SE447259B - Forfarande for framstellning av ett 1-n-/l-(-)-omega-amino-alfa-hydroxialkanoyl/kanamycin a eller b - Google Patents

Description

447 259 2 pglysilylerat kanamycin A eller B innehållande en annan blockerings- grupp än silyl på 6'-aminogruppen i ett i huvudsak vattenfritt orga- niskt lösningsmedel med ett acylerande derivat av en syra med for- meln B-HN-CH2-(CH2)n-ïfi-COOH II OH vari n är ett heltal från 0 till 2 och B är en aminoblockerande grupp, och därefter avlägsnar samtliga blockeringsgrupper.

'Kanamycinerna är välkända antibiotika, som exempelvis be- skrivs i Merck Index, 8:e upplagan, sid. 597-8. Talrika derivat av kanamycinerna är även kända. Strukturformlerna för kanamycin A och B återges nedan jämte det standardnumreringssystem som används inom tekniken. I det följande kommer de olika kanamycinderivaten att an- ges sâsom derivat av kanamycin A eller B istället för att anges med strukturformler, så att man undviker nödvändigheten av att jämföra komplicerade strukturer i syfte att fastställa skillnader. __6h CB NH 2 2 HO 4' HO III Kanamycin A: R = OH Kanamycin B: R = NH2 447 259 3 Den amerikanska patentskriften 3 781 268 avslöjar och be- skriver l-/L-(-%-3'-amino-alfa-hydroxibutyryl/kanamycin A (amika- cin) och B liksom deras mono- och dikarbobensyloxiskyddade derivat.

Lägre och högre homologer därav beskrivs i de amerikanska patent- skrifterna 3 886 139 och 3 904 597. Föreningarna framställs genom att man acylerar ett 6'-N-skyddat kanamycin A eller B med ett acyle- rande derivat av en N-skyddad L-(-)-'§'-amino-alfa-hydroxismörsy- ra i ett vattenhaltigt medium, varefter en eller båda N-skyddsgrup- perna avlägsnas.

Den amerikanska patentskriften 3 974 137 avslöjar och beskri- ver ett förfarande för framställning av l-/L-(-)-ö°amino-alfa-hydr- oxibutyryl/kanamycin A, vilket förfarande innebär att man omsätter 6'-karbobensyloxikanamycin A med minst 3 mol av bensaldehyd, en sub- stituerad bensaldehyd eller pivaldehyd för framställning av 6'-N- -karbobensyloxikanamycin A, som innehåller Schiffbasgrupper i l-,3- och 3"-ställningarna, acylerar detta tetraskyddade kanamycin A-de- rivat med N-hydroxisuccinimidestern av L-(-)-@'-bensyloxikarbonyl- amino-alfa-hydroxismörsyra och därefter avlägsnar skyddsgrupperna.

Den belgiska patentskriften 828 192 avslöjar och beskriver ett förfarande för framställning av l-/L-(-)-a'-amino-alfa-hydroxi- butyryl/kanamycin A genom framställning av samma tetraskyddade kana- mycin A-derivat som i den amerikanska patentskriften 3 974 137, acy- lering med N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboxiimidestern av L-(-)- 3'-bensyloxikarbonylamino-alfa-hydroxismörsyra och därpå följande avlägsnande av skyddsgrupperna.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett förbättrat och kommersiellt attraktivt förfarande för framställning av föreningar- na med formel I ovan. Användningen av ett polysilylerat kanamycin A eller B såsom utgångsmaterial ger hög löslighet i det organiska lös- ningsmedelssystemet, vilket således möjliggör omsättning vid höga koncentrationer. Ehuru reaktionen vanligtvis utförs i lösningar, som innehåller ca 10-20% polysilylerat kanamycinutgångsmaterial, har ut- märkta resultat erhållits vid koncentrationer av ca 50 g/100 ml lös- ningsmedel. - - I likhet med inom tekniken kända processer ger förfarandet enligt uppfinningen en blandning av acylerade produkter. Den önska- de 1-N-acylerade produkten avskiljs från de övriga produkterna me- delst kromatografi och biprodukterna kan, om så önskas, hydrolyse- 447 259 4 ras till kanamycinutgângsmaterialet för recirkulering. Vid de inom tekniken kända processerna har det visat sig att eventuellt bildat 3"-N-acylerat material ger en förlust, som ungefär motsvarar sam- ma mängd önskad l-N-acylerad produkt, till följd av den stora svå- righeten att separera sistnämnda produkt från förstnämnda material.

Ett speciellt fördelaktigt särdrag hos föreliggande förfarande är den ytterst låga mängd oönskvärd 3”'-N-acylerad produkt som bildas (normalt kan man icke påvisa någon sådan produkt).

Vid framställning av l-/L-(-)-alfa-amino-alfa-hydroxibutyr- yl/kanamycin A (amikacin) medelst olika, inom tekniken kända pro- cesser bildas normalt den 3"-N-acylerade produkten (BB-Kll), den 3-N~acylerade produkten (BB-K29), den 6'-N-acylerade produkten (BB-K6) och polyacylerat material jämte oreagerat kanamycin A. Vid kommersiell framställning av amikacin genom acylering av 6'-N-kar- bobensyloxikanamycin A i ett vattenhaltigt medium, följt av avlägs- nande av skyddsgrupperna, konstaterar man således att ca lO% av den önskade föreningen amikacin (2,5 kg i en 25-kg-sats) vanligvis går förlorade till följd av närvaron av föreningen BB-Kll såsom bipro- dukt. Vid framställning av föreningen amikacin medelst föreliggande förfarande kan man normalt icke påvisa biprodukten BB-Kll i reak- tionsblandningen.

Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för framställ- ning av ett l-N-/U)-amino-alfa-hydroxialkanoyl/kanamycin A eller B med formeln CH NH H0 10 15 20 25 30 35 447 259 vari R är OH eller NH2 och n är ett heltal från 0 till 2, eller ogiftiga, farmaceutiskt godtagbara syraaddítions- salter därav, vilket förfarande utmärks av att man på i och för sig känt sätt acylerar polysilylerat kanamycin A eller B eller polysilylerat kanamycin A eller B inne- hållande en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'~amino- gruppen, vilken blockeringsgrupp har formeln 1' cxo R o 3 || l H azoc- , czg-c-o-c- C33 112 I s- ' Ü r YZXC@" I_ N02 O å 0 y eller \ X3C-CH2-0-Q- c/ H O vari R1 och R2 är lika eller olika och vardera betecknar H, F, Cl, Br, N02, OH, lägre alkyl eller lägre alkoxi, X är Cl, Br, F eller I och Y är H, Cl, Br, F eller I 10 15 20 25 30 35 447 259 och varvid det polysilylerade kanamycinderivatet inne- håller 2-10 silylgrupper per molekyl,företrädesvis i genomsnitt 4-8 silylgrupper per molekyl eller 3-7 silyl- grupper per molekyl i det fall det polysilylerade kanamycin A- eller B-utgângsmaterialet innehåller en annan blockerings- grupp än silyl på 6'-aminogruppen, och silylgrupperna är tri-(lägre alkyl)silylgrupper, med ett acylerande derivat av en syra i L-(-)-formen med formeln B-HN-CH2-(CH2)n~CH-COOH (II) OH vari n är ett helt tal från 0 till 2 och B är en kon- ventionell aminoblockerande grupp, i ett organiskt lösningsmedel innehållande upp till 25% vatten och därefter på i och för sig känt sätt avlägsnar samtliga blockerings- grupper.

Den acylerande syran kan föreligga i sin isomera (+)- eller (-)-isomerform eller såsom en blandning av de två iso- mererna (d,l-formen), varvid man således erhåller mot- svarande förening med formel I där l-N-/u,-amino-alfa- hydroxialkanoyl/-gruppen föreligger i sin (+P-fäller (R)í7 form eller sin (-P-[eller (5)i7 form eller såsöm en blandning därav. Varje sådan isomer form och blandningen därav faller inom ramen för föreliggande uppfinning.

Vid en föredragen utföringsform föreligger den acylerande syran i sin (-)-form. Vid en annan föredragen utförings- form föreligger den acylerande syran i sin (+)-form.

Den mest föredragna blockeringgfiuppenär karbobensyloxi- gruppen.

Vid en föredragen utföringsform av uppfinningen är det acylerande derivatet av syran en aktiv ester och före- trädesvis dess aktiva ester med N-hydroxisuccinimid, N-hydroxi-5-nor-bornen-2,3-dikarboximid eller N-hydroxi- ftalimid. Vid en annan föredragen utföringsform är det 10 15 20 25 30 35 447 259 acylerande derivatet av syran en blandsyraanhydrid och företrädesvis dess blandsyraanhydrid med pivalinsyra, bensoesyra, isobutylkolsyra eller bensylkolsyra.

En synnerligen föredragen utföringsform av föreliggande uppfinning avser framställning av l-N-[I-(-)- ä'-amino- alfa-hydroxibutyrylykanamycin A eller ett ogiftigt, farmaceutiskt godtagbart syraadditionssalt därav, varvid man acylerar polysilylerat kanamycin A med en blandsyra- anhydrid av L- (-)-Q/ -bensyloxikarbonylamino-alfa- hydroxismörsyra (företrädesvis dess blandsyraanhydrid med pivalinsyra, bensoesyra, isobutylkolsyra eller bensyl- kolsyra) i ett i huvudsak vattenfritt organiskt lösnings- medel och därefter avlägsnar samtliga blockeringsgrupper.

En annan synnerligen föredragen utföringsform av upp- finningen avser framställning av l-N-[L-(-)-à/ -amino- alfa-hydroxibutyryly-kanamycin A eller ett ogiftigt, farmaceutiskt godtagbart syraadditionssalt därav genom att man acylerar polysilylerat kanamycin A, som innehåller en karbobensyloxigrupp på 6'-aminogruppen, med en bland- syraanhydrid av L-(-)-a/ -bensyloxikarbonylamino-alfa- hydroxismörsyra (och företrädesvis dess blandsyraanhydrid med pivalinsyra, bensoesyra, isobutylkolsyra eller bensyl- kolsyra) i ett i huvudsak vattenfritt organiskt lösnings- medel och därefter avlägsnar samtliga blockeringsgrupper.

Ytterligare en annan synnerligen föredragen utföringsform av uppfinningen avser framställning av l-N-[i-(-)-à/-amino- alfa-hydroxibutyrylfkanamycin A eller ett ogiftigt, farma- Ceutiskt gOdtaqbart syraadditionssaltdärav genom att man acylerar polysilylerat kanamycin A med en aktiv ester av L-(-)-à/ -bensyloxikarbonylamino-alfa-hydroxismörsyra (och företrädesvis dess aktiva ester med N-hydroxi- ' ' succinimid, N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboximid eller N-hydroxiftalimid) i ett i huvudsak vattenfritt organiskt lösningsmedel och därefter avlägsnar samtliga blockerings- grupper. 10 15 20 25 30 35 447 259 8 Ytterligare en synnerligen föredragen utföringsform av uppfinningen avser framställning av l-N-[f-(-)-2ï'-amino- alfa-hydroxibutyryljkanamycin A eller ett ogiftigt, farmaceutiskt godtagbart syraadditionsalt därav genom att man acylerar polysilylerat kanamycin A, som innehåller en karbobensyloxigrupp på 6'-aminogruppen, med en aktiv ester av L-(-)-Ö”-bensyloxikarboxylamino-alfa-hydroxi- smörsyra (och företrädesvis dess aktiva ester med N-hydroxi- succinimid, N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboximid eller N-hydroxiftalimid) i ett i huvudsak vattenfritt organiskt lösningsmedel och därefter avlägsnar samtliga blockerings- grupper.

Vid en föredragen utföringsform är materialet polysilylerat kanamycin A eller B och företrädesvis polysilylerat kana- mycin A, som innnehåller i genomsnitt 4-8 silylgrupper och företrädesvis trimetylsilylgrupper per molekyl. Vid en annan föredragen utföringsform är materialet polysilylerat kanamycin A eller B och företrädesvis polysilylerat kanamycin A, som innehåller en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-aminogruppen och innehåller i genomsnitt 3-7 silylgrupper och företrädesvis trimetylsilylgrupper per molekyl.

Med uttrycket "ogiftigt, farmaceutiskt godtagbart syra- additionssalt" av en förening med formel I avses i före- liggande sammanhang ett mono-, di-, tri- eller tetrasalt, som har bildats genom omsättning av en molekyl av en förening med formel I med 1-4 ekvivalenter av en ogiftig, farmaceutiskt godtagbar syra. Sådana syror innefattar ättiksyra, klorvätesyra, svavelsyra, maleinsyra, fosfor- syra, salpetersyra, bromvätesyra, askorbinsyra, äppelsyra och citronsyra och sådana övriga syror, som vanligtvis används för framställning av salter av aminhaltiga - 9 farmaceutika. 10 15 20 25 30 35 9 447 259 Acylering av polysilylerat kanamycin A- eller -B- utgângsmaterial (med eller utan en annan blockerings- grupp än silyl på 6'-aminogruppen) kan i allmänhet utföras i ett organiskt lösningsmedel, vari utgångsmaterialet har tillräcklig löslighet. Dessa utgângsmaterial är lätt- lösliga i de flesta vanliga organiska lösningsmedel.

Lämpliga lösningsmedel innefattar exempelvis aceton, dietylketon, metyl-n-propylketon, metylisobutylketon, metyl- etylketon, acetonitril, glym, diglym, dioxan, toluen, tetrahydrofuran, cyklohexanon, metylenklorid, kloroform, koltetraklorid och blandningar av aceton/butanol eller dietylketon/butanol. Valet av lösningsmedel är beroende på det speciella utgángsmaterialet ifråga. Ketoner är i allmänhet de föredragna lösningsmedlen. Det fördelaktigaste lösningsmedlet för den speciella kombination av reaktanter ifråga som används kan lätt fastställas genom rutinförsök.

Lämpliga silyleringsmedel för användning vid framställning av de polysilylerade kanamycinutgångsmaterialen innefattar trimetylklorsilan, hexametyldisilazan, trietylklorsilan, trietylbromsilan, tri-n-propylklorsilan, metyldietyl- klorsilan, dimetyletylklorsilan, dimetyl-t-butylklorsilan, hexaetyldisilazan, tri-n-propylsilylamin, tetraetyldimetyl- disilazan etc. Andra användbara silylföreningar är hexa- alkylcyklotrisilazaner och okta~alkylcyklotetrasilazaner liksom silylamider (såsom exempelvis trialkylsilylaceta- mider och bis-trialkylsilylacetamider),silylkarbamider (såsom exempelvis trimetylsilylkarbamid) och silylureider.

Trimetylsilylimidazol kan även användas.

En föredragen silylgrupp är trimetylsilylgruppen och föredragna silyleringsmedel för införande av trimetyl- silylgruppen är hexametyldisilazan, bis(trimety1silyl)~ acetamid och trimetylsilylacetamid. Hexametyldisilazañ ' föredras i synnerhet.

När man använder polysilylerat kanamycin A eller B, som innehåller en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-amino- gruppen, såsom utgàngsmaterial kan-detta framställas 10 15 20 25 30 10 447 259 antingen genom polysilylering av det önskade 6'-N- blockerade kanamycinet A eller B eller genom införande av den önskade 6'-N-blockeringsgruppen i polysilylerat kanamycin A eller B.

Metoder för införande av silylgrupper i organiska före- ningar innefattande vissa aminoglykosider är kända inom tekniken. De polysilylerade kanamycinerna (med eller utan en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-aminogruppen) kan framställas medelst inom tekniken kända metoder eller såsom beskrivs närmare nedan.

Med "polysilylerat kanamycin A eller B" avses i före- liggande sammanhang kanamycin A eller B, som innehåller 2-10 silylgrupper i molekylen. Uttrycket "polysilylerat kanamycin A eller B" innefattar således icke persilylerat kanamycin A eller B, som skulle innehålla 11 silylgrupper i molekylen.

Det exakta antalet silylgrupper (eller deras position) i de polysilylerade kanamycinutgångsmaterialen (med eller utan en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-amino- gruppen) är icke känt. Det har visat sig att både under- silylering och översilylering minskar utbytet av den önskade produkten och ökar utbytet av andra produkter.

Vid kraftig under- eller översilylering bildas en liten eller ingen mängd av den önskade produkten. Den silylerings- grad som ger det största utbytet av den önskade produkten är beroende av de speciella reaktanter ifråga som används i acyleringssteget. Den fördelaktigaste silyleringsgraden vid användning av en speciell kombination av reaktanter kan lätt fastställas genom rutinförsök. 447 259 ll Vid framställning av l-N-/L-(-)-'¶'-amino-alfa-hydroxibut- yryl/kanamycin A genom acylering av polysilylerat kanamycin A med N-hydroxisuccinimidestern av L-(-)- E'-bensyloxikarbonylamino-alfa- -hydroxismörsyra i acetonlösning har det visat sig att goda utbyten av den önskade produkten erhålls genom användning av polysilylerat kanamycin A, som har framställt genom omsättning av ca 4-5,5 mol hexametyldisilazan per mol kanamycin A. Större eller mindre mängder hexametyldisílazan kan användas, men utbytet av den önskade produk- ten i det efterföljande acyleringssteget minskas signifikant. Vid det nyssnämnda förfarandet är det föredraget att använda ca 4,5-5,0 mol hexametyldisilazan per mol kanamycin i syfte att erhålla maxi- malt utbyte av produkten i acyleringssteget.

Det torde inses att varje mol hexametyldisilazan kan infö- ra tvâ ekvivalenter av trimetylsilylgruppen i kanamycin A eller B.

Både kanamycin A och B har totalt elva positioner (NH2- och OH-grup- per), som kan silyleras, medan kanamycin A och B, som innehåller en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-aminogruppen, har totalt tio dylika positioner. Således kan teoretiskt 5,5 mol hexametyldisila- zan per mol kanamycin A eller B fullständigt silylera samtliga OH- och NH2-grupper i kanamycin, medan 5,0 mol hexametyldisilazan full- ständigt skulle kunna silylera l mol kanamycin A eller B, som inne- 447 259 12 håller en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-aminogruppen. Det antas emellertid att en sådan omfattande silylering icke äger rum med dessa molförhâllanden under rimlig reaktionstid, ehuru högre silyleringsgrader uppnås under en given reaktionstid då en silyle- ringskatalysator används.

Silyleringskatalysatorer accelererar kraftigt silylerings- hastigheten. Lämpliga silyleringskatalysatorer är välkända inom tek- niken och innefattar bl.a. aminsulfater (t.ex. kanamycinsulfat), sulfamsyra, imidazol och trimetylklorsilan. Silyleringskatalysato- rer befrämjar i allmänhet en högre silyleringsgrad än vad som er- fordras vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning. Översilyle- rat kanamycin A eller B kan emellertid användas såsom utgångsmateri- al om det först behandlas med ett desilyleringsmedel i syfte att nedbringa silyleringsgraden innan acyleringsreaktionen utförs.

Goda utbyten av den önskade produkten erhålls vid acylering av polysilylerat kanamycin A,'som har framställt under användning av ett molförhållande hexametyldisilazan till kanamycin A av 5,5:l.

Om emellertid kanamycin A, som har silylerats vid ett molförhållan- de hexametyldisilazan till kanamycin A av 7:1 (eller vid ett mol- förhållande av 5,5:l i närvaro av en silyleringskatalysator) acyle- ras i aceton med N-hydroxisuccinimidestern av L-(-)-J'-bensyloxi- karbonylamino-alfa-hydroxismörsyra erhålls mindre än l % utbyte av den önskade produkten. Om emellertid samma "översilylerade" kanamy- cin A acyleras med samma acyleringsmedel i acetonlösning, till Vilken vatten (21 mol vatten per mol kanamycin motsvarande 2,5 % (vikt/vo- lym) vatten) har satts såsom desilyleringsmedel l timme före acyle- ring, erhålls ett utbyte av ca 40% av den önskade produkten. Samma resultat erhålls om vattnet ersätts med metanol eller någon annan aktiv väteförening med förmåga att åstadkomma desilylering, t.ex. etanol, propanol, butandiol, metylmerkaptan, etylmerkaptan, fenyl- merkaptan och liknande.

Ehuru det är vanligt att utnyttja torra lösningsmedel vid arbete med silylerade material har det överraskande visat sig att tillsats av vatten till reaktionslösningsmedlet före acylering till och med i frånvaro av "översilylering" ger lika goda utbyten och ibland bättre utbyten av den önskade produkten än i ett torrt lös- ningsmedel. Vid acyleringsreaktioner, som utförs i aceton vid sed- vanliga koncentrationer av 10-20% (vikt/volym) av polysilylerat ka- 447 259 13 namycin A, har det visat sig att utmärkta utbyten av 1-N-/L-(-)-af - -amino-alfa-hydroxibutyryl/kanamycin A erhålls vid tillsats av.upp till 28 mol vatten per mol polysilylerat kanamycin A; vid en koncen- tration av 20% utgör 28 mol vatten per mol polysilylerat kanamycin A ca 8 % vatten. Med andra kombinationer av reaktanter kan t.o.m. ännu större vattenmängder tolereras eller vara gynnsamma. Acyle- ringsreaktionen kan utföras i lösnigsmedel, som innehåller upp till ca 40% vatten, ehuru vid dylika höga vattenkoncentrationer man mås- te utnyttja korta acyleringstider i syfte att undvika alltför kraf- tig desilylering av det polysilylerade kanamycin A- eller -B-ut- gångsmaterialet. I föreliggande sammanhang avses således med uttryc- ket "i huvudsak vattenfritt organiskt lösningsmedel" lösningsmedel, som innehåller upp till ca 25% vatten. En föredragen vattenhalt är upp till ca 20% vatten, en mera föredragen vattenhalt är upp till ca 8% vatten och den mest föredragna vattenhalten är upp till ca 4% vatten.

Såsom antytts ovan kan den lämpligaste silyleringsgraden för en given kombination av acyleringsreaktanter lätt fastställas genom rutinförsök. Det antas att det föredragna genomsnittliga antalet silylgrupper i utgångsmaterialet vanligen ligger mellan 4 och 8 för kanamycin A eller B och mellan 3 och 7 för kanamycin A eller B, som innehåller en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-aminogruppen, men detta är endast ett teoreriskt antagande och utgör icke någon Väsefltlig del av föreliggande uppfinning.

Acyleringsreaktionens varaktighet och temperatur är icke kritiska. Temperaturer inom intervallet från ca -30°C till ca l00oC kan användas för reaktionstider, som varierar från ca l timme upp tilll-åag eller mera. Det har visat sig att reaktionen vanligtvis förlöper väl vid rumstemperatur och ur bekvämlighetssynpunkt och av ekonomiska skäl är det föredraget att utföra reaktionen vid om- givningens temperatur. För maximala utbyten och selektiv acylering är det emellertid föredraget att utföra acyleringen vid en tempera- tur av ca 0-50.

Acylering av l-aminogruppen i det polysilylerade kanamyci- net A eller B (med eller utan en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-aminogruppen) kan utföras med vilket som helst acylerande derivat av syran med formel II ovan, vilket derivat är känt inom tekniken 447 259 14 att vara lämpligt för acylering av en primär aminogrupp. Exempel på lämpliga acylerande derivat av den fria syran innefattar motsvaran- de syraanhydrider, blandanhydrider såsom exempelvis alkoximyrsyra- anhydrider, syrahalider, syraazider, aktiva estrar och aktiva tio- estrar. Den fria syran kan kopplas med det polysilylerade kanamy- cinutgångsmaterialet efter det att den fria syran först har omsatts med N,N*_ dimetylkloroformiminiumklorid (se brittiska patentskriften 1 008 170 och Weichet: Experientia XXI, 6 (1965) 360) eller genom användning av en N,N'-karbonyldiimidazol eller en N,N'-karbonyldi- triazol (se sydafrikanska patentskriften 63/2684), ett karbodiimid- reagens (speciellt N,N'-dicyklohexylkarbodiimid, N,N'-diisopropyl- karbodiimid eller N-cyklohexyl-N“-(2-morfolinoetyl)karbodiimid; se Sheehan och Hess: J.A.C.S. 11 (1955) 1967), ett alkynylaminreagens (se R. Buijle och H.G. Viehe: Angew. Chem. International Edition, Ä (1964) 582),ett isoxazoliumsaltreagens (se R.B. Woodward, R.A.

Olofson och H. Mayer: J. Amer. Chem. Soc. §§ (1961) 1010), ett ke- teniminreagens (se C.L. Stevens och M. E. Munk: J. Amer. Chem. Soc.

§Q (1958) 4065), hexaklorcykB>trifosfatriazin eller hexabromcyklo- trifosfatriazin (se amerikanska patentskriften 3 651 050), difenyl- fosforyiazia wnPA; se J. mer. Chem. soc. g (1972) 6203-6205), dietylfosforylcyanid (DEPC; se Tetrahedron Letters lå (1973) 1595- -1598) eller difenylfosfit (Tetrahedron Letters 22 (1972) 5047-5050).

En annan ekvivalent av syran är en motsvarande azolid, dvs. en amid av motsvarande syra, vars amidkväve utgör del av en kvasiaromatisk femledad ring, som innehåller minst tvâ kväveatomer, dvs, imidazol, pyrazol, triazoler, bensimidazol, bensotriazol och deras substitue- rade derivat. Såsom torde vara uppenbart för fackmannen är det ibland önskvärt eller nödvändigt att skydda hydroxylgruppen i det acylerande derivatet av syran med formel II, t.ex. när man utnyttjar ett acylerande derivat såsom en syrahalid. Hydroxylgruppen kan skyd- das på i och för sig känt sätt, t.ex. genom användning av en karbo- bensyloxigrupp, genom acetylering, genom silylering och liknande.

Efter fullbordad acyleringsreaktion avlägsnas samtliga blockeringsgrupper med i och för sig kända metoder för erhållande av den önskade produkten med formel I. Silylgrupperna kan t.ex. lätt avlägsnas genom hydrolys med vatten, företrädesvis vid lågt pH.

Blockeringsgruppen B i det acylerande derivatet av syran med formel II och blockeringsgruppen på 6'-aminogruppen i det polysilylerade 447 259 15 kanamycinutgångsmaterialet (om ett sådant är närvarande) kan även avlägsnas medelst i och för sig kända metoder. Således kan en t- -butoxikarbonylgrupp avlägsnas genom användning av myrsyra, en kar- bobensyloxigrupp genom katalytisk hydrering, en 2-hydroxi-l-naftkarb- onylgrupp genom syrahydrolys, en trikloretoxikarbonylgrupp genom behandling med zinkstoft i isättika, en ftaloylgrupp genom behand- ling med hydrazinhydrat i etanol under uppvärmning etc.

Produktutbytena kan fastställas medelst olika metoder. Ef- ter avlägsnande av samtliga blockeringsgrupper och kromatografering på en kolonn CG-50 (NH4+) kan utbytet av amikacin bestämmas genom isolering av det kristallina fasta materialet ur de lämpliga frak- tionerna ifråga eller genom mikrobiologisk analys (turbidimetriskt eller på platta) av de lämpliga fraktionerna ifråga. En annan tek- nik, som kan utnyttjas, är vätskekromatografering av den oreducera- de acyleringsblandningen, dvs. av den vattenlösning som erhålls ef- ter hydrolys av silylgrupperna och avlägsnande av organiskt lös- ningsmedel men före hydrogenolys för avlägsnande av de återstående hlockeringsgrupperna. Denna analysmetod kan inte användas för direkt analys av amikacin eller föreningen BB-K29 men för analys av mot- svarande mono- eller di-N-blockerade föreningar.

Det instrument som har utnyttjats är en högtrycksvätskekro- matograf med beteckningen Waters Associates ALC/GPC 244 innehållan- de en absorbansdetektor med beteckningen Waters Associates Model 440 och en kolonn med en längd av 30 cm och en inre diameter av 3,9 mm med beteckningen -Honda ak C-18 column. Anal sbetingelserna var P P Y följande.

Mobil fas: 25% 2-propanol 4 75% 0,01% Natriumacetat pH 4,0 Flödeshast: l ml/minut Detektor: UV vid 254 nm Känslighet: 0,04 AUFS Utspädningsmedel: DMSO Injicerad mängd: 5 pl _ _ Koncentration: 10 mg/ml Pappershastigheten varierade, men 2 minuter/2,54 cm utnytt- jades normalt. Ovan angivna betingelser gav toppar, som var lätta att mäta kvantitativt. Resultaten av ovan angivna analysmetod anges i det följande såsom HLPC-analys. 447 259 16 I syfte att undvika komplicerade kemiska beteckningar ut- nyttjas ibland i det följande följande förkortningar: AHBA L-(-)-Ü'-amino-alfa-hydroxismörsyra BHBA N-cyklobensyloxi-derivat av AHBA HONB N-hYdroxi-5-norbornen-2,3-dikarboxamid NAE N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboxamid-ak- tiverad ester av BHBA HONS N-hydroxisuccinimid SAE N-hydroxisuccinimid-aktiverad ester av BHBA (eller BHBA-'ONS') DCC dicyklohexylkarbodiimid DCU dicyklohexylkarbamid HMDS hexametyldisilazan BSA bis(trimetylsilyl)acetamid MSA trimetylsilylacetamid TFA trifluoracetyl t-BOC tert.-butyloxikarbonyl "Dicalite“ utgör varunamnet för diatomacëjord (Great Lakes Carbon Corporation).

"Amberlite CG-50" utgör varunamnet för den kromatografiska kvaliteten av ett svagt surt katjonbytarharts av karboxylpolymetakryl- typ ( Rohm & Haas Co.).

"P-Bondapak" utgör varunamnet för en serie vätskekromatogra- fikolonner med höga prestanda (Waters Associates).

Uppfinningen âskâdliggörs närmare nedan medelst följande ut- föringsexempel, vari temperaturangivelserna avser Celsiusgrader. Med uttrycket "lägre alkyl“ och "lägre alkoxi" avses alkyl- respektive alkoxigrupper innehållande l-6 kolatomer.

Exemgel 1 Framställning av l-N-/L-(-)-'Z'-amino-alfa-hydroxibutyryl/- kanamycin A (amikacin) genom selektiv acylering av noly(trimetylsil- yl)-6'-N-karbobensyloxikanamycin A i vattenfri dietylketon 15 g (24,24 mmol) 6“-N-karbobensyloxikanamycin A uppslamma- des i 90 ml torr acetonitril och âterloppskokades under kväveatmos- fär. 17,5 g (l08,48 mmol) hexametyldisilazan tillsattes långsamt un- der 30 minuter och den resulterande lösningen återloppskokades un- der 24 timmar. Efter avlägsnande av lösningsmedlet i vakuum (400) och fullständig torkning i vakuum (10 mm) erhölls 27,9 g av ett vitt, amorft fast material (90,7l% räknat på 6'-N-karbobensyloxikanamycin A 447 259 17 (silyl)9).

Detta fasta material upplöstes i 150 ml torr dietylketon vid 230. 11,05 g (26,67 mmol) L-(-)-3'~bensyloxikarbonylamino-alfa- -hydroxismörsyra-N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboxamidester (NAE), som hade upplösts i 100 ml torr dietylketon vid 230, tillsattes lång- samt under en tidsperiod av en halv timme under god omröring.Lös- ningen omrördes 78 timmar vid 230. Den gula klara lösningen (pH 7,0) späddes med 100 ml vatten. Blandningens pH-värde inställdes på 2,8 (3 N HCl) och blandningen omrördes kraftigt 15 minuter vid 230. Vat- tenfasen avskiljdes och den organiska fasen extraherades med 50 ml vatten med ett pH av 2,8. De kombinerade vattenfraktionerna tvätta- des med 50 ml etylacetat. Lösningen infördes i en 500 ml Parr-flaska, tillsammans med 5 g av en katalysator av 5% palladium på kol (Engel- hard) och reducerades vid ett vätetryck av 3,5 kg/cmz vid 230 under 2 timmar. Blandningen filterades genom en dyna av Dicalite, som där- efter tvättades med ytterligare 30 ml vatten. Det färglösa filtra- tet koncentrerades i vakuum (40-450) till 50 ml. Lösningen appplice- rades på en 5 x 100 cm jonbytarkolonn CG-50 (NH4+). Efter tvätt- ning med 1000 ml vatten eluerades oreagerat kanamycin A, 3-/L-(-)- -'X'-amino-alfa-hydroxibutyryl/-kanamycin A (BB-K29) och amikacin med 0,5 N ammoniumhydroxid. Polyacylmaterial utvanns med 3N ammonium- hydroxid. Bioanalys, tunnskiktskromatografi och optisk vridning ut- nyttjades för att följa elueringsförloppet. Nedan återges för varje eluatfraktion volymen och observerad optisk vridning liksom mängden och det procentuella utbytet av fast material, som isolerades från varje fraktion genom indunstning till torrhet: Volym Vikt Material (ml) oàälâ (gm.) % utbyte Kanamycin A 1000 +0,ll5 0,989 9,15 BB-K29 1750 +0,24 4,37 32,0 Amikacin 2000 +0,3l 6,20 47,4 Polyacyler 900 +0,032 0,288 2,0 Det förbrukade dietylketonskiktet befanns vid HLPC-analys innehålla ytterligare 3-5 % amikacin. ' f Det orena amikacinet (6,20 g) upplöstes i 20 ml vatten och späddes med 20 ml metanol,och 20 ml isopropanol tillsattes för att initiera kristallisering. Man erhöll 6,0 g (45,8%) kristallint ami- kacin. 447 259 18 Exemgel 2 Framställning av l-N-/L-(-)- 2'-amino-alfa-hydroxibutyryl/- U kanamyoin A (amikacin) genom selektiv acylering av poly(trünetyl- silyl)-6'-N-karbobensyloxikanamycin A i vattenfri aceton 103 g (0,08l mol, räknat såsom 6'-N-karbobensyloxikanamycin A (silyl)9) poly(trimetylsilyl)-6'-N~karbobensyloxi-kanamycin A,S0m hade framställts såsom i exempel 1, upplöstes i 100 ml torr aceton vid 230. 35,24 g (0,085 mol) L-(-J-U'-bensyloxikarbonylamino-alfa- -hydroxismörsyra-N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboxamidester (NAE), som hade upplösts i 180 ml torr aceton vid 230, sattes långsamt un- der god omröring till lösningen av poly(trimetylsilyl)-6'-N-karbo- bensyloxikanamycin A under en 15-minuters-period. Lösningen omrör- des 20 timmar vid 23° under kväveatmosfär. Den blekgula klara lös- ningen (pH 7,2) späddes med 100 ml vatten. Blandningens pH-värde in- ställdes på 2,5 (3N HCl) och omröringen fortsattes 15 minuter vid 230. Acetonet avlägsnades genom användning av ângstrålevakuum vid ca 350. Lösningen infördes i en 500-ml Parr-flaska tillsammans med 10 g av en katalysator av 5% palladium på kol (Engelhard) och redu- cerades vid ett vätgastryck av 2,8 kg/cm2 vid 230 under 2 timmar.

Blandningen filtrerades genom en dyna av diatomacêjord, som däref- ter tvättades med ytterligare 50 ml vatten. Efter koncentrering till ca en tredjedel av den ursprungliga volymen applicerades lös- ningen (pH 6,9-7,2) på en 6 x ll0 cm jonbytarkolonn CG-50 (NH4+) och eluerades utnyttjande gradienteluering med vatten upp till 0,6 N ammoniumhydroxid för utvinning av amikacin. En automatisk polari- meter utnyttjades för att följa elueringsförloppet. Kombinationer gjordes på basis av tunnskiktskromatografiutvärdering. De kombinera- de amikacinfraktionerna koncentrerades till en halt fast material av 25-30%. Lösningen späddes med en lika stor volym metanol, följt av två volymer isopropanol för att initiera kristallisering. Man er- höll l8,2 g (40%) kristallint amikacin.

Utvinningen av 12% kanamycin A, 40% av föreningen BB-K29 och 5% polyacylerat kanamycin gav en materialbalans av 97%. _ _ Exempel 3 I Framställning av l-N-/L-(-)-:f -amino-alfa-hydroxibutyryl/- kanamycin A (amikacin) genom selektiv acvlering av ooly(trimetyl- silyl)-kanamycin A under användning av blockering in situ A. Poly(trimetylsilyl)-kanamycin A 18 g aktivitet (37,l5 mmol) kanamycin A i form av den fria 447 259 19 basen uppslammades i 200 ml torr acetonitril och återloppskokades. 29,8 g (l84,6 mmol) hexametyldisilazan tillsattes under 30 minuter och blandningen återloppskokades 78 timmar under omröring för erhål- lande av en ljusgul klar lösning. Avlägsnande av lösningsmedlet i vakuum gav en amorf fast återstod (43 g, 94%, räknat som kanamy- cin A (silyl)lO).

B. l-N-/L-(-Y-?f -amino-alfa-hydroxibutyryl/kanamycin A 5,56 g (20,43 mmol) p-(bensyloxikarbonyloxi)bensoesyra upp- slammades i 50 ml torr acetonitril vid 230. 8,4 g (4l,37 mmol) N,O-bis-trimetylsilylacetamid tillsattes under god omröring. Lös- ningen hölls 30 minuter vid 230 och sattes därefter under en tids- period av 3 timmar under kraftig omröring till en lösning av 21,5 g (l7,83 mmol, räknat såsom (silyl)l0~föreningen) i 75 ml torr aceto- nitril vid 230. Blandningen omrördes 4 timmar, lösningsmedlet av- lägsnades i'mæamm¿40o) och den oljiga återstoden upplöstes i 50 ml torr aceton vid 230. 8,55 g (20,63 mmol) L-(-)~'3'-bensyloxikarbonylamino-alfa- -hydroxismörsyra-N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboxamidester (NAE) i 30 ml aceton sattes till ovannämnda lösning under en period av 5 minuter. Blandningen hölls 78 timmar vid 230. Lösningen zspäddes med 100 ml vatten och pH-värdet (7,0) sänktes till 2,5 (6N HCl).

Blandningen infördes i en 500-ml Parrflaska tillsammans med 3 g av en katalysator av 5% palladium på kol (Engelhard) och reducerades vid ett vätgastryck av 2,80 kg/cmz vid 230 under 2 timmar. Blandning- en filtrerades genom en dyna av diatomacëjord, som därefter tvätta- des med 20 ml vatten. Kombinationen av filtrat och tvättvätskor (168 ml) underkastades därefter mikrobiologisk analys gentemot E.coli och befanns innehålla ca ll 400 pg/ml (19 % utbyte) amikacin.

Exempel 4 Framställning av l-N-/L-(-)-H' -amino-alfa-hydroxibutyryl/- kanamycin A (amikacin) genom selektiv acylering av poly(trimetylsil- yl)-kanamycin A A. Poly(trimetylsilyl)-kanamycin A _ 7 En suspension av 10 g (20,6 mmol) kanamycin A i 100 ml torr acetonitril och 25 ml (119 mmol) l,l,l,3,3,3-hexametyldisilazan återloppskokades under 72 timmar. Man erhöll en klar ljusgul lösning.

Lösningen indunstades till torrhet i vakuum vid 30-400, varvid man erhöll 21,3 g poly(trimetylsilyl)-kanamycín A såsom ett ljusbrunfär- gat amorft pulver (85% utbyte räknat såsom kanamycin A (silyl)l0). 447 259 20 B. l-N-(L-(-)-'3'-amino-a1fa-hydroxibutyryl/kanamycin A Till en lösning av 2,4 g (2,0 mmol) poly(trimetylsilyl)-ka- namycin A i 30 ml torr aceton sattes långsamt 2,0 mmol L-(-)-'ï'-ben- Syloxikarbonylamino-alfa-hydroxismörfsyra-N-hydroxi-5-norbornen-2,3- -dikarboxamidester (NAE) i 10 ml torr aceton vid 0-50. Reaktions- blandningen omrördes vid 230 under l vecka och indunstades därefter till torrhet i vakuum vid en badtemperatur av 30-400. 60 ml vatten' sattes därefter till återstoden, följt av 70 ml metanol för erhålan- de av en lösning. Lösningen surgjordes med 3N HCl till pH 2,0 och reducerades därefter vid ett vätgastryck av 3,5 kg/cmz under 2 tim- mar under användning av 500 mg av en katalysator av 5% palladium på kol. Materialet filtrerades och kombinationen av filtrat och tvätt- vätskor underkastades mikrobiologisk analys gentemot E. coli, vilken analys utvisade ett utbyte av 29,4 % amikacin.

Exemgel 5 Framställning av amikacin genom selektiv N-acylering av poly- trimetylsilyl-6'-N-karbobensoxi-kanamvcin A i vattenfri aceton I. Sammanfattning Silylering av 6'-N-karbobensoxi-kanamycin A i acetonitril under användning av hexametyldísilazan (HMDS) gav mellanprodukten 6'-N-karbobensoxi-kanamycin A (silyl)9<:). Detta silylerade kanamy- cin A var lättlösligt i de flesta organiska lösningsmedel. Acylering med NAE i vattenfri aceton vid 230 under användning av ett 5%-igt molärt överskott av NAE i förhållande till den satsade mängden 6'- -N-karbobensoxi-kanamycin A gav en blandning, som endast innehöll karbobensoxiderivaten av amikacin och föreningen BB-K29, viss mängd oreagerat kanamycin A och viss mängd polyacylmaterial. Man kunde inte vid dessa undersökningar påvisa föreningen BB-Kll. Eluering av en acetonacyleringsblandning gav efter reduktion och upparbetning under användning av en kolonn CG-50 (NH4+) med ammoniumhydroxidgra- dienteluering rent amikacin i ett utbyte av ca 40%. 21 II. Reaktionsschema 6'-N-Cbz-Kana A c25x42ol3N4 (s1e,ss) + (ena ) 3si-ÄNn-si (ca :H3 HMDS (l6l.4) A CH3CN OH R I Si(CH3)3 Q fiv-N-cbz-xana A cs-.uyng 447 259 447 259 22 OH I a. cbzna (C112) z-cn-coou + Hon + ncc ' BHBA (253,4) ' HONB (l79,2) Acetom OH 0 i II DcU + cbzmflcufz-CH-c-o-N '<2z4,a> <2) NAE (414,6) diCbzamikacin (854) + ® + <2) dicbzaB-Kzs + 5'CbZ~l,3-diBHBA-Kama A H2 + 5% På/C 6'Cbz-Kana A _ J\__ š;¿kacin + 35'K29 + 1,3-diAHBA-Kana A + Kan; 3* (5°5,52> _ <7zz,1s) (4a4,s) ' cs-so(ux4+) Anííkacin 447 259 23 III. Material Vikt (g) Vol.(ml) gg; 6'-N-Cbz-Kana A 50 0,081 HMDS 58,9 76,5 0,365 Acetonitril 300 BHBA 21,5 0,085 HONB 15,2 0,085 DCC 17,48 0,085 Aceton 260 CG-50 (NH4+) 3000 Metanol Efter behov IPA Efter behov IV. Säkerhetsföreskrifter 6'-N-Cbz-kana A - Acetonitril - Hexametyldisilazan (HMDS) - 6'-N-Cbz~kana A (silyl)n - BHBA _ HONB - DCC - AC QtOIl _ NAE - Metanol - Isogroganol - Ingen direkt information tillgänglig.

Kontakt med damm skall undvikas.

Behandlas såsom en cyanid. Inand- ning av ångor skall undvikas. Kan orsaka hudirritation.

Irriterande, hanteras med försiktig- het.

Ingen direkt information tillgänglig, hanteras med försiktighet.

Toxiciteten har ej fastställts. Ex- ponering för det fasta materialet skall undvikas.

Toxiciteten okänd. Försiktighet vid hanteringen bör iakttas.

Orsakar kraftig irritation av hud och ögon. Inhalering av ångor bör undvikas. Giftigt.

Eldfängd. Inhalering kan orsaka hu- vudvärk, trötthet, ångest, irritation i bronkerna och i stora mängder nar- kos.

Ingen direkt information tillgäng- lig, skall alltid hanteras direkt såsom lösning i aceton.

Eldfängd. Förgiftning kan inträda genom intagande oralt, inhalering eller perkutan äbSOrPti0n- Eldfängd. Intagande oralt eller in- halering av stora mängder av ångor- na kan orsaka huvudvärk, dâsighet, mental depression, kräkningar, narkos. 447 259 24 Ammoniumhvdroxid - Giftiga ångor. Andningsmask skall bäras och kontakt med vätskan skall undvikas.

CG-50 (NH4+) -3 Inga toxicitetsdata tillgängliga, hanteras med försiktighet.

V. Framställningsförfarande A. Framställning av 6'-N-karbobensyloxikanamycin A (silyl)n J 13'-N-Cbz-Kana A (silyl)97 l. 50 g 6“-N-karbobensyloxikanamycin A (vattenhalt enligt Karl Fischer mindre än 4%) uppslammas i 300 ml acetonitril (vatten- halt enligt Karl Fischer mindre än 0,01%). Det hela får återlopps- koka (740) under det att en ström av torr kvävgas får passera upp- slamningen. 2. Under en 30-minuters-period tillsätts långsamt 75,8 ml hexametyldisilazan (HMDS). Upplösning av materialet sker under ut- veckling av ammoniakgas. 3. Återloppskokningen fortsätts under l8-20 timmar under kvävgasgenomblåsning. 4. Den klara ljusgula lösningen koncentreras i vakuum (bad- temperatur 40-500) till ett skummigt fast material. Utbytet av sil- yl9-föreningen uppgår till 89-92 g (90-94% av det teoretiska vär- det).

/Observera: Vid utförande av förfarandet i andra lösningsme- del isoleras normalt icke detta fasta material utan används direkt för acylering.

B. Framställning av N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboximid- estern av L-(-)- ïy -karbobensyloxiamino-alfa-hvdroxismörsyra (NAE) l. 21,5 g'í~(-)-Qf-karbobensyloxiamino-alfa-hydroxismörsyra (BHBA) upplöses i ioo m1 torr aceton vid 23°, följt av 15,2 g N- -hydroxi-S-norbornen-2,3-dikarboxiimid (HONB). Fullständig upplös- ning inträder. 2. Under 30 minuter tillsätts en lösning av 17,48 g dicyklo- hexylkarbodiimid (DCC) i 50 ml aceton under omröring. Temperaturen stiger till ca 400 under tillsatsen under utfällning av dicyklohex- ylkarbamid (DCU). 3. Uppslamningen omrörs under 3-4 timmar under det att tem- peraturen hålls pâ 23-250. 4. Karbamidderivatet avlägsnas genom filtrering och filter- kakan tvättas med 30 ml aceton. Filtrat plus tvättvätskor sparas för 447 259 25 acyleringssteget nedan.

C. Acylering av 6'-N-Cbz Kana A (Silyl)n. 1. Den under A i steg 4 ovan isolerade föreningen 6'-N-Cbz- -Kana A (silyl)9 upplöses i 100 ml torr aceton vid 23-240. 2. Under god omröring tillsätts långsamt den under B ovan framställda NAE-lösningen under en 15-minuters-period. Temperaturen stiger gradvis till ca 400. Lösningen får anta en temperatur av 230, varefter omröringen fortsätts under l8-20 timmar under kvävgasatmos- fär. 3. 100 ml vatten tillsätts och pH-värdet (6,9-7,2) sänks till 2,2-2,5 med 6N klorvätesyra. Omröring sker 15 minuter vid 230.

(Observera: ett andra skikt kan bildas - detta orsakar icke något problem vid upparbetningen). 4. Acetonen avlägsnas i vakuum vid en badtemperatur av 30- -350. Koncentratet överförs till ett lämpligt hydreringskärl (som i förväg har genomspolats med kväve). 10 g av en katalysator av 5 g palladium på kol tillsätts och hydrering sker vid 2,8 kg/cmz under 2-3 timmar. 5. Blandningen filtreras genom en Dicalite-dyna, varefter hydreringskärlet och filterkakan tvättas med ytterligare 50 ml vat- ten. 6. Filtratet plus tvättvätska koncentreras till ca l/3 av den ursprungliga volymen (50 ml) i vakuum vid 40-450. 7. pH-värdet kontrolleras. Det bör ligga inom intervallet 6,9-7,2. Om så ej är fallet justeras pH-värdet med lN ammoniumhydr- oxid. Blandningen appliceras på en 6 x 110 cm kolonn av CG-50 (NH2). 8. Kolonnen tvättas med 1000 ml avjoniserat vatten. Därefter sker eluering med 0,5-0,6N ammoniumhydroxid under användning av en automatisk polarimeter för att följa elueringsförloppet. Eluerings- ordningen är följande: Resterande Kana A --Q) BB-K29 --{>»amikacin.Fören- ingen BB-Kll kunde ej påvisas vid någon av acylerings- upparbetningarna. Polyacylmaterial, dvs. l,3-diAHBA-ana- logen av Kana A, utvinns genom tvättning av kolönfien med 3N ammoniumhydroxid; 9. Amikacinfraktionerna kombineras och koncentreras till en halt fast material av 25-30%. Det hela späds späds med l volym metan- ol och försätts med amikacingroddkristaller. 10. Under 2 timmar tillsätts långsamt 2 volymer isopropanol 447 259 26 (IPA) under god omröring och kristallisering får ske under 6-8 tim- mer vid 23°. ll. Det fasta materialet filtreras, tvättas med 50 ml av en l:l:2-blandning av vatten, metanol och IPA och slutligen med 25 ml IPA. 12. Materialet torkas i vakuum under 12-16 timmar vid 400.

Utbytet uppgår :in 17,3-19,o g (sa-un amikacin med följande egen- skaper : .TE-E CHCl3-metanol-NH4OH-vatten (l:4:2:l), 5 x 20 cm silikagel- plattor från Quantum Industries - en zon vid detektering med nin- hydrin (RF^J 0,4).

Sgecifik vridning [di] sššo +Hig1,6 +O1'ol1rf 9NH4OH +oíåglfšzso4 C = 1,0 % 13. Utvinningen av BB-K29 i detta system är även 39-42%, av resterande Kana A l0-14% och av l,3-di-AHBA-Kana A ca 5 %, vilket ger en materialbalans överstigande 95%.

Exemgel 6 Framställning av amikacin genom selektiv N-acylering av poly- trimetylsilyl-Kana A i vattenfri aceton.

I. Sammanfattning Silylering av Kana A-bas i acetonitril under användning av hexametyldisilazan (HMDS) gav polytrimetylsilyl-kana A. Silylerings- graden är fortfarande osäker men antogs vara kana A(silyl)l0. Poly- silylerat Kana A var lättlösligt i de flesta organiska lösningsme- del. Acylering med SAE i vattenfri aceton vid 230 under användning av ett molförhållande SAE till Kana A av lzl gav en blandning, som innehöll Cbz-derivaten av amikacin och föreningen BB-K29, normalt i ett förhållande av 2-3:1, föreningen BB-K6 (ca 5-8 %), oreagerat Ka- na A (15-20%) och viss mängd polyacylmaterial (ca 5-10%). Såsom vid ovan angivna acylering av polytrimetylsilyl-6'-N-karbobensoxi-kana~A kunde föreningen BB-Klll icke påvisas vid dessa försök. Redaktion och upparbetning av en acetonacyleringsblandning, följt av kromatografe- ring pà CG-50-NH4+-kolonn under användning av 0,5N ammoniumhydr- oxid gav isolerat, kristallint amikacin i ett utbyte av 34-39%. 447 259 27 II. Reaktionsschema a, ' Ho ou OK ' 5 N _32; O *HS ma; M2 Q Kama A- bas clsaušollul; (484,Sl) + (CH3)3 Si~NH-Sl(Cfl3)3 anus <1s1,4> R I Si(CH3)3 CD Rana. A (Silyfllo c48a¿16ollN4sil0 (l2os,3S) 447 259 za o OH “ “ »I / B. cbzna(cx2)2-ca-coca + ao-N + pcc Basa N-Hos (2o6,3) 053,4) i (11s,9) EtOAc O ox o .ncU + cbzmitcziflzcx-c-o-N <224,3) 0 (2 SAE (350.33) C.

Cbzähmikacin (720) + Cbz-BB-K29 Acetorw + Q- + @ __í'_å X] cbz-aa-xs + Kana A + q ' ' H2 Pólyadyler (i huvudsak l;3- šï_ï37E i:_\\__ diBHBA-Kana A) ñJç "Ü Amikacin-i-BB-K29 + BB-KG + l,3-diAHBA-l (sas,62) ' (722,7s) ' cs-so(Nn4+) AmikacinA 447 259 29 III. Material Vikt (g) Vol. (ml) gg; Kana A-"bas“ 50 0,103 HMDS (Sp. vikt 0,774) 86,68 112 0,537 Acetonitril 600 SAE 35,03 0,10 Aceton 850 cs-so (m4 J' ) 3000 Metanol Efter behov IPA Efter behov IV. Säkerhetsföreskrifter Kana A-"bas" _ Känt läkemedel - vanlig försiktighet rekommenderas Kana A (Silyl)l0 - Ingen direkt information tillgänglig, hanteras med försiktighet Övriga material - Se exempel 5 V. Framställningsförfarande A. Framställning av Kana A (Silyl)l0 l. 50 g Kana A-bas (vattenhalt enligt Karl Fischer 2,5-3,5%) uppslammas i 500 ml acetonitril (vattenhalt enligt Karl Fischer under- stigande 0,01%). Det hela får återloppskoka (740) under det att en ström av torr kvävgas får passera uppslamningen. 2. Under en 30-minuters-period tillsätts långsamt 112 ml hexametyldisilazan (HMDS). Fullständig upplösning inträder inom 4-5 timmar under utveckling av ammoniakgas. 3. Aterloppskokningen fortsätts under 22-26 timmar under kvävgasgenomblåsning. 4. Den klara blekgula lösningen koncentreras i vakuum (40°L till en sirapsartad återstod. Avdrivning sker med ytterligare 100 ml acetonitril och det hela torkas fullständigt i vakuum under 3-6 tim- mar. Utbytet av ett vitt, amorft fast material är 109-115 g (90-95% av det teoretiska värdet, räknat såsom Kana A (Silyl)lO).

B. Framställning av N-hydroxisuccinimidestern av L-(~)-alfa- -karbobensyloxiamino-alfa-hydroxismörsyra (SAE). _ 1. 100 g L-(-)-alfa-bensyloxikarbonylamino-alfa-hydroxismör- syra (BHBA) och 45,38 g N-hydroxisuccinimid (N-HOS) upplöses i 1300 ml etylacetat (vattenhalt enligt Karl Fischer understigande 0,05 %) vid 23° under omröring. 447 259 30 2. 81,29 9 dicyklohexylkarbodiimid (DCC) upplöses i 400 ml etylacetat (vattenhalt enligt Karl Fischer understigande 0,05 %) vid 230. Denna lösning sätts under god omröring till lösningen från steg l under 30 minuter. Temperaturen stiger till ca 40-420 under samti- dig utfällning av dicyklohexylkarbamid (DCU). Uppslamningen omrörs 3-4 timmar, varvid temperaturen får anta 230. 3. DCU avfiltreras och filterkakan tvättas med 250 ml etyl- acetat (vattenhalt enligt Karl Fischer understigande 0,05%). DCU- -kakan kasseras, medan filtratet och tvättvätskorna sparas. 4. Filtratet plus tvättvätskor koncentreras till en volym av ca 500 ml (i vakuum vid 30-350). En viss mängd produkt utkristalli- serar. 5. Koncentratet överförs till ett lämpligt kärl och 100 ml heptan tillsätts under kraftig omröring. Eventuellt tillsätts grodd- kristaller av SAE. Kristallisation inträder praktiskt taget omedel- bart. Uppslamningen omrörs under 30 minuter vid 230. 6. Under 30 minuter tillsätts 400 ml heptan och uppslamning- en omrörs 4-5 timmar vid 230. 7. Det hela filtreras och filterkakan tvättas med 200 ml av en 3:1-blandning av heptan och etylacetat, följt av 100 ml heptan. 8. Materialet torkas i en vakuumugn vid 30-350 under 18-20 timmar. Utbytet uppgår till ll0,l-131,4 g (80-95 %). Smältpunkten utgör 119-l20O med mjukning vid ll4° (korr). Tunnskiktskromatografi med en 4:l2:l-blandning av aceton, bensen och CH3CO2H och detekte- ring med en 1%-ig vattenlösning av KMO4 ger ett Rf-värde av 0,7 för SAE och 0,2 för BHBA på 2 x 10 cm förpreparerade silikagelplattor från Analtech Inc.

C. Acylering av Kana A (Silyl)lO l. Den under A i steg 4 ovan isolerade föreningen Kana A (Silyl)l0 upplöses i 500 ml torr aceton vid 230. 2. Under god omröring tillsätts snabbt den i avdelning B ovan framställda föreningen SAE (35,03 g) såsom en l0%-ig lösning i torr aceton under 5-l0 minuter. Temperaturen stiger ca 50. Lösningen får anta 230 och omröringen fortsätts under 18-20 timmar. 3. Den ljust orangefärgade klara lösningen späds med 400 ml vatten och pH-värdet (7,0-7,5) sänks till 2,2-2,5 med 3 N klorväte- syra. Den klara lösningen omrörs nu vid 230 under l5-30 minuter. 447 259 31 4. Aceton avlägsnas i vakuum vid en badtemperatur av 30-350 (en liten mängd material kan utfalla i detta skede men förorsakar icke några problem). Koncentratet överförs till ett lämpligt hydre- ringskärl. 10 g av en katalysator av 5% palladium på kol tillsätts och hydrering sker vid 3,5 kg/cmz under 2-3 timmar. 5. Blandningen filtreras genom en Dicalite-dyna och hydre- ringskärlet och filterkakan tvättas med ytterligare 2 x 50 ml vatten. 6. Filtratet plus tvättvätskor koncentreras till ca. en tred- jedel av den ursprungliga volymen (l50-l65 ml) i vakuum vid 40-450. 7. pH-värdet i detta skede är 6,0-7,0. Blandningen applice- ras på en CG-50-(NH4+)-kolonn ( 6 x ll0 cm). 8. Kolonnen tvättas med 100 ml avjoniserat vatten och elue- ras med 0,5 N ammoniumhydroxid under användning av en automatisk po- larimeter för att följa elueringsförloppet. Elueringsordningen är följande: 'Resterande Kana A --5 BB-K6 --å BB-K29 --å amikacin.

Föreningen BB-Kll kunde inte påvisas vid dessa försök. 9. Amikacinfraktionerna kombineras och koncentreras till en halt fast material av 25-30%. Spädning sker med l volym metanol och groddkristaller av amikacin tillsätts. 10. Under 2 timmar tillsätts långsamt 2 volymer IPA och kris- tallisation sker vid 230 under 6-8 timmar. ll. Det fasta materialet filtreras, tvättas med 35 ml av en l:l:2-blandning av vatten, metanol och IPA och slutligen med 35 ml IPA. l2. Materialet torkas i en vakuumugn vid 400 under 16-24 tim- mar. Utbytet uppgår till 19,91-22,84 g (34-39%). IR-, PMR- och CMR- -spektraldata jämte specifik vridning var i fullständig överensstäm- melse med den önskade strukturen.

Tunnskiktskromatografisystem CHC13/metanol/NH4OH/vatten (l:4:2:l), 5 x 20 cm silikagelplat- tor från Quantum Industries - l zon amikacin med Rf ca 0,4 (nin- hydrintest).

Exempel 7 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetylsil- yl)-6'-N-Cbz-kana A i tetrahydrofuran med blandsyraanhydriden av pi- valinsyra och BHBA A. Framställning av blandanhydriden 5,066 g (20,0 mmol) BHBA, 4,068 g (20,0 mmol) BSA och 2,116 g (22,0 mmol) trietylamin upplöstes i 200 ml sikttorkad tetrahydrofuran. 447 259 32 Lösningen återloppskokades under 2,25 timmar och kyldes därefter till -100. 2,412 g (20,0 mmol) pivaloylklorid tillsattes under 2-3 minu- ter under omröring och omröringen fortsattes 2 timmar vid -100. Tem- peraturen fick därefter stiga till 230.

B. Acylering av poly(trimetylsilyl)-6”-N-Cbz-Kana A 5,454 g (4,97 mmol, räknat såsom 6'-Cbz-Kana A(Si1y1)9) poly- (trimetylsilyl)-6'-N-Cbz-Kana A, som hade framställts såsom i exem- pel l, upplöstes i 50 ml torr (molekylsikt) tetrahydrofuran vid 23°. hälften av den i steg A ovan framställda lösningen av blandanhydri- den (10,0 mmol) tillsattes under en tidsperiod av 20 minuter under omröring och omröringen fortsattes under 7 dygn. 100 ml vatten sattes därefter till reaktionsblandningen och pH-värdet (5,4) inställdes på 2,0 med 3M HZSO4. Omröringen fortsattes 1 timme och lösningen extraherades med etylacetat. Polyacylerat ma- terial började kristallisera, varför reaktionsblandningen filtrera- des. Efter torkning över P205 vägde det utvunna fasta materialet 0,702 g. Extraktionen av reaktionsblandningen fortsattes med totalt 4 x 75 ml etylacetat, varefter överskottet etylacetat avdrevs från vattenskiktet. En alikvot av vattenlösningen underkastades HPLC- -analys. Den erhållna kurvan antydde ett utbyte av 26,4 % di-Cbz-ami- kacin.

Vattenskiktet hydrerades därefter i en Parr-apparat vid ett vätgastryck av 3,5 kg/cmz under 2 timmar under användning av 0,5 g av en katalysator av 10% palladium på kol. Materialet filtrerades och kombinationen av filtrat och tvättvätskor underkastades analys gentemot E.coli och befanns innehålla 31,2 % amikacin. Förhållandet amikacin:BB-K29 var ca 9-10:l; spår av polyacyl och oreagerat Kana A var närvarande.

Exempel 8 Inverkan av vatten på framställningen av amikacin genom acy- lering av po1y(trimetylsilyl)-Kana A i acetonlösning vid 230 A. Vattenfritt lösningsmedel 2,40 g (2,0 mmol, räknat såsom Kana A (Silyl)l0) polyftri- metylsilyl)-Rana A, som hade framställts enligt exempel 3, upplöstes i 20 ml aceton, som hade torkats med en molekylsikt. Lösningen om- rördes vid 230 och en lösning av 0,701 g (2,0 mmol) SAE i 10 ml mo- lekylsiktstorkad aceton tillsattes under 10 sekunder. Omröringen fortsattes 22 timmar vid 230. 50 ml vatten tillsattes och pH-värdet (7,5) inställdes på 2,5. Acetonen avdrevs i vakuum vid 400 och vat- 447 259 33 tenlösningen reducerades därefter vid ett vätgastryck av 3,6 kg/cmz vid 230 under 2 timmar under utnyttjande av l,0 g av en katalysator av 10% palladium på kol. Mikrobiologisk analys utvisade ett utbyte av 31,24 % amikacin.

B. Tillsats av vatten till lösningsmedlet Steg A ovan upprepades med undantag av att 1,0 ml (56 mmol) vatten sattes till poly(trimetylsilyl)-Kana A-lösningen, som omrör- des 15 minuter före acylering med SAE. Mikrobiologisk analys utvisa- de ett utbyte av 33,80 % amikacin.

Exemgel 9 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- silyl)-6'-N-Cbz-Kana A i aceton med blandanhydriden av BHBA och iso- butylkolsyra A. Framställning av blandanhydriden 1,267 g (5,0 mmol) BHBA och 1,313 g (l0,0 mmol) N-trimetyl- silylacetamid (MSA) i 20 ml molekylsikttorkad aceton omrördes vid 230 och 0,70 ml (5,0 mmol) trietylamin (TEA) tillsattes. Blandning- en âterloppskokades under kväveatmosfär under 2,5 timmar. Blandningen kyldes till -2o° och 0,751 g Trietylaminhydroklorid började omedelbart utfalla. Blandningen omrör- des 1 timme vid -2o°.

B. Acylering 6,215 g (4,9 mmol, räknat såsom (silyl)9-föreningen) poly- (trimetylsilyl)-6'-N~Cbz-Kana A, som hade framställts enligt exempel l, upplöstes i 20 ml molekylsiktstorkad aceton vid 230 under omrö- ring. Lösningen kyldes till -200 och den kalla blandanhydridlösning- en från steg A tillsattes långsamt under en tidsperiod av 30 minuter.

Reaktionsblandningen omrördes under ytterligare 1,5 timmar vid -200 och därefter under 17 timmar vid 23°. Reaktionsblandningen hälldes därefter i 150 ml vatten vid 230 under omröring, pH-värdet (7,75) in- ställdes på 2,5 med 3N HCl och omröringen fortsattes under 15 minu- ter. Acetonen avdrevs därefter i vakuum vid 400. En alikvot av den erhållna vattenlösningen underkastades HPLC-analys. Den erhållna kurvan antydde ett utbyte av 34,33 % di-Cbz-amikacin. I Huvuddelen av vattenlösningen reducerades vid ett vätgastryck 2 av 3,5 kg/cm vid 230 under 3,25 timmar under utnyttjande av 2,0 g av en katalysator av palladium på kol. Katalysatorn avlägsnades genom av filtrering och kombinationen av filtrat och tvättvätskor underkasta- 447 259 34 des mikrobiologisk analys mot E.coli och befanns därvid innehålla ett utbyte av 35,0 % amikacin.

Exempel 10 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- JÉQQQ-6'-N-Cbz-Kana A i 3-pentanon 30 g (23,65 mmol, räknat såsom 6'-N-Cbz-Kana A (Silyl)9) poly(trimetylsilyl)-6'-N-Cbz-Kana A, som hade framställts enligt ex- empel l, upplöstes i 100 ml molekylsiktstorkad 3-pentanon, bland- ningen omröres vid 230 och 26,02 mmol (l0% överskott) NAE tillsattes under en tidsperiod av 40 minuter. Omröringen fortsattes under ll3 timmar vid 230 och blandningen sattes därefter till 250 ml vatten under kraftig omröring. pH-värdet (7,3 inställdes på 2,5 med 3N HCl, blandningen omrördes under ytterligare 30 minuter och 3-pentanonen avdrevs i vakuum vid 400. Vattenlösningen extraherades med 4 x 100 ml etylacetat. En alikvot av Vattenlösningen underkastades därefter HPLC-analys. Den erhållna kurvan antydde ett utbyte av 46,12 % di- -Cbz-amikacin.

Huvuddelen av den vattenhaltiga reaktionsblandningen reduce- rades vid ett vätgastryck av 3,6 kg/cmz vid 230 under 2,5 timmar un- der utnyttjande av 3,0 g av en katalysator av 10% palladium på kol.

Mikrobiologisk analys av en alikvot av kombinationen av filtrat och tvättvätskor antydde ett utbyte av 40,24 % amikacin. Huvuddelen av den reducerade vattenhaltiga reaktionsblandningen koncentrerades därefter i vakuum vid 400 till en volym av ca 100 ml och fraktione- rades på en jonbytarkolonn (CG-50 (NH4+), 10 x 122 cm, innehållande ca 10 liter harts). Vattenlösningen applicerades på kolonnen, kolon- nen tvättades med 5 liter vatten och materialet eluerades med 0,5 N NH4OH (följt av 3N NH4OH för eluering av polyacylerade produkter).

Polarimetri av fraktionerna utvisade ett utbyte av 42,7 % amikacin, 12,0 % oreagerat kanamycin A, 12,4 % polyacylerat material och 23,2% BB-K29 .

Exempel ll Framställning av amikacin genom acylering av po1y(trimetyl- silyl)-6'-N-Cbz-Kana A i vattenfri cyklohexanon under variation av reaktionstiden A. 2,537 g (2,0 mmol, räknat såsom 6'-N-Cbz-Kana A (Silyl)9)- poly(trimetylSilYl)-6'-N-Cbz-kana A, som hade framställt enligt ex- empel l, i 300 ml torr cyklohexanon acylerades under 20 timmar vid 447 259 35 23° med en NAE-lösning i torr cyklohexanon (l0,8 ml av en lösning innehållande 0,l944 mmol/ml = 2,l0 mmol). Reaktionsblandningen sat- tes därefter till 150 ml vatten under omröring och pH-värdet (5,6) inställdes på 2,5 med 3N HCl. Cyklohexanonen avdrevs i vakuum vid 400 och en alikvot av den kvarvarande vattenfasen uttogs för HPLC- -analys.

Huvuddelen av vattenfasen reducerades under ett vätgas- tryck av 3,5 kg/cmz under 3 timmar vid 230 under utnyttjande av 1,0 g av en katalysator av 10% palladium på kol. Katalysatorn avlägs- nades genom filtrering och kombinationen êV filtrat och tvättvätskor analyserades mikrobiologiskt med avseende på amikacin.

B. Reaktionssteget A ovan upprepades med undantag av att acy- leringen fick pågå 115 timmar istället för 20 timmar.

Utbyten ÉÉEÉIÉEEÄXÉ Mikrobiologisk analys (amikacin) (di-Cbz-amikacin) Turbidimetriskt Platta Reaktion A 49,18 % 42,87 % 39,16 % Reaktion B 56,17 % 55,39 % 38,45 % Exemgel 12 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- silyl)-6'-N~Cbz-Kana A i vattenfri tetrahydrofuran under variation ..av reaktionstiden A. Exempel ll A upprepades med undantag av att torr tetra- hydrofuran utnyttjades såsom lösningsmedel istället för torr cyklo- hexanon.

B. Exempel ll B upprepades med undantag av att torr tetra- hydrofuran utnyttjades såsom lösningsmedel istället för torr cyklo- hexanon.

Utbyten HPLC~analys Mikrobiologisk analys Gmflæmin) (di-Cbz-amikacin) Turbidimetriskt Platta Reaktion A 29,27 % 28,34 % _ 328,18 % Reaktion B 33,39 % 21,52 % 28,63 % 447 259 36 Exemgel 13 Framställning av amikacin genom açylering av poly(trimetyl- silyl)-6'-N-Cbz-Kana A i vattenfri dioxan under variation av reak- tionstiden A. Exempel ll A upprepades med undantag av att acyleringen fortgick 44 timmar under utnyttjande av torr dioxan såsom lösnings- medel.

B. Exempel ll B upprepades med undantag av acyleringen fort- gick 18,5 timmar under utnyttjande av torr dioxan såsom lösnings- medel.

Utbvten HPLC-analvs Mikrobiologisk analys (amikacin) (di-Cbz-amikacin) Turbidimetriskt Platta Reaktion A 39,18 % 43,27 % 33,36 % Reaktion B 42,82 % 22,55 % 33,37 % Exemnel 14 Framställning av amikacin genom acylering av noly(trimetyl- silyl)-6'-N-Cbz-Kana A i vattenfri dietylketon vid 750 Till en omrörd lösning av 2,537 g (2,0 mmol, räknat såsom 6'-N-Cbz-Kana A (Silyl)9) poly(trimetylsilyl)6'-N-Cbz-Kana A, som hade framställts enligt exempel l, i 32 ml molekylsiktstorkad dietyl- keton vid 750 sattes en lösning av NAE (lO,8 ml av en dietylketon- lösning innehållande O,l944 mmol/ml = 2,10 mmol) under 15 minuter.

Omröringen fortsattes vid 750 under ytterligare 3 timmar, varefter blandningen hälldes i 150 ml vatten. pH-värdet inställdes på 2,8 med 3N HCl och dietylketonen avdrevs i vakuum vid 400. HPLC-analys av en alikvot av vattenfasen antydde ett utbyte av 39,18 % di-Cbz- -amikacin.

Huvuddelen av vattenfasen reducerades under ett vätgastryck av 3,5 kg/cmz under 3,25 timmar vid 230 under utnyttjande av 1,0 g av en katalysator av palladium på kol. Katalysatorn avlägsnades ge- nom filtrering och kombinationen av filtrat och tvättvätskor analy- serades mikrobioløgiskt med avseende på amikacin. Turbidimetnisk ana- lys utvisade ett utbyte av 27,84 % ochplattanalys gav ett utbyte av 28,6 %. 447 259 37 Exempel 15 Framställning av amikacin genom acylering av poly(dimetyl- silyl)-Kana A med NAE vid 0-50 efter hydrolys med vatten A. Silylering av kanamycin A under användning av HMDS med TMCS såsom katalvsator 10 g kanamycin A (97,6 % renhet, 20,14 mmol) i 100 ml mole- kylsiktstorkad acetonitril återloppskokades under kväveatmosfär. En blandning av 22,76 g (141 mmol, 7 mol per mol kanamycin A) HMDS och 1 ml (0,856 g, 7,88 mmol) TMCS sattes till den âterloppskokande reak- tionsblandningen under 10 minuter. Återloppskokningen fick fortgå 4,75 timmar och blandningen kyldes därefter, koncentrerades i vakuum till en gul viskös sirap och torkades i högvakuum under 2 timmar.

Produktutbytet var 23,8 g (97,9 % räknat såsom kanamycin A (silyl)l0).

B. Acylering 23,8 g (20,l4 mmol) av den i steg A ovan framställda fören- ingen poly(trimetylsily1)-kanamycin A upplöstes i 250 ml molekyl- siktstorkad aceton vid 23° och kyldes därefter till 0-50. 3,63 ml (20l,4 mmol, 10 mol per mol polysilylerat kanamycin A) vatten till- sattes under omröring och blandningen fick stå 30 minuter i måttligt vakuum. 19,133 mmol (0,95 mol per mol polysilylerat kanamycin A) NAE i 108,3 ml aceton tillsattes under en tidsrymd av mindre än 1 mi- nut. Blandningen omrördes vid 0-50 under 1 timme och späddes däref- ter med vatten, varefter pH-värdet inställdes på 2,5 och acetonen avlägsnades i vakuum. Vattenlösningen reducerades därefter vid ett vätgastryck av 3,5 kg/cm2 vid 230 under 2,5 timmar under utnyttjande av 2,0 g av en katalysator av 10 % palladium på kol. Den reducerade reaktionsblandningen filtrerades genom Dicalite, koncentrerades till en volym av ca 100 ml i vakuum vid 400 och applicerades därefter på en CG-50 (NH4+)-kolonn (6 liter harts, 5 x 100 cm). Den tvättades med vatten och eluerades med 0,6 N-l,0N-3N NH40H. Man erhöll 60,25 % amikacin, 4,37 % BB-K6, 4,35 % BB-K29, 26,47 % kanamycin A och 2,18 % polyacylmaterial.

Exempel 16 _ , Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- silyl)-6'-N-Cbz-Kana A med SAE vid 0-50 efter metanolys A. Silylering av 6'-N-Cbz-kanamycin A 20,0 g (32,4 mmol) 6'-N-Cbz-kanamycin A i 200 ml molekylsikts- torkad acetonitril återloppskokades under kväveatmosfär. 47,3 ml 447 259 38 (226,8 mmol, 7 mol per mol 6'-N-Cbz-Kana A) HMDS tillsattes under en 10-minuters-period och återloppskokningen fortsattes under 20 timmar. Blandningen kyldes därefter, koncentrerades i vakuum och torkades i högvakuum under 2 timmar, varvid man erhöll 39,1 g av ett vitt, amorft fast material (95,4 % utbyte räknat såsom 6'-N- -Cbz-Kana A (Silyl)q).

B. Acvlering 39,1 g (32,4 mmol) poly(trimetylsilyl)-6'-N-Cbz-Kana A, som hade framställts enligt steg A ovan, upplöstes i 400 ml torr aceton vid 230 under omröring. 6,6 ml (162 mmol, 5 mol per mol polysilyle- rat 6'-N-Cbz-Kana A) metanol tillsattes och blandningen omrördes vid 230 under l tümne under kraftig kvävgasgenomblàsning. Blandningen kyldes till 0-50 och en lösning av 11,35 g (32,4 mmol) SAE i 120 ml av i förväg kyld, torr aceton tillsattes. Blandningen omrördes un- der ytterligare 3 timmar vid 0-5° och infördes därefter i ett kyl- rum vid temperaturen 4° under 1 vecka. 300 ml vatten tillsattes, pH- -värdet inställdes på 2,0, blandningen omrördes under l timme och acetonet avdrevs i vakuum. Den erhållna vattenlösningen reducerades vid ett vätgastryck av 3,8 kg/cmz under 17 timmar vid 230 under ut- nyttjande av 3,0 g av en katalysator av l0% palladium på kol. Lös- ningen filtrerades därefter genom Dicalite, koncentrerades i vakuum till en volym av 75-100 ml, applicerades på en CG-50 (NH4+)-yolonn och eluerades med vatten och 0,6N NH40H. Man erhöll S2,52% amikacin, l4,5% BB-K29, l9,6% kanamycin A och l,7l% polyacylmaterial.

Exempel 17 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- silyl)-Kana A med SAE vid 0-50 efter hydrolys med vatten A. Silylering av kanamycin A med TMCS i acetonitril under användning av tetrametylguanidin såsom syraaccentor 4,88 g (l0,07 mmol) kanamycin A suspenderades i 100 ml mole- kylsiktstorkad acetonitril vid 230 under omröring. Till den omrörda suspensionen sattes l6,234 g (l40,98 mmol, 14 mol per mol kanamycin A) tetrametylguanidin (TMG). Blandningen återloppskokades oQh,l5,32 g (l40,98 mol, 14 mol per mol kanamycin A) TMCS tillsattes under 15 minuter. Ett vitt precipitat av TMG.HCl bildades efter det att ca hälften av TMCS hade tillsatts. Blandningen kyldes till rumstempera- tur, koncentrerades till en klibbig återstod och torkades i högvä- kuum under 2 timmar. Det fasta materialet triturerades med 100 ml 447 259 39 torr THF och det olösliga precipitatet av TMG.HCl avfiltrerades och tvättades med 5 x 20 ml THF. Kombinationen av filtrat och tvättvät- skor koncentrerades i vakuum vid 400 till en klibbig återstod och torkades i högvakuum under 2 timmar. Man erhöll 10,64 g av en ljust gräddfärgad, klibbig återstod (87,6% utbyte räknat såsom kanamycin A (Silyl)l0).

B. Acvlering 10,64 g (IQ07 mmol) poly(trimetylsilyl)-kanamycin A, som ha- de framställts enligt steg A ovan, upplöstes i 110 ml molekylsikts- torkad aceton under omröring vid 230 och lösningen kyldes därefter till 0-50. 1,81 ml vatten (l00,7 mmol, l0 mol per mol polysilylerat Kana A) vatten tillsattes och lösningen omrördes under 30 minuter i måttligt vakuum. 3,70 g (l0,57 mmol, 5% överskott) SAE i 40 ml av i förväg kyld, torr aceton tillsattes under en tidsrymd av mindre än l minut och blandningen omrördes under l timme. Blandningen upparbe- tades enligt det i exempel 16 B beskrivna allmänna förfarandet, var- vid man erhöll ca 50% amikacin, ca 10% BB-K29, 5-8% BB-K6, ca 20% kanamycin A och 5-8% polyacylmaterial.

Exempel l8 Framställning av poly(trimetylsilyl)-kanamycin A i pyridin under användning av HMDS 10,0 g (20,64 mmol) kanamycin A suspenderades i 100 ml mole- kylsiktstorkat, nydestillerat pyridin vid 230. Kvävgasgenomblåsning begynte och suspensionen återloppskokades. l7,33 g (l07,32 mmol, 5,2 mol per mol kanamycin A) HMDS tillsattes under 10 minuter och blandningen âterloppskokades under 19 timmar. Den kyldes därefter till rumstemperatur, koncentrerades i vakuum till en ljust guldfär- gad sirap och torkades i högvakuum till ett vitt, amorft fast mate- rial. Man erhöll 22,1 g (92,6% utbyte räknat såsom kanamycin A (si- lyl)l0).

Exempel 19 Framställning av noly(trietylsilyl)-kanamycin A under använd- ning av trietylklorsílan med trietylamin såsom syraacceptor_ , 5,0 g kanamycin A (97,6% renhet, 10,07 mmol) suspenderades i 1oo m1 moiekyisiktstorkaa acetonitril vid 23°. 33,8 m1 (24,s g, 241,7 mmol) trietylamin (TEA) tillsattes och suspensionen âterlopps- kokades. En lösning av 23,7 ml (2l,3 g, 140,98 mmol) trikloretylsi- lan i 25 ml torr acetonitril tillsattes under 20 minuter. Återlopps- 447 259 40 kokningen fortsattes under ytterligare 7 timmar och blandningen kyl- des till rumstemperatur, varvid långa fina nålar av TEA.HCl utföll.

Blandningen fick stå vid rumstemperatur under ca 16 timmar, koncen- trerades i vakuum vid 400 till en klibbig fast återstod och torkades under 2 timmar i högvakuum till ett mörkt orangefärgat, klibbigt fast material. Det fasta materialet triturerades med 100 ml torr THF vid z3° och olösligt -rßzhncl avfiitreraaes, tvättaaes med s x zo m1 THF och torkades för erhållande av 16,0 g TEA.HCl. Kombinationen av filtrat och tvättvätskor koncentrerades i vakuum till ett fast mate- rial och torkades i högvakuum under 2 timmar. Man erhöll 19,3 g po- 1y(trietylsilyl)kanamycin A såsom en mörkt orangefärgad, viskös si- rap.

Exempel 20 Framställning av poly(trimety1si1yl)-kanamycin A under använd- ning av bis-trimetylsilylkarbamid 10,0 g kanamycin A (99,7% renhet, 20,58 mmol) suspenderades i 200 ml molekylsiktstorkad acetonitril under omröring vid 230. Till suspensionen sattes 29,45 g (144,0l mmol, 7 mol per mol kanamycin)- bis-trimetylsilylkarbamid (BSU) och blandningen återloppskokades un- der kväveatmosfär. Återloppskokningen fortsattes under 17 timmar, varefter reaktionsblandningen kyldes till rumstemperatur. En liten mängd närvarande olösligt material avlägsnades genom filtrering, tvättades med 3 x 10 ml acetonitril och torkades för erhållande av l,l38l g material. Infrarödanalys visade att detta material var BSU plus en liten mängd oreagerat kanamycin A. Kombinationen av filtrat och tvättvätskor kyldes vid 40 under 16 timmar. Ytterligare fast ma- terial utföll, och utvanns på ovan beskrivet sätt (7,8 g). Infraröd- analys visade att detta material var BSU + karbamid. Det ljusgula filtratet och tvättvätskorna koncentrerades i vakuum vid 400 och tor- kades i högvakuum, varvid man erhöll 27,0 g av ett vitt fast materi- al, som delvis var klibbigt och delvis utgjordes av fina, nålliknan- de kristaller. Det fasta materialet behandlades med 150 ml heptan vid 230, den olösliga delen avlägsnades genom filtrering, tyättades med 2 x 50 ml heptan och torkades för erhållande av 6,0 g vita nålar (infrarödanalys visade att detta material utjordes av BSU plus karb- amid). Kombinationen av filtrat och tvättvätskor koncentrerades i vakuum vid 400 och torkades i högvakuum under-2 timmar för erhållande av 20,4 g vita nålar, vars infrarödspektrum var typiskt för polysi- lylerat kanamycin A. Beräkningar visade att produkten innehöll i ge- 447 259 41 nomsnitt 7,22 trimetylsilylgrupper.

Exempel 21 Framställning av amikacin genom acylering av per(trimetyl- silyl)-kanamycin A efter partiell avsilylering med 1,3-butandiol A. Framställning av ner(trimetylsilyl)-kanamycin A 10,0 g (20,639 mmol) kanamycin A suspenderades 100 ml mo- lekylsiktstorkad acetonitril vid 230 under omröring. Suspensionen fick återloppskoka under kvävgasgenomblåsning och 23,322 g (l44,5 mmol, 7 mol per mol kanamycin A) HMDS tillsattes under en tidsrymd av 10 minuter. Återloppskokningen fortsattes under l6 timmar och blandningen kyldes därefter till rumstemperatur, koncentrerades i vakuum och torkades i högvakuum under 2 timmar. Man erhöll 24,3 g av en vit, klibbig återstod (92,l % utbyte räknat såsom kanamycin A (silyl)ll).

B.Acylering 24,3 g per(trimetylsilyl)kanamycin A, som hade framställts enligt steg A ovan, upplöstes i 240 ml molekylsiktstorkad aceton vid 230 under omröring. Till denna lösning sattes 9,25 ml (l03,2 mmol, 5 mol per mol per(trimetylsilyl)-kanamycin A)l,3-butandiol. Bland- ningen omrördes 2 timmar vid 230 under kvävgasgenomßlâsning och kyl- des därefter till o-5°. 7,23 g 00,64 mmol) SAE i 70 m1 av i förväg kyld aceton tillsattes under en tidsrymd av ca l minut. Blandningen omrördes vid 0-50 under 3 timmar och fick därefter stå i ett kylrum vid 4° under ca 16 timmar. 200 ml vatten tillsattes, pH-värdet in- ställdes på 2,5 och den klargula lösningen omrördes 30 minuter vid 230. Acetonen avdrevs i vakuum och vattenlösningen reducerades vid ett vätgastryck av 3,9 kg/cmz vid 230 under 2 timmar under använd- ning av 3,0 g av en katalysator av 10% palladium på kol. Den reduce- rade lösningen filtrerades genom Dicalite och kromatograferades så- som i exempel 16 B för erhållande av 47,50 % amikacin, 5,87 % BB-K29, 7,32 % BB-K6, 24,26 % kanamycin A och 7,41 % polyacylmaterial.

Exempel 22 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- silyl)-kanamycin A framställt i THF under användning av SAE med sul- famsyrakatalysator Till en återloppskokande blandning av 5,0 g (10,32 mmol) ka- namycin A i 50 ml molekylsiktstorkad tetrahydrofuran (THF) sattes 100 mg sulfamsyra och 12,32 g (76,33 mmol) HMDS. Blandning återlopps- 447 259 42 kokades under 18 timmar, varvid fullständig upplösning inträdde efter 6 timmar. Lösningen kyldes till 230, behandlades med 0,1 ml vatten och hölls vid 230 under 30 minuter. En lösning av 3,61 g (10,3 mmol) SAE i 36 ml THF tillsattes under en tidsrymd av 30 mi- nuter. Efter omröring under 3 timmar späddes blandningen med 100 ml vatten och pH-värdet inställdes på 2,2 med 10%-ig H2SO4. Blandning- en omrördes vid 23° under/30 minuter och koncentrerades därefter i vakuum för avlägsnande av THF. Den resulterande vattenlösningen re- ducerades vid ett vätgastryck av 3,5 kg/cmz under 2 timmar vid 230 under användning av en katalysator av 10% palladium på kol. Den re- ducerade lösningen filtrerades genom Dicalite och det fasta materia- let tvättades med vatten. Kombinationen av filtrat och tvättvätskor (150 ml) underkastades mikrobiologisk analys mot E. coli och befanns innehålla 1225 pg/ml (3l,5 % aktivitetsutbyte) av amikacin.

Exemgel 23 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- silyl)-kanamycin A med N-hydroxisuccinimidestern av di-karbobensyl- oxi-AHBA A. Framställning av dikarbobensyloxi-L-(-)-alfa-amino-alfa- -hydroxismörsyra-N-hydroxisuccinimidestern 8 g (20,65 mmol) dikarbobensyloxi-L-(-)-alfa-amino-alfa-hydr- oxismörsyra och 2,37 g (20,65 mmol) N-hydroxisuccinimid upplöstes i so m1 torr aceton vid 23°. 4,25 g (2o,6s mmol) aicykionexyikarbodi- imid, som hade upplösts i 20 ml torr aceton, tillsattes och hela hlandningen omrördes 2 timmar vid 230. Dicyklohexylkarbamid aviltre- rades, filterkakan tvättades med 10 ml torr aceton och filtratet och tvättvätskorna kombinerades.

B. Acvlering Poly(trimetylsi1yl)-kanamycin A, som hade framställts enligt det allmänna förfarandet i exempel 2l utgående från 10,0 g (20,639 mmol) kanamycin A,upplöstes i 100 ml torr aceton. Lösningen kyldes till 0-50, 3,7 ml avjoniserat vatten tillsattes och lösningen omrör- des vid 0-50 under 30 minuter under måttligt vakuum. _ g Till denna lösning sattes den i steg A framställda lösning- en av det åi~Cbz-blockerade acyleringsmedlet och blandningen omrördes vid 0-50 under 30 minuter. Blandningen späddes med vatten, pH-värdet inställdes på 2,2 och acetonen avlägsnades i vakuum. Vat- tenlösningen reducerades medelst det allmänna förfarandet i exempel 22 och filterades därefter genom Dicalite. Kromatografering utvisade 447 259 43 40-45% amikacin, ca 10% BB-K29, spår av BB-K6, ca 30% kanamycin A och en liten mängd polyacylmaterial.

Exemgel 24 Framställning av poly(trimetylsilyl)-kanamycin A under an- vändning av HMDS med imidazol såsom katalysator ll 9 (22,7 mmol) kanamycin A och 100 mg imidazol återlopps- kokades i l00 ml molekylsiktstorkad acetonitril under kvävgasgenom- blåsning. l8,48 g (ll4,5 mmol, 5 mol per mol kanamycin A) HMDS till- sattes under en tidsrymd av 30 minuter och blandningen återloppsko- kades under 20 timmar. Fullständig upplösning inträdde inom ca 2,5 timmar. Lösningen kyldes till 230 och lösningsmedlet avlägsnades i vakuum, varvid man erhöll 21,6 g poly(trimetylsilyl)-kanamycin A så- som en skummig återstod (93,l % utbyte räknat såsom kanamycin(silyl)ll).

Exemgel 25 Framställning av l-N-/L-(-)-7? -amino-alfa-hydroxibutyryl/- kanamycin B (BB-K26) genom acylering av poly(trimetylsilyl)kanamy- cin B med SAE A. Framställning av poly(trimetylsilyl)kanamycin B under an- vändning av HMDS med TMCS-katalysator 25 g (5l,7 mmol) kanamycin B i 250 ml molekylsiktstorkad ace- tonitril återloppskokades under en kvävgasström. 62,3 g (385,8l mmol, 7,5 mol per mol kanamycin B) HMDS tillsattes under en tidsrymd av _30 minuter, följt av 1 ml TMCS såsom katalysator. Blandningen åter- 10??Sk0kfideS under 21 timmar med fullständig upplösning efter l timme. flösningsmedlet avlägsnades därefter i vakuum vid 600 och den oljiga återstoden hölls vid 600 i högvakuum under 3 timmar. Man erhöll 53,0 g poly(trimetylsilyl)-kanamycin B (85,2 % utbyte räknat såsom kana- mycin B (silyl)l0).

B. Acylering 53,0 g av den i steg A ovan framställda föreningen poly(tri- metylsilyl)-kanamycin B upplöstes i 500 ml torr aceton vid 0-50, 20,9 ml metanol tillsattes och blandningen omrördes i vakuum vid 0~5° under 30 minuter. En lösning av l8,l g (5l,67 mmol) SAE i 200 ml av i förväg kyld, torr aceton tillsattes under en tidsrymd av mindre än 1 minut och blandningen omrördes vid 0-50 under 30 minu- ter. Blandningen upparbetades enligt det allmänna förfarandet i ex- empel 22 och applicerades därefter på en kolonn av CG-50 (NH4+) (8 x 120 cm). Den eluerades med en NH4OH-gradient från 0,6N till 3N. 447 259 44 Man erhöll 38% BB-K26, 5% av motsvarande 6'-N-acylerade kanamycin B (BB-K22), 10% av motsvarande 3-N-acylerade kanamycin B (BB-K46), l4,63% kanamycin B och en liten mängd polyacylerat kanamycin B.

Exemgel 26 Framställning av poly(trimetylsily1)-kanamycin A under an- vändning av HMDS med kanamycin A-sulfat såsom katalysator 19,5 g (40,246 mmol) kanamycin A och 0,5 g (0,858 mmol) ka- namycin A-sulfat (totalt = 20,0 g, 41,0 mmol) i 200 ml molekyl- siktstorkad acetonitril bringades att återloppskoka. 60,3 ml (287,7 mmol, 7 mol per mol kanamycin A) HMDS tillsattes långsamt och bland- ningen återloppskokades under 28 timmar. Den indunstades därefter till torrhet i en rotationsindunstare och torkades under ângstrâle- vakuum. Man erhöll 47,5 g poly(trimetylsilyl)-kanamycin A såsom en blekgul olja (95,82 % utbyte räknat såsom kanamycin A (silyl)l0).

Exemgel 27 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- silyl)-kanamvcin A med N-hydroxisuccinimidestern av N~trifluoracetyl- blockerad AHBA A. Framställning av N-trifluoracetyl-AHBA och omvandling där- av till dess N-hydroxisuccinimidester Till en suspension av 5,0 g (42 mmol) AHBA i l0O ml THF sat- tes 40 g (191 mmol) trifluorättiksyraanhydrid under en tidsrymd av 10 minuter under omröring. Lösningen omrördes vid 23° under 18 tim- mar och koncentrerades därefter till torrhet i vakuum vid 500. Ater- stoden upplöstes i 100 ml av en 1:1-blandning av vatten och metanol och omrördes under l timme. Den koncentrerades därefter till torrhet i vakuum och återupplöstes i 50 ml vatten. Vattenlösningen extrahe- rades med 3 x 50 ml MIBK och efter torkning över natriumsulfat kon- centrerades extraktet till en olja. Spår av lösningsmedel avlägsnades genom tillsats och avdestillation av 4 ml vatten. Då oljan fick stå omvandlades den till ett vaxartat, kristallint fast material (2,5 g, 28% utbyte). g 2,4 g (ll,3 mmol) N-trifluoracetyl-AHBA upplöstes i_50 ml torr aceton och l,30 g (ll,3l mmol) N-hydroxisuccinimid sattes till lösningen. En lösning av 2,33 g dicyklohexylkarbodiimid i 20 ml torr aceton tillsattes långsamt. Reaktionsblandningen omrördes vid 230 un- der 2 timmar och den utfällda dicyklohexylkarbamiden avlägsnades ge- nom filtrering och tvättades med en liten mängd aceton. Kombinationen 447 259 45 av filtrat och tvättvätskor (en lösning av N-hydroxisuccinimidestern av N-trifluoracetyl-AHBA) utnyttjades i följande steg utan isolering.

B. Acylering Till en lösning av 11,31 mmol poly(trimetylsilyl)-kanamycin A, som hade framställts såsom i exempel 26, i 54 ml aceton sattes 2,0 ml (ll3,4 mmol) vatten och blandningen omrördes i vakuum vid O-50 under 30 minuter. ll,3l mmol av den i steg A ovan framställda N~hydroxisuccinimidestern av N-trifluoracetyl-AHBA sattes till bland- ningen, som därefter hölls vid 50 under l timme. pH-värdet inställ- des därefter på ca 2,0 med 20%-ig svavelsyra, blandningen omrördes under 30 minuter och pH-värdet höjdes därefter till ca 6,0 med NH4OH.

Blandningen indunstades därefter till torrhet i en rotationsinduns- tare för erhållande av l4,4 g av ett klibbigt, gråvitt fast material.

Det fasta materialet upplöstes i 100 ml vatten, pH-värdet höjdes från 5,5 till 11,0 med l0N NH40H och lösningen upphettades på oljebad vid 700 under l timme. pH-värdet (9,5) sänktes därefter till 7,0 med HCl, lösningen klarfiltrerades för avlägsnande av en liten mängd olösligt material och filtret tvättades med vatten. Kombinationen av filtrat och tvättvätskor (188 ml) applicerades på CG-50 (NH4+)-kolonn ( 8 x 90 cm), tvättades med 2 liter vatten och eluerades med en NH4-gradi- ent (O,6N-l,0N-koncentrerad). Man erhöll 28,9 % amikacin, 5,0% BB- -K6, S,7% BB-K29, 43,8% kanamycin A, 3,25% polyacylmaterial plus l4,3% av ett okänt material, som återfanns i den första fraktionen från kolonnen.

Exemgel 28 Framställning av amikacin genom acylering av poly(trimetyl- silyl)-kanamycin A med N-hydroxisuccinimidestern av t-butyloxikarb- onylblockerad AHBA A. Framställning av t-BOC-AHBA och omvandling därav till dess N-hydroxisuccinimidester En lösning av 5,0 g (42 mmol) AHBA i 100 ml vatten och 20 ml aceton inställdes på pH 10 med l0N Na0H. Under en tidsperiod av 3-4 minuter tillsattes 11,6 g (53 mmol) di-t-butyldikarbonat,och lösningen omrördes 35 minuter under det att pH-värdet hölls vid 10 genom periodisk tillsats av l0N Na0H. Acetonen avlägsnades i vakuum och vattenfasen tvättades med 40 ml etylacetat. Vattenlösningens pH- -värde sänktes till 2,0 med 3N HCl och extraherades därefter med 3 x 30 ml MIKB. De kombinerade MIBK-extrakten torkades över natri- 447 259 46 umsulfat och koncentrades till en klar oljig återstod (8,2 g, 89%), 4,25 g (19,4 mmol) t-BOC-AHBA upplöstes i 50 ml aceton och 2,23 g (19,4 mmol) N-hydroxisuccinimid tillsattes. En lösning av 4,00 g (19,4 mmol) dicyklohexylkarbodiimid i 20 ml aceton tillsattes långsamt och blandningen omrördes 2 timmar vid 230. Den utfällda di- cyklohexylkarbamiden avlägsnades genom filtrering och tvättades med en liten mängd aceton. Kombinationen av filtrat och tvättvätskor (en lösning av N-hydroxisuccinimidistern av t-BOC-AHBA) utnyttjades i följande steg utan isolering.

I B. Acylering Till en lösning av 41,28 mmol poly(trimetylsilyl)-kanamycin A, som hade framställts enligt exempel 26, i 94 ml aceton sattes 3,5 ml (194 mmol) vatten och blandningen omrördes i vakuum 30 minu- ter vid 0-5°. 19,4 mmol av den i steg A ovan framställda N-hydroxi- succinimidestern av t-BOC-AHBA tillsattes och blandningen fick stå l timme vid 50. 200 ml vatten tillsattes och pH-värdet (7,0) sänk- tes till 2,0 med 20%-ig svavelsyra. Efter 30 minuters omröring öka- des pH-värdet till ca 6,0 med NH4OH och blandningen indunstades till torrhet i vakuum för erhållande av 36,3 g av en guldfärgad olja. Ol- jan upplöstes i 200 ml trifluorättiksyra, fick stå 15 minuter och indunstades till torrhet i en rotationsindunstare. Oljan tvättades med vatten och vattnet avdrevs. Koncentrerad NH4OH tillsattes till pH 6,0 och avdrevs. Den erhållna oljan upplöstes i vatten och fil- trerades och filtret tvättades med vatten. Kombinationen av filtrat och tvättvätskor (259 ml) applicerades på en CG-50 (NH4+)-kolonn (8 x 92 cm), tvättades med 4 liter vatten och eluerades med en NH4OH- -gradient (0,6N-l,0N-koncentrerad). Man erhöll 40,32 % amikacin, 4,58% BB-K6, 8,32% BB-K29, 30,50% kanamycin A och 7,43% polyacylma- terial- Exemoel 29 Det allmänna förfarandet enligt exempel l upprepades med undantag av att den däri använda föreningen 6'-N-karbobensyloxikana- mycin A ersattes med en ekvimolär mängd 6'-N-karbobensy1oxikanamy- cin B, varvid man erhöll i-N-/L-(q- a* -amino-aifa-hyaroxibutyryu- -kanamycin B.

Exemgel 30 Det allmänna förfarandet enligt exempel l upprepades med un- dantag av att den däri använda L-(-)-Z'-bensyloxikarbonylamino-alfa- 447 259 47 -hydroxismörsyra-N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboximidestern er- sattes med L-(-)-beta-bensyloxikarbonylamino-alfa-hydroxipropion- syra-N-hydroxi-5-norbornen-2,3-dikarboximidester respektive L-(-)-8'-bensyloxikarbonylamino-alfa-hydroxivaleriansyra-N-hydr- oxi-5-norbornen-2,3-dikarboximidester, varvid man erhöll l-N-[L- (-)-beta-amino-alfa-hydroxipropionylfkanamycin A respektive l-N-ÅL-(-)-8'-amino-alfa-hydroxivalerylfkanamycin A.

Exempel 31 Det allmänna förfarandet i exempel 25 upprepades med undan- tag att den däri använda L-(-)-3/-bensyloxikarbonylamino-alfa- hydroxismörsyra-N-hydroxiestern ersattes med L-(-)-beta-bensyloxi- karbonylamino-alfa-hydroxipropionsyra-N-hydroxisuccinimidester respektive L-(-)-6 -bensyloxikarbonylamino-alfa-hydroxivalerian- syra-N-hydroxisuccinimidester, varvid man erhöll l-N-¿L-(-)~beta- amino-alfa-hydroxipropionylfkanamycin B respektive l-N-[I-(-)- 6 -amino-alfa-hydroxivalerylfkanamycin B.

Exempel 32 Framställning av amikacin genom acylering av poly(tri- metylsilyl)-3,6”-di-N-karbobensyloxikanamycin A i vattenfri di- etylketon A. 3,6'-di-N-karbobensyloxikanamycin A En suspension av 7,26 g (15 mmol) kanamycin A i form av den fria basen och 18,6 g (75 mmol) nickelacetat-tetrahydrat i 300 ml dimetylsulfoxid (DMSO) upphettades vid 1000 under ca 30 minuter under omröring till dess man erhöll en klar grön lös- ning. Efter kylning sattes en lösning av 11,8 g (37,6 mmol) N-karbobensyloxi-5-norbornen-2,d-dikarboximid 50 ml DMSO till lösningen. Blandningen omrördes vid rumstemperatur över natten, behandlades med 100 ml koncentrerat ammoniakvatten och l liter vatten, omrördes i rumstemperatur under l timme och applicerades på toppen av en Diaion HP-10 kolonn (300 ml). Kolonnen under- kastades stegvis eluering, varvid man började med 7N NH4OH, där- efter metanol-vatten i ett volymförhållande av l:l och slutli- gen metanol-vatten i ett volymförhållande av l0:l. 20 ml frak- tioner tillvaratogs och man övervakade elueringen medelst tunn- skiktskromatografi på silikagelplattor av typ Merck 60 F-254 under användning av en blandning av kloroform, etanol och 28% ammoniumhydroxid i ett volymförhâllande av l:2:l. En andel av 447 259 48 den önskade produkten, som kristalliserades såsom fina nålar ur fraktioner innehållande produkten i höga koncentrationer, av- filtrerades för erhållande av ett analytiskt prov. Filtratet och övriga fraktioner innehållande den önskade produkten (Rf 0,42) kombinerades och lösningen indunstades i vakuum. Återstoden triturerades med dietyleter, varvid man erhöll totalt 9,7 g (86%) av den i rubriken angivna produkten med en smältpunkt överstigande 3000. IR(KBr)v¶c=o l690cm_l. NMR(DMSO-dö + DCl, pm ca 3)= å' 4,76-s,2e (psn,m,nl',nl" och cø-oggz-cßns x z) , 7,26(l0H,s,CO-OCHZ-§6§5 x 2).

Analys Beräknat för C34H48N40l5-H20: C 52,98, H 6,54, N 7,27 Funnet: C 53,20, H 6,42, N 7,04.

B. Poly(trimetylsilyl)-3,6'-di-N-karbobensyloxikanamycin A En blandning av 1,5 g (2 mmol) 3,6'-di-N-karbobensyloxi- kanamycin A från steg A ovan och 1,29 g (8 mmol) hexametyldisila- zan i l5 ml torr acetonitril återloppskokades 16 timmar. Den klara lösningen koncentrerades till torrhet i vakuum och återsto- den upplöstes i 20 ml torr dietylketon. Lösningen användes direkt i efterföljande steg.

C. Acylering av poly(trimetylsislyl)-3,6'-di-N-karboben- syloxi-kanamycin A under användning av en ekvimolär mängd av acyleringsmedlet Till lösningen från steg B ovan sattes under omröring 700 mg (2 mmol) L-(-)-alfa-karbobensyloxiamino-alfa-hydroxismörsyra- N-hydroxisuccinimidester (SAE). Blandningen omrördes i rumstem- peratur under 19 timmar, behandlades därefter med 8 ml vatten och 35 ml tetrahydrofuran (THF), inställdes på pH 3 med en vatten- lösning av klorvätesyra, omrördes 30 minuter och koncentrerades till torrhet i vakuum. Återstoden upplöstes i en blandning av 30 ml vatten, 40 ml metanol, 10 ml n-butanol och 40 ml THF och hyd- rerades över natten i närvaro av 500 mg l0% palladium på kpl¿ Katalysatorn avlägsnades genom filtrering och filtratet indunsta- des i vakuum och lyofiliserades för erhållande av l,7 g orent amikacin. Det amorfa pulvret återupplöstes i vatten och lösningen inställdes på pH 4 med en vattenlösning av klorvätesyra och kro- matograferades på en kolonn av Amberlite CG-50 i NH4+-cykeln. 447 259" 49 Kolonnen underkastades stegvis eluering med vatten, 0,1 N NH4OH, 0,3 N NH4 OH, 0,5 N NH4OH och 2 N NH40H, varvid man tillvaratog 10 ml fraktioner och övervakade elueringen medelst tunnskikts- kromatografi under användning av silikagelplattor av typ Merck 60 F-254 under användning av en blandning av kloroform, metanol, 28% ammoniumhydroxid och vatten i ett volymförhâllande av l:4:2:l.

De homogena fraktionerna kombinerades, indunstades och lyofili- serades slutligen. Fraktioner innehållande amikacin och fraktio- ner innehållande återvunnet kanamycin A analyserades under an- vändning av K. pneumoniae A20680 resp. B. subtilis PCl 129.

Följande resultat erhölls.

Fraktion NH OH Vikt Utbyte Produkt Rf- nr (3) (%) värde 32-39 0,1, 0,3 102 mg partiellt avblocke- rad produkt 40-46 0,3 174 mga 7° kanamycin A i 0,42 47-59 0,3, 0,5 l06 mg oidentifierad 0,33 produkt 60-78 0,5 816 mgb 67° amikacin 11,16 89-95 2 70 mg 5 diacylkanamycin A O, 5 (a) 408 pg/mg (b) 956 pg/mg (c) baserat på bioanalys Hydrering av den partiellt avblockerade produkten med Pd-C, följt av isolering på en CG-50-kolonn, gav ytterligare 30 mg (2%) amikacin. Det totala utbytet av amikacin uppgick således till 846 mg (69%).

D. Acylering av poly(trimetylsilyl)-Sfi'-di-N-karbobensyloxi- kanamycin A under användning av 1,2 ekvivalenter acyleringsmedel Steg C ovan upprepades med undantag av att man använde ett 20% överskott acyleringsmedel. Följande resultat erhölls.

Fraktion NH4OH Vikt Utbyte Produkt Rf- nr (%) värde (N) 28-29 0,2 107 mg partiellt avblocke- rad produkt 447 259 50 30-41 0,2 157 mg oidentifierad 0,35 produkt 42-52 0,3 120 mg oidentifierad 0,30 produkt 53-81 0,3, 0,5 750 mga sob amikacin o,14 94-116 l, 2 147 mg ll diacylkanamycin A 0,05 (a) 933 pg/mg (b) baserat på bioanalys Hydrolys av den partiellt avblockerade produkten med Pd-C, följt av isolering på en CG-50-kolonn,gavytterligare 21 mg (2%) amikacin. Det totala utbytet av amikacin uppgick såle- des till 77l mg (62%).

E. Acylering av polyltrimetylsiljb-3ß'-di-N-karbobensy- loxi-kanamycin A under användning av 1,5 ekvivalenter acylerings- medel Steg C ovan upprepades med undantag av att man utnyttjade ett 50% överskott acyleringsmedel. Följande resultat erhölls.

Fraktion NH4OH Vikt Utbyte Produkt Rf- nr (N) (%) värde (dubbelfram- kallning) 29-39 0,2 293 mg ” partiellt avblocke- rad produkt 40-47 0,3 95 mga e° kanamycin A 0,67 65-so 0,5 582 mgb 29° amikacin 0,33 100-130 l, 2 543 mg 26 diacylkanamycin A 0,09 (a) 860 pg/mg (b) 880 yg/mg (c) baserat på bioanalys

Claims (6)

s: 447 259 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett 1-N-[i-(-)%fl-amino- alfa-hydroxialkanoyl7kanamycin A eller B med formeln CšízNïiz 30 H0 vari R är OH eller NH och n är ett helt tal från 0 till 2, 2 eller ett ogiftigt farmaceutiskt godtagbart syraadditions- 5 salt därav, k ä n n e t e c k n a t därav, att man på i och för sig känt sätt acylerar polysilylerat kanamycin A eller B eller polysilylerat kanamycin A eller B inne- hållande en annan blockeringsgrupp är silyl på 6'-amino- gruppen, vilken blockeringsgrupp har formeln 10 1 . R f: W czzoc- , cna-clz-o-c- , Yzxeå I ca3 2 10 15 20 35 447 259 _ 52 ÖIS: O å . ' \ R eller , X C-CH -O-C- 3 2 C,/! H 0 vari R1 och R2 är lika eller olika och vardera betecknar H, F, Cl, Br, N02, OH, lägre alkyl eller lägre alkoxi, X är Cl, Br, F eller I och Y är H, Cl, Br, F eller I och varvid det polysilylerade kanamycinderivatet innehåller 2-10 silylgrupper per molekyl företrädesvis i genomsnitt 4-8 silylgrupper per molekyl eller 3-7 silylgrupper per molekyl i det fall det polysilylerade kanamycin A- eller B-utgângsmaterialet innehåller en annan blockeringsgrupp än silyl på 6'-aminogruppen, och silylgrupperna är tri- (lägre alkyl)silylgrupper, med ett acylerande derivat av en syra i L-(-)-formen med formeln B-HN-CHZ- (cnz ) n-gn-coofl (II) of: vari n är ett helt tal från O till 2 och B är en konventio- nell aminoblockerande grupp, i ett organiskt lösningsmedel innehållande upp till 25% vatten och därefter pâ i och för sig känt sätt avlägsnar samtliga blockeringsgrupper.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det acylerande derivatet av syran är dess aktiva ester men N-hydroxisuccinimid, N-hydroxi-5-norbornen-2,3- dikarboxiimid eller N-hydroxiftalimid. 10 15 53 447 259

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att den aminoblockerande gruppen på det acylerande derivatet av syran är en karbobensyloxigrupp.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det acylerande derivatet av syran är dess bland- syraanhydrid med pivalinsyra, bensoesyra, isobutylkolsyra eller bensylkolsyra.

5. Förfarande enligt något av kraven 1-4, k ä n n e- t e c k n a t därav, att det polysilylerade kanamycin A eller B innehåller en karbobensyloxigrupp på 6'-amino- gruppen.

6. Förfarande enligt något av kraven 1-5, k ä n n e - t e c k n a t därav, att silylgrupperna är trimetylsilyl- grupper.