden sind, R⁴ für (niedrig)Alkyl steht, m eine ganze Zahl von 1 bis 2 darstellt und X die Bedeutungen Halogen und

worin R⁸ für Wasserstoff oder (niedrig)Alkyl steht und R⁹ die Bedeutung Wasserstoff, (niedrig)Alkyl oder

besitzt, worin R⁵, R⁶ und R⁷ die vorstehenden Bedeutungen besitzen.

Als Beipsiele für spezifische Silylverbindungen der Formeln IV und V kann man nennen: Trimehtylchlorsilan, Hexamethyldisilazan, Triähtylchlorsilan, Methyltrichlorsilan, Dimethyldichlorsilan, Triäthylbromsilan, Tri-n-propylchlorsilan, Methyldiäthylchlorsilan, Dimethyläthylchlorsilan, Dimethyl-tert.-butylchlorsilan, Phenyldimethylbromsilan, Benzylmethyläthylchlorsilan, Phenyläthylmethylchlorsilan, Triphenylchlorsilan, Triphenylfluorsilan, Tri-o-tolylchlorsilan, Tri-p-diemthyl-aminophenylchlorsilan, N-Äthyltriäthylsilylamin, Hexaäthyldisilazan, Triphenylsilylamin, Tri-n-propylsilylamin, Tetraäthyldimethyldisilazan, Hexaphenyldisilazan und Hexa-p-tolyldisilazan. Ebenfalls brauchbar sind Hexaalkylcyclotrisilazane und octa-Alkylcyclotetrasilazane. Andere geeignete Silylierungsmittel sind Silylamide (beispielsweise Trialkylsilylacetamide und bis Trialkylsilylacetamide), Silylharnstoffe (beispielsweise Trimethylsilylharnstoff) und Silylureide. Man kann auch Trimethylsilylimidazol einsetzen.

Eine bevorzugte Silylgruppe ist die Trimethylsilylgruppe. Bevorzugte Silylierungsmittel zur Einführung der Trimethylsilylgruppe sind Hexamethyldisilazan, Bis(trimethylsilyl)acetamid und Trimethylsilylacetamid. Am bevorzugtesten ist das Hexamethyldisilazan.

Verwendet man ein polysilyliertes Kanamycin A oder B, das an der 6′-Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe enthält, so kann dieses Ausgangsmaterial entweder dadurch hergestellt werden, daß das gewünschte, in 6′-Stellung N-blockierte Kanamycin A oder B polysilyliert oder die gewünschte 6′-N-Schutzgruppe in polysilyliertes Kanamycin A oder B einführt.

Methoden zur Einführung von Silylgruppen in organische Verbindungen, einschließlich bestimmter Aminoglycoside, sind bekannt. Die polysilylierten Kanamycine (mit oder ohne eine Schutzgruppe an der 6′-Aminogruppe, die von Silyl verschieden ist) können nach Methoden hergestellt werden, die an sich bekannt sind oder im vorliegenden Text beschrieben sind.

Der hier verwendete Begriff "polysilyliertes Kanamycin A oder B′′ betrifft Kanamycin A oder B, das 2 bis 10 Silylgruppen im Molekül aufweist. So umfaßt der Begriff "polysilyliertes Kanamycin A oder B′′ nicht ein persilyliertes Kanamycin A oder B, das 11 Silylgruppen im Molekül enthielte.

Die genaue Anzahl der Silylgruppen (oder deren Stellung) im polysilylierten Kanamycin-Ausgangsmaterial (mit oder ohne eine Blockierungsgruppe an der 6′-Aminogruppe, die von Silyl verschieden ist) ist nicht bekannt. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Untersilylierung und Übersilylierung die Ausbeute an gewünschtem Produkt absenken und zu einem Ansteigen anderer Produkte führen. Im Falle einer starken Unter- und Übersilylierung kann es dazu kommen, daß nur wenig oder überhaupt kein gewünschtes Produkt gebildet wird. Der Silylierungsgrad, der zur größten Ausbeute an gewünschtem Produkt führt, hängt von den jeweiligen Reaktionspartnern ab, die bei der Acylierungsstufe eingesetzt werden. Der jeweils vorteilhafteste Silylierungsgrad bei irgendeiner Kombination von Reaktionspartnern kann durch routinemäßiges Ausprobieren leicht festgestellt werden.

Bei der Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-kanamycin A durch Acylierung von polysilyliertem Kanamycin A mit dem N-Hydroxysuccinimidester der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure in Acetonlösung wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß man gute Ausbeuten an gewünschtem Produkt erhält, wenn man polysilyliertes Kanamycin A einsetzt, das durch Reaktion von ungefähr 4 bis ungefähr 5,5 Mol Hexamethyldisilazan pro Molekül Kanamcyin A hergestellt wurde. Man kann auch größere oder kleinere Mengen an Hexamethyldisilazan einsetzen, jedoch wird hierdurch die Ausbeute an gewünschten Produkt bei der nachfolgenden Acylierungsstufe merklich verringert. Bei der obigen spezifischen Arbeitsweise wird bevorzugt, ungefähr 4,5 bis ungefähr 5,0 Mol Hexamethyldisilazan pro Mol Kanamycin einzusetzen, um bei der Acylierungsstufe eine maximale Produktausbeute zu erzielen.

Pro Mol Hexamethyldisilazan können zwei Äquivalente der Trimethylsilylgruppe in Kanamycin A oder B eingeführt werden. Sowohl Kanamycin A wie auch Kanamycin B weisen insgesamt 11 Stellen (NH₂- und OH-Gruppen) auf, die silylierbar sind, während Kanamycin A und Kanamycin B, die an der 6′-Aminogruppe eine von Silyl verschiedene Blockierungsgruppe aufweisen, insgesamt 10 derartige Stellen aufweisen. So müßten 5,5 Mol Hexamethyldisilazan pro Mol Kanamycin A oder B theoretisch zu einer vollständigen Silylierung sämtlicher OH- und NH₂-Einheiten des Kanamycins führen, während 5,0 Mol Hexamethyldisilazan zu einer vollständigen Silylierung von einem Mol Kanamycin A oder B, das in der 6′-Aminogruppe eine von Silyl verschiedene Blockierungsgruppe aufweist, führen sollte. Jedoch wird erfindungsgemäß angenommen, daß eine derartig extensive Silylierung bei diesen molaren Verhältnissen während vernünftiger Reaktionszeiten nicht erfolgt, obgleich man bei vorgegebener Reaktionszeit höhere Silylierungsgrade erzielt, wenn man einen Silylierungskatalysator zugibt.

Silylierungskatalysatoren führen zu einer beträchtlichen Erhöhung der Silylierungsgeschwindigkeit. Geeignte Silylierungskatalysatoren sind bekannt. Hierzu gehören unter anderem Aminsulfate (beispielsweise Kanamycinsulfat), Sulfaminsäure, Imidazol und Trimethylchlorsilan. Silylierungskatalysatoren fördern im allgemeinen einen höheren Silylierungsgrad als beim erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich. Man kann jedoch auch übersilyliertes Kanamycin A oder B als Ausgangsmaterial beim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen, wenn man es zuerst mit einem Desilylierungsmitel behandelt, um den Silylierungsgrad zu vermindern, bevor die Acylierungsreaktion durchgeführt wird.

Man erhält gute Ausbeuten an gewünschtem Produkt, wenn man polysilyliertes Kanamycin A acyliert, das unter Verwendung eines 5,5 : 1 molaren Verhältnisses von Hexamethyldisilazan zu Kanamycin A hergestellt wurde.

Wenn man jedoch Kanamycin A mit einem 7 : 1 molaren Verhältnis an Hexamethyldisilazan (oder mit einem 5,5 : 1 molaren Verhältnis in Gegenwart eines Silylierungskatalysators) in Aceton mit dem N-Hydroxysuccinimidester der L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure acyliert, so erhält man weniger als eine 1%ige Ausbeute des gewünschten Produkts. Wenn man jedoch dasselbe "übersilylierte" Kanamycin A mit demselben Acylierungsmittel in einer Acetonlösung acyliert, zu der man 1 Stunde vor der Acylierungsreaktion Wasser [21 Mol Wasser pro Mol Kanamycin/2,5% Wasser (Gew./Vol.)] als Desilylierungsmittel zugesetzt hatte, so erhält man eine Ausbeute von angenähert 40% des gewünschten Produkts. Dieselben Ergebnisse werden erhalten, wenn das Wasser durch Methanol oder durch eine andere Verbindung mit aktivem Wasserstoff ersetzt wird, die zu einer Desilylierung führen kann, beispielsweise weise durch Äthanol, Propanol, Butandiol, Methylmercaptan, Äthylmercaptan oder Phenylmercaptan.

Obgleich man beim Arbeiten mit silylierten Materialien üblicherweise trockene Lösungsmittel einsetzt, wurde überraschend gefunden, daß selbts in Abwesenheit einer "Übersilylierung" die Zugabe von Wasser zum Reaktionslösungsmittel vor der Acylierung häufig gleich gute Ausbeute ergibt, ja bisweilen sogar zu besseren Ausbeuten an gewünschtem Produkt als in einem trockenen Lösungsmittel, führt. Bei Acylierungsreaktionen, die in Aceton bei den üblichen Konzentrationen von 10 bis 20% (Gew.-/Vol.) polysilyliertem Kanamycin A durchgeführt werden, wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß man ausgezeichnete Ausbeuten an 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-Hydroxybutyryl]kanamycin A erhält, wenn man bis zu 28 Mol Wasser pro Mol polysilyliertes Kanamycin A zusetzt. Arbeitet man bei 20%iger Konzentration, so bedeuten 28 Mol pro Mol angenähert 8% Wasser. Mit anderen Kombinationen von Reaktionspartnern kann man sogar die Anwesenheit von noch mehr Wasser dulden; sie kann sogar vorteilhaft sein. Die Acylierungsreaktion kann in Lösungsmitteln durchgeführt werden, die bis zu ungefähr 40% Wasser enthalten, obgleich man bei derart hohen Wasserkonzentrationen kurze Acylierungszeiten wählen muß, um eine übermäßige Desilylierung des polysiylierten Kanamycin A oder B-Ausgangsmaterials zu vermeiden. Wenn demgemäß im vorliegenden Falle der Begriff "im wesentlichen wasserfreies organisches Lösungsmittel" gebraucht wird, so umfaßt dieser Begriff auch Lösungsmittel, die bis zu ungefähr 25% Wasser enthalten. Ein bevorzugter Bereich geht bis zu ungefähr 20% Wasser, ein bevorzugterer Bereich geht bis ungefähr 8% Wasser und ein am meisten bevorzugter Bereich geht bis zu ungefähr 4% Wasser.

Wie zuvor gesagt, kann der jeweils geeignetste Silylierungsgrad für jegliche Kombination von Acylierungs-Reaktionspartnern durch Routineuntersuchungen leicht festgestellt werden. Es wird angenommen, daß die bevorzugte durchschnittliche Anzahl an Silylgruppen im Ausgangsmaterial üblicherweise bei Kanamycin A oder B zwischen 4 und 8 liegt und bei Kanamycin A oder B, das an der 6′-Aminogruppe eine von Silyl verschiedene Blockierungsgruppe aufweist, zwischen 3 und 7 liegt. Dies ist jedoch eine mehr theoretische Betrachtung.

Dauer und Temperatur der Acylierungsreaktion sind nicht kritisch. Temperaturen im Bereich von ungefähr -30°C bis ungefähr 100°C sind brauchbar bei Reaktionszeiten, die von ungefähr 1 Stunde bis zu einem Tag und mehr dauern. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Reaktion bei Raumtemperatur üblicherweise gut verläuft, und aus Gründen der Einfachheit und Wirtschaftlichkeit ist bevorzugt, die Reaktion bei Umgebungstemperatur durchzuführen. Wenn es jedoch um maximale Ausbeuten und um selektive Acylierung geht, wird bevorzugt, die Acylierung bei einer Temperatur von ungefähr 0°C bis ungefähr 5°C durchzuführen.

Die Acylierung der 1-Aminogruppe des polysilylierten Kanamcyins A oder B (mit oder ohne eine Blockierungsgruppe an der 6′-Aminogruppe, die von Silyl verschieden ist) kann mit irgendeinem acylierenden Derivat der Säure der allgemeinen Formel II durchgeführt werden, von dem bekannt ist, daß es sich zur Acylierung einer primären Aminogruppe eignet. Zu Beispielen für geeignete acylierende Derivate der freien Säure gehören die entsprechenden Säureanhydride, gemischten Anhydride, beispielsweise Alkoxyameisensäureanhydride, Säurehalogenide, Säureazide, aktive Ester und aktive Thioester. Man kann die freie Säure mit dem polysilylierten Kanamycin-Ausgangsmaterial kuppeln, nachdem man zuerst die freie Säure mit N,N′-Dimethylchlorformiminiumchlorid [vgl. GB-PS 10 08 170 und Novak und Weichet. Experientia XXI, 6, 360 (1965)] umgesetzt hat, oder mit Hilfe eines N,N′-Carbonyldiimidazols oder eines N,N′-Carbonylditriazols [vgl. südafrikanische Patentschrift 63/2684] oder mit Hilfe eines Carbodiimidreagenzes [insbesondere N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid, N,N′-Diisopropylcarbodiimid oder N-Cyclohexyl-N′-(2-morpholinoäthyl)carbodiimid; vgl. Sheehan und Hess, J.A.C.S., 77, 1967 (1955)] oder mit Hilfe eines Alkynylaminreagenzes [vgl. R. Buÿle und H. G. Viehe, Angew. Chem. International Edition, 3, 582 (1964)] oder mit Hilfe eines Isoxazoliumsalzreagenzes [vgl. R. B. Woodward, R. A. Olofson und H. Mayer, J. Amer. Chem. Soc., 83, 1010 (1961)] oder mit Hilfe eines Keteniminreagenzes [vgl. C. L. Stevens und M. E. Munk, J. Amer. Chem. Soc., 80, 4065 (1958)] oder mit Hilfe eines Hexachlorcyclotriphosphatriazins oder Hexabromcyclotriphosphatriazins (US-PS Nr. 36 51 050) oder mit Hilfe von Diphenylphosphorylazid [DDPA; J. Amer. Chem. Soc., 94, 6203-6205 (1972)] oder mit Hilfe von Diäthylphosphorylcyanid [DEPC; Tetrahedron Letters Nr. 18, Seiten 1595-1598 (1973)] oder mit Hilfe von Diphenylphosphit [Tetrahedron Letters Nr. 49, Seiten 5047-5050 (1972)] umgesetzt hat. Ein anderes Äquivalent der Säure ist ein entsprechendes Azolid, d. h. ein Amid der entsprechenden Säure, deren Amidstickstoff Glied eines quasi-aromatischen 5-gliedrigen Rings ist, der mindestens zwei Stickstoffatome enthält, d. h. Imidazol, Pyrazol, die Triazole, Benzimidazol, Benzotriazol und deren substituierte Derivate. Es kann bisweilen wünschenswert oder erforderlich sein, die Hydroxylgruppe des acylierenden Derivats der Säure der allgemeinen Formel II zu schützen, beispielsweise wenn man acylierende Derivate, wie beispielsweise Säurehalogenide, einsetzt. Der Schutz der Hydroxylgruppe kann auf an sich bekannte Weise erfolgen, z. B. unter Verwendung einer Carbobenzyloxygruppe, durch Acetylieren und durch Silylieren.

Nach Beendigung der Acylierungsreaktion werden sämtliche Schutzgruppen in an sich bekannter Weise entfernt, um das gewünschte Produkt der allgemeinen Formel I zu liefern.

Die Silylgruppen kann man beispielsweise leicht dadurch entfernen, daß man mit Wasser hydrolysiert. Dies erfolgt vorzugsweise bei niedrigem pH. Die Schutzgruppe B des acylierenden Derivats der Säure der allgemeinen Formel II und die Schutzgruppe an der 6′-Aminogruppe des polysilylierten Kanamycin-Ausgangsmaterials (falls vorhanden) können ebenfalls nach bekannten Methoden entfernt werden. So kann man beispielsweise eine tert.-Butoxycarbonylgruppe durch Verwendung von Ameisensäure entfernen, eine Carbobenzyloxygruppe durch katalytisches Hydrieren, eine 2-Hydroxy-1-naphthocarbonylgruppe durch saure Hydrolyse, eine Trichloräthoxycarbonylgruppe durch Behandlung mit Zinkstaub in Eisessig und die Phthaloylgruppe durch Behandlung mit Hydrazinhydrat in Äthanol unter Erhitzen entfernen.

Die Ausbeuten an Produkt wurden nach verschiedenen Methoden bestimmt. Nach Entfernung sämtlicher Schutzgruppen und Chromatographie auf einer Säule mit CG-50 (NH₄⁺) ließ sich die Ausbeute an Amikacin durch Isolierung des kristallinen Feststoffs aus den entsprechenden Fraktionen oder durch mikrobiologische Untersuchung (turbidimetrische Methode oder Plattentest) der entsprechenden Fraktionen bestimmen. Eine andere erfindungsgemäß eingesetzte Technik war Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie der nicht reduzierten Acylierungsmischung, d. h. mit Hilfe der wässerigen Lösung, die nach der Hydrolyse der Silylgruppen und der Entfernung des organischen Lösungsmittels erhalten wurde, jedoch vor der Hydrogenolyse zur Entfernung der verbleibenden Schutzgruppe(n). Diese Untersuchung ist keine direkte Untersuchung auf Amikacin oder BB-K29, sondern auf die entsprechenden mono- oder di-N-blockierten Verbindungen.

Man setzt dazu Hochdruck-Flüssigkeitschromatograph mit einem Absorptionsdetektor und einer 30 cm × 3,9 mm (Innendurchmesser) µ-Bondapak® C-18-Säule ein, und zwar unter den folgenden Bedingungen:

Mobile Phase:25% 2-Propanol
75% 0,01 m Natriumacetat pH 4,0 Flußrate:1 ml/Minute Detektor:UV bei 254 nm Empfindlichkeit:0,04 AUFS Verdünnungsmittel:DMSO Injizierte Menge:5 µl Konzentration10 mg/ml

Die Schreibergeschwindigkeit variierte, jedoch waren 2 Minuten/2,54 cm typisch. Die obigen Bedingungen ergaben UV-Spuren mit Peaks, die quantitativ leicht zu bestimmen waren. Die Ergebnisse der obigen Analysen sind im vorliegenden Text als HLPC-Tests bezeichnet.

Im vorliegenden Text werden bisweilen die nachfolgenden Abkürzungen gebraucht:

AHBAL-(-)-γ-Amino-α-hydroxybuttersäure BHBAN-Carbobenzyloxyderivat von AHBA HONBN-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid NAE
(oder BHBA-'ONB')N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid-aktivierter Ester von BHBA HONSN-Hydroxysuccinimid SAE
(oder BHBA-'ONS')N-Hydroxysuccinimid-aktivierter Ester von BHBA DCCDicyclohexylcarbodiimid DCUDicyclohexylharnstoff HMDSHexamethyldisilazan BSABis(trimethylsilyl)acetamid MSATrimehtylsilyacetamid TFATrifluoracetyl t-BOCtert.-Butyloxycarbonyl

"Dicalite® ist ein Produkt aus Diatomeenerde.

"Amberlite® CG-50" ist ein schwach-saures Kationenaustauscherharz des Carbonsäure-polymethacrylsäuretyps von chromatographischer Qualität.

"µ-Bondapak®" ist eine Bezeichnung für eine Reihe von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesäulen.

Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.

Die Begriffe "(niedrig)Alkyl" und "(niedrig)Alkoxy" beziehen sich auf Alkyl- oder Alkoxygruppen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen.

Beispiel 1 Herstellung von 1-N[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-carbobenzyloxykanamycin A in wasserfreiem Diäthylketon

Man schlämmt 15 g (24,24 mMol) 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A in 90 ml trockenem Acetonitril auf und erhitzt unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Dann gibt man im Verlauf von 30 Minuten langsam 17,5 g (108,48 mMol)Hexamethyldisilazan zu und hält die erhaltene Lösung 24 Stunden lang am Rückfluß. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum (40°C) und vollständigem Trocknen unter Vakuum (10 mm) erhält man 27,9 g eines weißen, amorphen Feststoffs. Ausbeute 90,71%, berechnet als 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A (Silyl)₉.

Diesen Feststoff löst man in 150 ml trockenem Diäthylketon bei einer Temperatur von 23°C auf. Man gibt 11,05 g (26,67 mMol) L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE), gelöst in 100 ml trockenem Diäthylketon bei 23°C unter gutem Rühren im Verlauf von einer halben Stunde langsam zu. Man rührt die Lösung 78 Stunden lang bei 23°C. Man verdünnt die gelbe, klare Lösung (pH 7,0) mit 100 ml Wasser. Der pH der Mischung wird mit 3 n HCL auf 2,8 eingestellt und man rührt 15 Minuten lang heftig bei einer Temperatur von 23°C. Die wässerige Phase wird abgetrennt, und die organische Phase wird mit 50 ml Wasser von pH 2,8 extrahiert. Die vereinigten wässerigen Fraktionen wäscht man mit 50 ml Äthylacetat. Man gibt die Lösung in eine 500ml-Parr-Vorrichtung zusammen mit 5 g 5%igem Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator und reduziert 2 Stunden lang bei 23°C bei einem Druck von 3,45 bar (50 psi) H₂. Man filtriert die Mischung durch ein Filterbett aus Dicalite®, das dann mit zusätzlichen 30 ml Wasser gewaschen wird. Man konzentriert das farblose Filtrat im Vakuum (40 bis 45°C) auf 50 ml. Die Lösung wird auf eine 5 × 100 cm CG-50® (NH₄⁺)-Ionenaustauschersäule aufgegeben. Nach dem Waschen mit 1000 ml Wasser eluiert man unumgesetztes Kanamycin A, 3-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A (BB-K29) und Amikacin mit 0,5 n Ammoniumhydroxyd. Mit 3 n Ammoniumhydroxyd wird Polyacylmaterial wiedergewonnen. Zur Überwachung der fortlaufenden Eluierung wählt man Biotest. Dünnschichtchromatographie und optische Drehung. Volumen, beobachtete optische Drehung jeder Fraktion des Eluats und Gewicht und prozentuale Ausbeute des aus jeder Fraktion durch Eindampfen zur Trockne isolierten Feststoffs sind nachstehend zusammengestellt:

Durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wird gezeigt, daß die verbrauchte Diäthylketonschicht weitere 3 bis 5% Amikacin enthält.

Man löst das rohe Amikacin (6,20 g) in 20 ml Wasser auf und verdünnt mit 20 ml Methanol und setzt dann 20 ml Isopropanol zu, um die Kristallisation einzuleiten. Man erhält 6,0 g (45,8%) kristallines Amikacin.

Beispiel 2 Herstellung von 1-N[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-carbobenzyloxykanamycin A in wasserfreiem Aceton

Man löst 103 g (0,081 Mol, berechnet als 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A (Silyl)₉) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-carbobenzyl-oxykanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 100 ml trockenem Aceton bei einer Temperatur von 23°C auf. Man gibt unter gutem Rühren langsam 35,24 g (0,085 Mol) L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE), gelöst in 180 ml trockenem Aceton bei 23°C im Verlauf von 15 Minuten zur Lösung des Poly(trimethylsilyl)-6′-N-carbobenzyloxykanamycins A zu. Man rührt die Lösung 20 Stunden bei 23°C unter einer Stickstoffatmosphäre. Die blaß-gelbe, klare Lösung (pH 7,2) wird mit 100 ml Wasser verdünnt. Der pH der Mischung wird mit 3 n HCl auf 2,5 eingestellt. Dann rührt man noch 15 Minuten bei 23°C. Das Aceton wird unter Verwendung eines Dampfstrahlvakuums bei ungefähr 35°C entfernt. Die Lösung wird in eine 500 ml-Parr-Flasche gegeben und zwar zusammen mit 10 g 5% Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator. Man reduziert bei einer Temperatur von 23°C 2 Stunden lang bei einem Druck von 2,76 bar (40 psi) H₂. Dann filtriert man die Mischung durch ein Filterbett aus Diatomeenerde, das anschließend mit weiteren 50 ml Wasser gewaschen wird. Nach dem Konzentrieren auf angenähert ¹/₃ des Volumens gibt man die Lösung (pH 6,9 bis 7,8) auf eine 6 × 110 cm CG-50® (NH₄⁺)-Ionenaustauschersäule und eluiert mit einem stufenweisen Gradienten von H₂O zu 0,6 n Ammoniumhydroxyd, um das Amikacin zu gewinne. Zur Überwachung der fortlaufenden Eluierung verwendet man ein automatisches Polarimeter. Die Fraktionen werden auf der Grundlage der Bewertung durch Dünnschichtchromatographie vereinigt. Die vereinigten Amikacinfraktionen werden auf einem Gehalt von 25 bis 30% Feststoffen konzentriert. Man verdünnt die Lösung mit einem gleichen Volumen Methanol und gibt dann zwei Volumina Isopropanol zu, um die Kristallisation einzuleiten. Man gewinnt 18,2 g (40%) kristallines Amikacin.

Durch Wiedergewinnung von 12% Kanamycin A, 40% BB-K29 und 5% polyacyliertem Kanamycin erhält man eine Materialbilanz von 97%.

Beispiel 3 Herstellung von 1-N[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, wobei man in situ schützt A) Poly(trimethylsilyl)kanamycin A

Man schlämmt Kanamycin A in Form der freien Base (18 g Aktivität, 37,15 mMol) in 200 ml trockenem Acetonitril auf und erhitzt zum Rückfluß. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man 29,8 g (184,6 mMol) Hexamethyldisilazan zu und rührt die Mischung 78 Stunden am Rückfluß, wobei man eine hellgelbe klare Lösung erhält. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum bleibt ein amorpher, fester Rückstand übrig. Die Ausbeute beträgt 43 g (94%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀).

B) 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A

Man schlämmt 5,56 g (20,43 mMol) p-(Benzyloxycarbonyloxy)-benzoesäure in 50 ml trockenem Acetonitril bei einer Temperatur von 23°C auf. Dann gibt man unter gutem Rühren 8,4 g (41,37 mMol) N,0-Bis-trimethylsilylacetamid zu. Die Lösung wird 30 Minuten bei 23°C gehalten und dann im Verlauf von 3 Stunden unter heftigem Rühren zu einer Lösung von 21,5 g (17,83 mMol, berechnet als (Silyl)₁₀-Verbindung) Poly(trimethylsilyl)kanamycin A in 75 ml trockenem Acetonitril von 23°C zugegeben. Man rührt die Mischung 4 Stunden lang, entfernt das Lösungsmittel im Vakuum (40°C) und löst dann den öligen Rückstand in 50 ml trockenem Aceton mit einer Temperatur von 23°C.

Im Verlauf von 5 Minuten gibt man 8,55 g (20,63 mMol) L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE) in 30 ml Aceton zur obigen Lösung. Man hält die Mischung 78 Stunden bei 23°C. Dann verdünnt man die Lösung mit 100 ml Wasser und senkt den pH (7,0) mit 6 n HCl auf 2,5 ab. Die Mischung wird in eine 500 ml Parr-Flasche zusammen mit 3 g 5% Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator gegeben und 2 Stunden bei einer Temperatur von 23°C bei einem Druck von 2,76 bar (40 psi) H₂ reduziert. Man filtriert die Mischung durch ein Filterbett aus Diatomeenerde, das anschließend mit 20 ml Wasser gewaschen wird. Bei den vereinigten Filtraten und Waschflüssigkeiten (168 ml) wird durch mikrobiolgoischen Test gegen E. coli festgestellt, daß sie angenähert 11 400 mcg/ml Amikacin enthalten (Ausbeute 19%).

Beispiel 4 Herstellung von 1-N[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A, Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A A) Poly(trimethylsilyl)kanamycin A

Eine Suspension von 10 g (20,6 mMol) Kanamycin A in 100 ml trockenem Acetonitril und 25 ml (119 mMol) 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan wird 72 Stunden lang am Rückfluß gehalten. Man erhält eine klare, hellgelbe Lösung. Die Lösung wird im Vakuum bei 30 bis 40°C zur Trockne eingedapmft. Man erhält 21,3 g Poly(trimehtylsilyl)kanamycin A in Form eines hellockerfarbenen, amorphen Pulvers. Die Ausbeute beträgt 85%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.

B) 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A

Zu einer Lösung von 2,4 g (2,0 mMol) Poly(trimehtylsilyl)kanamycin A in 30 ml trockenem Aceton gibt man langsam 2,0 mMol L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE) in 10 ml trockenem Aceton bei einer Temperatur von 0 bis 5°C zu. Die Reaktionsmischung wird 1 Woche lang bei 23°C gerührt und dann im Vakuum bei einer Badtemperatur von 30 bis 40°C zur Trockne eingedampft. Dann gibt man 60 ml Wasser zum Rückstand, gefolgt von 70 ml Methanol, um eine Lösung zu erhalten. Die Lösung wird mit 3 n HCl auf pH 2,0 angesäuert und dann 2 Stunden lang bei einem Druck von 3,45 bar (50 psi) H₂ reduziert, wobei man 500 mg 5% Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator verwendet. Das Material wird filtriert, und vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mit dem mikrobiologischen Test gegen E. coli untersucht. Man stellt fest, daß eine Ausbeute von 29,4% Amikacin erhalten wurde.

Beispiel 5 Herstellung von Amikacin durch selektive N-Acylierung von Poly-trimethylsilyl)-6′-N-carbobenzoxy-kanamycin A in wasserfreiem Aceton. I. Zusammenfassung

Die Silylierung von 6′-N-Carbobenzoxykanamycin A in Acetonitril unter Verwendung von Hexamethyldisilazan (HMDS) führt zum 6′-N-Carbobenzoxykanamycin A (Silyl)₉-Zwischenprodukt I. Dieses silylierte Kanamycin A ist in den meisten organischen Lösungsmitteln leicht löslich. Die Acylierung mit NAE in wasserfreiem Aceton bei 23°C unter Verwendung eines 5%igen molaren Überschusses an NAE bezogen auf das eingesetzte 6′-N-Cbz-Kanamycin A führt zu einer Mischung, die nur Cbz-Derivate des Amikacins und BB-K29, etwas nichtumgesetztes Kanamycin A und etwas Polyacylmaterial enthält. Bei keiner dieser Untersuchungen läßt sich BB-K11 entdecken. Eluieren eines Aceton-Acylierungsgemischs nach der Reduktion und Aufarbeitung durch eine CG-50® (NH4⁺)-Säule unter Verwendung eines Ammoniumhydroxydgradienten liefert Ausbeuten an reinem, isoliertem Amikacin im Bereich von 40%.

II. Reaktionsgleichungen

III. Materialien

IV. Arbeitsweise A) Herstellung von 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A (Silyl)₉ [6′-N-Cbz-Kana A (Silyl)₉]

• 1. Man schlämmt 50 g 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A (KF<4%) in 300 ml Acetonitril (KF<0,01%) auf. Man bringt zum Rückfluß (74°C), wobei man einen trockenen Stickstoffstrom durch die Aufschlämmung aufrechterhält.
• 2. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man langsam 75,8 ml Hexamethyldisilazan (HMDS) zu. Die vollständige Auflösung erfolgt unter Freisetzung von Ammoniakgas.
• 3. Man setzt das Rückflußkochen 18 bis 20 Stunden unter Stickstoffspülung fort.
• 4. Man konzentriert die klare, hellgelbe Lösung unter Vakuum (Badtemperatur 40 bis 50°C) zu einem schaumigen Feststoff. Die Ausbeute an Silyl₉-Verbindung beträgt 89 bis 92 g (90 bis 94% der Theorie).

Anmerkung: Bei anderen Lösungsmitteln wird dieser Feststoff üblicherweise nicht isoliert, sondern direkt zur Acylierung verwendet.

Herstellung des N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidesters der L-(-)-γ-Carbobenzyloxyamino-a-hydroxybuttersäure (NAE)

• 1. Man löst 21,5 g L-(-)-γ-Carbobenzyloxyamino-α-hydroxybuttersäure (BHBA) in 100 ml trockenem Aceton bei 23°C auf und gibt dann 15,2 g N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (HONB) zu. Man erhält eine vollständige Auflösung.
• 2. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man eine Lösung von 17,48 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 50 ml Aceton unter Rühren zu. Während der Zugabe steigt die Temperatur auf angenähert 40°C an, wobei Dicyclohexylharnstoff (DCU) ausfällt.
• 3. Man rührt die Aufschlämmung 3 bis 4 Stunden lang, während sich die Temperatur bei 23 bis 25°C einpendelt.
• 4. Man entfernt das Harnstoffderivat durch Filtrieren und wäscht den Kuchen mit 30 ml Aceton. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden für die nachfolgende Acylierungsstufe aufgehoben.

C) Acylierung von 6′-N-Cbz Kana A (Silyl)₉

• 1. Man löst das 6′-N-Cbz Kana A (Silyl)₉, das in Teil A, Stufe 4 isoliert wurde, in 100 ml trockenem Aceton bei 23 bis 24°C auf.
• 2. Unter gutem Rühren gibt man langsam die NAE-Lösung, die in Teil B hergestellt wurde, im Verlauf von 15 Minuten zu. Die Temperatur steigt allmählich auf angenähert 40°C an. Man läßt die Temperatur der Lösung auf 23°C einpendeln und rührt noch 18 bis 20 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre.
• 3. Man gibt 100 ml Wasser zu und senkt den pH (6,9 bis 7,2) mit 6 n Chlorwasserstoffsäure auf 2,2 bis 2,5 ab. Man rührt 15 Minuten bei 23°C.
  (Anmerkung: Es kann sich eine zweite Schicht bilden, dies stellt jedoch bei der Aufarbeitung kein Problem dar.)
• 4. Man entfernt das Aceton unter Vakuum bei einer Badtemperatur von 30 bis 35°C. Das Konzentrat wird in ein geeignetes Hydriergefäß (das mit Stickstoff vorgespült ist) überführt. Man gibt 10 g 5% Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator zu und hydriert 2 bis 3 Stunden lang bei 2,76 bar (40 psi).
• 5. Die Mischung wird durch ein Dicalite®-Filterbett durchfiltriert und man wäscht das Hydriergefäß und den Filterkuchen mit weiteren 50 ml Wasser.
• 6. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden auf angenähert ¹/₃ ihres Volumens (50 ml) unter Vakuum bei 40 bis 45°C konzentriert.
• 7. Man überwacht den pH. Er sollte im Bereich von 6,9 bis 7,2 liegen. Falls dies nicht der Fall ist, wird mit 1 n Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Mischung wird auf eine 6 × 110 cm CG-50® (NH₄⁺)-Säule aufgegeben.
• 8. Man wäscht die Säule mit 1000 ml entionisiertem Wasser. Dann eluiert man mit 0,5 bis 0,6 n Ammoniumhydroxyd, wobei man zur Überwachung des Fortschreitens der Eluierung ein atomatisches Polarimeter gebraucht. Die Reihenfolge der Eluierung ist wie folgt:
  • Verbliebenes Kanamycin A → BB-K29 → Amikacin. Bei keiner der Aufbereitungen der Acylierungsprodukte wird BB-K11 entdeckt. Polyacylmaterial, d. h. das 1,3-diAHBA-Analoge von Kanamycin A, wird durch Waschen der Säule mit 3 n Ammoniumhydroxyd wiedergewonnen.
• 9. Man vereinigt die Amikacin-Fraktionen und konzentriert auf einen Gehalt von 25 bis 30% Feststoffen. Man verdünnt mit 1 Volumen Methanol und impft mit Amikacinkristallen an.
• 10. Man gibt langsam im Verlauf von 2 Stunden 2 Volumina Isopropanol (IPA) unter gutem Rühren zu und kristallisiert 6 bis 8 Stunden lang bei 23°C.
• 11. Man filtriert den Feststoff, wäscht mit 50 ml 1 : 1 : 2 Wasser : Methanol : IPA-Mischung und schließlich mit 25 ml IPA.
• 12. Man trocknet im Vakuum 12 bis 16 Stunden bei 40°C. Ausbeute 17,3 bis 19,0 g (38 bis 42%) Amikacin mit den folgenden Eigenschaften:
  Dünnschichtchromatographie (TLC) CHCl₃-Methanol-NH₄OH-Wasser (1 : 4 : 2 : 1), 5 × 20 cm Silikagelplatten, eine Zone, durch Ninhydrin festgestellt (R_f∼0,4).
  Spezifische Drehung:
  13. Die Wiedergewinnung des BB-K29 in diesem System erfolgt ebenfalls zu 39 bis 42%. Restliches Kanamycin A wird zu 10 bis 14% wiedergewonnen, und 1,3-di-AHBA-Kanamycin A wird zu angenähert 5% wiedergewonnen, wodurch man eine Materialbilanz <95% erhält.

Beispiel 6 Herstellung von Amikacin durch selektive N-Acylierung von Polytrimethylsilyl-kanamycin A in wasserfreiem Aceton I. Zusammenfassung

Silylierung von Kanamycin A-"Base" in Acetonitril unter Verwendung von Hexymethyldisilazan (HMDS) führt zu Polytrimethylsilyl-kanamycin A. Das Ausmaß der Silylierung ist noch ungewiß, jedoch wird derzeit vermutet, daß es sich bei der Substanz um Kanamycin A (Silyl)₁₀ handelt. Polysilyliertes Kanamycin A ist in den meisten organischen Lösungsmitteln leicht löslich. Acylierung mit SAE im wasserfreiem Aceton bei 23°C unter Verwendung eines 1 : 1 molaren Verhältnisses von SAE zu eingesetztem Kanamycin A liefert eine Mischung, die Cbz-Derivate des Amikacins und BB-K29 enthält, und zwar üblicherweise im Verhältnis 2 bis 3/1; man erhält BB-K6 (angenähert 5 bis 8%), nichtumgesetztes Kanamycin A (15 bis 20%) und etwas Polyacylmaterial (angenähert 5 bis 10%). Auch bei diesen Experimenten wird wie bei den vorherigen Arbeiten zur Acylierung von Polytrimethylsilyl-6′-N-carbobenzoxy-kanamycin A keinerlei BB-K11 festgestellt. Reduktion und Aufarbeitung einer Acylierungsmischung in Aceton, gefolgt von Chromatographie auf einer CG-50® (NH₄⁺)-Säule unter Verwendung von 0,5 n Ammoniumhydroxyd liefert isoliertes kristallines Amikacin im Bereich von 34 bis 39%.

Reaktionsgleichungen

III. Materialien

IV. Arbeitsweise A) Herstellung von Kanamycin A (Silyl)₁₀

• 1. Man schlämmt 50 g Kanamycin A-"Base" (KF 2,5 bis 3,5%) in 500 ml Acetonitril (KF<0,01%) auf. Man bringt zum Rückfluß (74°C), während man einen Strom aus trockenem Stickstoff durch die Aufschlämmung aufrechterhält.
• 2. Man gibt langsam im Verlauf von 30 Minuten 112 ml Hexamethyldisilazan (HMDS) zu. Innerhalb von 4 bis 5 Stunden erfolgt vollständige Auflösung unter Entweichung von Ammoniakgas.
• 3. Man hält noch 22 bis 26 Stunden unter Stickstoffspülung am Rückfluß.
• 4. Man konzentriert die klare, blaßgelbe Lösung unter Vakuum (40°C) zu einem sirupartigen Rückstand. Man spült mit weiteren 100 ml Acetonitril und trocknet vollständig unter Hochvakuum während 3 bis 6 Stunden. Die Ausbeute an weißlichem, amorphem Feststoff beträgt 109 bis 115 g (90 bis 95% der Theorie, als Kanamycin A (Silyl)₁₀ berechnet).

B) Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters von L-(-)-α-Carbobenzyloxyamino-α-hydroxybuttersäure (SAE)

• 1. Man löst 100 g L-(-)-α-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure (BHBA) und 45,38 g N-Hydroxysuccinimid (N-HOS) in 1300 ml Äthylacetat (NF<0,05%) unter Rühren bei 23°C auf.
• 2. Man löst 81,29 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 400 ml Äthylacetat (KF<0,05%) bei 23°C auf. Unter gutem Rühren gibt man diese Lösung im Verlauf von 30 Minuten zu der Lösung gemäß Stufe 1. Die Temperatur steigt auf ungefähr 40 bis 42°C, während gleichzeitig Dicyclohexylharnstoff (DCU) ausfällt. Man rührt die Aufschlämmung 3 bis 4 Stunden, und läßt die Temperatur bei 23°C einpendeln.
• 3. Man filtert den DCU ab, wäscht den Filterkuchen mit 250 ml Äthylacetat (KF<0,05%). Der DCU-Filterkuchen wird verworfen. Man hebt das Filtrat und die Waschflüssigkeiten auf.
• 4. Man konzentriert das Filtrat und die Waschflüssigkeiten auf ungefähr 500 ml (im Vakuum bei 30 bis 35°C). Etwas Produkt kristallisiert aus.
• 5. Man gibt das Konzentrat in ein geeignetes Gefäß und gibt unter heftigem Rühren 100 ml Heptan zu. Falls erforderlich gibt man Impfkristalle von SAE zu. Die Kristallisation erfolgt beinahe sofort. Man rührt die Aufschlämmung 30 Minuten bei 23°C.
• 6. Im Verlaufe von 30 Minuten gibt man 400 ml Heptan zu und rührt die Aufschlämmung 4 bis 5 Stunden lang bei 23°C.
• 7. Man filtriert und wäscht den Filterkuchen mit 200 ml 3 : 1 Heptan/Äthylacetat, gefolgt von 100 ml Heptan.
• 8. Man trocknet im Vakuumofen 18 bis 20 Stunden lang bei 30 bis 35°C. Die Ausbeute beträgt 110,1 bis 131,4 g (80 bis 95%).
  Schmelzpunkt 119 bis 120°C unter Erweichung bei 114°C (korrigiert). TLC4 Aceton : 12 Benzol : 1 CH₃CO₂H-Entwicklung mit 1% wässiergem KMnO₄. R_f0,7 für SAE, 0,2 für BHBA auf 2 × 10 cm vorbehandelten Silikagelplatten

C) Acylierung von Kanamycin A (Siulyl)₁₀

• 1. Man löst das Kanamycin A (Silyl)₁₀, das in Teil A, Stufe 4 isoliert wurde, in 500 ml trockenem Aceton bei 23°C auf.
• 2. Unter gutem Rühren gibt man schnell das in Teil B hergestellte SAE (35,03 g) in Form einer 10%igen Lösung in trockenem Aceton im Verlauf von 5 bis 10 Minuten zu. Die Temperatur steigt angenähert um 5°C an. Man läßt die Temperatur der Lösung bei 23°C einpendeln und rührt dann noch weitere 18 bis 20 Stunden.
• 3. Die hell-orangefarbene, klare Lösung wird mit 400 ml Wasser verdünnt, und der pH (7,0 bis 7,5) wird mit 3 n Chlorwasserstoffsäure auf 2,2 bis 2,5 abgesenkt. Dann rührt man die klare Lösung 15 bis 30 Minuten lang bei 23°C.
• 4. Das Aceton wird unter Vakuum bei einer Temperatur von 30 bis 35°C entfernt (bei dieser Stufe kann sich eine kleine Menge Material abscheiden, dies stellt jedoch kein Problem dar). Man gibt das Konzentrat in ein geeignetes Hydriergefäß. Man gibt 10 g 5% Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator zu und hydriert 2 bis 3 Stunden lang bei 3,45 bar (50 psi).
• 5. Man filtriert die Mischung durch ein Dicalite®-Filterbett und wäscht das Hydriergefäß und den Kuchen mit weiteren 2 × 50 ml Wasser.
• 6. Man konzentriert das Filtrat und die Waschflüssigkeiten auf angenähert ¹/₃ des Volumens (150 bis 165 ml) unter Vakuum bei 40 bis 45°C.
• 7. In dieser Stufe liegt der pH im Bereich von 6,0 bis 7,0. Man gibt die Mischung auf eine CG-SO® (NH₄⁺)-Säule (6 × 110 cm) auf.
• 8. Die Säule wird mit 1000 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Man eluiert mit 0,5 n Ammoniumhydroxyd, wobei man ein automatisches Polarimeter verwendet, um das Fortlaufen des Eluiervorgangs zu überwachen. Die Reihenfolge der Eluierung ist wie folgt:
  • Verbliebenes Kanamycin A → BB-K6 → BB-K29 → Amikacin.
• Bei keiner der Untersuchungen wird die Anwesenheit von BB-K11 festgestellt.
• 9. Man vereinigt die Amikacin-Fraktionen und konzentriert auf einen Gehalt von 25 bis 30% Feststoffen. Man verdünnt mit 1 Volumen Methanol und impft mit Amikacinkristallen an.
• 10. Im Verlauf von 2 Stunden gibt man langsam unter gutem Rühren 2 Volumina IPA zu und kristallisiert 6 bis 8 Stunden lang bei 23°C.
• 11. Man filtriert den Feststoff, wäscht mit 35 ml 1 : 1 : 2 Wasser/Methanol/IPA und schließlich mit 35 ml IPA.
• 12. Man trocknet in einem Vakuumofen 16 bis 24 Stunden lang bei 40°C. Die Ausbeute beträgt 19,91 bis 22,84 g (34 bis 39%). Die IR-, PMR- und CMR-Spektraldaten, die zusätzlich zur spezifischen Rotation bestimmt wurden, stehen in vollständiger Übereinstimmung mit der gewünschten Struktur.

TLC-System

CHCl₃/Methanol/NH₄OH/Wasser (1 : 4 : 2 : 1), 5 × 20 cm Silikagelplatten 1 Zone Amikacin mit R_f∼0,4 (Bestimmung durch Ninhydrin).

Beispiel 7 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethyl-silyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A in Tetrahydrofuran mit dem gemischten Säureanhydrid aus Pivalinsäure und BHBA A) Herstellung des gemischten Anhydrids

Man löst 5,066 g (20,0 mMol) BHBA, 4,068 g (20,0 mMol) BSA und 2,116 g (22,0 mMol) Triäthylamin in 200 ml Tetrahydrofuran, das zuvor über einem Molekularsieb getrocknet wurde. Man hält die Lösung 2¼ Stunden am Rückfluß und kühlt dann auf -10°C ab. Im Verlauf von 2 bis 3 Minuten gibt man 2,412 g (20,0 mMol) Pivaloylchlorid unter Rühren zu und rührt dann noch 2 Stunden lang bei -10°C. Dann läßt man die Temperatur auf 23°C ansteigen.

B) Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A

5,454 g (4,97 mMol), berechnet als 6′-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, wie in Beispiel 1 hergestellt, wird in 50 ml trockenem (Molekularsieb) Tetrahydrofuran von 23°C aufgelöst. Man gibt die Hälfte der Lösung des wie in Stufe A beschrieben hergestellten gemischten Anhydrids (10,0 mMol) im Verlauf von 20 Minuten unter Rühren zu und rührt dann noch weitere 7 Tage.

Dann gibt man 100 ml Wasser zur Reaktionsmischung und stellt den pH (5,4) mit 3 m H₂SO₄ auf 2,0 ein. Man rührt noch 1 Stunde und extrahiert dann die Lösung mit Äthylacetat. Die Krisatllisation von polyacyliertem Material setzt ein, so daß die Reaktionsmischung gefiltert wird. Nach dem Trocknen über P₂O₅ wiegen die gewonnenen Feststoffe 0,702 g. Die Extraktion der Reaktionsmischung wird insgesamt mit 4 × 75 ml Äthylacetat durchgeführt. Anschließend wird das überschüssige Äthylacetat aus der wässerigen Schicht entfernt. Man führt einen Test mit Hilfe von HPLC bei einem aliquoten Anteil der wässerigen Lösung durch. Die erhaltene Kurve zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 26,4% an.

Dann hydriert man die wässerige Schicht in einer Parr-Vorrichtung 2 Stunden lang bei einem H₂-Druck von 3,45 bar (50 psi), wobei man 0,5 g 10% Pd-auf-Aktivkohle-Katalysator verwendet. Man filtriert das Material und stellt bei dem vereinigten Filtrat und den Waschflüssigkeiten durch Test gegen E. coli fest, daß eine Ausbeute an Amikacin von 31,2% vorliegt. Das Verhältnis Amikacin/BB-K29 beträgt angenähert 9-10/1. Es liegen Spuren von Polyacylverbindungen und unumgesetzten Kanamycin A vor.

Beispiel 8 Einfluß von Wasser auf die Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)kanamycin A in Acetonlösung bei 23°C A) Wasserfreies Lösungsmittel

Man löst 2,40 g (2,0 mMol, als Kanamycin A (Silyl)₁₀ berechnet) Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde, in 20 ml Aceton, das über einem Molekularsieb getrocknet worden war. Man rührt die Lösung bei 23°C und gibt eine Lösung von 0,701 g (2,0 mMol) SAE in 10 ml mit einem Molekularsieb-getrocknetem Aceton im Verlauf von 10 Sekunden zu. Man rührt noch 22 Stunden bei 23°C. Dann gibt man 50 ml Wasser zu und stellt den pH (7,5) auf 2,5 ein. Das Aceton wird im Vakuum bei 40°C entfernt, anschließend wird die wässerige Lösung bei einem H₂-Druck von 3,45 bar (51 psi) 2 Stunden lang bei 23°C reduziert, wobei man 1,0 g 10% Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Die mikrobiologische Untersuchung zeigt eine Ausbeute an Amikacin von 31,24%.

B) Wasserschutz zum Lösungsmittel

Man wiederholt die obige Stufe A mit der Ausnahme, daß man 1,0 ml Wasser (56 mMol) zu der Lösung des Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A zugibt und vor der Acylierung mit SAE 15 Minuten lang rührt. Die mikrobiologische Untersuchung zeigt eine Ausbeute an Amikacin von 33,80%.

Beispiel 9 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-kanamycin A in Aceton mit dem gemischten Anhydrid aus BHBA und Isobutylkohlensäure A) Herstellung des gemischten Anhydrids

1,267 g (5,0 mMol) BHBA und 1,313 g (10,0 mMol) N-Trimethylsilylacetamid (MSA) in 20 ml über Molekularsieb-getrocknetem Aceton wird bei 23°C gerührt und man gibt 0,70 ml (5,0 mMol) Triäthylen (TEA) zu. Die Mischung wird 2½ Stunden unter einer N₂-Atmosphäre am Rückfluß gehalten. Man kühlt die Mischung auf -20°C ab und gibt 0,751 g (0,713 ml; 5,50 mMol) Isobutylchlorformiat zu. Es setzt eine sofortige Abscheidung von Triäthylaminhydrochlorid ein. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei -20°C.

B) Acylierung

Man löst 6,215 g (4,9 mMol, berechnet als (Silyl)₉-Verbindung) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 20 ml Molekularsieb-getrockneten Aceton unter Rühren bei 23°C auf. Man kühlt die Lösung auf -20°C ab und gibt langsam im Verlauf von 30 Minuten die kalte Lösung des gemischten Anhydrids aus Stufe A zu. Man rührt die Reaktionsmischung weitere 1½ Stunden bei -20°C und anschließend 17 Stunden bei 23°C. Die Reaktionsmischung wird dann unter Rühren in 150 ml Wasser von 23°C gegossen, der pH (7,75) wird mit 3 n HCl auf 2,5 eingestellt, und das Rühren wird nach 15 Minuten fortgesetzt. Dann wird das Aceton im Vakuum bei 40°C entfernt. Man führt einen Test mit HPLC bei einem Aliquot der erhaltenen wässerigen Lösung durch. Die erhaltene Kurve zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 34,33% an.

Der Hauptteil der wässerigen Lösung wird 3¼ Stunden bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,46 bar (50 psi) reduziert, wobei man 2,0 g Pd/C-Katalysator einsetzt. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt; und bei den vereinigten Filtraten und Waschflüssigkeiten wird durch mikrobiologische Untersuchung gegen E. coli festgestellt, daß eine Ausbeute von 35,0% an Amikacin vorliegt.

Beispiel 10 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A in 3-Pentanon

30 g (23,65 mMol, als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉ berechnet) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, und das in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem 3-Pentanon gelöst ist, wird bei 23°C gerührt. Im Verlauf von 40 Minuten gibt man 26,02 mMol NAE (10%iger Überschuß) zu. Man rührt noch 113 Stunden lang bei 23°C und gibt die Mischung dann unter heftigem Rühren zu 250 ml Wasser. Der pH (7,3) wird mit 3 n HCl auf 2,5 eingestellt, die Mischung wird weitere 30 Minuten gerührt, und das 3-Pentanon wird im Vakuum bei 40°C entfernt. Man extrahiert die wässerige Lösung mit 4 × 100 ml Äthylacetat. Dann wird ein aliquoter Anteil der wässerigen Lösung einer Untersuchung mit HPLC unterworfen. Die erhaltene Kurve zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 46,12% an.

Man reduziert den Hauptteil der wässerigen Reaktionsmischung 2½ Stunden lang bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,52 bar (51,0 psi), wobei man 3,0 g 10% Pd/C-Katalysator einsetzt. Die mikrobiologische Untersuchung eines aliquoten Anteils der vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten zeigt eine Ausbeute an Amikacin von 40,24% an. Anschließend konzentriert man den Hauptteil der reduzierten wässerigen Reaktionsmischung im Vakuum bei 40°C auf angenähert 100 ml und fraktioniert auf einer CG-50® (NH₄⁺)-Ionenaustauschersäule (10,2 cm × 122 cm die angenähert 10 Liter Harz enthält). Man belädt die Säule mit der wässerigen Lösung, wäscht mit 5 Liter Wasser und eluiert dann das Material mit 0,5 n NH₄OH (gefolgt von 3 n NH₄OH, um polyacylierte Produkte zu eluieren). Polarimetrie der Fraktionen zeigt eine 42,7%ige Ausbeute an Amikacin, eine 12,0%ige Ausbeute an nichtumgesetztem Kanamycin A, eine 12,4%ige Ausbeute an polyacyliertem Material und eine 23,2%ige Ausbeute an BB-K29 an.

Beispiel 11 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Cyclohexanon bei unterschiedlichen Reaktionszeiten

• A) 2,537 g (2,0 mMol, berechnet als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 300 ml trockenem Cyclohexanon wird 20 Stunden bei 23°C mit einer NAE-Lösung in trockenem Cyclohexanon (10,8 ml einer 0,1944 mMol/ml-Lösung, 2,10 mMol) acyliert. Dann gibt man die Reaktionsmischung zu 150 ml Wasser unter Rühren zu und stellt den pH (5,6) mit 3 n HCl auf 2,5 ein. Das Cyclohexanon wird im Vakuum bei 40°C entfernt, und ein aliquoter Anteil der verbliebenen wässerigen Phase wird zur Untersuchung mit HPLC herangezogen.
• Man reduziert die Hauptmenge der wässerigen Phase 3 Stunden lang bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,45 bar (50 psi), wobei man 1,0 g eines 10%igen Pd/C-Katalysators verwendet. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mikrobiologisch auf Amikacin untersucht.
• B) Die obige Reaktion A wird wiederholt mit der Ausnahme, daß die Acylierung diesmal nicht 20 Stunden lang, sondern 115 Stunden lang durchgeführt wurde.

Ausbeuten

Beispiel 12 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Tetrahydrofuran bei unterschiedlichen Reaktionszeiten

• A) Man wiederholt Beispiel 11, A mit der Ausnahme, daß man anstelle von trockenem Cyclohexanon trockenes Tetrahydrofuran als Lösungsmittel verwendet.
• B) Man wiederholt Beispiel 11, B mit der Ausnahme, daß man anstelle von trockenem Cyclohexanon trockenes Tetrahydrofuran als Lösungsmittel verwendet.

Ausbeuten

Beispiel 13 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Dioxan während unterschiedlicher Reaktionszeiten

• A) Man wiederholt Beispiel 11, A mit der Ausnahme, daß man unter Verwendung von trockenem Dioxan als Lösungsmittel 44 Stunden lang acyliert.
• B) Man wiederholt das Beispiel 11, B mit der Ausnahme, daß man unter Verwendung von trockenem Dioxan als Lösungsmittel 18½ Stunden acyliert.

Ausbeuten

Beispiel 14 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Diäthylketon bei 75°C

Zu einer gerührten Lösung von 2,537 g (2,0 mMol, berechnet als -6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 32 ml Molekularsieb-getrocknetem Diäthylketon bei 75°C gibt man im Verlauf von 15 Minuten eine Lösung von NAE (10,8 ml mit 0,1944 mMol/ml Diäthylketon, 2,10 mMol) zu. Man rührt noch weitere 3 Stunden bei 75°C und gießt dann die Mischung in 150 ml Wasser. Der pH wird mit 3 n HCl auf 2,8 eingestellt und das Diäthylketon wird bei 40°C im Vakuum entfernt. HPLC-Test eines aliquoten Anteils der wässerigen Phase zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 39,18% an.

Man reduziert die Hauptmenge der wässerigen Phase 3¼ Stunden bei 23°C unter einem H₂-Druck von 2,43 bar (49,8 psi), wobei man 1,0 g Pd/C-Katalysator einsetzt. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt, und vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mikrobiologisch auf Amikacin untersucht. Die turbidimetrische Untersuchung zeigt eine Ausbeute von 27,84% an, der Plattentest ergibt eine Ausbeute von 28,6%.

Beispiel 15 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A mit NAE bei 0 bis 5°C nach "Rück"-Hydrolyse mit Wasser A) Silylierung von Kanamycin A unter Verwendung von HMDS mit TMCS als Katalysator

Man erhitzt 10 g Kanamycin A (97,6% rein, 20,14 mMol) in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Zu dieser Reaktionsmischung gibt man im Verlauf von 10 Minuten eine Mischung aus 22,76 g (141 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin A) HMDS und 1 ml (0,856 g, 7,88 mMol) TMCS. Man hält noch 4¾ Stunden am Rückfluß und kühlt dann die Mischung, konzentriert im Vakuum zu einem gelben, viskosen Sirup und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum. Die Ausbeute an Produkt beträgt 23,8 g (97,9%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀).

B) Acylierung

Man löst 23,8 g (20,14 mMol) Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das in Stufe A hergestellt wurde, in 250 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton bei 23°C auf und kühlt dann auf 0 bis 5°C ab. Dann gibt man unter Rühren 3,63 ml (201,4 mMol, 10 Mol pro Mol polysilyliertem Kanamycin A) Wasser zu und läßt die Mischung 30 Minuten lang unter mäßigem Vakuum stehen. Im Verlauf von weniger als 1 Minute werden 19,133 mMol (0,95 Mol pro Mol polysilyliertes Kanamycin A) NAE in 108,3 ml Aceton zugegeben. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei 0 bis 5°C, verdünnt mit Wasser, stellt den pH auf 2,5 ein und entfernt dann das Aceton im Vakuum. Dann wird die wässerige Lösung 2½ Stunden bei 23°C bei einem H₂-Druck von 3,45 bar (50 psi) reduziert, wobei man 2,0 g 10% Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Die reduzierte Reaktionsmischung wird durch Dicalite® filtriert, im Vakuum bei 40°C auf ungefähr 100 ml konzentriert und dann auf eine CG-50® (NH₄⁺)-Säule (6 Liter Harz, 5 × 100 cm) aufgegeben. Man wäscht mit Wasser und eluiert dann mit 0,6 n-1,0 n-3 n NH₄OH. Man erhält 60,25% Amikacin, 4,37% BB-K6, 4,35% BB-K29, 26,47% Kanamycin A und 2,18% Polyacylverbindungen.

Beispiel 16 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A mit SAE bei 0 bis 5°C nach "Rück"-Methanolyse A) Silylierung von 6′-N-Cbz-Kanamycin A

Man bringt 20,0 g (32,4 mMol) 6′-N-Cbz-Kanamycin A in 200 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter einem Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Im Verlauf von 10 Minuten gibt man 47,3 ml (226,8 mMol, 7 Mol pro Mol 6′-N-Cbz-Kanamycin A) HMDS zu und setzt das Erhitzen am Rückfluß noch 20 Stunden fort. Dann kühlt man die Mischung, konzentriert im Vakuum und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum, wodurch man 39,1 g weißen amorphen Feststoff erhält. Ausbeute 95,4%, berechnet als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉.

B) Acylierung

Man löst 39,1 g (32,4 mMol) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das in der obigen Stufe A hergestellt wurde, in 400 ml trockenem Aceton unter Rühren bei 23°C auf. Man gibt 6,6 ml (162 mMol), 5 Mol pro Mol polysilyliertes -6′-N-Cbz-Kanamycin A) Methanol zu und rührt die Mischung 1 Stunde unter einer starken Stickstoffspülung bei 23°C. Die Mischung wird auf 0 bis 5°C abgekühlt, und eine Lösung von 11,35 g (32,4 mMol) SAE in 120 ml zuvor abgekühltem, trockenem Aceton wird zugesetzt. Man rührt die Mischung weitere 3 Stunden bei 0 bis 5°C und gibt sie dann 1 Woche lang in einen bei 4°C gehaltenen Kälteraum. Dann gibt man 300 ml Wasser zu, stellt den pH auf 2,0 ein, rührt die Mischung 1 Stunde und entfernt das Aceton im Vakuum. Die erhaltene wässerige Lösung wird 17 Stunden bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,72 bar (54,0 psi) reduziert, wobei man 3,0 g 10%iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Dann filtriert man durch Dicalite®, konzentriert im Vakuum auf 75 bis 100 ml, gibt auf eine CG-60® (NH₄⁺)-Säule auf und eluiert mit Wasser und 0,6 n NH₄OH. Man erhält 52,52% Amikacin, 14,5% BB-K29, 19,6% Kanamycin A und 1,71% Polyacylverbindungen.

Beispiel 17 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-Kanamycin A mit SAE bei 0 bis 5°C nach "Rück"-Hydrolyse mit Wasser A) Silylierung von Kanamycin A mit TMCS in Acetonitril unter Verwendung von Tetramethylguanidin als Säureakzeptor

Man suspendiert 4,88 g (10,07 mMol) Kanamycin A in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei 23°C. Zur gerührten Suspension gibt man 16,234 g (140,98 mMol, 14 Mol pro Mol Kanamycin A) Tetramethylguanidin (TMG). Man erhitzt die Mischung zum Rückfluß und gibt im Verlauf von 15 Minuten 15,32 g (140,98 mMol pro Mol Kanamycin A) TMCS zu. Ungefähr ½ Stunde nach der Zugabe des TMCS bildet sich ein weißer Niederschlag von TMG · HCl. Man kühlt die Mischung auf Raumtemperatur, konzentriert zu einem klebrigen Rückstand und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum. Der Feststoff wird mit 100 ml trockenem THF verrieben, und das unlösliche TMG-HCl wird abfiltriert und mit 5 × 20 ml-Portionen THF gewaschen. Vereinigtes Filtrat und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 40°C zu einem klebrigen Rückstand konzentriert und 2 Stunden unter Hochvakuum getrocknet. Man erhält 10,64 g eines hell-cremefarbigen, klebrigen Rückstands. Die Ausbeute beträgt 87,6%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.

B) Acylierung

Man löst 10,64 g (10,07 mMol) Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das in der obigen Stufe A hergestellt wurde, in 110 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton unter Rühren bei 23°C auf und kühlt die Lösung auf 0 bis 5°C. Dann gibt man 1,81 ml Wasser (100,7 mMol, 10 Mol pro Mol polysilyliertem Kanamycin A) zu und rührt die Lösung 30 Minuten unter mäßigem Vakuum. 3,70 g (10,57 mMol, 5%iger Überschuß) SAE in 40 ml vorgekühltem, trockenem Aceton werden im Verlauf von weniger als 1 Minute zugegeben, und die Mischung wird 1 Stunde gerührt. Man arbeitet die Mischung nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 16B auf, wobei man ungefähr 50% Amikacin, ungefähr 10% BB-K29, 5 bis 8% BB-K6, ungefähr 20% Kanamycin A und 5 bis 8% Polyacylverbindungen erhält.

Beispiel 18 Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A in Pyridin unter Verwendung von HMDS

Man suspendiert 10,0 g (20,64 mMol) Kanamycin A in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem, frisch destilliertem Pyridin bei 23°C. Man beginnt eine Stickstoffspülung und bringt die Suspension zum Rückfluß. 17,33 g (107,32 mMol, 5,2 Mol pro Mol Kanamycin A) HMDS werden in Verlauf von 10 Minuten zugesetzt, und die Mischung wird 19 Stunden am Rückfluß gehalten. Dann kühlt man auf Raumtemperatur, konzentriert im Vakuum zu einem hellgelb-goldenen Sirup und trocknet unter Hochvakuum, wobei man einen weißen, amorphen Feststoff erhält. Man erhält 22,1 g Produkt. Ausbeute 92,6%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.

Beispiel 19 Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A unter Verwendung von Triäthylchlorsilan mit Triäthylamin als Säureakzeptor

5,0 g zu 97,6% reines Kanamycin A (10,07 mMol) werden in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril bei 23°C suspendiert. Man gibt 33,8 ml (24,5 g, 241,7 mMol) Triäthylamin zu und bringt die Suspension zum Rückfluß. Eine Lösung von 23,7 ml (21,3 g, 140,98 mMol) Trichloräthylsilan in 25 ml trockenem Acetonitril wird im Verlauf von 20 Minuten zugesetzt. Man hält noch weitere 7 Stunden am Rückfluß und kühlt die Mischung auf Raumtemperatur ab, worauf lange, feine Nadeln von TEA-HCl abgeschieden werden. Man läßt die Mischung ungefähr 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen, konzentriert im Vakuum bei 40°C zu einem klebrigen Feststoff und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum zu einem dunkel-orangefarbenen, klebrigen Feststoff. Man verreibt den Feststoff mit 100 ml trockenem THF von 23°C und filtriert das unlösliche TEA-HCl ab, wäscht mti 5 × 20 ml THF und trocknet. Hierbei erhält man 16,0 g TEA-HCl. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum zu einem Feststoff konzentriert. Dann trocknet man 2 Stunden unter Hochvakuum. Man erhält 19,3 g Poly(triäthylsilyl)-kanamycin A als dunkelorangen, viskosen Sirup.

Beispiel 20 Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A unter Verwendung von bis-Trimethylsilylharnstoff

Man suspendiert 10,0 g zu 99,7% reines Kanamycin A (20,58 mMol) in 200 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei 23°C. Zur Suspension gibt man 29,45 g bis-Trimethylsilylharnstoff (BSU) (144,01 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin) und bringt die Mischung unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Man hält noch 17 Stunden am Rückfluß und kühlt dann die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur ab. Eine kleine Menge unlösliches Material wird durch Filtrieren entfernt, mit 3 × 10 ml-Portionen Acetonitril gewaschen und getrocknet (1,1381 g), Infrarot-Spektroskopie zeigt, daß es sich hierbei um BSU und eine kleine Menge nichtumgesetztes Kanamycin A handelt. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden 16 Stunden auf 4°C abgekühlt. Es scheidet sich weiterer Feststoff ab, der wie oben beschrieben gewonnen wird. Man erhält 7,8 g. Durch Infrarotanalyse wird gezeigt, daß es sich um BSU und Harnstoff handelt. Das hellgelbe Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 40°C konzentriert. Anschließend trocknet man unter Hochvakuum, wobei man 27,0 eines weißen Feststoffs erhält, der teilweise klebrig ist und teilweise aus feinen, nadelartigen Kristallen besteht. Man behandelt den Feststoff mit 150 ml Heptan von 23°C, entfernt den unlöslichen Anteil durch Filtrieren, wäscht mit 2 × 50 ml-Portionen Heptan und trocknet. Hierbei erhält man 6,0 g weiße Nadeln, bei denen es sich nach Infrarotanalyse um BSU und Harnstoff handelt. Vereinigtes Filtrat und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 40°C konzentriert. Dann trocknet man 2 Stunden lang unter Hochvakuum, wobei man 20,4 g weiße Nadeln erhält. Deren Infrarotspektrum ist typisch für polysilyliertes Kanamycin A. Berechnungen zeigen, daß das Produkt durchschnittlich 7,22 Trimethylsilylgruppen enthält.

Beispiel 21 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Per(trimethylsilyl)-kanamycin A nach teilweise Desilylierung mit 1,3-Butandiol A) Herstellung von Per(trimethylsilyl)-kanamycin A

Man suspendiert 10,0 g (20,639 mMol) Kanamycin A in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei 23°C. Man bringt die Suspension unter Stickstoffspülung zum Rückflußkochen und gibt dann im Verlauf von 10 Minuten 23,322 g (144,5 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin A) HMDS zu. Man hält noch 16 Stunden lang am Rückfluß und kühlt dann die Mischung auf Raumtemperatur ab und konzentriert dann im Vakuum. Anschließend trocknet man 2 Stunden unter Hochvakuum. Man erhält 24,3 g eines weißen, klebrigen Rückstands. Die Ausbeute beträgt 92,1%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₁.

B) Acylierung

24,3 g in Stufe A hergestelltes Per(trimethylsilyl-kanamycin A werden in 240 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton bei 23°C unter Rühren gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 9,25 ml 1,3-Butandiol (103,2 mMol, 5 Mol pro Mol Per(trimethyl)-kanamycin A). Man rührt die Mischung 2 Stunden bei 23°C unter Stickstoffspülung und kühlt dann auf 0 bis 5°C ab. Im Verlauf von ungefähr 1 Minute gibt man 7,23 g SAE (20,64 mMol) in 70 ml vorgekühltem Aceton zu. Die Mischung wird 3 Stunden bei 0 bis 5°C gerührt und dann ungefähr 16 Stunden lang in einem bei 4°C gehaltenen Kälteraum stehengelassen. Man gibt 200 ml Wasser zu, stellt den pH auf 2,5 ein und rührt die klare, gelbe Lösung 30 Minuten bei 23°C. Das Aceton wird im Vakuum entfernt und die wässerige Lösung wird 2 Stunden lang bei 23°C bei einem H₂-Druck von 3,79 bar (55,0 psi) reduziert, wobei man 3,0 g 10%iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Dann filtriert man die reduzierte Lösung durch Dicalite® und chromatographiert wie in Beispiel 16 B beschrieben. Man erhält 47,50%Amikacin, 5,87% BB-K29, 7,32% BB-K6, 24,26% Kanamycin A und 7,41% Polyacylverbindungen.

Beispiel 22 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das in THF unter Verwendung von SAE mit Sulfaminsäurekatalysator hergestellt wurde

Zu einer unter Rückfluß gehaltenen Mischung von 5,0 g (10,32 mMol) Kanamycin A in 50 ml Molekularsieb-getrocknetem Tetrahydrofuran (THF) gibt man 100 mg Sulfaminsäure und 12,32 g (76,33 mMol) HMDS. Man hält die Mischung 18 Stunden lang am Rückfluß, wobei nach 6 Stunden vollständige Auflösung erfolgt. Man kühlt die Lösung auf 23°C, behandelt mit 0,1 ml Wasser und hält 30 Minuten bei 23°C. Eine Lösung von 3,61 g (10,3 mMol) SAE in 36 ml THF wird im Verlauf von 30 Minuten zugesetzt. Nach 3stündigem Rühren wird die Mischung mit 100 ml Wasser verdünnt und der pH mit 10%iger H₂SO₄ auf 2,2 eingestellt. Man rührt 30 Minuten lang bei 23°C und konzentriert dann im Vakuum, um das THF zu entfernen. Die erhaltene wässerige Lösung wird 2 Stunden lang bei 23°C bei einem H₂-Druck von 3,45 bar (50 psi) reduziert, wobei man 10%iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Die reduzierte Lösung wird durch Dicaliete® filtriert, und die Feststoffe werden mit Wasser gewaschen. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (150 ml) werden mikrobiologisch gegen E. coli untersucht. Man stellt fest, daß sie 1225 mcg/ml (31,5% Ausbeute an aktivem Material) Amikacin enthält.

Beispiel 23 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Di-carbobenzyloxy-AHBA A) Herstellung des Dicarbobenzyloxy-L-[-)-α-amino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxysuccinimidesters

Man löst 8 g (20,65 mMol) Dicarbobenzyloxy-L-(-)-α-amino-a-hydroxybuttersäure und 2,37 g (20,65 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 50 ml trockenem Aceton von 23°C auf. 4,25 g (20,65 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 20 ml trockenem Aceton, werden zugegeben und das Ganze wird 2 Stunden bei 23°C gerührt. Man filtriert den Dicyclohexylharnstoff ab, wäscht den Filterkuchen mit 10 ml trockenem Aceton und vereinigt Filtrate und Waschflüssigkeiten.

B) Acylierung

Aus 10,0 g (20,639 mMol) Kanamycin A nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 21 hergestelltes Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A wird in 100 ml trockenem Aceton gelöst.

Man kühlt die Lösung auf 0 bis 5°C ab, gibt 3,7 ml entionisiertes Wasser zu und rührt die Lösung 30 Minuten unter mäßigem Vakuum bei 0 bis 5°C.

Zu dieser Lösung gibt man die Lösung des in Stufe A hergestellten di-Cbz-blockierten Acylierungsmittels und rührt die Mischung dann 30 Minuten lang bei 0 bis 5°C. Die Mischung wird mit Wasser verdünnt, der pH wird auf 2,2 eingestellt und das Aceton wird im Vakuum entfernt. Man reduziert die wässerige Lösung nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 22 und filtriert dann durch Dicalite®. Durch Chromatographie wird festgestellt, daß 40 bis 45% Amikacin, etwa 10% BB-K29, eine Spur BB-K6, ungefähr 30% Kanamycin A und eine klein Menge Polyacylverbindungen vorliegen.

Beispiel 24 Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A unter Verwendung von HMDS mit Imidazol als Katalysator

Man erhitzt 11 g (27,7 mMol) Kanamycin A und 100 mg Imidazol in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Stickstoffspülung zum Rückfluß. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man 18,48 g HMDS (114,5 mMol, 5 Mol pro Mol Kanamycin A) zu und hält die Mischung 20 Stunden im Rückfluß. Nach ungefähr 2½ Stunden erfolgt vollständige Auflösung. Man kühlt die Lösung auf 23°C und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum, wobei 21,6 g Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A als schaumiger Rückstand zurückbleiben. Die Ausbeute beträgt 93,1%, berechnet als Kanamycin (Silyl)₁₁.

Beispiel 25 Herstellung von 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin B (BB-K26) durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B mit SAE A) Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B unter Verwendung von HMDS mit TMCS-Katalysator

25 g (51,7 mMol) Kanamycin B in 250 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril werden unter einem Stickstoffstrom zum Rückfluß erhitzt. Man gibt im Verlauf von 30 Minuten 62,3 g HMDS (385,81 mMol, 7,5 Mol pro Mol Kanamycin B), gefolgt von 1 ml TMCS als Katalysator, zu. Die Mischung wird 21 Stunden unter Rückfluß gehalten, wobei nach 1 Stunde vollständige Auflösung erfolgt. Dann wird das Lösungsmittel bei 60°C im Vakuum entfernt. Den öligen Rückstand hält man 3 Stunden bei 60°C unter Hochvakuum. Man erhält 53,0 g Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B. Die Ausbeute beträgt 85,2%, berechnet als Kanamycin B (Silyl)₁₀.

B) Acylierung

53,0 g des in der obigen Stufe A hergestellten Poly(trimethylsilyl)-kanamycins B werden in 500 ml trockenem Aceton bei 0 bis 5°C aufgelöst. Man gibt 20,9 ml Methanol zu und rührt die Mischung 30 Minuten bei 0 bis 5°C im Vakuum. Eine Lösung von 18,1 g (51,67 mMol) SAE in 200 ml vorgekühltem, trockenem Aceton wird im Verlauf von weniger als 1 Minute zugesetzt, und die Mischung wird 30 Minuten bei 0 bis 5°C gerührt. Die Mischung wird nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 22 aufgearbeitet und dann auf eine Säule mit CG-50® (NH₄⁺) (8 × 120 cm) aufgegeben. Man eluiert mit einem NH₄OH-Gradienten von 0,6 n auf 3 n. Erhalten werden 38% BB-K26, 5% des entsprechenden 6′-N-acylierten Kanamycins B (BB-K22), 10% des entsprechenden 3-N-acylierten Kanamycins B (BB-K46), 14,63% Kanamycin und eine kleine Menge polyacyliertes Kanamycin B.

Beispiel 26 Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A unter Verwendung von HMDS mit Kanamycin A-Sulfat als Katalysator

19,5 g (40,246 mMol) Kanamycin A und 0,5 g (0,858 mMol) Kanamycin A-Sulfat [insgesamt = 20,0 g, 41,0 mMol] in 200 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril werden zum Rückfluß gebracht. Man gibt langsam 60,3 ml HMDS (287,7 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin A) zu und hält die Mischung 28 Stunden am Rückfluß. Dann wird am Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft und anschließend unter Dampfstrahlvakuum getrocknet. Man erhält 47,5 g Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A als blaßgelbes Öl. Die Ausbeute beträgt 95,82%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.

Beispiel 27 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A mit N-Trifluoracetyl-blockiertem AHBA-N-hydroxysuccinimidester A) Herstellung von N-Trifluoracetyl-AHBA und Umwandlung in den N-Hydroxysuccinimidester

Zu einer Suspension von 5,0 g (42 mMol) AHBA in 100 ml THF gibt man 40 g (191 mMol) Trifluoressigsäureanhydrid unter Rühren im Verlauf von 10 Minuten zu. Man rührt die Lösung 18 Stunden bei 23°C und konzentriert dann im Vakuum bei 50°C zur Trockne. Den Rückstand löst man in 100 ml wässerigem Methanol (1 : 1) und rührt 1 Stunde. Dann konzenetriert man im Vakuum zur Trockne und läst in 50 ml H₂O wieder auf. Die wässerige Lösung wird mit 3 × 50 ml-Portionen MIBK extrahiert, und nach dem Trockenen über Na₂SO₄ wird der Extrakt zu einem Öl konzentriert. Spuren an Lösungsmittel werden durch Zusatz und Abdestillieren von 4 ml Wasser entfernt. Beim Stehenlassen geht das Öl in einen wachsartigen, kristallinen Feststoff über. Man erhält 2,5 g Produkt. Ausbeute 28%.

Man löst 2,4 g (11,3 mMol) des N-Trifluoracetyl-AHBA in 50 ml trockenem Aceton und gibt 1,30 g (11,31 mMol) N-Hydroxysuccinimid zur Lösung. Eine Lösung von 2,33 g Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml trockenem Aceton wird langsam zugesetzt. Man rührt die Reaktionsmischung 2 Stunden lang bei 23°C und entfernt dann den ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren und wäscht mit einer kleinen Menge Aceton. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters der N-Trifluoracetyl-AHBA) wird bei der nachfolgenden Stufe ohne Isolierung verwendet.

B) Acylierung

Zu einer Lösung von 11,31 mMol Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das wie in Beispiel 26 beschrieben hergestellt wurde, in 54 ml Aceton gibt man 2,0 ml (113,4 mMol) Wasser und rührt die Mischung 30 Minuten im Vakuum bei 0 bis 5°C. Zu der Mischung gibt man den in der obigen Stufe A hergestellten N-Hydroxysuccinimidester der N-Trifluoracetyl-AHBA (11,31 mMol) und hält die Mischung dann 1 Stunde bei 5°C. Der pH wird mit 20%iger H₂SO₄ auf ungefähr 2,0 eingestellt, die Mischung wird 30 Minuten gerührt und dann wird der pH mit NH₄OH auf ungefähr 6,0 erhöht. Anschließend dampft man die Mischung am Rotationsverdampfer zur Trockne ein. Man erhält 14,4 g eines klebrigen, weißlichen Feststoffs. Der Feststoff wird in 100 ml Wasser gelöst, der pH wird mit 10 n NH₄OH von 5,5 auf 11,0 angehoben und die Lösung wird in einem Ölbad 1 Stunde bei 70°C erhitzt. Dann senkt man den pH (9,5) mit HCl auf 7,0 ab, führt mit der Lösung eine Klarfiltration durch, um eine kleine Menge unlösliche Materialien zu entfernen und wäscht das Filter mit Wasser. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (189 ml) werden auf eine Säule mit CG-50® (NH₄⁺) (8 × 90 cm) aufgegeben, mit 2 Liter Wasser gewaschen und mit einem NH₄-OH-Gradienten (0,6 n - 1,0 n konzentriert) eluiert. Man erhält 28,9% Amikacin, 5,0% BB-K6, 5,7% BB-K29, 43,8% Kanamycin A, 3,25% Polyacylverbindungen und 14,3% eines unbekannten Materials, das in der ersten Fraktion aus der Säule austritt.

Beispiel 28 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A mit tert.-Butoxycarbonyl-blockiertem AHBA-N-hydroxysuccinimidester A) Herstellung von tert.-BOC-AHBA und Umwandlungen in den N-Hydroxysuccinimidester

Eine Lösung von 5,0 g (42 mMol) AHBA in 100 ml Wasser und 20 ml Aceton wird mit 10 n NaOH auf pH 10 eingestellt. Im Verlauf von 3 bis 4 Minuten gibt man 11,6 g (53 mMol) Ditert.-butylcarbonat zu und rührt die Lösung 35 Minuten, während man den pH durch periodische Zugabe von 10 n NaOH bei pH 10 hält. Das Aceton wird im Vakuum entfernt, und die wässerige Phase wird mit 40 ml Äthylacetat gewaschen. Man senkt den pH der wässerigen Lösung mit 3 n HCl auf 2,0 ab und extrahiert dann mit 3 × 30ml MIBK. Die vereinigten MIBK-Extrakte werden über Na₂SO₄ getrocknet und zu einem klaren, öligen Rückstand konzentriert. Man erhält 8,2 g Produkt, Ausbeute 89%.

4,25 g (19,4 mMol) des tert.-BOC-AHBA werden in 50 ml Aceton gelöst, und man gib 2,23 g (19,4 mMol) N-Hydroxysuccinimid zu. Eine Lösung von 4,00 g (19,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Aceton wird langsam zugesetzt, und die Mischung wird 2 Stunden bei 23°C gerührt. Man entfernt den ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren und wäscht mit einer kleinen Menge Aceton. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von tert.-BOC-AHBA) werden in der nachfolgenden Stufe ohne Isolierung eingesetzt.

B) Acylierung

Zu einer Lösung von 41,28 mMol Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, wie in Beispiel 26 beschrieben hergestellt, in 94 ml Aceton gibt man 3,5 ml (194 mMol) Wasser und rührt die Lösung 30 Minuten im Vakuum bei 0 bis 5°C. 19,4 mMol des in der obigen Stufe A hergestellten N-Hydroxysuccinimidesters von tert.-BOC-AHBA werden zugesetzt und die Mischung wird 1 Stunde bei 5°C stehengelassen. Dann gibt man 200 ml Wasser zu und senkt den pH (7,0) mit 20%iger H₂SO₄ auf 2,0 ab. Nach 30minütigem Rühren wird der pH mit NH₄OH auf ungefähr 6,0 angehoben, und die Mischung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man 36,3 g eines goldfarbenen Öls erhält. Das Öl wird in 200 ml Trifluoressigsäure gelöst. 15 Minuten lang stehengelassen und dann am Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft. Man wäscht das Öl mit Wasser und destilliert das Wasser ab. Man gibt konzentrierte NH₄OH auf pH 6,0 zu und destilliert dann ab. Der erhaltene Feststoff wird in Wasser gelöst, filtriert, und das Filter wird mit Wasser gewaschen. Man gibt vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (259 ml) auf eine CG-50® (NH₄⁺)-Säule (8 × 92 cm), wäscht mit 4 Liter Wasser und eluiert mit einem NH₄-OH-Gradienten (0,6 n - 1,0 n konzentriert). Man erhält 40,32% Amikacin, 4,58% BB-K6, 8,32% BB-K29, 30,50% Kanamycin A und 7,43% Polyacylverbindungen.

Beispiel 29

Man wiederholt die allgemeine Arbeitsweise des Beispiels 1 mit der Ausnahme, daß man das dort verwendete 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A durch eine äquimolare Menge in 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin B ersetzt. Hierbei erhält man das 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamicyin B.

Beispiel 30

Man wiederholt die allgemeine Arbeitsweise des Beispiels 1 mit der Ausnahme, daß man den dort verwendeten L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester durch:

L-(-)-β-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxypropionsäure-N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester und
L-(-)-w-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxyvaleriansäure-N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester ersetzt, wodurch man
1-N-[L-(-)-β-Amino-α-hydr 01003 00070 552 001000280000000200012000285910089200040 0002002818992 00004 00884oxypropionyl]kanamycin A, bzw.
1-N-[L-(-)-δ-Amino-α-hydroxyvaleryl]kanamycin A

erhält.

Beispiel 31

Man wiederholt die allgemeine Arbeitsweise des Beispiels 25 mit der Ausnahme, daß man den dort verwendeten L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxysuccinimidester durch:

L-(-)-β-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxypropionsäure-N-hydroxy-succinimdester, bzw.
L-(-)-δ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxyvaleriansäure-N-hydroxy-succinimidester ersetzt, wodurch man
1-N-[L-(-)-β-Amino-α-hydroxypropionyl]kanamycin B, bzw.
1-N-[L-(-)-δ-Amino-α-hydroxyvaleryl]kanamycin A

erhält.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von 1-N-[ω-Amino-α-hydroxy-alkanyl]kanamycinen A oder B der allgemeinen Formel I: in derRfür OH oder NH₂ steht und neine ganze Zahl von 0 bis 2 darstellt,dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

• a) in einem organischen Lösungsmittel und gegebenenfalls in Gegenwart eines Sliylierungskatalysators,
  • a₁) Kanamycin A oder B oder
  • a₂) Kanamycin A oder B, das an der 6′-Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe aufweist,
• mit einem Silylierungsreagens umsetzt,
• b) das erhaltene Produkt mit einem acylierenden Derivat einer Säure der allgemeinen Formel II: in derneine ganze Zahl von 0 bis 2 und Beine Aminoschutzgruppe darstellt,in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und
• c) sämtliche Schutzgruppen abspaltet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Kanamycin A oder B gemäß Verfahrensstufe a₂) an der 6′-Aminogruppe eine der folgenden Schutzgruppen: aufweist,
wobei R¹ und R² gleich oder verschieden sind und jeweils für H, F, Cl, Br, NO₂, OH, Niedrigalkyl oder Niedrigalkoxy stehen und X für Cl, Br, F oder J steht und Y die Bedeutungen H, Cl, Br, F oder J besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß Verfahrensstufe a₁) bis zu einer durchschnittlichen Anzahl von 4 bis 8 Silylgruppen pro Molekül silyliert.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß Verfahrensstufe a₂) bis zu einer durchschnittlichen Anzahl von 3 bis 7 Silylgruppen pro Molekül silyliert.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Trimethylsilylierungsreagens umsetzt.

6. Durch Trimethylsilylgruppen substituierte Kanamycine A oder B, erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 in der in den Ansprüchen 2 bis 5 angegebenen Ausführung,
Erhitzen der Reaktionsmischung unter Rückfluß und Abziehen des Lösungsmittels.