CS207607B2 - Method of making the 1-n-/omega-amino-alphe-hydroxyalcanoylcanamycine a and b - Google Patents

Description

(54) Způsob výroby l-N-(w-amino-a>hydroxyalkanoyl)kanamycinu A a B

Vynález se týká způsobu výroby 1-Ν-(ω- -amino-a-hydroxyalkanoyl)kanamycinu A B obecného vzorce I

kde

R znamená hydroxyskupinu nebo aminoskupinu a n znamená celé číslo 0 až 2, jakož i netoxických, z farmaceutického hlediska přijatelných adičních solí těchto látek s kyselinami, vyznačující se tím, že se acyluje polysilylovaný kanamycin A nebo B nebo polysilylovaný kanamycin A nebo B, s obsa hem odlišné ochranné skupiny od silylové skupiny na 6‘-aminoskupině, · za předpokladu, že polysilylovaný kanamycin A nebo' B, užitý jako výchozí materiál obsahuje průměrně ' 4 až 8 silylových skupin v molekule, a polysilylovaný kanamycin A nebo B, užitý jako výchozí materiál a obsahující na 6*-aminoskupině · ochrannou skupinu, odlišnou od ' silylové · skupiny obsahuje průměr207607 ný počet silylových skupin v molekule 3 až 7, přičemž jako acylačního činidla se užije derivátu kyseliny obecného vzorce II

В \

B—N—CH₂— (CH₂)_n—CH—COOH ,

OH (П) kde n znamená celé číslo 0 až 2, a

В znamená ochrannou skupinu na aminoskupině nebo atom vodíku za předpokladu, že alespoň jeden z těchto symbolů znamená ochrannou skupinu na aminoskuplně, načež še odstraní všechny ochranné skupiny.

Kanamyciny jsou velmi známá antibiotika, která byla popsána například v publikaci Merck Index, 8. vydání, str. 597 až 598. Jsou také známy četné deriváty kanamycinu. Strukturní vzorce kanamycinu А а В jsou dále uvedeny spolu s běžným způsobem číslování těchto vzorců. Dále budou uváděny různé deriváty kanamycinu A nebo В pouze názvem a nikoli strukturním vzorcem.

Kanamyciny А а В je možno vyjádřit vzorcem III

Kanamycin A: R = OH

Kanamycin B: R = NHz

V US patentu, č. 3 781 268 se popisuje způsob výroby l-[L-( — )-y-amino-a-hydroxybutyryl]kanamycinu A (amikacin) а В a jejich chráněné deriváty pomocí mono- a dlbenzoyloxykarbonylskupiny. Nižší a vyšší homology jsou popsány v US patentu číslo 3 886 139 a 3 904 597. Sloučeniny se vyrábí acylací kanamycinu A nebo B, chráněných na 6‘-aminoskupině acylačním derivátem N-chráněné L- (—) -y-amino-a-hydroxymáselné kyseliny ve vodném prostředí s následným odstraněním jedné nebo obou ochranných skupin.

V US patentu č. 3 974 137 se popisuje způsob výroby l-[L-( —)-y-amino-a-hydroxy-. butyryl ]kanamycinu A, který spočívá v tom, že se uvede v reakci 6‘-benzyloxykarbonylkanamycin A s alespoň 3 moly benzaldehydu, substituovaného benzaldehydu nebo pivalaldehydu za vzniku 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A, který obsahuje zbytek Schiffovy báze v polohách 1,3 a 3“, tento derivát kanamycinu A se acyluje N-hydroxysukcinimidesterem kyseliny L-( — )-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné, načež se odstraní ochranné skupiny.

Belgický patent č. 828 192 popisuje způsob výroby l-[L-(—J-y-amino-a-hydroxybutyryl] kanamycinu A tak, že se připraví tentýž chráněný derivát kanamycinu A jako v US patentu č. 3 947 137 a tento derivát se acyluje N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboxyimidester em kyseliny L- (—) -χ-benzy 1oxykarbonylamino-a-hydroxymáselné s následným odstraněním ochranných skupin.

Vynález se týká zlepšeného způsobu výroby sloučenin obecného vzorce I. Použití polysilylovaných kanamycinu A nebo В jako výchozích látek zajišťuje vysokou rozpustnost v organickém rozpouštědle a tím provádění reakce ve vysokých koncentracích. Přestože se reakce obvykle provádí v roztocích, které obsahují 10 až 20 % polysilylovaného kanamycinu, je možno získat velmi dobré výsledky i při koncentracích až 50 g na 100 ml rozpouštědla. *

Stejně jako je tomu při provádění známých postupů, získává se při provádění způsobu podle vynálezu směs acylovaných produktů. Žádaný 1-N-acylovaný produkt se » oddělí od ostatních produktů chromatograficky a popřípadě je možno vedlejší produkty hydrolyzovat na výchozí kanamycin. Při provádění známých postupů bylo zjištěno, že jakékoli množství 3“-N-acylovaného materiálu jako výsledného produktu odpovídá ztrátě přibližně stejného množství žádaného 1-N-acylovaného .produktu, protože uvedené dva produkty je možno od sebe jen velmi nesnadno oddělit. Zvláště výhodným znakem způsobu podle vynálezu je vznik velmi nízkého množství nežádoucího 3“-N5

207807

-acylovaného produktu, obvykle není možno' tento produkt vůbec zjistit.

Při výrobě l-[L-( — )-a-amino-a-hydroxybutyryljkanamycinu A, který je také nazýván amikacinem, vzniká vždy také 3“-N-acylovaný produkt (BB-K11), 3-N-acylovaný produkt (BB-K29), 6‘-N-acylovaný produkt (BB-K6), polyacylovaný materiál a mimoto zbývá nezreagovaný kanamycin A. To znamená, že při běžné výrobě .amikacinu acylací 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu

A ve vodném prostředí s následným odstraněním ochranné skupiny se' ztrácí obvykle 10 % této látky, obvykle 2,5 kg na 25 kg, v důsledku přítomnosti BB-K11 jako vedlejšího produktu. V případě, že se tato látka připravuje způsobem podle vynálezu, není možno ' shora uvedený . vedlejší produkt v reakční směsi vůbec dokázat.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby 1-N- [ ω-amino-a-hydroxyalkanoyl ] kanamycinu A a B' obecného' vzorce I

kde

R znamená skupinu —OH nebo aminoskupinu, a n znamená celé číslo '0 až 2, jakož i netoxických, z . farmaceutického hlediska přijatelných adičních solí těchto . látek s kyselinami, vyznačující ' se tím, . že se acyluje polysilylovaný kanamycin A nebo B nebo polysilylovaný kanamycin A nebo B, s obsahem odlišné ochranné skupiny od silylové ' skupiny na 6‘-aminoskupině, za předpokladu, že polysilylovaný kanamycin A nebo B, užitý jako výchozí materiál, obsahuje průměrně 4 až 8 silylovýCh skupin v molekule, a polysilylovaný kanamycin A nebo B, užitý jako výchozí materiál a obsahující na 6‘-amlnoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od silylové skupiny obsahuje průměrný počet silylových skupin v molekule 3 až 7, přičemž jako acylačního činidla se užije derivátu kyseliny obecného vzorce II

B \

B—N—CH,— (CH,)n—CH—COOH , ' ' I

OH (Π) kde kde n znamená celé číslo 0 až 2,

B znamená ochrannou skupinu na aminoskupině. ' nebo atom vodíku za předpokladu, že alespoň jeden z těchto symbolů znamená ochrannou skupinu na aminoskupině, a to o-nitrofenylthloskupinu, skupiny vzorců

o II .

CM ОС -,CH-C-OCHt I 3

I

O Q

II II c-/ YJCCC-, .

nebo symboly В spolu tvoří skupinu

kde

R¹ a R², stejné nebo různé, znamenají atom vodíku, fluoru, chloru, bromu, skupinu —NO2, —OH, alkyl nebo alkoxyl vždy o 1 až 6 atomech uhlíku,

X znamená atom chloru, bromu, fluoru nebo jodu, a

Y znamená atom vodíku, chloru, bromu, fluoru nebo jodu, ve v podstatě bezvodém organickém rozpouštědle s následným odstraněním všech ochranných skupin, načež se takto získaný výsledný produkt popřípadě převede na svou netoxickou, z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sul s kyselinou.

Kyselinu obecného vzorce II je možno užít v její ( + ) nebo (—) formě nebo ve směsi obou těchto isomerů, čímž je možno získat odpovídající sloučeniny obecného vzorce I, v němž se l-N-J^-amino-a-hydroxyalkanoyl]skupina nachází rovněž ve formě ( + ) čili (R) nebo ve formě ( —) čili (S) nebo ve směsi obou těchto forem. Jednotlivé formy a jejich směsi spadají do oboru vynálezu. Podle výhodného provedení se užije kyselina obecného vzorce II ve formě (—). V dalším výhodném provedení se kyselina obecného vzorce II užije ve formě ( + ).

Podle dalšího provedení způsobu podle vynálezu se užije jako výchozí látka polysilylovaný kanamycin A nebo B, s výhodou polysilylovaný kanamycin A. Podle dalšího provedení se užije polysilylovaný kanamycin A nebo B, s výhodou polysilylovaný kanamycin A, který obsahuje na 6‘-aminoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od silylové skupiny.

Nejvýhodnější ochrannou skupinou je benzyloxykarbonylová skupina.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se užije jako acylační činidlo ky selina obecného vzorce II ve formě aktivního esteru, s výhodou je aktivním esterem N-hydroxysukcinimidester, N-hydroxy-5-norfornen-2,3-dikarboximidester a N-hydroxyftalimidester. Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu je derivátem kyseliny obecného· vzorce II smíšený anhydrid, s výhodou s kyselinou pivalovou, benzoovou, isobutylkarboxylovou nebo benzylkarboxylovou.

Podle velmi výhodného provedení způsobu podle vynálezu je možno získat l-N-[L-( —}-χ-amino-a-hydroxybutyryl] kanamycin A nebo jeho netoxickou, z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou tak, že se acyluje polysilylovaný kanamycin A smíšeným anhydridem kyseliny L-( — J-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné, s výhodou smíšeným anhydridem s kyselinou pivalovou, benzoovou, isobutylkarboxylovou nebo benzylkarboxylovoou ve v podstatě bezvodém organickém rozpouštědle s následným odstraněním všech ochranných skupin.

Podle dalšího velmi výhodného provedení způsobu podle vynálezu je možno získat 1-N- [ L- (—) -y-amino-a-hydroxybutyryl Jkanamycin A nebo jeho netoxickou, z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou tak, že se acyluje polysilylovaný kanamycin A, který obsahuje benzyloxykarbonylskupinu na 6'-aminoskupině smíšeným anhydridem kyseliny L-( —)-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné, s výhodou smíšeným anhydridem s kyselinou pivalovou, benzoovou, isobutylkarboxylovou nebo benzylkarboxylovou ve v podstatě bezvodém organickém rozpouštědle s následným odstraněním všech ochranných skupin.

Podle dalšího velmi výhodného provedení způsobu podle vynálezu je možno získat 1-N-[ L- {—) -y-amino-3-hydroxybutyryl ] kanamycin A nebo jeho netoxickou, z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou tak, že se acyluje polysilylovaný kanamycin A aktivním esterem kyseliny L-

- (— )-y-benzyloxykarbonylamino-«-hydroxymáselné, s výhodou N-hydroxysukcini.midesterem, N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidesterem nebo N-hydroxyftalimidesterem ve v podstatě bezvodém organickém rozpouštědle s následným odstraněním všech ochranných skupin.

V dalším velmi výhodném provedení způsobu podle vynálezu je možno získat 1-N-

- [ L- (—·) -^-amino-a-hy droxybutyryl ] kanamycin A nebo jeho netoxickou, z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou tak, že se acyluje polysilylovaný kanamycin A, který obsahuje benzyloxykarbonylskupinu na 6‘-aminoskupině aktivním esterem kyseliny L-( — J-^-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné, s výhodou N-hydroxysukcinimidesterem, N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidesterem nebo N-hydroxyftalimidesterem ve v podstatě bezvodém organickém rozpouštědle s ná-

0 760'7 sledným odstraněním všech ochranných skupin.

Jako výchozího materiálu při provádění způsobu podle vynálezu se užívá polysilylovaného· kanamycinu A nebo B s obsahem odlišných ochranných skupin od silylových skupin na 6‘-aminoskupině. Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu je tímto materiálem polysilylovaný kanamycin A nebo B, s výhodou polysilylovaný kanamycin A, který obsahuje průměrně 4 až 8 silylových skupin, s výhodou trimethylsilylových skupin v molekule. Podle · dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu je tímto materiálem polysilylovaný kanamycin A nebo B, s výhodou polysilylovaný kanamycin A, který obsahuje na 6‘-aminoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od * silylové skupiny a jinak obsahuje 3 až 7 silylových skupin, s výhodou trimethylsilylových skupin v molekule.

Pod pojmem „netoxická, z farmaceutického hlediska přijatelná adiční sůl s kyselinou“ sloučeniny obecného vzorce I se rozumí až čtyřnásobná sůl sloučeniny obecného vzorce I, která se získává reakcí s 1 až 4 ekvivalenty netoxické, z farmaceutického hlediska přijatelné kyseliny. Jde například o kyselinu octovou, chlorovodíkovou, sírovou, maleinovou, fosforečnou, dusičnou, bromovodíkovou, · askorbovou, jablečnou a citrónovou a další kyseliny, běžně k tomuto účelu užívané.

Acylace výchozího polystilylovaného kanamycinu A nebo B, který popřípadě obsahuje na 6‘-aminoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od silylové skupiny, se obvykle provádí v organickém rozpouštědle, v němž je výchozí látka dostatečně rozpustná. Výchozí látky jsou vysoce rozpustné ve většině organických rozpouštědel. Vhodným rozpouštědlem je například aceton, diethylketon, methyl-n-propylketon, methylisobutylketon, methylethylketon, acetonitril, glyme, diglyme, dioxan, toluen, tetrahydrofuran, cyklohexanon, methylenchlorid, chloroform, tetrachlormethan a směsi acetonu s butanolem nebo diethylketonu s butanolem. Volba rozpouštědla závisí na užitém výcho- * zim materiálu. Nejvhodnějšími rozpouštědly jsou ketony. Nejvýhodnější rozpouštědlo pro určitou směs reakčních složek je možno snadno určit jednoduchými předběžnými po* kusy.

Vhodným silylačním činidlem pro příklady výchozích polysilylovaných kanamycinů jsou například sloučeniny obecného vzorce IV a V

H (IV)

R⁵

R6—SÍ—X ,

R7

(V) kde

R⁵, R⁶ · a R7 znamenají · atom vodíku, atom halogenu, nižší alkyl, nižší halogenalkyl nebo fenyl, přičemž alespoň jeden z těchto substituentů má odlišný význam od atomu halogenu nebo atomu vodíku,

R4 znamená nižší · alkyl, m · znamená číslo 1 až 2 a

X znamená · atom · halogenu nebo skupinu

R⁹ kde

R8 znamená atom · vodíku nebo nižší alkyl, a

R⁹ znamená atom· vodíku, nižší· alkyl nebo skupinu

R⁵

R6—SÍ— , . R7 kde

R⁵, R® a R7 mají shora uvedený význam.

Specifickými silylačními činidly obecných vzorců IV a V jsou následující sloučeniny:

trimethylchlorsilan, hexamethyldisilazan, triethylchlorsilan, methyltrichlorsilan, dimethyldichlorsilan, triethylbromsilan, tri-n-propylchlorsilan, methyldiethylchlorsilan, dimethylethylchlorsilan, dimethyl-terc.butylchlorsilan, fenyldimethylbromsilan,

7 6.0 7 benzylmethylethylchlorsilan, fenylethylmethylchlorsilan, trifenylchlorsilan, trifenylfluorsilan, tri-o-tolylchlorsilan, tri-p-dimethylaminofenylchlorsilan, N-ethyltriethylsilylamin, hexaetbyldisllazan, trifenylsilylamin, tri-n-propylsilylamin, tetraethyldimethylsilazan, hexafenyldisllazan, hexa-p-tolyldisilazan apod.

Dalšími použitelnými látkami jsou hexaalkylcyklotrisilazany a okta-alkylcyklotetrasilazany. Použitelnými silylačními činidly jsou i silylamidy, například · trialkylsilylacetamidy a bis-trialkylsilylacetamidy, silylmočoviny, například trimethylsilylmočovina a silylureidy. Je možno užít i trimethylsilylimidazol.

Výhodnou silylovou skupinou je trimethylsilylová skupina· a výhodným silylačním činidlem pro zavádění této skupiny jsou hexamethyldisilazan, ' bis(trimethylsilyl)acetamid a ' trimethylsilylacetamid. Nejvýhodnějším je hexamethyldisilazan.

V případě, že se užívá jako výchozí látka polysilylovaný · kanamycin . A nebo B, který obsahuje na 6‘-aminoskupině ochrannou skupinu odlišnou od silylové skupiny, je možno tyto· látky získat buď tak, že se zavede několik silylových skupin do molekuly kanamycinu A nebo B, která je již chráněna na · 6‘-aminoskupině, nebo· se zavádí žádaná ochranná skupina do polohy 6‘ v polysilylovaném kanamycinu A nebo B.

Způsoby zavádění silylových skupin do organických sloučenin včetně některých · . aminoglykosidů jsou známy. Polysilylované kanamyciny, i ty, které obsahují na 6‘-aminoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od silylové skupiny, je možno· vyrobit známými způsoby nebo· způsoby, které jsou v průběhu přihlášky popsány.

Pod pojmem „polysilylovaný kanamycin A nebo B“ se rozumí kanamycin A nebo B, který obsahuje 2 až 10 silylových skupin v molekule. To znamená, že tento· termín nezahrnuje persilylovaný kanamycin A nebo B, který obsahuje 11 silylových skupin . v molekule.

Přesný počet silylových skupin a jejich poloha ve výchozích polysilylovaných kanamycinech, které popřípadě obsahují · na 6‘-aminoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od · silylové skupiny, není znám. Bylo zjištěno, že příliš malý i příliš velký počet silylových skupin snižuje výtěžek žádaného produktu a zvyšuje výtěžek vedlejších produktů. V případě, že je počet silylových skupin skutečně malý nebo skutečně příliš velký, může dojít k tomu, že se vytvoří jen velmi malé množství žádaného . produktu nebo tento produkt nevznikne vůbec. Stupeň silylace, při němž je možno získat nej12 vyšší · výtěžek _ žádaného· produktu, závisí vždy na· specifických reakčních složkách v acylačiním.· stupni. Nejvýhodnější stupeň silylace je· pro každé reakční složky možno stanovit jednoduchými předběžnými pokusy.

V případě, že se připravuje l-N-[L-( — )-y-amino-a-hydroxybutyryl] kanamycin A acylací · polysilylovaného kanamycinu A N-hydroxysukcinimidesterem kyseliny L-( — )-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné v acetonovém. · roztoku, bylo zjištěno, že je možno dosáhnout · dobrých výtěžků žádaného produktu v případě, že se užije polysilylovaný· kanamycin · A, připravený reakcí 4 až

5,5 molu hexamethyldisilazanu na 1 mol kanamycinu A. Je sice možno užít i vyšší nebo nižší množství hexamethyldisilazanu, dojde však k podstatnému snížení výtěžku žádaného produktu v následujícím acylačním stupni. Nejvýhodnější · je užití 4,5. až · 5,0 molů hexamethyldisilazanu · na 1 mol kanamycinu, protože v · tomto . případě je možno· dosáhnout maximálního výtěžku produktu · v acylačním · stupni.

Je zřejmé, že každý mol hexamethyldisilazanu může zavést . do · kanamycinu A nebo B · 2 ekvivalenty trimethylsilylové skupiny. Kanamycin A a B ·· ·mají · celkem 11 poloh (skupiny NHa a OH), · které je možno podrobit · silylaci, přičemž kanamycin A · a · B, který obsahuje na · 6‘-aminoskuplně ochrannou skupinu, odlišnou od silylové skupiny, má těchto poloh 10. To· znamená, že · v případě ..použití 5,5 · molu hexamethyldisilazanu na 1 mol kanamycinu A nebo B je teoreticky možno · podrobit silylaci všechny hydroxyskupiny · a aminoskupiny kanamycinu, kdežto při· 5,0· molech hexamethyldisilazanu je možno úplně · podrobit · silylaci 1 mol kanamycinu A· . nebo B, které obsahují na 6‘-aminoskupině. ochrannou skupinu, · odlišnou od silylové · skupiny. Zdá · se však, · že při použití uvedených · -molárních množství . nedochází k · · úplné silylaci v případě, že se neužije · příliš dlouhé reakční doby, i když je nutno připustit, že při použití katalyzátoru je možno i v kratší době dosáhnout vysokého· stupně silylace.

Katalyzátory silylace značně zvyšují její· rychlost. · Vhodnými katalyzátory · . silylace, které jsou obecně dobře známé, jsou například sulfáty aminů, například kanamycinsulfát, kyselina sulfonová, imidazol a trimethylchlorsilan. Katalyzátory silylace obvykle vyvolají vyšší stupeň silylace, než . „ je · požadován v · průběhu · způsobu · podle·, vynálezu. Kanamycin A nebo B, který má velký počet silylovaných skupin, je možno užít jako výchozí látky při provádění způsobu podle vynálezu v případě, že se podrobí působení desilylačního činidla ke snížení stupně silylace před acylační reakcí.

Dobrých výtěžků výsledného produktu je možno dosáhnout v případě, že se acyluje polysilylovaný kanamycin A, připravený při použití poměru hexamethyldisilazanu ke kanamycinu A 5,5 : · 1. V případě, že se acy207607 luje kanamycin A, silylovaný při poměru hexamethyldisilazanu 7 : 1 nebo· při poměru 5,5 : 1 v případě, že se užije katalyzátoru silylace v acetonovém roztoku pomocí N-hydroxysukcinimidesteru kyseliny · L-( — )-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné, získá se méně než 1 o/o žádaného výsledného produktu. V případě, že se tentýž kanamycin A acyluje týmž acylačním činidlem v acetonovém roztoku, k němuž byla přidána voda v poměru 21 molů vody na 1 mol kanamycinu, což znamená 2,5 % vody [hmotnostní %/objemová %) 1 hodinu před acylací jako desilylační činidlo, bylo možno 1 získat přibližně 40 % žádaného výsledného produktu. Tytéž výsledky bylo možno získat v případě, že se místo vody užilo methanolu nebo jiné látky, schopné provést desily- * laci, jako je například ethanol, propanol, butandiol, methylmerkaptan, ethylmerkaptan, fenylmerkaptan apod.

Přestože je obvyklé užít bezvodé rozpouštědlo při práci se silylovanými materiály, bylo nyní neočekávaně zjištěno, že i tehdy, kdy užitý materiál neobsahuje příliš velké množství silylových skupin, je možno získat přidáním vody do reakčního rozpouštědla před acylací stejně dobré a někdy lepší výsledky výsledného produktu než při použití bezvodého rozpouštědla. Při acylačních reakcích, prováděných v acetonu při obvyklé koncentraci 10 až 20 % (hmotnostní %/objemová · %) polysilylovaného kanamycinu A, bylo zjištěno, že· lze získat velmi dobré výtěžky 1-N- [ L- ( — ) -y-^-^]^^ino-a-hydroxybutyryl] kanamycinu A v případě, že se přidá až 28 molů na 1 mol polysilylovaného kanamycinu A. Při koncentraci 20 % znamená 28 molů vody koncentraci přibližně 8 % vody. Při použití jiné směsi reakčních složek je někdy možno přidat ještě větší množství vody. Acylační reakci je možno· provádět v rozpouštědlech, která obsahují až 40 % vody, přestože při tak vysoké koncentraci vody je · pak nutno zkrátit dobu acylace, aby · nedošlo k příliš velké desilylaci polysilylovaného· kanamycinu A nebo B. Znamená to, že · pojem· „v podstatě bezvodé organické rozpouštědlo“ má zahrnovat rozpouštědla, kte- * rá obsahují až 25 θ/o vody. Výhodné rozmezí je až 20 % vody, ještě výhodnější až 8 % vody a nejvýhodnější až 4 % vody.

Jak již bylo uvedeno, je možno nejvýhod4 nější · stupeň · silylace pro jednotlivé směsi reakčních složek při acylací snadno stanovit běžnými pokusy. Výhodné průměrné množství silylových skupin ve výchozím materiálu se obvykle pohybuje v rozmezí 4 až 8 pro kanamycin A nebo Bav rozmezí 3 až 7 pro · kanamycin A nebo B, který obsahuje na 6‘-aminoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od silylové skupiny, jde však pouze o teoretické úvahy, které netvoří podstatnou část vynálezu.

Teplota a doba acylace nejsou kritickými hodnotami. Teplota se může pohybovat v rozmezí —30 až 100 °C a doba reakce se může pohybovat od 1 hodiny až do 1 nebo více dní. Bylo zjištěno, že reakce obvykle dobře probíhá při teplotě místnosti, a z tohoto důvodu byla při této teplotě prováděna. V · případě, že jsou požadovány maximální výtěžky · nebo selektivní acylace, je nutno tuto acylací provádět při teplotě 0 až 5 °C.

Acylace 1-aminoskupiny polysilylovaného kanamycinu A nebo B, popřípadě obsahujícího na 6⁴-aminoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od silylové skupiny, je možno provádět jakýmkoli acylačním derivátem kyseliny obecného vzorce II, kterým je možno provést acylací primární aminoskupiny. Příklady vhodných acylačních derivátů volné kyseliny jsou anhydrldy, smíšené anhydridy, například smíšený anhydrid s kyselinou alkoxymravenčí, halogenidy kyseliny, její · azidy, · aktivní estery a aktivní thioestery. Volnou kyselinu je možno uvést v reakci s výchozím polysilylovaným · kanamycinem tak, že se volná kyselina nejprve uvádí v reakci s N,N⁴-dimethylchlorforminiumchloridem podle britského· patentu č. 1 008 170 nebo podle publikace Novák a Weichet, Experientia XXI, · 6, 360 (1965) nebo při použití N,N‘-karbonyldiimidazolu nebo · N,N‘-karbonylditriazolu podle jihoafrické přihlášky číslo 62/2684 nebo je možno užít reakčního činidla typu karbodiimidu, zvláště N,N‘-dicyklohexylkarbodiimidu, · N,N‘-diisopropylkarbodiimidu nebo N-cyklohexy-N‘-[2-morfolinethyl)karbodiimidu podle publikace Sheehan a Hess, · · J. A. C. S., 77, 1967 (1955), je možno užít i alkinylaminu [R. · Buijle a H. G. Viege, Angew. Chem. International Edition, 3, 582 (1.96-4·)] nebo isoxazoliové soli [R. B. Woodward, R. A. Olofson a H. Mayer, J. Amer. Chem. Soc., 83, 1010 (1961)] nebo· keteniminu [C. L. Stevens a Μ. E. Munk, J. Amer. Giem. · Soc., ··80, · 4065 (1958)] nebo hexachlorcyklotrifosfatriazinu nebo hexabromcyklotrifosfatriazinu podle US patentu číslo 3 651050, difenylfosforylazidu [DDPA, J. Amer. Chem. Soc., 94, 6203—6205 (1972)], diěthylfosforylkyanidu [DEPC, · Tetrahedron Let-ters č. 18, · str. 1595 až 1593 (1973)] nebo difenylfosfitu [Tetrahedron Letters č. 49, str. 5047 až 5050 19*^22)]. Dalším ekvivalentem kyseliny je odpovídající azolid, tj. amid odpovídající kyseliny, v níž atom · dusíku amidové skupiny je současně členem· pětičlenného kruhu, který obsahuje alespoň 2 atomy dusíku, jako je imidazol, · pyrazol, triazoly, · benzimidazol, · benzotriazol a substituované deriváty těchto látek. Je zřejmé, že někdy může být žádoucí nebo nutné chránit hydroxylovou skupinu acylačního derivátu kyseliny vzorce II například v případě, že se jako acylačního· derivátu užije halogenidu · kyseliny. Ochranu hydroxylové skupiny je možno zajistit známým způsobem, například užitím benzyloxykarbonylskupiny, acetylací, silylací apod.

Po skončení acylační reakce se odstraňují všechny' Ochranné skupiny známým způsobem, čímž se získá žádaný výsledný pro dukt obecného vzorce I. Silylové skupiny je například možno snadno odstranit hydrolýzou ve vodě, s výhodou při nižším. pH. Ochrannou skupinu В acylačního derivátu kyseliny obecného vzorce II a ochrannou skupinu na 6‘-aminoskupině polysilylovaného výchozího kanamycinu, v případě, že tato skupina je přítomna, je možno rovněž odstranit známými způsoby. Znamená to, že terc.butoxykarbonylcwou skupinu je možno odstranit užitím kyseliny mravenčí, benzyloxykarbonylskupinu katalytickou hydrogenací, 2-hydroxy-l-naftylkarbonylovou skupinu je možno odstranit kyselou hydrolýzou, trichlorethoxykarbonylovou skupinu působením práškovaného zinku v ledové kyselině octové, ftaloylovou skupinu působením hydrazinhydrátu v ethanolu za současného zahřívání apod.

Výtěžky výsledných produktů je možno stanovit různým způsobem. Po odstranění všech ochranných skupin a po chromatogr-afii na sloupci přípravku CG-50 v NHt⁺ formě je možno stanovit výtěžek amikacinu tak, že se krystalická pevná látka z odpovídajících frakcí izoluje nebo je možno přítomnost této látky prokazovat mikrobiologickým způsobem, a to turbidimetricky nebo na plotnách při použití příslušných frakcí. je možno užít i Jiných způsobů, například kapalinové chromatografie neredukované acylační směsi, tj. vodného roztoku, získaného po hydrolýze silylových skupin a po odstranění organického rozpouštědla, avšak před hydrogenolýzou prováděnou к odstranění zbývajících ochranných skupin. Tato reakce není přímou reakcí na amikacin nebo BB-K29, jde o reakci, jíž je možno zjistit odpovídající mono- nebo di-N-chráněné sloučeniny.

Při provádění těchto zkoušek bylo užito přístroje pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii Waters Associates ALC/GPG 244 a detektoru absorbance Waters Associates Model 440 při použití sloupce o rozměru 30 cm x 3,9 mm μ-Bondapak C-18. za následujících podmínek:

Mobilní fáze:

25% 2-propanol,

75% 0,01 M octan sodný při pH 4,0. ·»

Rychlost průtoku:

ml/min. Detektor:

spektrometr pro stanovení ultrafialového světla při 254 nm.

Citlivost: _ 0,04 AUFS.

Ředidlo:

dimethylsulfoxid.

Užité množství:

μΐ.

Koncentrace:

mg/ml.

Rychlost záznamu byla měněna, obvykle však bylo užíváno rychlosti přibližně 2,5 cm za 2 minuty. Při shora uvedených podmín kách bylo možno získat v ultrafialovém světle kvantitativní měřitelné vrcholy. Výsledky těchto analýz budou dále uváděny v textu jako HLPC-zkoušky.

Aby bylo zabráněno trvalému opakování složitých chemických názvů, budou v průběhu přihlášky užívány následující zkratky:

AHBA — kyselina L-( — )-y-amino-«-hydroxymáselná

BHBA — N-benzyloxykarbonylderivát AHBA HONB — N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximid

NAe (nebo BHBA-„ONB“J — aktivovaný N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidester BHBA

HONS — N-hydroxysukcinimid

SAE (nebo BHBA-„ONS“) — aktivovaný N-hydroxysukcinimidester BHBA DCC — dicyklohexylkarbodiimid DCU — dicyklohexylmočovina HMDS — hexamethyldisilazan BSA — bis(trimethylsilyl)acetamid MS A — trimethylsilylacetamld TFA — trifluoracetyl t-BOC — terc.butyloxykarbonyl.

„Dicalit“ je přípravek, sestávající z infusoriové hlinky, dodávaný Great Lakes Carbon Corporation.

„Amberlit CG-50“ je slabě kyselá kationtoměničová pryskyřice typu karboxylové kyseliny a polymethakrylové kyseliny, dodávaná ke chromatografickým účelům firmou Rohm a Haas Co.

,,μ-Bondapak“ je náplň kolon dodávaná pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii firmou Waters Associates.

Pojmy „nižší alkyl“ a „nižší alkoxyl“ znamenají alkylové a alkoxylové skupiny, které obsahují 1 až 6 atomů uhlíku.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, v nichž jsou všechny teplotní údaje uváděny ve stupních Celsia.

Příklad 1

Způsob výroby l-N-[.L-( —J-y-amino-a-hydroxybutyryl] kanamycinu A (amikacinj selektivní acylací poly(trimethylsilyl)-6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A v bezvodém diethylketonu g (24,24 molu) 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A se uvede v suspenzi v 90 ml· bezvodého acetonitrilu a suspenze se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem v dusíkové atmosféře. Pak se pomalu v průběhu 30 minut přidá 17,5 g (108,48 molu] hexamethyldisilazanu a výsledný roztok se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem 24 hodin. Pak se odstraní rozpouštědlo ve vakuu při teplotě 40 ^CC a výsledná látka se suší při tlaku 1,33 kPa, čímž se získá 27,9 g bílé amorfní pevné látky ve výtěžku 90,71 o/o, přepočítáno na 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A s 9 silylovými skupinami.

Získaná pevná látka se. rozpustí ve 150 ml bezvodého diethylketonu ' při · teplotě 23 °C. Pak se pomalu za energického· míchání v průběhu 30 minut přidává 11,05 g (26,67 mmolu) N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidesteru kyseliny L-( — j-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné v roztoku ve 100 ml bezvodého diethylketonu při teplotě 23· °c. Roztok se míchá při teplotě 23 °C po dobu 78 hodin. Žlutý čirý roztok o pH 7,0 se zředí 100 ml vody a pH směsi se upraví na hodnotu 2,8 přidáváním 3 N kyseliny chlorovodíkové, načež se směs míchá energicky 15 minut při teplotě 23 °C. Vodná fáze se oddělí a organická fáze se extrahuje 50 ml vody o pH 2,8. Vodné fáze se slijí, promyjí se 50 ml ethylacetátu a získaný roztok se vloží do Parrovy nádoby o obsahu 500 ml s .obsahem 5 g 5% paládia na . aktivním . uhlí, načež se provádí redukce 2 hodiny při teplotě 23 °C při tlaku vodku 0,35 MPa. Směs se zfiltruje přes vrstvu přípravku Dicalit, který se pak .promyje ještě 30 ml vody. Bezbarvý filtrát se zahustí · ve vakuu při teplotě 40 až 45 °C na objem 50 ml. Získaný roztok se pak nanese na sloupec o· rozměrech 5 x 100 cm s obsahem přípravku CG-50 v NH4+ formě. Sloupec se promyje 100 ml vody a pak se nezreagovaný kanamycin A, 3- [ L- (— ] -χ-amino-a-hydr oxybutyryl ] kanamycin A (BB-K29) a amikacin vymývají 0,5 M hydroxidem amonným. Polyacylovaný materiál se izoluje přidáním 3 N hydroxidu amonného. K průkazu eluce aktivního materiálu se užívá biologické zkoušky, chromatografie na · tenké vrstvě a zjištění optické otáčivosti. Objem jednotlivých frakcí, jejich otáčivost a množství získané látky spolu s výtěžkem po odpaření každé frakce do· sucha jsou uvedeny v následující tabulce:

Materiál Objem (ml) kanamycin A1000

BB-K291750 amikacin2000 polyacylované deriváty900

a578	Hmotnost (g)	Výtěžek (%)
+ 0,115	0,989	9,15
+ 0,24	4,37	32,0
+ 0,31	6,20	47,4
+ 0,032	0,288	2,0

Vysokotlakou kapalinovou chromatografií bylo prokázáno, že odložená vrstva ethylketonu obsahovala ještě 3 až 5· % amikacinu.

6,20 g surového amikacinu se rozpustí ve 20 ml vody a. roztok se zředí 20 ml methanolu, načež se . přidá 20 ml isopropanolu k zahájení krystalizace. Tímto způsobem se ve výtěžku 45,8 % získá 6,0 g krystalického amikacinu.

Příklad 2

Způsob výroby l-N-(L-( — )-y-amino-a-hydroxybutyryl ] kanamycinu A (amikacin) selektivní acylací póly (trimethylsilyl) -6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A v bezvodém acetonu

103 g (0,081 molu) poly(trimethylsilyl)-6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A připraveného způsobem, podle příkladu 1, přepočítáno na 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycin A (silyl)g se rozpustí ve 100 ml bezvodého acetonu při teplotě 23 °C. Pak se přidá 35,24 g (0,085 molu) N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboxyimidesteru kyseliny L- (—) -χ-benzy loxykarbonylamino-a-hydroxymáselné v roztoku ve 180 ml bezvodého acetonu při teplotě 23 ^CC pomalu za energického míchání k roztoku póly (trimethylsilyl )-6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A v průběhu 15 minut. Roztok se míchá při teplotě 23 °C po dobu 20 hodin v atmosféře dusíku. Vznikne bledě žlutý, čirý roztok o pH 7,2, který se zředí 100 ml vody. Směs se upraví na pH 2,5 přidáním 3 N kyseliny chlorovodíkové a pak se míchá dalších 15 minut při teplotě 23 °C. Aceton se odstraní při teplotě 35 °C destilací s vodní párou ve vakuu. Pak se roztok vloží do Parrovy nádoby o obsahu 500 ml spolu s 10 g 5% paládia na aktivním uhlí jako katalyzátoru a směs se redukuje 2 hodiny při . teplotě 23 °C a při tlaku vodíku 0,28 MPa. · Pak se směs zfiltruje přes vrstvu ' infusoriové · hlinky, která se pak promyje ještě 50 · ml vody. · Po zahuštění · na přibližně jednu třetinu · původního objemu se roztok o pH . 6,9 až 7,2 nanese na vrchol sloupce o · rozměrech ·6 x 110 cm s obsahem přípravku CG-50 .v NH4⁺ formě a sloupec se · vymývá vodou ·se ' stoupajícím množstvím hydroxidu ' amonného.: až 'do· koncentrace · 0,6 N pro ' vymývání amikacinu. Ke sledování eluce této· látky se . užije automatického · polarimetru. Současně, se· · provádí vyhodnocení chromatografií na tenké vrstvě. 'Frakce, které obsahují amikacin, se slijí a zahustí na koncentraci 25 až ·30 %. Roztok se zředí stejně· .velkým množstvím methanolu, načež se přidají 2 objemy isopropanolu k vyvolání krystalizace. Tímto způsobem se ve výtěžku 40 ' ' % získá 18,2 g krystalického amikacinu.

Izoluje se rovněž 12 % kanamycinu A, 40 procenty BB-K29 a 5 % polyacýlovanéno kanamycinu, úhrnem se tedy izoluje 97 % produktu.

Příklad 3

Způsob výroby l-N-[L-( — )-y-amino-α-nydroxybutryl]kanamycinu A (amikacin) selektivní acylací poly(trimetnylsilyl)kanamycinu A při zavádění ochranných skupin přímo· v reakční směsi

A. Póly (trimethylsilyl)kanamycin A g (37,15 mmolu) kanamycinu A ve volné formě se uvede v suspenzi ve 200 ml bezvodého acetonitrilu a suspenze se zahřívá na teplotu varu pod zpětným· . chladičem. Pak se přidá v průběhu 30 minut 29,8 g (184,6 mmolu) hexamethyldisilazanu ' a výsledná směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem 78 hodin, čímž se získá čirý světle žlutý roztok. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, Čímž se získá 43 g amorfní pevné látky, výtěžek je 94 °/o, propočítáno· jako kanamycin A (silyljio.

B. 1-N- [ L- (—) -y-amino-a-hydroxybutyryl ] kanamycin A

5,56 g (20,43 mmolu) kyseliny p-(benzyloxykarbonyloxy)benzoové se uvede v . suspenzi v 50 ml bezvodého acetonitrilu při teplotě 23 °C. Pak se přidá za energického míchání 8,4 g [41,37 mmolu) N,O-bis-trimethylsilylacetamidu. Roztok se udržuje 30 minut na teplotě 23 . °C a pak se přidává v průběhu 3 hodin za energického míchání k roztoku, který .obsahuje 21,5 g (17,83 mmolu) poly(trimethylsilyl)k-anamycinu A, propočítáno na sloučeninu s 10 silylovými skupinami v 75 ml bezvodého acetonitrilu při teplotě 23 °C. Směs se · míchá .4 hodiny, pak se rozpouštědlo · odstraní ve. . vakuu při · teplotě 40 °C a · olejovitý zbytek se rozpustí v 50 ml bezvodého acetonu při teplotě . 23 °C.

8,55 g . (20,63 mmolu) N-hydroxy-5-nor- bornein-2,3-dikarboimidesteru . kyseliny L- (—)-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydro- . xymáselné (NAE) ve. 30 · ml . acetonu . se přidá ke svrchu uvedenému roztoku · v · průběhu 5 minut. Směs · se udržuje · 78 hodin . na teplotě 23 °C. Pak se roztok . zředí 100 ml . vody a pH se z hodnoty 7,0 sníží na hodnotu 2,5 přidávání 6 N kyseliny . chlorovodíkové. Získaná směs . se vloží .do· Parrovy nádoby . o obsahu . 500 ml současně se 3 g 5% paládia na aktivním uhlí a pak se redukuje 2. . hodiny při teplotě 23 cq .a při . tlaku . vodíku 0,28 MPa. . Pak se směs zfiltruje vrstvou infusoriové hlinky, která se ještě promyje 20 ml vody. Filtrát . a promývací voda v celkovém množství 168 ml se .podrobí mikrobiologickým . zkouškám při použití E. coli, čímž je možno. prokázat přibližně 11 400 ^íg/ml amikacinu, což znamená výtěžek 19

Příklad 4

Způsob výroby l-N-[L-( — )-y-amino-a-hydroxybutyryl] kanamycinu A (amikacin) selektivní acylací póly (trimethylsllyl) kanamycinu A

A. Póly (trimethylsilyl) kanamycin A

Suspenze 10 g (20,6 mmolu) kanamycinu

A ve 100 ml bezvodého. acetonitrilu. a 25 ml (119 mmolů) 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazanu se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem 72 hodin. Získá .se světle žlutý, čirý roztok, který se destiluje ve vakuu do· sucha . při teplotě 30 .až 40 ^QC. Tímto způsobem . se získá 21,3 g poly(trimethylsilyl)kanamycinu A ve formě špinavě bílého amorfního· prášku ve výtěžku 85 %, propočítáno· na kanamycin A s obsahem 10 silylových skupin.

B. 1-N- [ L- (—) -y-amino-a-hydroxybutyryl ] kanamycin A

K roztoku 2,4 g (2,0 mmolů) poly(trimethylsilyl jkanamycinu A ve 30 .ml bezvodého acetonu se pomalu . přidá 2,0 mmolů N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidoesteru kyseliny L- ( — ) -y-benzyioxykarbonylamino-a-hydroxymáselné (NaE) v 10 ml bezvodého acetonu při teplotě 0 až 5 °C. Reakční směs.s.e . . míchá . týden... .při. teplotě .23.5-0, pak se . odpaří ve vakuu . do sucha . při . teplotě lázně 30 .až 40 3Q. K odparku se . přidá 60 ml vody a pak 70 ml methanolu k . získání roztoku. Vzniklý roztok . se . okyselí na - . pH 2,0 přidáním 3 N kyseliny chlorovodíkové a pak . se . redukuje . 2 . hodiny při . tlaku vodíku 0,35. MPa při použití '500 mg .5% ..paládia na aktivním uhlí . jako katalyzátoru. .Získaný materiál se zfiltruje, filtráty a promývací . kapalina. .se slijí a . podrobí . mikrobiologickým zkouškám při použití E. coli, čímž je možno prokázat . amikacin ve . výtěžku 29,4 %.

P^íkladb

Způsob výroby amikacinu selektivní N-acylací polytrimethylsilyl-6‘-Nbenzyloxykarbonylkanamycinu A v bezvodém. acetonu

I. Celkový popis . . ... '...·

Silylací . O^N-benzoKykarbonylkánamycinu A v acetonitrilu při použití hexamethyldisilazanu (HMDS) se získá 6‘-N-benzoxykarbonylkanamycin A s 9 silylovými skupinami jako· . meziprodukt I. Tento materiál je dobře rozpustný ve většině organických . rozpouštědel. Acylací působením . NAE v bezvodém acetonu při teplotě 23 cq a 5% molárního přebytku NAE vzhledem k výchozímu derivátu kanamycinu A se získá směs, která obsahujepouze benzoxykarbonyl (Cbz) derivátu amikacinu a BB-K29, nezreagovaný kanamycin A a malé množství polyacylovaného materiálu. Nebylo možno prokázat BB-Kll. Elucí acylační směsi po redukci a zpracování .na sloupci . CG-50 v NH4⁺ formě * a .při použití stoupajícího. množství hydroxidu amonného .se získá čistý amikacin ve výtěžku 40 %.

II.

A.

+ (CH3)3Si—NH—S1(.CH3)3

HMDS (161,4)

B.

DCC (206) aceton

BHBA (253,4) HONB (179,2)

OH o

I II

DCU + (CU^U£CH~C~ o

®NAE(414,6) (224,3)

С.

diCbzamtkacln (854)

aceton ------> <

^CC diCbzBB—K29 +

/-----------------amikacin BB-K29 4*' №

5% Pd/C /4.

6‘-Cbz-l,3-diBHBA-kanamycin A +

6‘~Cbz: kanamycln A к

1,3-diAříBA-kanamycin A + kanamycin A (585,62) (484,5)

arnik acin

III. Materiály

Hmotnost (g) Objem (ml) Moly

6‘-N-Cbz*) kanamycin A	50	0,081
HMDS	58,9	76,5	0,365
acetonitril		300 .
BHBA	21,5		0,085
HONB	15,2		0,085
DCC	17,48		0,085
aceton		260
CG-50 (NHi+)		3000
methanol		podle potřeby
IPA		podle potřeby

*) Cbz = benzoxykarbonyl

IV. Bezpečnostní opatření .

6‘-N-Cbz kanamycin A — .přímé informace nejsou k dispozici, je nutno vyvarovat se styku s práškovitým materiálem acetonitril — postup stejný jako u kyanidů, je nutno zabránit vdechování par, může způsobit podráždění kůže hexamethyldisilazan (HMDS) — všestranně dráždivá látka, nutnost opatrného zacházení

6‘-N-Cbz kanamycin A (silyl)9 — nejsou k dispozici informace, je zapotřebí se vyvarovat styku s práškovitým materiálem,

BHBA — toxicita nebyla stanovena, je nutno· se vyvarovat styku s pevným materiálem

HONB — toxicita není známa, stačí běžná, bezpečnostní opatření

DCC — látka, silně dráždící kůži i oči. Je nutno vyvarovat se vdechování par, látka Je velmi toxická aceton — je hořlavý, po vdechování še dostavuje bolest hlavy, únava, později vzrušení, podráždění průdušek a ve velkém množství narkóza

NAE — informace nejsou k dispozici, užívá se však vždy v acetonovém roztoku methanol — je hořlavý, k otravě je možno dospět nejen požitím, nýbrž i vdechnutím nebo vstřebáním kůží.

isopropanol — je hořlavý, po požití nebo vdechnutí většího množství par dochází k bolesti hlavy, obluzení, zvracení a · narkóze hydroxid amonný — páry jsou toxické, je možno. pracovat v masce a vyvarovat . se styku s kapalinou

CG-50 (NHd⁺j — údaje o toxicitě nejsou k dispozici, stačí běžná bezpečnostní opatření.

V. Provedení

A. Způsob výroby 6‘-N-eenzyloxykarbonylkanamycinu A (silyljg [6‘-N-Cbz kanamycin A (silyl)9j

1. 50 g 6‘-N-benzyloxykarbonylkanamycinu A (KF < 4 '%) se uvede v suspenzi ve 300 ml acetonitrilu (KF < 0,01 %). Směs se uvede na teplotu 74 °C pod zpětným chladičemž přičemž se suspenzí nechá procházet .proud bezvodého dusíku.

2. v průběhu 30· minut se pomalu přidává

75,8 ml hexkmethyldisilkzanu (HMDS). Dojde k vytvoření čirého. roztoku za současného vývinu plynného amoniaku.

3. Směs se · zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem 18 až 20 hodin v dusíkové . atmosféře.

4. Čirý, světle . žlutý roztok se zahustí za sníženého tlaku při teplotě lázně 4 . až 50 °C na pěnovitou pevnou látku. Získá. se 89 až 92 g sloučeniny s 9 silylovými skupinami, což znamená výtěžek 90 až 94 % teoretického množství.

Poznámka: Při .použití dalších rozpouštědel se tato pevná · látka obvykle neizoluje, nýbrž se používá. přímo k acylaci.

B. Způsob výroby N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikkrboximidesteru kyseliny L-( — )-f-bennyloxyУarbonylкmino-«-hydrooymáselné (NAE)

1. 21,5 g kyseliny L- ( — ) -/-benzyloxykar- bonyl.kmino-.k-hydroxymáselné (BHBA) . se rozpustí ve 100 ml bezvodého acetonu při teplotě 23 °C, načež se· přidá 15,2 N-hydroxy-5-norbornen-2,3-diУkrboximidu (HONB).

Dojde k vytvoření roztoku.

2. v · průběhu 30 minut se přidá roztok 17,48 g dicyУloheoylkкrbodiimidu (DCC) v 50 ml acetonu za stálého· míchání. Teplota stoupne na přibližně 40· °C v průběhu přidávání za současného vysrážení dicyklohexylmočoviny (DCU).

3. Suspenze se míchá 3 až 4 hodiny, přičemž dojde k ustálení teploty . na . hodnotě 23 až 25 °C.

4. Derivát močoviny se odstraní filtrací, filtrační koláč se promyje 30 ml acetonu. Filtrát a promývací materiál se odloží pro acylační stupeň.

C. Acylace 6‘-N-Cbz kanamycinu A (silyl)g

1. 6‘-N-Cbz kanamycin A (silylj9 . izolovaný v části A, stupni 4 se rozpustí ve 100 ml bezvodého acetonu při teplotě · 23 . až 24 °C.

2. Za energického míchání se pomalu přidává roztok NAE, připravený v části · B v průběhu 15 minut. Teplota postupně· stoupne přibližně na 40 °C. Pak se nechá teplota roztoku ustálit na hodnotě 23 °C a směs se dále míchá 18 až 20 hodin v dusíkové atmosféře.

3. Přidá se 100 ml vody a pH, které původně má hodnotu 6,9 až 7,2, se sníží na hodnotu 2,2 až 2,5 přidáváním 6 N kyseliny chlorovodíkové. Směs se míchá 15 minut při teplotě 23 °C.

Poznámka: Může se vytvořit druhá vrstva, tento· jev však neovlivňuje další zpracování směsi.

4. Aceton se odstraní za sníženého tlaku při teplotě lázně · 30 až 35 °C. Koncentrát se přenese do vhodné hydrogenační nádoby, která se předem vymývá dusíkem. Pak se přidá 10 g 5% · paládia na aktivním uhlí jako katalyzátor a hydrogenace se provádí 2 až 3 hodiny při tlaku 0,28 MPa.

5. Směs se zfiltruje vrstvou přípravku Dicalit, hydrogenační nádoba se vymyje a filtrační koláč se rovněž vymyje dalšími 50 ml vody.

6. Filtrát a promývací voda se zahustí na jednu třetinu objemu (50 ml] ve vakuu při 40 až 45 °C.

7. Je nutno kontrolovat pH, které se má pohybovat v rozmezí 6,9 až 7,2. V případě, že pH je nižší, je nutno provést úpravu přidáním 1 N hydroxidu amonného'. Pak se směs nanese na sloupec o rozměrech 6 x 110 cm s obsahem CG-50 (NH4⁺).

8. Sloupec se promyje 1000 ml deionizované vody a pak se vymývá 0,5 až 0,6 N hydroxidem při použití automatického polarimetru ke sledování eluce. Jednotlivé složky se vymývají v tomto pořadí:

zbývající kanamycin A,

BB-K29 a amikacin.

V žádné acylační reakční směsi nebylo možno prokázat BB-K11. Polyacylovaný materiál, tj. 1,3-diAHBA analog kanamycinu A je možno izolovat promytím sloupce 3 N hydroxidem amonným.

9. Frakce amikacinu se slijí a zahustí se tak, aby obsahovaly 25 až 30 % pevných látek. Pak se koncentrát zředí stejným objemem methanolu a krystalizace se zahájí přidáním¹ malých krystalků amikacinu.

10. V průběhu 2 hodin se pomalu přidávají 2 objemy isopropanolu za energického míchání, načež se směs nechá krystalizovat 6 až 8 hodin při teplotě 23 °C.

11. Pevná látka se oddělí filtrací, promyje se 50 ml směsi vody, methanolu a isopropanolu v poměru 1:1:2 a nakonec 25 ml isopropanolu.

12. Krystalky se suší ve vakuu při teplotě 40 °c po dobu 12 až 16 hodin. Tímto způsobem se získá 17,3 až 19,0 g amikacinu ve výtěžku 38 až 42 %. Amikacin má následující vlastnosti:

Chromatografie na tenké vrstvě •Při použití směsi chloroformu, methanolu, hydroxidu amonného a vody v poměru 1: :4:2:1 a silikagelových desek (Quantum Industries) o rozměrech ‘5x 20 cm, dojde к vytvoření jediné zóny, jak je možno prokázat ninhydrinem (R_f = 0,4).

Specifická otáčivost

HzO 0,1 Μ NH4OH 0,1 M H2SO4 (a]589²³ + 101,6 + 101,9 + 103,5

C = 1,0 0/0.

13. Výtěžek BB-K29 v tomto systému byl rovněž 39 až 42 %, směs obsahovala 10 až 14 % kanamycinu A a přibližně 5 % 1,3-di-AHBA kanamycinu A, bylo tedy možno získat zpět přibližně 95 % původních materiálů.

P ř í к 1 a d 6

Způsob výroby amikacinu selektivní acylací polytrimethylsilyl-kanamycinu A v bezvodém acetonu

I. Celkový popis

Silylace kanamycinu A ve volné formě v acetonitrilu při použití hexamethylsilazanu (HMDS) vede ke vzniku polytrimethylsilyl kanamycinu A. Míra silylace není dosud známa, avšak předpokládá se, že kanamycin A obsahuje 10 silylových skupin. Polysilylovaný kanamycin A obsahuje 10 silylových skupin. Polysilylovaný kanamycin A je dobře rozpustný ve většině organických rozpouštědel. Při acylaci SAE v bezvodém acetonu při teplotě 23 °C a při použití molárního poměru SAE ke kanamycinu A 1: 1 vzniká směs, která obsahuje Cbz-deriváty amikacinu а BB-K29, obvykle v poměru 2 až 3:1. Mimoto obsahuje směs přibližně 5 až 8 % BB-K6, 15 až 20 % nezreagovaného kanamycinu A a přibližně 5 až 10 % polyacylovaného materiálu. Stejně jako v předchozích případech acylace polytrimethylsilyl 6‘-N-benzoxykarbonylkanamycinu A nebylo možno zjistit v žádném vzorku BB-Kll. Acylační směs v acetonu byla podrobena redukci a běžnému zpracování s následnou chromatografií na sloupci CG-50 (N'H4⁺ ) při použití 0,5 N hydroxidu amonného, čímž byl získán izolovaný krystalický amikacin ve výtěžku 3 až 39 %.

он O №

kanamycin A (silyl)io

CísHneOiiNlSiio (1206,35)

В.

он

ChzNH (СН^-СН-СООН + HO-N

ВНВА (253,4)

Н—HOS (206,3) (115,9)

EtOAc

DCU + CbzNH (CH,) (2) SAE (350,33) (224,3)

II

C.

Cbz amikačin (720) © ® ^aceton <

°C

Cbz BB-K29

Cbz BB-K6 +

H2 kanamycin A

5% Pd/C polyacylovaný 1,3-dlBHBA-kanarnycin A amikačin + BB-K29 + BB-K6 + 1,3-diAHBA-kanamyčln A j kanamycin A (585,62) (722,76)

CG-50(NHf amikacin

III. Materiály

Hmotnost (g) Objem (ml) Moly

kanamycin A ve volné· formě	50	0,103
HMDS (specifická hmotnost
0,774)	86,68	112	0,537
acetonitril		600
SAE	35,03		0,10
aceton		850
CG-50 (NH1+)		3000
methanol		podle potřeby
IPA		podle potřeby

IV. Bezpečnostní opatření

Kanamycin A ve volné formě — stačí běžná bezpečnostní opatření kanamycin A (silyl)io — nejsou k dispozici přímé informace, stačí běžná bezpečnostní opatření další materiály — údaje jsou uvedeny v příkladu 5.

V. Provedení.

A. Způsob výroby kanamycinu A (silyl)io

1. 50 g volného kanamycinu A (KF · 2,5 až

3,5 %) se uvede v suspenzi v 500 ml acetonitrilu (KF < 0,01 %). Směs se zahřívá na teplotu 74 °C pod zpětným chladičem, přičemž se suspenzí nechá procházet proud bezvodého dusíku.

2. V průběhu 30 minut se pomalu přidává 112 ml hexamethyldisilazanu (HMDS). V průběhu 4 až 5 hodin dojde k vytvoření účinného- roztoku za současného vývinu plynného amoniaku.

3. Směs se zahřívá na teplotu varu- pod zpětným chladičem 22 až 25 hodin v dusíkové atmosféře.

4. Čirý bledě žlutý -roztok se zahustí ve vakuu při teplotě 40 °C na sirupovitý zbytek.

Pak se přidá dalších 100 ml acetonitrilu, rozpouštědlo se odpaří a odparek se suší za vysokého podtlaku 3 až 6 - hodin. Ve výtěžku 90 až 95 % teoretického· množství, přepočítáno na kanamycin A (silyl)io se získá 109 až 115 g bělavého· amorfního prášku.

B. Způsob výroby N-hydroxysukcinimidesteru kyseliny L-( — )-a-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné [ SAE)

1. 100 g kyseliny L-( — )-a-benzyloxykarbonylamíno-a-hydroxymáselné (BHBA) a 45,38 g N-hydroxysukcinimidu (N-HOS) se rozpustí v 1300· ml ethylacetátu (KF < 0,05 procenta) za stálého míchání při teplotě 23 °C.

2. 81,29 g dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) se rozpustí ve 400 ml ethylacetátu (KF < < 0,05 ·%) při teplotě 23 ^QC. Za energického míchání se tento· roztok přidá v průběhu 30 minut k roztoku z prvního stupně. Teplota stoupne na 40 až 42°C za současného vysrážení dicyklohexylmočoviny (DCU).

Suspenze se míchá 3 až 4 hodiny, v průběhu této doby se teplota ustálí na hodnotě 23 °C.

3. Dicyklohexylmočovina se oddělí filtrací, filtrační koláč se promyje 250 ml ethylacetátu (KF < 0,5 %). Filtrační koláč se odloží, filtrát a promývací kapalina se zpracují v dalším· stupni.

4. Filtrát -a promývací kapalina se zahustí ve vakuu při teplotě 30 až 35 °C na objem 500 ml. Dojde k vykrystalizování určitého podílu pevné látky.

5. Koncentrát se přenese do vhodné nádoby a za energického míchání se přidá 100 ml heptanu. V -případě potřeby se přidají také malé krystalky SAE. Ke krystalizaci dojde téměř okamžitě. Suspenze se míchá ještě 30 minut při teplotě 23 °C.

6. V průběhu 30 -minut se přidá 400 ml heptanu a suspenze -se míchá dalších 4 až 5 hodin při teplotě 23 °C.

7. Pevný podíl se oddělí filtrací a filtrační koláč se promyje 200 ml směsi heptanu a ethylacetátu v poměru 3:1a pak ještě 100 ml heptanu.

8. Směs se suší ve vakuu při teplotě 30 až 35 ^CC po- dobu 18 až 20 hodin. Ve výtěžku 80 až 95 % se získá 110,1 až 131,4 g pevné látky.

Teplota tání je 119 až 120 °C při měknutí při teplotě 114 °C.

Chromatografie na tenké vrstvě při použití směsi acetonu, benzenu a kyseliny octové v poměru 4 : 12 : 1, stanovení se provádí 1% vodným roztokem manganistanu draselného.

Rf je 0,7 pro- SAE a 0,2 pro BHBA na silikagelové desce o rozměrech 2 x 10 cm (Analtech lne.).

C. Acylace kanamyclnu A (silyl)io

1. Kanamycin A (silyl)io, izolovaný v čás ti A., stupni 4, se rozpustí v 500 ml bezvodého acetonu při teplotě 23 oc.

2. Za energického- míchání se rychle přidá 35,03 g SAE, připraveného podle části B ve formě ΙΟθ/ο roztoku v bezvodém acetonu v průběhu 5 až 10 minut. Teplota stoupne přibližně -o 5 °C. Roztok se nechá ustálit na teplotě 23 °C a dále se míchá 18 až 20- . hodin.

3. Světle -oranžový, čirý roztok se zředí 400 ml vody a pH, jehož původní hodnota byla 7,0 až 7,5, se sníží na hodnotu 2,2 až

2,5 přidáním. 3 N kyseliny chlorovodíkové. Čirý roztok -se míchá 15 až 30 minut při teplotě 23 °C.

4. Aceton se odstraní ve vakuu při - teplotě lázně 30 až 35 C, někdy se v tomto- stupni vysráží malé množství materiálu, které nečiní potíží při dalším zpracování. Koncentrát se přenese do vhodné dehydrogenační nádoby a přidá se 10- g 5% paládia na aktivním uhlí - jako- katalyzátor, načež se směs podrobí hydrogenaci 2 až 3 hodiny při tlaku 0,35 MPa.

5. Směs se zfiltruje vrstvou -přípravku Dicalit, hydrogenační nádoba se vymyje stejně jako- filtrační koláč ještě 2 x 50 ml vody.

6. Filtrát -a promývací kapalina se - zahustí ve vakuu při teplotě- 40' až 45 ^C'C na přibližně jednu -třetinu původního objemu (150 až ' 165 ml).

7. V tomto· stupni má -sm.ěs pH - 6,0 až 7,0. Směs se nanese na sloupec ' o- rozměru 6 x x 110 - cm s obsahem přípravku CG-50 (NH4⁺).

8. Sloupec -se vymyje' -1000 ml ' deionizované vody a pak se promývá 0,5 - N hydroxidem amonným za - použití automatického polarimetru - - ke sledování eluce.' Jednotlivé složky ' směsi se vymývají v tomto pořadí:

zbylý kanamycin A, BB-K6, BB-K29 a amikacin. V žádném pokusu nebylo- možno- prokázat přítomnost' BB-K11.

9. Frakce, které obsahují amikacin, se slijí a zahustí tak, aby obsahovaly 25 až ' 30 ' °/o pevné látky. Směs se zředí stejným objemem- methanolu a k vyvolání' krystalizace se přidají malé krystalky amikacinu.

10. V průběhu 2 hodin se pomalu přidávají - 2 objemy IPA za energického míchání -a krystalizace pak probíhá 6 až ' 8 hodin při teplotě 23 °C.

11. Pevná látka se oddělí filtrací, promyje se 35 ml směsi- vody, methanolu a isopropanolu v poměru 1:1:2 a pak ještě -35 ml IPA.

12. Krystalky se suší ve vakuu při teplotě 40 °C po dobu 16 až 24 hodin. Tímto způsobem se získá 19,91 až 22,84 g výsledné látky při výtěžku 34 až 39 %, spektrum - v infračerveném světle, RMR a- Cⁿ-NMR spektra a specifická -otáčivost jsou v -souhlasu s předpokládanou strukturou výsledné látky.

Chromatografie na - tenké vrstvě

Bylo užito- směsi chloroformu, methanolu, hydroxidu amonného a vody v poměru 1 : :4:2:1 a silikagelových desek o· rozměru 5 x 20 cm (Quantum Industries). Bylo· možno pozorovat jednu zónu amikaclnu o· Rf 0,4 při detekci ninhydrinem.

Příklad 7

Způsob výroby amikacinu acylací poly(trimethylsilyl)-6‘-N-Cbz-kanamycinu A v tetrahydrofuranu smíšeným anhydridem kyseliny pivalové a BHBA

A. Příprava smíšeného· anhydridu

5,06'6 g · (20,0 mmolů) BHBA, 4,068 g (20,0 mmolů) triethylaminu se rozpustí ve 200 ml tetrahydrofuranu, zbaveného vody pomocí molekulárního· síta. Roztok se vaří pod zpětným chladičem 2 hodiny a 15 · minut, pak se zchladí na teplotu —10 °C. Pak se přidá v průběhu 2 až 3 minut 2,412 g, 20,0 mmolů pivaloylchloridu za stálého míchání a pak se směs míchá ještě další 2 hodiny při teplotě —10· °C. Pak se nechá teplota reakční směsi stoupnout na 23 °C.

B. Acylace póly (trimethylsilyl )-6‘-N-Cbz-kanamycinu A

5,454 g (4,97 mmolů) poly (trimethylsilyl )-6‘-N-'Cbz-kanamycinu A, připraveného způsobem podle· příkladu 1, propočítáno· jako 6‘-Cbz-kanamycin A (silyl)s se rozpustí v 50 ml bezvodého tetrahydrofuranu, sušeného molekulárním sítem, při ·· teplotě 23 °C. Pak se přidá v průběhu 20 minut polovina (10,0 · mmolů) roztoku smíšeného· anhydridu, připraveného . . · podle svrchu . uvedeného stupně · A · za energického míchání a pak se směs dále míchá ještě · 7 dní.

Pak se k reakční směsi přidá 100· ml vody a pH, jehož původní . hodnota byla 5,4, se upraví · na hodnotu 2,0 přidáním 3 M · kyseliny sírové. Směs se ještě hodinu míchá a pak se extrahuje ethylacetátem. · . Polyacylovaný materiál značné krystalizovat, takže je · nutno reakční směs zfiltrovat. Po· vysušení kysličníkem fosforečným se získá tímto způsobem 0,702 g pevné látky. Reakční směs se dále extrahuje celkem 4 x 75 · ml ethylacetátu, pak se přebytečný· ethylacetát z vodné vrstvy odstraní destilací. Vzorek vodného roztoku se podrobí analýze vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Z výsledné křivky je zřejmé, že výtěžek di-Cbz amikacinu je 26,4 %.

Vodná vrstva se pak podrobí hydrogenaci v Parrově přístroji při tlaku vodíku 0,35 MPa při použití 0,5 g 10% paládia na aktivním uhlí jako katalyzátoru. Výsledný materiál se oddělí filtrací a filtrát a promývací kapalina se podrobí zkoušce při použití E. coli, čímž je možno· prokázat, že výtěžek amikacinu je 31,2 %. Poměr amikacinu a BB-K29 je přibližně 9 až 10 : 1, bylo možno prokázat i · stopy polyacylovaného materiálu a nezreagovaného¹ · kanamycinu A.

P říklad 8

Vliv vody na přípravu amikacinu acylací poly (trimethylsilyl jkanamycinu A v acetonovém roztoku při teplotě 23 °C

A. Bezvodé rozpouštědlo

2,40 g (2,0 mmoly) poly (trimethylsilyl)kanamycinu A, připraveného· způsobem podle příkladu ·3, přepočítáno· na kanamycin

A, (silyl) io se rozpustí .veZOml acetonu, který byl předběžně zbaven vody molekulárním sítem. Roztok se míchá při teplotě 23 °C, přidává se roztok 0,701 g (2,0 mmoly) SAE v 10 ml bezvodého acetonu, sušeného· rovněž molekulárním sítem. Přidávání se provádí v rozmezí 10 sekund. Pak se směs míchá ještě 22 hodin při teplotě 23 °C. Přidá se 50 ml vody a původní pH 7,5 se upraví na hodnotu 2,5. Aceton se odstraní destilací ve · vakuu při teplotě 40 °C a vodný roztok se pak redukuje při tlaku vodíku 0,35 MPa při teplotě 23 °C po dobu 2 hodin, přičemž jako· katalyzátor . se užije 1 g 10% paládia na aktivním uhlí. Mikrobiologickým- pokusem bylo· možno prokázat 31,24 % amikacinu.

B. Přidání vody k rozpouštědlu

Stupeň A byl opakován s tím rozdílem, že do· · roztoku po!y[trimethylsilyl)kanamycinu A bylo · přidáno 1,0· ml (56 mmolů) vody a směs· byla před acylací SAE míchána ještě 15 minut. · Mikrobiologickými . zkouškami· bylo možno prokázat, že · výtěžek · amykacinu byl v tomto případě 33,80 %.

P ř í k 1 a d · 9 . .

Způsob výroby amikacinu . acylací· poly(trimethylsilyl)-6‘-N-Cbz-kanamycinu A v acetonu smíšeným anhydridem· BHBA· a kyseliny isobutylkarboxylové

A. Příprava smíšeného anhydridu

1,267 g (5,0 mmolů) BHBA a 1,313 g · (10,0 mmolů) N-trimethylsilylacetamidu (MSA) ve · 20 ml acetonu, vysušeného molekulárním sítem, se míchá při teplotě 23 °C, přičemž se přidává 0,70· ml (5,0 mmolů) trimethylaminu (TEA). Směs se zahřívá na teplotu varu pod · zpětným· chladičem v dusíkové atmosféře 2,5 hodiny. Pak se směs zchladí na teplotu —20 °C a přidá se 0,751 g, 0,713 ml (5,50 mmolů) isobutylchlormravenčanu. Okamžitě dojde k vysrážení triethylaminhydrochloridu. Směs se pak ještě hodinu míchá při teplotě —20 °C.

В. Acylace

6,215 g (4,9 mmolu) póly(trimethylsilyl )-6‘-N/Cbz-kanamycinu A, připraveného způsobem podle příkladu 1, přepočítáno na sloučeninu s 9 sily 1-ovými skupinami se rozpustí ve 20 ml acetonu, předem zbaveného vody molekulárním sítem za stálého míchání při teplotě 23 °C. Roztok se zchladí na —20 °C, načež se pomalu v průběhu 30 minut přidává roztok zchlazeného smíšeného anhydridu ze stupně A. Pak se reakční směs míchá 1,5 hodiny při teplotě — 20 °C a pak j ještě 17 hodin při teplotě 23 °C. Pak se reakční směs vlije do 150 ml vody při teplotě 23 °C za stálého míchání a původní pH 7,75 se upraví na hodnotu 2,5 přidáním 3 N ky_t seliny chlorovodíkové, načež se směs míchá ještě dalších 15 minut. Pak se aceton odstraní destilací ve vakuu při teplotě 40 °C. Vzorek výsledného pevného roztoku se podrobí zkoušce vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Podle získané křivky je možno prokázat, že výtěžek di-Cbz-amikacinu byl 34,33 %.

Hlavní podíl svrchu získaného vodného roztoku se podrobí redukci při tlaku vodíku 0,35 MPa při teplotě 23 °C po dobu 3 hodin a 15 minut, přičemž se jako katalyzátoru užije 2,0 g paládia na aktivním uhlí. Katalyzátor se oddělí filtrací, filtrát a promývací kapalina se slijí a účinnost se stanoví mikrobiologicky proti E. coli, čímž je možno prokázat, že výtěžek amikacinu je 35,0 procenta.

Příklad 10

Způsob výroby amikacinu acylací póly(trimethylsilyl )-6‘-N-Cbz-kanamycinu A v 3-pentanonu g (23,65 mmolu) póly (trimethylsilyl )-6‘-N-Cbz-kanamycinu A, připraveného způsobem podle příkladu 1 přepočítáno na 6‘-N-Cbz-kanamycin A (silyl)9 v roztoku ve 100 ml 3-pentanonu, předem zbaveného vody pomocí molekulárního síta, se míchá při teplotě 23 °C, přičemž se v průběhu 40 mi* nut přidává 26,02 mmolu, tj. ΙΟθ/o přebytek

NAE. Směs se míchá ještě 113 hodím při teplotě 23 °C, načež se přidá za energického míchání ke 250 ml vody. Původní pH 7,3 se > upraví na hodnotu 2,5 přidáním 3 N kyseliny chlorovodíkové, jak se směs míchá ještě dalších 30 minut a 3-pentanon se odstraní destilací ve vakuu při teplotě 40 ^CC. Vodný roztok se extrahuje 4 x 100 ml ethylacetátu. Vzorek vodného roztoku se pak podrobí vysokotlaké kapalinové chromatografii. Z výsledné křivky je možno prokázat, že výtěžek di-Cbz-amikacinu byl 46,12 %.

Hlavní podíl vodné reakční směsi se podrobí redukci při tlaku vodíku 0,35 MPa při teplotě 23 °'C po dobu 2,5 hodiny, přičemž jako katalyzátoru se užijí 3 g 10% paládia na aktivním uhlí. Filtrát a promývací kapalina se slijí a vzorek tohoto materiálu se podrobí mikrobiologickým zkouškám, v nichž je možno prokázat, že výtěžek amikacinu je 40,24 %. Hlavní podíl redukované vodné reakční směsi se pak zahustí ve vakuu při teplotě 40 °C na objem přibližně 100 ml a získaný materiál se nanese na sloupec o rozměrech 130 x 10 cm s obsahem přibližně 10 litrů přípravku CG-50 (NH4⁺). Po nanesení vodného roztoku na vrchol sloupce se sloupec promyje 5 litry vody a účinná látka se pak vymývá nejprve 0,5 N hydroxidem amonným, pak se vymyjí ještě polyacylované produkty 3 N hydroxidem amonným. Při polarimetrii jednotlivých frakcí je možno tímto způsobem prokázat výtěžek 42,7 % amikacinu, 12,0 % nezreagovaného kanamycinu A, 12,4 % polyacylovaného materiálu a 23,2 procenta BB-K29.

Příklad 11

Způsob výroby amikacinu acylací póly (trimethylsilyl)-6‘-N-Cbz-kanamycinu A v bezvodém cyklohexanonu různou dobu

A. 2,537 g (2 mmoly) póly(trimethylsilyl)-6‘-N-Cbz-kanamycinu A, připraveného způsobem podle příkladu 1, propočítáno na 6‘-N-Cbz-kanamycin A (silyl)9 ve 300 ml bezvodého cyklohexanonu se acyluje 20 hodin při teplotě 23 °C roztokem 10,8 ml (0,1944 mmolu/ml, 2,10 mmolu) NAE v bezvodém cyklohexanonu. Reakční směs se pak přidá ke 150 ml vody za stálého míchání a původní pH 5,6 se upraví na hodnotu 2,5 přidání 3 N kyseliny chlorovodíkové. Cyklohexanon se odstraní destilací ve vakuu při teplotě 40 °C a odejme se vzorek zbývající vodné fáze pro zkoušky vysokotlakou kapalinovou chromatografií.

Hlavní podíl vodné fáze se redukuje při tlaku vodíku 0,35 MPa po dobu 3 hodin při teplotě 23 °C, přičemž jako katalyzátor se užije 1 g 10% paládia na aktivním uhlí. Katalyzátor se pak odstraní filtrací, filtrát a promývací kapalina se slijí a podrobí se mikrobiologické zkoušce na amikacin.

B. Opakuje se shora uvedená reakce A s tím rozdílem, že se acylace provádí 115 hodin místo 20 hodin.

Výtěžky

Zkouška kapalinovou vysokotlakou chromatografií (di-Cbz amikacin)

Mikrobiologická zkouška na amikacin turbidimetricky na plotnách reakce A 49,18 % reakce B 56,17 %

Příklad 12

Způsob výroby amikacinu acylací póly (trimethylsilyl) -6'-N-Cbz-kanamycinu A v bezvodém· tetrahydrofuranu různou dobu

A. Opakuje se příklad 11 s tím rozdílem,

Výtěžky Zkouška kapalinovou vysokotlakou chromatografií (di-Cbz amikacin) reakce A 2-9,27 % reakce B 233,99 %

Příklad 13

Způsob výroby amikacinu acylací póly (trimethylsilyl) -6‘-N-Cbz-kanamy cínu A v bezvodém dioxanu různou dobu

42,87 % 39,16 O/o

55,39 % 38,45 % že se jako· rozpouštědlo užije místo bezvodého· cyklohexanonu bezvodý tetrahydrofuran.

B. Opakuje se příklad 11 B s tím rozdílem, že se jako· rozpouštědlo užije místo· bezvodého · cyklohexanonu bezvodý tetrahydrofuran.

€

Mikrobiologická zkouška na amikacin turbidimetricky na plotnách

28,34 % 28,18 %

21,52 % 28,63 %

A. Opakuje se příklad 11 A s tím rozdílem, že se acylace provádí 44 hodin při použití bezvodého dioxanu jako rozpouštědla.

B. Opakuje se příklad 11 B s tím rozdílem, že se acylace provádí 18,5 hodiny při · použití bezvodého· dioxanu jako rozpouštědla.

Výtěžky Zkouška kapalinovou vysokotlakou chromatografií (di-Cbz amikacin) reakce A reakce B

39,18 %

42,82 %

Příklad 14

Způsob výroby amikacinu acylací póly (trimethylsilyl) -6'-N-Cbz-kanamycinu A v bezvodém diethylketonu při teplotě 75 °C

K 2,537 g (2,0 mmoly) poly(trimethylsilyl )-6‘-N-Cbz-kanamycinu A, připraveného způsobem podle příkladu 1, přepočítáno na 6‘-N.-Cbz-kanamycin A (silyl)9 ve 32 ml · diethylketonu, předem zbaveného· vody molekulárním sítem, se za stálého míchání při teplotě · 75 °C přidá 10,8 ml (0,1944 mmolu/ /ml, 2,10 mmolu) roztoku NAE v diethylketonu v průběhu 15 minut. Směs se dále míchá 3 hodiny při teplotě 75 ^cC, načež se vlije do 150· ml vody. pH se upraví na hodnotu

2,8 3 N kyselinou chlorovodíkovou a diethylketon se odstraní destilací ve vakuu při teplotě 40 °C. Při vysokotlaké chromatografii vzorku vodné fáze je možno prokázat, že výtěžek di-Cbz amikacinu je 39,18 %.

Hlavní podíl vodné fáze se redukuje při tlaku vodíku 0,35 MPa po· dobu 3 hodin 15 minu při teplotě 23 °C, přičemž jako· katalyzátor se užije 1,0 g paládia na aktivním uhlí. Katalyzátor se oddělí filtrací, filtrát

Mikrobiologická zkouška na amikacin turbidimetricky na plotnách

43,27 o/o 33,36 %

22,55 O/o 33,37·% a promývací materiál se pak podrobí mikrobiologickým zkouškám na amikacin. Při turbidimetrické zkoušce je možno· prokázat výsledek · 27,84 · %, · při zkoušce na plotnách bylo· možno prokázat výtěžek 28,6 %.

P ř í k 1 -a · d 15

Způsob výroby amikacinu acylací póly (trimethylsilyl) kanamycinu A .

působením· NAE při teplotě 0 až 5 °C po zpětné hydrolýze vodou

A. Sílylace kanamycinu A při použití HDMS « spolu s TMCS jako katalyzátoru g (20,14 mmolu) kanamycinu A o čistotě 97,6 % ve 100 ml acetonitrilu, předem zbaveného· vody molekulárním sítem se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem v dusíkové atmosféře. K reakční směsi se v průběhu zahřívání na teplotu varu přidá směs 22,76 g (141 mmolů, tj. 7 molů na 1 ·· mol kanamycinu A) HMDS a 1 ml (0,856 gramu, 7,88 mmolu) TMCS v průběhu 10 minut. Směs se pak dále zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem 4 hodiny á 45 minut, pak se zchladí, zahustí ve vakuu na viskózní žlutou sirupovitou kapalinu a pak se suší ve vysokém vakuu 2 hodiny. Tímto způsobem je možno získat ve výtěžku 97,9 procenta výsledný produkt v množství 23,8 gramu, přepočítáno na kanamycin A (sily 1J ío.

B. Acylace

23,8 g (20,14 mmolu) poly(trimethylsilyljkanamycinu A připraveného ve stupni A se rozpustí ve 250 ml acetonu, předem zbaveného vody molekulárním sítem při teplotě 23 °C, načež se roztok zchladí na teplotu 0 až 5 °C, za energického míchání se přidá 3,63 ml (201,4 mmolu) vody, to znamená 10 molů vody na 1 mol polysilylovaného kanamycinu A, a směs se nechá stát při mírném podtlaku 30 minut. Pak se přidá za dobu kratší než 1 minuta 19,133 mmolu, tj. 0,95 molu na 1 mol polysilylovaného kanamycinu A NAE v 108,3 ml acetonu. Směs se hodinu míchá při teplotě 0 až 5 °C, pak se zředí vodou, pH se upraví na hodnotu 2,5 a aceton se odstraní ve vakuu. Vodný roztok se pak redukuje při tlaku vodíku 0,35 MPa při teplotě 23 °C a 2,5 hodiny při použití 2,0 g 10% paládia na aktivním uhlí jako katalyzátoru. Redukovaná reakční směs se zfiltruje vrstvou přípravku Dicalit, zahustí se ve vakuu na objem přibližně 100 ml při teplotě 40 ^C'C a pak se nanese na sloupec o rozměrech 5 x 100 cm s obsahem 5 litrů přípravku CG-50 (NH4⁺). Sloupec se promyje vodou a pak se vymývá postupně 0,6 N, 1,0 N a 3 N hydroxidem· amonným. Tímto způsobem se získá 60,25 % amikacinu, 4,37 % BB-K6, 4,35 % BB-K29, 26,47 % kanamycinu A a 2,18 % polyacylovaných produktů.

Příklad 16

Způsob výroby amikacinu acylací póly (trimethylsilyl)-6‘-N-Cbz-kanamycinu A působením SAE při teplotě 0 až 5 °C po zpětné methanolýze

A. Silylace 6‘-N-Cbz-kanamycinu A

20,0 g (32,4 mmolu) 6‘-N-Cbz-kanamycinu A ve 200 ml acetonitrilu, předem zbaveného vody molekulárním sítem se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem v dusíkové atmosféře. Pak se v průběhu 10 minut přidá 47,3 ml (226,8 mmolu) HDMS, tj. 7 molů této látky na 1 mol 6‘-N-Cbz-kanamycinu A se přidá v průběhu 10 minut a směs se pak zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem 20 hodin. Pak se reakční směs zchladí, koncentruje ve vakuu a suší ve vysokém vakuu 2 hodiny, čímž se získá 39,1 g bílé amorfní pevné látky. Výtěžek je 95,4 %, vypočítáno jako 6‘-N-Cbz-kanamycin A (silyl)9.

B. Acylace

39,1 g (32,5 mmolu) póly(trimethylsilyl)-6‘-N-Cbz-kanamycinu A, připraveného podle stupně A, se rozpustí ve 400 ml bszvodého acetonu za stálého míchání při teplotě 23 °C. Pak se přidá 6,6 ml (162 mmolů) methanolu, tj. 5 molů methanolu na 1 mol polysilylovaného 6‘-N-Cbz-kanamycinu A a směs se míchá hodinu při teplotě 23 °C v silném proudu dusíku. Pak se směs zchladí na teplotu 0 až 5 °C a přidá se roztok 11,35 gramu, 32,4 mmolu, SAE ve 120 ml předem zchlazeného bezvodého acetonu. Pak se reakční směs míchá další 3 hodiny při teplotě 0 až 5 °C, načež se uloží na 1 týden do chladné místnosti o teplotě 4 °C. Pak se přidá 300 ml vody, pH se upraví na hodnotu 2,0, směs se míchá další hodinu a pak se aceton odstraní destilací ve vakuu. Výsledný vodný roztok se redukuje při tlaku vodíku 0,39 MPa 17 hodin při teplotě 23 °C, přičemž jako katalyzátor se užije 3,0 g 10% paládia na aktivním uhlí. Výsledná reakční směs se zfiltruje vrstvou přípravku Dicalit, pak se zahustí ve vakuu na objem 75 až 100 ml a nanese se na sloupec přípravku CG-50 (NH4⁺) a pak se vymývá vodou a 0,6 N hydroxidem amonným. Tíipto· způsobem se získá 52,52 % amikacinu, 14,5 % BB-K29, 19,6 % kanamycinu A a 1,71 o/_o polyacylovaných materiálů.

Příklad 17

Způsob výroby amikacinu acylací póly (trimethylsilyl) kanamycinu A působením SAE při teplotě 0 až 5 ^CC po zpětné hydrolýze vodou

A. Silylace kanamycinu A působením TMCS v acetonitrilu při použití tetramethylguanidinu jako látky, která váže kyselinu

4,88 g (10,07 mmolu) kanamycinu A se uvede v suspenzi ve 100 ml acetonitrilu, předem zbaveného vody molekulárním sítem za stálého míchání při teplotě 23 °C. К suspenzi se zamíchání přidá 16,234 g (140,98 mmolu) tetramethylguanidinu (TMG), tj. 14 molů této látky na 1 mol kanamycinu A. Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem, načež se v průběhu 15 minut přidá 15,32 g, (140,98 mmolu) TMCS, tj. 14 molů této látky na 1 mol kanamycinu A. Jakmile se přidá polovina TMCS, vytvoří se bílá sraženina hydrochloridu TMG. Směs se zchladí na teplotu místnosti, zahustí na lepkavý zbytek a suší 2 hodiny ve vysokém vakuu. Získaná pevná látka se rozetře se 100 mil bezvodého tetrahydrofuranu a nerozpustný hydrochlorid TMG se oddělí filtrací a promyje se 5 x 20 ml tetrahydrofuranu. Filtrát a promývací kapalina se slijí a zahustí ve vakuu při teplotě 40 °C na lepkavý zbytek, načež se suší 2 hodiny ve vysokém vakuu. Tímto způsobem se získá 10,64 g svět le krémového lepkavého zbytku, výtěžek je 87,6 o/_o, vztaženo na kanamycin A (silyl)io.

B. Acylace

10,64 g (10,07 mmolu) póly (trimethylsilyl) kanamycinu A, přiveného- ve stupni A se rozpustí ve 110 ml acetonu, předem zbaveného vody molekulárním sítem' za stálého míchání při teplotě 23 °C a roztok se zchladí na teplotu 0 až 5 °С. Pak se přidá 1,81 ml (100,7 mmolu) vody, tj. 10 molů vody na 1 mol polysilylovaného kanamycinu A, a roztok se míchá 30 minut za mírného podtlaku. Pak se v době kratší než 1 minuta přidá

3,70 g (10,57 mmolu), to znamená 5% přebytek SAE ve 40 ml předem zchlazeného bezvodého acetonu a směs se dále hodinu míchá. Pak se směs dále zpracovává způsobem, uvedeným v příkladu 16 B, čímž se získá přibližně 50 °/o amikacinu, 10 o/o BB-K29, 5 až 8 % BB-K6, 20 % kanamycinu A a 5 až 8 % polyacylovaných produktů.

Příklad 18

Způsob výroby póly (trimethylsilyl)kanamycinu A v pyridinu .při použití HMDS

10,0 g (20,64 mmolu) kanamycinu A se uvede v suspenzi ve 100 ml pyridinu zbaveného vody molekulárním sítem při teplotě 23 °C. Pak se směsí nechá procházet dusík a suspenze se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Pak se přidá v průběhu 10 minut 17,33 g (107,32 mmolu) HMDS, tj.

5,2 molu této látky na 1 mol kanamycinu A a směs se dále zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem 19 hodin. Pak se směs zchladí na teplotu místnosti, zahustí se ve vakuu na světle zlatožlutou sirupovitou kapalinu, která se pak suší ve vysokém vakuu až na bílou amorfní pevnou látku. Tímto způsobem se ve výtěžku 92,6 o/o získá 22,1 g produktu, přepočítáno na kanamycin A (silyljio.

Příklad 19

Způsob výroby póly(trimethylsilyl)kanamycinu A při použití triethylchlorsilanu a triethylaminu jako látky, která váže kyselinu

5,0 g (10,07 mmolu) kanamycinu Aočistotě 9?,6 % se uvede v suspenzi ve 100 ml acetonitrilu, předem zbaveného vody molekulárním: sítem při teplotě 23 °C. Pak se přidá 33,8 ml, 24,5 g, (241,7 mmolu) triethylaminu (TEA) a suspenze se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Pak se v průběhu 20 minut přidá roztok 23,7 ml, 21,3 gramu (111,98 mmolu) trichlorethylsilanu ve 25 ml bezvodého acetonitrilu. Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem dalších 7 hodin, pak se zchladí na teplotu místnosti, čímž dojde к vysrážení hydrochloridu TEA ve formě dlouhých jemných jehliček. Směs se nechá stát při teplotě místnosti přibližně 16 hodin, pak se zahustí ve vakuu při teplotě 40 °C na lepkavou pevnou látku, která se suší 2 hodiny ve vysokém vakuu na hluboce oranžovou lepkavou pevnou látku. Tento materiál se rozetře se 100 ml bezvodého tetrahydrofuranu při teplotě 23 °C a nerozpustný hydrochlorid TEA se oddělí filtrací, a suší se, čímž se získá 16,0 g hydrochloridu TEA. Filtrát a promívací kapalina se suší ve vakuu na pevnou látku, která se pak suší ještě 2 hodiny ve vysokém vakuu. Tímto způsobem se získá

19,3 g póly (triethylsilyl) kanamycinu A ve formě silně oranžové viskózní sirupovité kapaliny.

Příklad 20

Způsob výroby póly(trimethylsilyl)kanamycinu A při použití bis-trimethylsilylmočoviny

10,0 g (20,58 mmolu) kanamycinu A o čistotě 99,7 % se uvede v suspenzi ve 200 ml acetonitrilu, předem zbaveného vody molekulárním sítem za stálého míchání při teplotě 23 °C. К suspenzi se přidá 29,45 g 144,01 mmolu) bis-trimethylsilylmočoviny (BSU), tj. 7 molů této látky na 1 mol kanamycinu A, pak se směs zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem v atmosféře dusíku. Zahřívání trvá 17 hodin, pak se reakční směs zchladí na teplotu místnosti. Malý podíl nerozpustného materiálu se oddělí filtrací. Promyje se 3 x 10 ml acetonitrilu a suší, čímž se získá 1,1381 g nerozpustného pevného podílu. V infračerveném světle je možno prokázat, že jde o BSU a malé množství nezreagovaného kanamycinu A. Filtrát a promývací kapalina se slijí a uloží na 16 hodin při teplotě 4°C. Tímto způsobem dojde к vyloučení další pevné látky, která se izoluje stejně jako svrchu, čímž se získá 7,8 gramu této látky, která sestává z BSU a močoviny, jak je možno prokázat v infračerveném světle. Světle žlutý filtrát a .promývací kapalina se zahustí ve vakuu při teplotě 40° Celsia a suší ve vysokém vakuu, čímž se získá 27,0 g bílé pevné látky, která je částečně ve formě bílých jemných jehličkovitých krystalků a částečně ve formě lepkavé pevné látky. Tento materiál se zpracovává přidáním 150 ml heptanu při teplotě 23 °C, nerozpustný podíl se oddělí filtrací, promyje se 2 x 50 ml heptanu a pak se suší, čímž se získá 6,0 g bílých jehličkovitých krystalků. V infračerveném světle je možno prokázat, ž© jde o směs BSU a močoviny. Filtrát a promývací kapalina se slijí, zahustí se ve vakuu při teplotě 40 °C a suší ve vysokém vakuu 2 hodiny, čím, se získá 20,4 g bílých jehličkovitých krystalků. V infračerveném světle je možno prokázat, že spektrum je typické pro polysilylovaný kanamycin A. Počtem bylo prokázáno, že produkt obsahu je průměrně 7,22 trimethylsilylových skupin.

Příklad 21

Způsob výroby amikacinu acylací per (trimethylsilyl ] . kanamycinu A po částečné desilylaci působením

1,3-butandiolu

A. Příprava per (trimethylsilyl)kanamycinu A

10,0 g (20,639 mmolu) kanamycinu A se uvede v suspenzi ve 100 ml acetonitrilu, zbaveného vody molekulárním sítem· za stálého míchání při teplotě 23 C. Suspenze se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem· v proudu dusíku, načež se v průběhu 10 minut přidá 23,322 g (144,5 mmolu) HMDS, což znamená 7 molů této látky na 1 mol kanamycinu A. Pak se směs 16 hodin dále zahřívá na. teplotu varu pod zpětným chladičem, načež se zchladí na teplotu místnosti, koncentruje ve' vakuu a 2 hodiny suší ve vysokém vakuu. Získá se 24,3 g bílé lepkavé látky ve výtěžku 92,1 %, · vztaženo na kanamycin A (silyljn.

B. Acylace

24,3 g per (trimethylsilyl )kanamycinu A, připraveného· podle stupně A se rozpustí za stálého· míchání ve 240 ml acetonu, zbaveného· vody · molekulárním sítem při teplotě 23° Celsia. K tomuto· roztoku se přidá 9,25 ml (103,2 mmolu] 1,3-butandiolu, tj. 5 molů této látky na 1 mol per (trimethylsilyl] kanamycinu A. Pak se směs míchá 2 hodiny při teplotě 23 °C v proudu dusíku, načež se zchladí na teplotu 0 až 5 °C. Pak se v průběhu 1 minuty přidá · roztok · 7,23 g (20,64 mmolu] SAE v 70 ml předem zchlazeného· acetonu. Směs se míchá 3 hodiny při teplotě 0 až 5 °C, načež se nechá stát přibližně 16 hodin v chladné místnosti při teplotě 4° Celsia. Pak se přidá 200 ml vody, pH se upraví na hodnotu 2,5 a čirý žlutý roztok se míchá 30 minut při teplotě 23 °C. Aceton se odstraní filtrací ve vakuu a vodný roztok se redukuje při tlaku 0,39 MPa vodíku při teplotě 23 °C 2 hodiny, přičemž jako katalyzátor se užije 3,0 g 10% paládia na aktivním· uhlí. Redukovaný roztok se zfiltruje vrstvou přípravku Dicalit a chromatografuje stejně jako v příkladu 16 B, čímž se získá·

47,50 o/o amikacinu, 5,87 % BB-K29, 7,32 % BB-K6, 24,26 % kanamycinu A a 7,41 %· polyacylovaných produktů.

Příklad 22

Způsob · výroby amikacinu acylací poly(trimethylsilyl] kanamycinu A připraveného v tetrahydrofuranu při použití · SAE a kyseliny sulfamové jako katalyzátoru

Ke směsi 5,0 g (10,32 mmolu] kanamycinu A a 50 · ml tetrahydrofuranu (THF) předem· zbaveného vody molekulárním sítem se přidá při teplotě varu pod zpětným chladičem 100 mg kyseliny sulfonové a 12,32 g (76,33 mmolu] HMDS.t Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným -chladičem· 18 hodin, přičemž ke vzniku čirého roztoku dojde po 6 hodinách. Roztok se zchladí na 23 °C, přidá se 0,1 ml vody a roztok se udržuje ještě 30 minut na teplotě 23 °C. Pak se v průběhu 30 minut přidá roztok · 3,61 g (10,3 mmolu] SAE ve 36 ml tetrahydrofuranu. Směs se míchá další 3 hodiny a pak se zředí 100 ml vody a pH se upraví 10% kyselinou sírovou na hodnotu 2,2. Pak se · směs 30 minut míchá při· teplotě 23 °C, načež se tetrahydrofuran odstraní ve vakuu. Výsledný vodný roztok se redukuje při tlaku · vodíku 0,35 MPa po dobu 2 hodin, při teplotě 23 °C, přičemž jako· katalyzátor se · užije 10% paládium · na aktivním· uhlí. Redukovaný roztok se zfiltruje vrstvou přípravku Dicalit a pevný podíl se promyje vodou. Filtrát a promývací kapalina v celkovém· množství 150 ml se · podrobí mikrobiologickým zkouškám: proti E. coli, čímž se ve výtěžku 31,5 % získá 1225 m.ikrogramů amikacinu/ml materiálu.

Příklad 23

Způsob výroby amikacinu acylací poly(trimethylsilyl] kanamycinu A působením. N-hydroxysukcinimidesteru dibenzyloxykarbonyl AHBA

A. Příprava dibenzyloxykarbonyl-L-( — ]-α-amino-a-hydroxymáselné kyseliny ve formě N-hydroxysukcinimidesteru g (20,65 mmolu] kyseliny dibenzyloxykarbonyl-L- [ — ] -α-amino-a-hydroxymáselné a ' 2,37 g (20,65 mmolu] N-hydroxysukcinimidu se rozpustí · při teplotě 23 °C v 50 ml bezvodého acetonu. Pak se přidá 4,25 g (20,65 mmolu] dicyklohexylkarbodiimidu v roztoku ve 20 ml bezvodého acetonu a výsledná směs se míchá 2 hodiny při teplotě 23 °C. Dcyklohexylmočovina se oddělí filtrací, filtrační koláč se promyje 10 ml bezvodého acetonu a filtrát a promývací kapalina se slijí.

B. Acylace

Poly(trimethylsilyl]kanamycin A, připravený způsobem, uvedeným v příkladu 21 · z 10,0 g (20,639 mmolu] kanamycinu A se rozpustí ve 100 ml bezvodého acetonu. Roztok se zchladí na teplotu 0 až 5 °C, přidá se 3,7 ml deionizované vody a roztok se míchá při teplotě 0 až 5 °C po dobu 30 minut při mírném podtlaku.

K roztoku se přidá roztok di-Cbz-chráněného acylačního činidla, připraveného ve stupni A a· směs se míchá 30 minut při teplotě· 0 až 5 °C. Pak se směs zředí vodou, pH se upraví na 2,2 a aceton se odstraní ve vakuu. Vodný roztok se redukuje způsobem podle příkladu 22 a zflltruje se vrstvou přípravku Dicalit. Chromatografií bylo možno prokázat 40 až 45 % amikacinu, přibližně 10 % BB-K29, stopy BB-K6, přibližně 30 % kanamycinu A . a malé množství polyacylovaných materiálů.

Příklad 24

Způsob výroby póly (trimethylsilyl)kanamycinu A při použití HMDS a imidazolu jako katalyzátoru g (22,7 mmolu) kanamycinu A a 100 ml imidazolu se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem ve 100 ml acetonitrilu, zbaveného vody molekulárním· sítem v proudu dusíku. . Pak se v průběhu 30 minut přidá 18,48 g (114,5 mmolu) MHDS, což znamená 5 molů této· látky na 1 mol kanamycinu · A a směs se dále zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem 20 hodin. Ke vzniku čirého roztoku dojde přibližně za 2,5 hodiny. Roztok se zchladí na 23 °C a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, čímž se získá 21,8 g poly(trimethylsilyl)kanamycinu A ve formě pěnovitého zbytku. Výtěžek je 93,1 °/o, vztaženo na kanamycin A (silyl)n.

Příklad 25

Způsob výroby l-N-(L-( — )-y-amino-α-hydroxybutyryl jkanamycinu B (BB-K26) acylací póly (trimethylsilyl Jkanamycinu B působením· SAE

A. Příprava poly(trimethylsilyl)kanamycinu B působením. HMDS při použití TMCS jako katalyzátoru g (51,7 mmolu) kanamycinu B ve 250 ml acetonitrilu, zbaveného vody molekulárním sítem, se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. v proudu dusíku. · Pak se. v průběhu 30· minut přidá 62,3 g (358,81 mmolu) HMDS, tj. 7,5 molu této látky na 1 mol kanamycinu B, načež se přidá ještě 1 ml TMCS jako katalyzátoru. Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným· chladičem 21 hodin, ke vzniku čirého roztoku dojde po 1 hodině varu. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu při teplotě 60 °C a olejovitý zbytek se udržuje při teplotě 60 °C ve vysokém vakuu 3 hodiny. Tímto·, způsobem se získá 53,0 gramu poly(trimethylsilyl)kanamycinu B. Výtěžek je 85,2 %, vztaženo na kanamycin B (silyl)io.

B. Acylace

Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B, připravený ve stupni A v množství 53,0 g, se rozpustí v 500 ml bezvodého acetonu při teplotě 0 až 5°C, přidá se 20,9 ml methanolu a směs se míchá 30 minut · ve vakuu při tep lotě 0 až 5 °C. Pak se za dobu kratší než 1 minuta přidá roztok 18,1 g (51,67 mmolu) SAE ve 200 ml předem zchlazeného· bezvodého acetonu a směs se míchá ještě 30 ' minut při teplotě 0 až · 5 °C. Pak se směs zpracuje způsobem podle příkladu 22 a nanese se na sloupec o· rozměrech 6 x 120 cm s obsahem přípravku ' CG-50 (NHí⁺). Sloupec se vymývá hydroxidem· amonným při stoupající koncentrací od 0,6 N do· 3 N. Tímto· způsobem se získá 38 % BB-K26, 5 % odpovídajícího 6‘-N-acylovaného kanamycinu B (BB-K22), 10 % odpovídajícího 3-N-acylovaného kanamycinu B (BB-K46), 14,63 o/₀ kanamycinu B a malé množství polyacylovaného kanamycinu B.

P ř í k 1 a d 26

Způsob výroby poly(trimethylsilyl)kanamycinu A při použití HMDS a kanamycinu A ve formě sulfátu jako katalyzátoru

19,5 g· (40,246 mmolu) kanamycinu A a 0,5 g (0,858 mmolu) kanamycin A-sulfátu, celkem 20,0 g (41,0 mmolů) ve 200 ml acetonitrilu, zbaveného vody molekulárním sítem se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Pak se pomalu přidá 60,3 ml (287,7 mmolu) HMDS, tj. Ί molů této· látky na 1 mol kanamycinu A a směs se . zahřívá na teplotu «aru pod zpětným chladičem 28 hodin. Pak se směs odpaří do· sucha na rotačním odpařovači a suší. Tímto· způsobem se získá 47,5 g poly(trimethylsilyl)kanamycinu A ve formě bledě žluté olejovité kapaliny. Výtěžek je 95,82 %, vztaženo na kanamycin A (silyljio.

Příklad ' 27

Způsob výroby 'amikacinu acylací . póly(trimethylsilyl Jkanamycinu A působením· N-hydroxysukcinimidesteru AHBA, s N-trifluoracetylovou skupinou jako ochrannou skupinou '

A. Příprava N-trifluoracetyl AHBA a přeměna ' této· látky na N-hydroxysukcinimidester

K suspenzi 5,0 g (42 mmolů) AHBA ve · 100 ml tetrahydrofuranu · se přidá 40 g (191 mmolů) · anhydridu kyseliny trifluoroctové za stálého míchání v průběhu 10 minut. Roztok se míchá 18 hodin při · teplotě 23 °C a pak se odpaří do sucha ve vakuu při teplotě 50°C. Odparek se rozpustí ve 100 ml směsi vody a methanolu v poměru 1:1a hodinu se míchá. Pak se směs odpaří ve vakuu do sucha a znovu se rozpustí v 50 ml vody. Vodný roztok se extrahuje 3 x 50 ml MIBK a po vysušení síranem sodným se extrakt zahustí na olejovitou kapalinu. · Stopy rozpouštědla se odstraní přidáním 4 ml vody následnou · destilací. Stáním se kapalina změní na 2,5 g voskovité krystalické pevné látky. Výtěžek je 28 %.

2,4 g (11,3 mmolu) N-trifluoracetyl AHBA se rozpustí v 50 m.l bezvodého acetonu a k roztoku se přidá 1,30 ' g (11,31 mmolu) N-hydroxysukcinimidu. Pak se pomalu přidá roztok 2,33 g dicyklohexylkarbodiimidu v 20· ml bezvodého acetonu. Reakční směs se 2 hodiny míchá při teplotě 23 · a vysrážená dicyklohexylmočovina se •odstraní filtrací a promyje se malým množstvím acetonu. Filtrát a promývací kapalina se slijí. Jde o roztok N-hydroxysukcinimidesteru N-trifluoracetyl -AHBA, který se užije bez izolace v následujícím stupni.

B. Acylace

K 11,31 mmolu roztoku poly(trimethylsilyl) kanamycinu A, připraveného způsobem· podle příkladu 26 v 54 ml acetonu se přidá 2,0 ml (113,4 mmolu) vody a směs se míchá ve vakuu při teplotě ..0 až 5 °C po, dobu 30 minut. Pak se ke směsi přidá 11,31 mmolu N-hydroxysukcinimidesteru N-trifluoracetyl AHBA, připraveného· ve stupni A a směs se hodinu udržuje na teplotě 5 °C. Pak se upraví pH . na hodnotu 2,0 přidáním 20% . kyseliny sírové, směs se míchá ještě 30 minut a .pak se pH · upraví na hodnotu 6,0 přidáním hydroxidu amonného·. Směs se pak odpaří do· sucha v rotačním odpařovači, čímž se získá 14,4 g lepkavé bělavé · pevné látky. Tento materiál se rozpustí ve · 100 ml vody, pH se upraví z původní hodnoty 5,5 na · 11,0 přidáním 10 N hydroxidu amonného a roztok se zahřívá na olejové lázni 1 hodinu při teplotě 70 °C. Roztok se pak z původního pH 9,5 upraví na pH 7,0 přidáním kyseliny chlorovodíkové, roztok se zfiltruje k odstranění malého nerozpustného podílu a filtr se promyje vodou. Filtrát a promývací kapalina v celkovém množství 188 m.l se nanese na sloupec ·σ rozměrech 8 x · 90 cm- s obsahem přípravku CG-50 (NH4+), sloupec · se promyje 2 litry vody a vymývá hydroxidem amonným při stoupající koncentraci od 0,6 N do 1,0 N. Tímto způsobem se získá ·28,9 % amikacinu, 5,0 % BB-K6, 5,7 % BB-K29, 43,8 procenta kanamycinu A, 3,25 % polyacylovaného materiálu, 14,3 % neznámé látky, která se nacházela v první frakci.

Příklad 28

Způsob výroby amikacinu acylací (poly(trimethylsilyl) kanamycinu A působením N-hydroxysukcinimidesteru terc.butyloxykarbonyl AHBA

A. Příprava terc.butyloxykarbonyl AHBA a přeměna této· látky na N-hydroxysukcinimidester

5,0 g (42 mmolů) AHBA ve 100 ml vody a 20 ml acetonu se upraví na pH 10 přidáním 10 N hydroxidu sodného. . V průběhu 3 až 4 minut se přidá 11,4 g (53 mmolů) di-terc.butyldikarbonátu, roztok se · míchá ještě 35 minut a pH se udržuje na hodnotě 10 přidáváním· 10 N hydroxidu sodného. Aceton se odstraní ve vakuu a vodná fáze se promyje 40 · ml ethylacetátu. Vodný roztok se upraví na pH 2,0· přidáním- 3 N kyseliny chlorovodíkové a pak se extrahuje 3 · x 30 ml MIBK. Extrakty se slijí, vysuší síranem sodným a zahustí na čirou olejovítou kapalinu. Ve výtěžku 89 ·% se získá 8,2 g této· kapaliny.

4,25 g (19,4 mmolu) terc.butyloxykarbonyl AHBA se rozpustí v 50 ml acetonu a přidá se 2,23 g · (19,4 mmolu) N-hydroxysukcinimidu. Pak se pomalu přidává 4,00 g (19,4 mmolu) roztoku dicyklohexylkarbodiimidu ve 20 ml acetonu a směs se 2 hodiny míchá při teplotě 23 °C. Vysrážená dicyklohexylmočovina se odfiltruje a promyje se malým množstvím acetonu. Filtrát a promývací kapalina, tvořící roztok N-hydroxysukcinimidesteru terc.butyloxykarbonyl AHBA se užije bez izolace v následujícím stupni.

B. Acylace

K roztoku · · 41,28 mmolu poly(trimethylsilyl) kanamycinu A, připraveného· způsobem podle příkladu 26 v 94 ml acetonu se přidá

3,5 ml (194 mmolů) vody a směs se míchá ve vakuu při teplotě 0 až 5 °C ' .30 minut. Pak se přidá 19,4 mmolu N-hydroxysukcIninridesteru terc.butyloxykarbonyl AHBA, připravený ve stupni A, a směs · se nechá stát hodinu při teplotě 5 °C. Pak · se přidá 200 ml vody a původní pH 7,0- · se. sníží·, na 2,0 přidáním 20 % kyseliny sírové. · . Po 30 minutách míchání se pH znovu upraví na hodnotu 6,0 hydroxidem amonným · a směs se odpaří do sucha ve vakuu, čímž se získá 36,3 g zlatožluté olejové kapaliny. Tato kapalina se rozpustí ve 200 ml kyseliny trifluoroctové, nechá se stát 15 minut a pak se odpaří do sucha v rotačním odpařovači. Pak se olejovitý materiál promyje vodou a voda se odpaří. Přidá se koncentrovaný hydroxid amonný · do pH 6,0 a rovněž se rychle odpaří. Výsledná pevná látka se rozpustí ve vodě, zfiltruje a filtr se promyje vodou. Filtrát a promývací kapalina v celkovém množství 259. ml se nanese na sloupec o· rozměrech 8 x 92 cm s náplní přípravku CG-50 (NH4⁺), sloupec se promyje 4 litry vody, pak se· vymývá hydroxidem amonným při stoupající koncentraci od 0,6 N do 1,0 N. Tímto· způsobem se získá 40,32 % amikacinu, 4,58 % BB-K6,

8,32 % BB-K29, 30,50 % kanamycinu A a

7,43 % polyacylovaných materiálů.

Příklad 29

Opakuje se způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se místo 6‘-N-benzyloxykarbonylanamycinu A užije ekvimolární množství 6‘-N-be-nzyloxykarbonylkanamycinu B, čímž se získá l-N-[L-( — J-y-amino-a-hydroxybutyryl] kanamycin B.

P ř í k 1 a d 30

Opakuje se způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že se místo·. N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidesteru kyseliny L-( — )-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné užije

N-hydroxy-5-norboi'nen-2,3-dikarboximidesteru kyseliny L-(—)-/3-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxypropionové a

N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidesteru kyseliny L-( — )-á-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxyvalerové, čímž se získká

1-N- [ L- ( — ) -/-amino-a-hydroxy pr opionyl ] kanamycin A a

1-N- [ L- ( — ) -á-amino-a-hy droxy valeryl ] kanamycin A.

Příklad 31

Opakuje . se způsob podle příkladu 25 s tím rozdílem, 'že se . užitý N-hydroxyester kyseliny ' L-( — )-y-benzyloxykarbonylamino-a-hydroxymáselné . .nahradí

N-hydroxysukcinimidesterem kyseliny ' L- (—) -ú-benzýloxýkar bony lamino-a-hydroxypropionové; a

N-hydroxysukcinimidesterem kyseliny L- ( — ) -á-benzyloxykarbony lamino-a-hydroxyvalerové, · · čímž . se získá l-N-[ L- ( — )-/^--^i^ii^'O-^-ial^h^c^i^<^]^j^]propionyljkanamycin . B · a

1-N- [ L- ( — ) -á-amino-a-hydr oxy valer y 1 ] kanamycin B.

P ř í k 1-a d 3 2 .................... ....... ........

Výroba BB-K8 acylací póly (trimethylsilyl )-3,6‘-di-N-karbobenzyloxykanamycinu A v. bezvodém diethylketonu

A. 3,6‘-di-N-benzyloxykarbonylkanamycin A

Suspenze 7,26 g . (15 mmol) kanamycinu A ve volné formě a 18,6 g (75 mmol) tetrahydrátuoctanu nikelnatého ve 300 ml dimethylsulfoxidu se zahřívá na teplotu 100 °C po dobu 30 minut za stálého· míchání, čímž se získá čirý, zelený · roztok. Po zchlazení se k tomuto· roztoku přidá 11,8 g (37,6 mmol) N-benzyloxykarhonyll5-n-orborneri-2,3-dikarboximidu v 50· ml dimethylsulfoyidu. Pak se směs míchá přes noc při teplotě místnosti, přidá se 100 ml koncentrovaného vodného amoniaku a 1 litr vody, načež se směs dále míchá při teplotě · místnosti ještě hodinu, načež se nanese na vrchol sloupce, který obsahuje 300 ml pryskyřice Diaion HP-10. Tento sloupec se pak postupně vymý vá nejprve 7 N hydroxidem amonným, pak směsí methanolu a vody v poměru 1:1 a nakonec směsí methanolu a vody v poměru 10-:1, přičemž se odebírají frakce po)- 20 ml a tyto frakce se sledují chromatografií na tenké vrstvě silikagelu (Merck Silica . Gel 60 F-254), přičemž jako rozpouštědlo· se užívá směsi chloroformu, ethanolu a 28% hydroxidu amonného v poměru 1:2:1. Část výsledného produktu, který krystalizuje ve formě jemných jehliček z vysoce koncentrované frakce · se oddělí filtrací, čímž se získá analogický vzorek. Filtrát a ostatní frakce s obsahem výsledného· produktu (Rf 0,42) se slijí a roztok se odpaří ve vakuu. Odparek se rozetře s diethyletherem, čímž se ve výtěžku 86 % získá celkem 9,7 g výsledného produktu · o teplotě tání vyšší než 300' °C.

Spektrum v infračerveném světle (KBr) má maximum při 1690 cm¹.

NMR-spektrum · (DMSO-d6 + DC1, pD = 3):

4,76 až 5,26 (6H, m, Hi‘, Hi“ a CO—OCHa—C&H5 x 2),

7,26 (10H, s, CO—OCHa—CfiHs x 2). '

Pro Ό34Η4»Ν4θΐ1. HaO vypočteno:

52,98 ·% C, · 6,54 % H, 7,27 % N;

nalezeno^.

53,20 % C, 6,42 0/0 H, 7,04 % N.

B. Póly (trim-ethyl-sily!)-3,6‘sdi-N-benzkls oxyaarbonylkanamycin · A

Směs 1,5 g (2 mmol) 3,6‘-di-N-karbobenzkloxykaramkcinu A ze stupně A a 1,29 g (8 mmol) hexamethyldisilazanu v 15 ml bezvodého acetonitrilu se 16 hodin zahřívá_ na teplotu varu pod zpětným chladičem. Čirý roztok se pak odpaří dosucha ve vakuu a odparek se rozpustí ve ·20 ml bezvodého diethylketonu. Roztok se přímo užije v následujícím stupni.

C. Acylace póly (trimethklsilyl)-3,6‘-di-N-

-berzkloxykaгborylkanamkciru A při použití eavimolárrího množství acylačního· činidla

K roztoku ze stupně B se · přidá za stálého míchání 700 mg (2 mmol) N-hkdroxkSUkcinimi-desteru kyseliny L- ( — ) -α-benzkloykkarbonklamino-a-hkdroykmáselré. · Směs se míchá při teplotě místnosti 19 hodin, pak se přidá 8 ml vody a 35 ml tetrahydrofuranu, pH se upraví na hodnotu 3' přidáním vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, pak se směs míchá ještě 30· hodin, načež se odpaří do· sucha ve vakuu. Odparek· se rozpustí ve směsi 30 ml . vody, 40 ml methanolu, 10 ml · n-butanolu a 40 ml tetrahydrofuranu a pak se hydrogenuje přes noc za přítomnosti 500 miligramů 10% paládia na aktivním uhlí jako katalyzátoru. Katalyzátor· se odstraní

207В07 filtrací a filtrát se odpaří ve vakuu a lyofilizuje, čímž se získá 1,7 g surového BB-K8. Amorfní prášek se ' znoyu rozpustí ve vodě, roztok . se upraví na pH 4 přidáváním vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a pak se chromatografuje na sloupci pryskyřice (Amberlíte CG-50) v NHá⁺-cyklu. Sloupec se postupně promývá vodou, 0,1 N hydroxidem' amonným, 0,3 N hydroxidem amonným, 0,5 N hydroxidem amonným a 2 N hydroxidem amonným, přičemž se odebírají frakce po. 10 ml a tyto frakce se sledují chromatografií na tenké vrstvě silíkagelu (Merek Silica Gel 60 F-254), přičemž jako rozpouštědla se užívá směsi chloroformu, methanolu, 28% hydroxidu amonného a vody v poměru 1:4:2:1, Homogenní frakce se slijí, odpaří a znovu lyofilizují. Frakce s obsahem BB-K8 a frakce s obsahem kanamycinu A se podrobí zkouškám při použití K. pneumoniae A20680 a B. subtilis PCI 129.

Frakce NHdOH (N) Hmotnost Výtěžek číslo (mg) (%)

Produkt

Hodnota Rf

32 .až 39	0,1, 0,3	102	částečně deblokovaný
40 až 46	0,3	Γ74η	7C	kanamycin A	0,42
47 až 59	0,3, 0,5	106		neidentifikovaný	0,33
60 až 78	0,5	816b	67c	BB-K8 .	0,18
89 až 95	2	70	5	diacylkanamycin AA	0,05
a) 408 (íg/mig
b) 956 fuZm-g

c) podle biologické zkoušky

Hydrogenolýzou produktu, částečně zbaveného ochranných skupin působením paládia na aktivním. uhlí s následnou izolací na sloupci pryskyřice (Amberlíte CG-50) se získá dalších 30 mg BB-K8 . (výtěžek 2 ' %). ' Celkový výtěžek BB-K8 se tímto. způsobem zvýší na 69 % (846 mg).

D. Acylace poly(třimethylslly))-3,6‘-d--N--benzyloxykarbonylkanamycinu A při použití 1,2 ekvivalentu acylačního činidla

Opakuje se .stupeň C s tím rozdílem, že se užije 20% přebytek acylačního činidla. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Frakce	NHáOH	Hmotnost	Výtěžek	Produkt	Hodnota
číslo	(N)	(mg)	(%)		Rf

28 až 29	0,2	107	částečně deblokovaný
30 až 41	0,2	157		neidentifikovaný	0,35
42 až 52	0,3	120		neidentifikovaný	0,30
53 až 81	0,3, 0,5	7503	60b	BB-K8	0,14
94 až 116	1, 2	147	11	diacylkanamycin A	0,05
a) 933 ^glmg

b) podle biologické zkoušky

Hydrogenolýzou produktu, částečně zbaveného ochranných skupin působením paládia na aktivním- uhlí s následnou izolací na sloupci pryskyřice (Amberlíte CG-50) se získá dalších 21 mg BB-K8 (výtěžek 2 %). Celkový výtěžek BB-K8 se tím zvýší na 62 proč. (771 mg).

E. Acylace póly (trimethylsilyl)3,6‘-di-N-banzyloxykarbonylkanamycinu A při použití 1,5 ekvivalentu acylačního činidla

Byl opakován stupeň C s tím rozdílem, že bylo užito 5C^0/o přebytku acylačního činidla. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Frakce číslo	NH4OH (N)	Hmotnost !(mg)	Výtěžek (%)	Produkt	Hodnota Rf (dvojí vyvíjení)
29 až 39	0,2	293		částečně deblotkovaný
40 až 47	0,3	95a	6C	kanamycin A	0,67
65 až 80	0,5	582b	29c	BB-K8	0,33
100 až 130	1, 2	543	26	diacylkanamycin A	0,09

a) 860 (g/^mg

b) 880. (zggmg

c) podle biologické zkoušky

PŘEDMĚT vynálezu

Claims (8)

1. Způsob· výroby l-N-(w-amino-a-hydro-xyalkanoyl)kanamycmu A a B obecného vzorce I kde

R znamená skupinu OH nebo aminoskupinu a n znamená celé číslo 0 až 2, jakož i netoxic-kých, z · farmaceutického hlediska přijatelných adičních solí těchto· látek s kyselinami,· vyznačující · se . tím, že se acyluje · polysilylovaný kanamycin A nebo B nebo polysilylovaný kanamycin A nebo B, s obsahem' odlišné ochranné skupiny od silylové skupiny na 6*-aminoskupině, za předpokladu, že polysilylovaný kanamycin A· nebo B, užitý · jako · výchozí . materiál obsahuje . průměrně · 4 až 8 silylových skupin v molekule, a polysilylovaný kanamycin A nebo B, užitý · jako výchozí materiál a obsahující na 6‘-aminoskupině ochrannou skupinu, odlišnou od silylové skupiny obsahuje průměrný počet silylových skupin v molekule 3 až 7, přičemž jako acylačního činidla se užije derivátu kyseliny obecného vzorce II

B \

B—N—CH₂— (CH2 b—CH-COOH · ,

OH (II), kde n znamená celé číslo 0 až 2,

B znamená ochrannou skupinu na aminoskupině nebo atom vodíku za předpokladu, že alespoň jeden z těchto symbolů znamená ochrannou skupinu na aminoskupině, a to o-nitrofenylthioskupinu, skupiny

O CH. O o ^11 ¹ 3 I I ч

CHgC -CH-C-0 - C~i YJCC- o

II XC-CH^O-C-A nebo symboly B spolu tvoří skupinu

O

II

II kde

R¹ a R² stejné nebo různé znamenají atom vodíku, fluoru, chloru, bromu, skupin N02» OH, alkyl nebo alkoxyl vždy o 1 až 6 atomech uhlíku,

X znamená atom chloru, bromu, fluoru nebo jodu a

Y znamená atom vodíku, chloru, bromu, fluoru nebo jodu, ve v podstatě bezvodém organickém rozpouštědle s následným odstraněním všech ochranných skupin, načež se takto získaný výsledný produkt popřípadě převede na svou netoxickou, z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se jako acylační derivát kyseliny obecného vzorce II užije aktivní ester nebo smíšený anhydrid.

3. Způsob podle bodů 1 a 2 vyznačující se tím, že se jako acylační derivát kyseliny obecného vzorce II užije aktivní N-hydroxysukcinimidester, N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidester nebo N-hydroxyftalimidester.

4. Způsob podle bodu 3 vyznačující se tím, že se užije acylačního derivátu kyseliny obecného vzorce II, v němž В znamená benzyloxykarbonylovou skupinu.

5. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se jako acylačního derivátu kyseliny užije smíšeného anhydridu s kyselinou pivalovou, kyselinou benzoovou, kyselinou isobutylkarboxylovou nebo s kyselinou benzylkarboxylovou.

6. Způsob podle bodů 1 až 5 vyznačující se tím, že se jako výchozího materiálu užije polysilylovaného kanamycinu A nebo B, který obsahuje na 6‘-aminoskupině benzyloxykarbonylovou skupinu jako ochrannou skupinu.

7. Způsob podle bodů 1 až 6 vyznačující se tím, že se jako výchozího materiálu užije polysilylovaného kanamycinu A nebo B, v němž silylovými skupinami jsou trimethylsilylové skupiny.

8. Způsob výroby l-N-[L-( — )-á>-am.ino-a-hydroxyalkanoyl] kanamycinu A podle bodů 1 až 7, vyznačující se tím, že se jako acylačního derivátu kyseliny užije sloučeniny obecného vzorce