DK165450B - Fremgangsmaade til fremstilling af 1-n-(omega-amino-alfa-hydroxyalkanoyl)kanamycin a eller b - Google Patents

Description

i

DK 165450 B

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af l-N-[<ø-amino-a-hydroxyalkanoyl]kanamycin A-eller B med den almene formel (I) 5 ho-^,cVh2 3-a R Ί NH2 hq/ 7n\ /h2oh / i-o

\ / HO-0H

\ °\ / (0H ) 15 NH2 /\\ / H0 \ / NH2

(O

hvori R betegner OH eller NH2, og n er et helt tal på O til 2, eller et 20 ikke-toxisk, farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf.

Kanamycinerne er velkendte antibiotika, som f.eks. er blevet beskrevet i Merck Index, 8. udgave, side 597-598. Der kendes talrige derivater af kanamycinerne. De strukturelle formler af kanamycin A og B er anført nedenfor sammen med det inden for området anvendte standard num-25 mereringssystem. I det efterfølgende vil de forskellige derivater af kanamycin, hvor det vil være let forståeligt, blive omtalt som derivater af kanamycin A eller B fremfor ved strukturel formel, således at behovet for at sammenligne komplekse strukturer for at fastslå forskelle undgås.

30 35 6' 2

DK 165450 B

HO fCH2NH2 5 *o/ /Na., „ R N1 fH2 y 3 ~t~\ **'· *-Ηθ/Γ 1 H°- CH OH / NH2 10 V\^5- / γ3<» ζ«Οχ j m2~ 7ΝΛ /

/ ΝνΛ / Kanamycin A: R = OH

HO i"\ /

Kanamycin B: R = NH2 15 USA-patent nr. 3.781.168 omhandler l-[L-(-)-Y-amino-a-hydroxybuty- ryl]kanamycin A (amikacin) og B, samt de mono- og di-carbobenzyloxy-be-skyttede derivater deraf. For lavere og højere homologe deraf henvises til USA-patenterne nr. 3.886.139 og 3.904.597. Forbindelserne fremstilles ved acylering af et 6'-N-beskyttet kanamycin A eller B med et acyle-20 rende derivat af en N-beskyttet L-(-)-y-amino-a-hydroxysmørsyre i et vandigt medium efterfulgt af fjernelse af én N-beskyttende gruppe eller begge N-beskyttende grupper.

USA-patent nr. 3.974.137 omhandler en fremgangsmåde til fremstilling af l-[L-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A, som omfatter, at 25 man omsætter 6'-carbobenzyloxykanamycin A med mindst tre mol benzalde-hyd, et substitueret benzaldehyd eller pivaldehyd, til frembringelse af 6'-N-carbobenzyloxykanamycin A indeholdende Schiff-basegrupper ved 1,3-og 3"-stillingerne, acylerer dette tetra-beskyttede kanamycin A derivat med N-hydroxysuccinimidesteren af L-(-)-y-benzyloxycarbonylamino-Q!-hy-30 droxysmørsyre og derefter fjerner de beskyttende grupper.

Belgisk patent nr. 828.192 omhandler og indeholder krav rettet på en fremgangsmåde til fremstilling af l-[L-(-)-ir-amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A ved fremstilling af samme tetra-beskyttede kanamycin A derivat som i USA-patent nr. 3.974.137, acylering med N-hydroxy-5-norbornen-35 2,3-dicarboximidesteren af L-(-)-7-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmør-syre og efterfølgende fjernelse af de beskyttende grupper.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er ejendommelig ved, at man acylerer polysilyleret kanamycin A eller B eller polysilyle- 3 ret kanamycin A eller B indeholdende en blokerende gruppe, som er forskellig fra silyl på 6'-aminogruppen, med a) en aktiv ester af N-hydro-xysuccinimid, N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dicarboxamid eller N-hydroxy-phthalimid, eller b) et blandet syreanhydrid af pivalinsyre, benzoesyre, 5 i sobutyl carboxyl syre eller benzyl carboxyl syre og en syre med den almene formel (II) B-HN-CH2-(CH2)n-CH-COOH (II)

10 OH

hvori n er et helt tal på 0 til 2, og B betegner en aminoblokerende gruppe med formlen 15 Y\-r » 'i \s /~~ch20c“' ch3-c-o-c- , y2xcc- R2 CH3 . Q~ c? o o ,? r 25 x3c-ch2-0-c- ,Uer

II

o 1 2 hvori R og R er ens eller forskellige, og hver især betegner H, F, Cl, Br, N02, OH, (lavere)alkyl eller (lavere)alkoxy, og X betegner Cl, Br, F 30 eller I, og Y betegner H, Cl, Br, F eller I, i et organisk opløsningsmiddel, der eventuelt indeholder op til ca. 25% vand, og derefter fjerner alle blokerende grupper.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en forbedret og kommercielt attraktiv fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med 35 formel (I). Anvendelsen af et polysilyleret kanamycin A eller B som udgangsmateriale giver stor opløselighed i det organiske opløsningsmiddel -system, hvilket muliggør omsætning ved høje koncentrationer. Skønt omsætningen sædvanligvis gennemføres i opløsninger indeholdende ca. 10-20%

DK 165450 B

4 polysilyleret kanamycin udgangsmateriale, er fortræffelige resultater blevet opnået ved koncentrationer på ca. 50 g/100 ml opløsningsmiddel.

Som ved kendte fremgangsmåder giver den foreliggende fremgangsmåde en blanding af acylerede produkter. Det ønskede l-N-acylerede produkt 5 adskilles fra de andre produkter ved kromatografi, og om ønsket kan biprodukterne hydrolyseres til udgangskanamycinen med henblik på recirkulering. Ved kendte fremgangsmåder viste det sig, at eventuelt 3"-N-acy-leret materiale, som fremstilledes, forårsagede et tab på ca. en tilsvarende mængde af det ønskede l-N-acylerede produkt på grund af den store 10 vanskelighed ved at adskille sidstnævnte fra førstnævnte. Et særlig attraktivt træk ved den foreliggende fremgangsmåde er den ekstremt lave mængde af uønsket 3"-N-acyleret produkt, som frembringes (typisk påvises der intet).

Ved fremstilling af l-[L-(-)-7-amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A, 15 amikacin ved forskellige kendte fremgangsmåder, frembringes der typisk også det 3"-N-acylerede produkt (BB-K11), det 3-N-acylerede produkt (BB-K29), det 6'-N-acylerede produkt (BB-K6) og polyacyleret materiale sammen med uomsat kanamycin A. Ved kommerciel fremstilling af amikacin'ved acylering af 6'-N-carbobenzyloxy kanamycin A i et vandigt medium efter-20 fulgt af fjernelse af den beskyttende gruppe blev det således fundet, at ca. 10% af det ønskede amikacin (2,5 kg i en charge på 25 kg) sædvanligvis mistedes på grund af tilstedeværelsen af BB-K11 som co-produkt. Når amikacin fremstilles ved den foreliggende fremgangsmåde påvises BB-K11 typisk ikke i reaktionsblandingen.

25 De blokerende grupper, som kan anvendes til beskyttelse af 6'-aminogruppen på kanamycinet, er konventionelle blokerende grupper til beskyttelse af primære aminogrupper, og de er velkendte for fagmanden.

Egnede blokerende grupper indbefatter alkoxycarbonylgrupper såsom t-but-oxycarbonyl og t-amyloxycarbonyl; aralkoxycarbonylgrupper såsom benzyl -30 oxycarbonyl; cycl oal kyl oxycarbonyl grupper såsom cyclohexyloxycarbonyl; halogenal koxycarbonyl grupper såsom trichlorethoxycarbonyl; acyl grupper såsom phthaloyl og o-nitrophenoxyacetyl; og andre velkendte blokerende grupper såsom o-nitrophenylthiogruppen, tritylgruppen, etc.

Den acylerende syre med formel (II) kan være i (+) eller (-) 35 isomerformen eller en blanding af de to isomere (d,l-formen), således at der fremstilles den tilsvarende forbindelse med formel (I), hvori 1-N-[ω-amino-a-hydroxyalkanoyl]-gruppen er i sin (+) [eller (R)]-form eller sin (-) [eller (S)]-form, eller en blanding deraf. Enhver sådan isomer 5 form og blandingen deraf ligger inden for opfindelsens rammer. I en foretrukket udførelsesform er den acylerende syre med formel (II) i sin (-) form. Ved en anden foretrukket udførelsesform er den acylerende syre med formel (II) i sin (+) form.

5 I en udførelsesform af opfindelsen er udgangsmaterialet poly- silyleret kanamycin A eller B (og fortrinsvis polysilyleret kanamycin A). I en anden udførelsesform er udgangsmaterialet polysilyleret kanamycin A eller B (og fortrinsvis polysilyleret kanamycin A) indeholdende en blokerende gruppe forskellig fra silyl på 6'-aminogruppen, hvilken blo- 10 kerende gruppe fortrinsvis er udvalgt blandt grupperne med formlerne:

Rl_ ch3 o o V?—λ 0 I 3 II ti ^ ^-CH2OC-, CH3-C-0-C- , Y2XCC- , X==/ ch3

11 B O

<> Ot K fj 20 i? i? x3c-ch2-o-c- og L ikc/ o 1 2 hvori R og R er ens eller forskellige og hver især betegner H, F, Cl, 25 Br, NOg, OH, (lavere)alkyl eller (lavere)alkoxy, og X betegner Cl, Br, F eller I, og Y betegner H, Cl, Br, F eller I. Den blokerende gruppe, der foretrækkes mest, er carbobenzyloxygruppen.

I en foretrukket udførelsesform af opfindelsen er det acyl erende derivat af syren med formel (II) en aktiv ester med N-hydroxysuccinimid, 30 N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid eller N-hydroxyphthalimid. Ved en anden foretrukket udførelsesform er det acyl erende derivat af syren med formel (II) et blandet syreanhydrid med pivalinsyre, benzoesyre, isobu-tylcarboxyl syre eller benzyl carboxyl syre.

I en særligt foretrukket udførelsesform angår opfindelsen frem- 35 stilling af l-N-[L-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A eller et ik-ke-toxisk, farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf, ved hvilken fremgangsmåde man acyl erer polysilyleret kanamycin A med et blandet syreanhydrid af L-(-)-Tr-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmørsyre og en af

DK 165450B

6 de ovenfor nævnte syrer.

I en artfen særligt foretrukket udførelsesform angår opfindelsen fremstilling af l-N-[L-(-)^-amino-a-hydroxybutyryl] kanamycin A eller et ikke-toxisk, farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf, ved hvil-5 ken fremgangsmåde man acylerer polysilyleret kanamycin A indeholdende en carbobenzyloxygruppe på 6'-aminogruppen med et blandet syreanhydrid af l__(.)-γ-benzyloxycarbonylami ηο-α-hydroxysmørsyre og en af de ovenfor nævnte syrer.

I endnu en særligt foretrukket udførelsesform angår opfindelsen 10 fremstilling af l-N-[L-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A eller et ikke-toxisk, farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf, ved hvilken fremgangsmåde man acylerer polysilyleret kanamycin A med en aktiv ester af L-(-)-γ-benzyloxycarbonylamiηο-α-hydroxysmørsyre med N-hydroxy-succinimid, N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid eller N-hydroxy-15 phthalimid.

I yderligere en særligt foretrukket udførelsesform angår opfindelsen fremstilling af l-N-[L-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A eller et ikke-toxisk, farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf, ved hvilken fremgangsmåde man acylerer polysilyleret kanamycin A inde-20 holdende en carbobenzyloxygruppe på S'-aminogruppen med en aktiv ester af L-(-)-γ-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmørsyre med N-hydroxysuccin-imid, N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid eller N-hydroxy-phthalimid.

I en foretrukket udførelsesform anvendes som udgangsmateriale polysilyleret kanamycin A eller B (og fortrinsvis polysilyleret kanamycin A) 25 indeholdende et gennemsnitligt antal silylgrupper (og fortrinsvis tri-methylsilylgrupper) pr. molekyle på fra 4 til 8. I en anden foretrukket udførelsesform anvendes som udgangsmateriale polysilyleret kanamycin A eller B (og fortrinsvis polysilyleret kanamycin A) indeholdende en blokerende gruppe, som er forskellig fra silyl på 6'-amino-gruppen, og et 30 gennemsnitligt antal silylgrupper (og fortrinsvis trimethylsilylgrupper) pr. molekyle på fra 3 til 7.

Betegnelsen "ikke-toxisk, farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt" af en forbindelse med formel (I) betyder, som den anvendes heri og i kravene, et mono-, di-, tri- eller tetrasalt dannet ved interaktion 35 mellem et molekyle af en forbindelse med formel (I) og 1-4 ækvivalenter af en ikke-toxisk, farmaceutisk acceptabel syre. Disse syrer omfatter eddikesyre, saltsyre, svovlsyre, maleinsyre, phosphorsyre, salpetersyre, hydrogenbromidsyre, ascorbinsyre, æblesyre og citronsyre, og de andre 7 syrer, der almindeligvis anvendes til dannelse af salte af aminholdige lægemidler.

Acylering af det polysilylerede kanamycin A eller B udgangsmateriale (med eller uden en blokerende gruppe, som er forskellig fra 5 silyl på 6'-aminogruppen) udføres i et organisk opløsningsmiddel, hvori udgangsmaterialet har tilstrækkelig opløselighed. Disse udgangsmaterialer er stærkt opløselige i de fleste almindelige organiske opløsningsmidler. Egnede opløsningsmidler omfatter f.eks. acetone, diethylketon, methyl-n-propyl keton, methyl isobutylketon, methylethyl keton, acetoni-10 tril, glyme, diglyme, dioxan, toluen, tetrahydrofuran, cyclohexanon, methylenchlorid, chloroform, carbontetrachlorid og blandinger af aceto-ne/butanol eller diethylketon/butanol. Valget af opløsningsmiddel afhænger af det særlige udgangsmateriale, der anvendes. Ketoner er sædvanligvis de foretrukne opløsningsmidler. Det mest fordelagtige opløsnings-15 middel for den specielle kombination af reaktanter, der anvendes, kan let bestemmes ved rutineforsøg.

Egnede silyleringsmidler til anvendelse ved fremstilling af de polysilylerede kanamycin-udgangsmaterialer, der anvendes heri, indbefatter silyleringsmidlerne med den almene formel 20 R\ /R4 7 f ) 25 ^Si—---nh r4 nh f

'SN;i /R4 °9 R6-Si-X

/ \ ./ 17

---Si R

30 R N \ 4 H ^ j m

IV V

35 hvori R5, R6 og R7 betegner hydrogen, halogen, (lavere)alkyl, halogen- 5 6 7 (lavere)alkyl eller phenyl, idet mindst én af grupperne R , R og R ikke betegner halogen eller hydrogen; R4 betegner (lavere)alkyl, m er et helt tal på 1 til 2, og X betegner halogen eller 8 5

DK 165450 B

.R8 -N v ^R9 o g hvori R betegner hydrogen eller (lavere)alkyl, og R: betegner hydrogen, (lavere) al kyl eller R5 10 R6-Si- R7 5 6 7 15 hvori R , R og R har den ovenfor definerede betydning.

Specifikke silylforbi ndel ser med formlerne IV og V er: trimethyl-chlorsilan, hexamethyldisilazan, triethylchlorsilan, methyltrichlor-silan, dimethyldichlorsilan, tri ethyl bromsi 1 an, tri-n-propylchlorsilan, methyldi ethylchlors i1 an, d i methyl ethylchlors i 1 an, di methyl -t-butylchior-20 silan, phenyldimethyl bromsilan, benzy1methylethylchlorsilan, phenyl-ethyl methyl chl ors i lan, triphenylchlorsilan, triphenylfluorsilan, tri-o-tolylchlors i 1 an, tri-p-di methyl ami nophenylchlorsi1 an, N-ethyltri ethyl-silylamin, hexaethyldisilazan, triphenyl silylamin, tri-n-propylsilyl-amin, tetraethyldimethyldisilazan, hexaphenyldisilazan, hexa-p-tolyl 25 disilazan, etc. Også hexaalkylcyclotrisilazaner og octa-alkylcyclotetra-silazaner er anvendelige. Andre egnede silyleringsmidler er silylamider (såsom trialkylsilylacetamider og bis-trialkylsilylacetamider), silyl-urinstoffer (såsom trimethyl silylurinstof) og silylureider. Også tri-methylsilylimidazol kan anvendes.

30 En foretrukket silylgruppe er trimethyl silylgruppen, og foretrukne silyleringsmidler til indførelse af trimethyl silylgruppen er hexamethyldisilazan, bi s (trimethyl si lyl)acetamid og tr i met hyl silylacet amid. Hexamethyldisilazan er det mest foretrukne.

Når der som udgangsmateriale anvendes polysilyleret kanamycin A el-35 ler B indeholdende en blokerende gruppe, som er forskellig fra silyl på 6'-aminogruppen, kan udgangsmaterialet fremstilles enten ved polysilyle-ring af den ønskede 6'-N-blokerede kanamycin A eller B eller ved indførelse af den ønskede 6'-N-blokerende gruppe i polysilyleret kanamycin A

DK 165450 B

9 eller B.

Fremgangsmåder til indførelse af silylgrupper i organiske forbindelser, inklusive visse aminoglycosider, er kendt inden for området.

De polysilylerede kanamyciner (med eller uden en blokerende gruppe for-5 skellig fra silyl på 6'-aminogruppen) kan fremstilles ved i og for sig kendte fremgangsmåder eller som beskrevet i nærvarende beskrivelse.

Betegnelsen polysilyleret kanamycin A eller B refererer som anvendt heri til kanamycin A eller B indeholdende fra 2 til 10 silylgrupper i molekylet. Betegnelsen polysilyleret kanamycin A eller B omfatter såle-10 des ikke persilyleret kanamycin A eller B, som ville indeholde 11 silylgrupper i molekylet.

Det præcise antal af silylgrupper, som er til stede i de polysilylerede kanamycin-udgangsmateri al er (med eller uden en blokerende gruppe, som er forskellig fra silyl på 6'-aminogruppen) (eller deres position) 15 kendes ikke. Det har vist sig, at både under-silylering og over-silyle-ring formindsker udbyttet af det ønskede produkt og forøger udbyttet af andre produkter. I tilfælde af kraftig under- eller over-silylering kan der blive dannet lidt eller slet intet af det ønskede produkt. Den sily-leringsgrad, som vil give det største udbytte af ønsket produkt, vil af-20 hænge af de særlige reaktanter, der anvendes ved acyleringstrinnet. Den mest fordelagtige silyleringsgrad under anvendelse af en vilkårlig kombination af reaktanter kan let fastslås ved rutineforsøg.

Ved fremstilling af l-N-[L-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]kanamycin A ved acylering af polysilyleret kanamycin A med N-hydroxysuccinimideste-25 ren af L-(-)-y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmørsyre i acetoneopløsning har det vist sig, at gode udbytter af det ønskede produkt fås ved anvendelse af polysilyleret kanamycin A, som er blevet fremstillet ved omsætning af fra ca. 4 til ca. 5,5 mol hexamethyldisilazan pr. mol kanamycin A. Større eller mindre mængder af hexamethyldisilazan kan an-30 vendes, men udbyttet af det ønskede produkt ved det efterfølgende acyle-ringstrin mindskes betragteligt. Ved den særlige fremgangsmåde, der er anført ovenfor, foretrækkes det at anvende fra ca. 4,5 til ca. 5,0 mol hexamethyldisilazan pr. mol kanamycin med henblik på opnåelse af maksimalt produktudbytte ved acyleringstrinnet.

35 Det vil kunne forstås, at hvert mol hexamethyldisilazan er i stand til at indføre to ækvivalenter af trimethylsilylgruppen i kanamycin A eller B. Både kanamycin A og B har ialt 11 positioner (NHg- og OH-grup-per), som kan silyleres, mens kanamycin A og B indeholdende en blokeren-

DK 165450 B

10 de gruppe, som er forskellig fra silyl på 6'-amino-gruppen, har ialt 10 sådanne positioner. 5,5 mol hexamethyldisilazan pr. mol- kanamycin A eller B kunne således teoretisk fuldstændigt silylere alle OH- og NH2-grupper på kanamycinet, mens 5,0 mol hexamethyldisilazan fuldstændigt 5 kunne silylere et mol kanamycin A eller B indeholdende en blokerende gruppe forskellig fra silyl på 6'-aminogruppen. Det menes imidlertid, at en så vidtgående silylering ikke finder sted med disse molære forhold inden for rimelige reaktionstidsrum, skønt højere silyleringsgrader fås inden for en given reaktionstid, når en silyleringskatalysator til sæt-10 tes.

Silyleringskatalysatorer accelererer i høj grad silyleringshastig-heden. Egnede silyleringskatalysatorer er velkendte inden for området og omfatter blandt andet aminsulfater (f.eks. kanamycinsul fat), sulfamin-syre, imidazol og trimethylchlorsil an. Silyleringskatalysatorer fremmer 15 sædvanligvis en højere silyleringsgrad, end hvad der er nødvendigt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Oversilyleret kanamycin A eller B kan imidlertid anvendes som udgangsmateriale, hvis det først behandles med et desilyleringsmiddel til reduktion af silyleringsgraden,før acyle-ringsreaktionen gennemføres.

20 Gode udbytter af det ønskede produkt opnås, når man acylerer poly-silyleret kanamycin A fremstillet under anvendelse af et 5,5:1 molært forhold af hexamethyldisilazan til kanamycin A. Når imidlertid kanamycin A silyleret med et 7:1 molært forhold af hexamethyldisilazan (eller med et 5,5:1 molært forhold under tilstedeværelse af en silyleringskataly-25 sator) acyleredes i acetone med N-hydroxysuccinimidesteren af benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmørsyre, opnåedes mindre end et 1% udbytte af det ønskede produkt. Når imidlertid samme "oversilylerede" kanamycin A acyleredes med samme acyleringsmiddel i acetone-opløsning, hvortil vand (21 mol vand pr. mol kanamycin; 2,5% vand (vægt/vol.) var 30 blevet tilsat som desilyleringsmiddel 1 time før acyleringen, opnåedes et udbytte på omkring 40% af det ønskede produkt. Samme resultater opnås, hvis vandet erstattes med methanol eller en anden aktiv hydrogenforbindelse, som er i stand til at udvirke desilylering, f.eks. ethanol, propanol, butandiol, methylmercaptan, ethylmercaptan, phenyl mercaptan 35 eller lignende.

Skønt det er sædvanligt at anvende tørre opløsningsmidler, når der arbejdes med silylerede materialer, har det overraskende vist sig, at tilsætning af vand til reaktionsopløsningsmidlet forud for acylering

DK 165450 B

11 selv i fravær af "oversilylering" ofte giver lige så gode udbytter og af og til bedre udbytter af ønsket produkt end et tørt opløsningsmiddel.

Ved acyleringsreaktioner gennemført i acetone ved de sædvanlige koncentrationer på 10-20% (vægt/vol.) af polysilyleret kanamycin A, har det 5 vist sig, at fortræffelige udbytter af l-N-[L-(-)-Y-amino-a-hydroxybu-tyryl]kanamycin A opnåedes, når indtil 28 mol vand pr. mol polysilyleret kanamycin A blev tilsat; ved en koncentration på 20% er 28 mol pr. mol omkring 8% vand. Ved andre kombinationer af reaktanter kan endog mere vand tolereres eller være gunstigt. Ved fremgangsmåden ifølge opfindel-10 sen anvendes i det væsentlige vandfrie organiske opløsningsmidler, hvorved forstås opløsningsmidler indeholdende op til ca. 25% vand. Et foretrukket interval er op til ca. 20%, et mere foretrukket interval er op til 8% vand, og et særlig foretrukket interval er op til ca. 4% vand.

Som anført ovenfor kan den mest ønskværdige silyleringsgrad for en 15 vilkårlig kombination af acyleringsreaktanter let bestemmes ved rutineforsøg. Det menes, at det foretrukne gennemsnitlige antal silylgrupper i udgangsmaterialet sædvanligvis vil være mellem 4 og 8 for kanamycin A eller B og mellem 3 og 7 for kanamycin A eller B indeholdende en blokerende gruppe forskellig fra silyl på β'-aminogruppen, men dette er kun 20 teori og betragtes ikke som en væsentlig del af opfindelsen.

Varigheden af og temperaturen under acyleringsreaktionen er ikke kritisk. Temperaturer i intervallet fra ca. -30°C til ca. 100°C kan anvendes til reaktionstider i området fra omkring 1 time og op til 1 dag eller mere. Det har vist sig, at reaktionen sædvanligvis forløber godt 25 ved stuetemperatur, og af bekvemmeligheds- og økonomiske grunde foretrækkes det at gennemføre omsætningen ved omgivelsestemperatur. Med henblik på opnåelse af maksimale udbytter og selektiv acylering foretrækkes det imidlertid at gennemføre acyleringen ved fra ca. 0 til 5°.

Efter afslutning af acyleringsreaktionen fjernes alle blokerende 30 grupper på i og for sig kendt måde til frembringelse af det ønskede produkt med formel (I). Silylgrupperne kan f.eks. let fjernes ved hydrolyse med vand, fortrinsvis ved lav pH-værdi. Også den blokerende gruppe B på acyleringsderivatet af syren med formel (II) og den blokerende gruppe på 6'-aminogruppen på det polysilylerede kanamycin-udgangsmate-35 ri ale (såfremt en sådan er til stede) kan fjernes ved hjælp af kendte metoder. Således kan en t-butoxycarbonylgruppe fjernes under anvendelse af myresyre, en carbobenzyloxygruppe ved katalytisk hydrogenering, en 2-hydroxy-l-naphthcarbonylgruppe ved sur hydrolyse, en trichlorethoxy- 12

DK 165450 B

carbonylgruppe ved behandling med zinkstøv i iseddikesyre, en phthaloyl-gruppe ved behandling med hydrazinhydrat i ethanol under opvarmning, etc.

Produktudbytter bestemtes på forskellige måder. Efter fjernelse af 5 alle blokerende grupper og kromatografi på en CG-50 (NH^+) søjle kunne udbyttet af amikacin bestemmes ved isolering af det krystallinske faste stof fra de passende fraktioner eller ved mikrobiologisk analyse (turbi-dimetrisk eller plade) af de passende fraktioner. En anden teknik, som anvendtes, var HP-væskekromatografi af den ureducerede acyleringsblan-10 ding, dvs. den vandige opløsning opnået efter hydrolyse af silylgrupper-ne og fjernelse af organisk opløsningsmiddel, men før hydrogenolyse til fjernelse af den eller de resterende blokerende gruppe(r). Denne analyse var ikke en direkte analyse for amikacin eller BB-K29, men for de tilsvarende mono- eller di-N-blokerede forbindelser.

15 Det anvendte instrument var en Waters Associates "ALC/GPC 244" højtryks væskekromatograf med en Waters Associates absorptionsdetektor af model 440 og en 30 cm x 3,9 mm i.d. "/t-Bondapak C-18" søjle, under følgende betingelser: 20 Mobil fase: 25% 2-propanol 75% 0,01 M natriumacetat pH 4,0 Strømningshastighed: 1 ml/min.

Detektor: UV ved 254 nm.

Følsomhed: 0,04 AUFS

25 Fortyndingsmiddel: DMS0

Injiceret mængde: 5 μΐ

Koncentration: 10mg/ml.

Kurvehastigheden varierede, men 2 minutter pr. 2,54 cm var typisk.

30 Ovennævnte betingelser gav UV-kurver med toppe, som var lette at måle kvantitativt. Resultaterne af ovenstående analyser er i beskrivelsen betegnet som HPLC-analyser.

For at undgå gentagelse af komplekse kemiske betegnelser anvendes følgende forkortelser af og til i beskrivelsen.

AHBA L-(-)-γ-ami no-a-hydroxysmørsyre

BHBA N-carbobenzyloxyderivat af AHBA

Η0ΝΒ N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid 35 13 NAE N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid- (eller BHBA-'ONB') aktiveret ester af BHBÅ HONS N-hydroxysuccinimid SAE N-hydroxysuccinimid-aktiveret ester af

5 (eller BHBA-'ONS') BHBA

DCC dicyclohexylcarbodiimid DCU dicyclohexyl urinstof HMDS hexamethyldisilazan BSA bis(trimethylsilyl)acetamid 10 MSA trimethyl si lylacetamid TFA trifluoracetyl t-BOC tert-butyloxycarbonyl.

Kana A Kanamycin A

15 "Dicalite" er et varemærke fra Great Lakes Carbon Corporation for diatoméjord.

"Amberiite CG-50" er et varemærke fra Rohm and Haas Co. for kromatografi udformni ngen af en svagt sur kationisk ionbytterharpiks'af carboxyl-polymethacryl-typen.

20 "μ-Bondapak" er et varemærke fra Waters Associates for en serie stærkt effektive væskekromatografi søjler.

Alle temperaturer heri er anført i °C.

Med betegnelserne "(lavere)alkyl" og "(lavere)alkoxy" menes, som de anvendes heri, al kyl- eller alkoxygrupper indeholdende fra 1 til 25 6 carbonatomer.

Den foreliggende opfindelse beskrives i det efterfølgende nærmere ved eksemplerne 1-18, 21-23, 25 og 27-31, som illustrerer foretrukne udførelsesformer.

30 Eksempel 1

Fremstilling af l-N-rL-(-)-y-amino-tt-hydroxybutyryllkanamycin A, amikacin, ved selektiv acylering af poly(trimeth.ylsilyl) 6'-N-carbobenzyloxv-kanamycin A i vandfri diethyl keton 6'-N-carbobenzyloxykanamycin A (15 g, 24,24 m.mol) opslæmmedes i 90 35 ml tør acetonitril og opvarmedes til reflux under nitrogenatmosfære. Hexamethyldisilazan (17,5 g, 108,48 m.mol) tilsattes langsomt i løbet af 30 minutter, og den opnåede opløsning refluxedes i 24 timer. Efter fjernelse af opløsningsmidlet i vakuum (40°) og fuldstændig tørring under

DK 165450B

14 vakuum (10 mm), opnåedes 27,9 g af et hvidt, amorft faststof [90,71% beregnet som 6'-N-carbobehzyloxykanamycin A (silyl)g]. "

Dette faste stof opløstes i 150 ml tør diethyl keton ved 23°. L-(-)-γ-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmørsyre N-hydroxy-5-norbornen-2,3-di-5 carboximidester (NAE) (11,05 g, 26,67 m.mol) opløst i 100 ml tør diethyl keton ved 23° tilsattes langsomt under god omrøring i løbet af en halv time. Opløsningen omrørtes ved 23° i 78 timer. Den gule, klare opløsning (pH 7,0) fortyndedes med 100 ml vand. pH-værdien af blandingen indstilledes til 2,8 (3 N HC1) og omrørtes kraftigt ved 23° i 15 minut-10 ter. Den vandige fase fraskiltes, og den organiske fase ekstraheredes med 50 ml vand med pH 2,8. De kombinerede vandige fraktioner vaskedes med 50 ml ethyl acetat. Opløsningen anbragtes i en 500 ml Parr-flaske sammen med 5 g 5% palladium-på-carbon katalysator (Engelhard) og reduceredes ved 3,4 atm. H2 i 2 timer ved 23°. Blandingen filtreredes gennem 15 et lag "Dicalite", som derefter vaskedes med yderligere 30 ml vand. Det farveløse filtrat koncentreredes i vakuum (40-45°) til 50 ml. Opløsningen blev fyldt på en 5 x 100 cm "CG-50" (NH^+) ionbytningssøjle. Efter vask med 1000 ml vand elueredes uomsat kanamycin A, 3-[L-(-)-7-amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A (BB-K29) og amikacin med 0,5 N ammoniumhy-20 droxid. Polyacylmateri ale blev udvundet med 3 N ammoniumhydroxid. Bioanalyse, tyndtlagskromatografi og optisk drejning anvendtes til registrering af elueringens fremadskriden. Volumenet og den iagttagne optiske drejning for hver eluatfraktion samt vægten og det procentuelle udbytte af faststof isoleret fra hver fraktion ved inddampning til tør-25 hed er sammenfattet nedenfor:

Volumen

Materiale (ml) a578 Vægt (g) % udbytte 30 Kanamycin A 1000 +0,115 0,989 9,15 BB-K29 1750 +0,24 4,37 32,0

Amikacin 2000 +0,31 6,20 47,4

Polyacyler 900 +0,032 0,288 2,0 35 Det forbrugte diethyl keton!ag vistes ved HP væskekromatografi at indeholde yderligere 3-5% amikacin.

Det rå amikacin (6,20 g) opløstes i 20 ml vand og fortyndedes med 20 ml methanol, og 20 ml isopropanol tilsattes til fremkaldelse af kry-

DK 165450 B

15 stall isation. Der opnåedes 6,0 g (45,8%) krystallinsk amikacin.

Eksempel 2

Fremstilling af l-N-rL-H-T-amino-tt-hydroxybutyryll kanamycin amika-5 cin, ved selektiv acylering af poly(trimethyl si ly!) 6'-N-carbobenzyloxy-kanamycin A i vandfri acetone

Poly(trimethylsilyl) 6'-N-carbobenzyloxy kana A fremstillet som i Eksempel 1 (103 g, 0,081 mol, beregnet som 6'-N-carbobenzyloxykanamycin A (silyl)g) opløstes i 100 ml tør acetone ved 23°. L-(-)-γ-benzyloxy-10 carbonylamino-a-hydroxysmørsyre N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid-ester (NAE) (35,24 g, 0,085 mol) opløst i 180 ml tør acetone ved 23° sattes langsomt under god omrøring til opløsningen af poly(trimethylsi-lyl)-6'-N-carbobenzyloxykanamycin A i løbet af et tidsrum på 15 minutter. Opløsningen omrørtes ved 23° i 20 timer under nitrogenatmosfære.

15 Den bleggule, klare opløsning (pH 7,2) fortyndedes med 100 ml vand. Blandingens pH-værdi indstilledes til 2,5 (3 N HC1), og omrøring fortsattes ved 23° i 15 minutter. Acetone fjernedes under anvendelse af dam-pejektorvakuum ved ca. 35°. Opløsningen anbragtes i en 500 ml Parr-fla-ske sammen med 10 g 5% palladium-på-carbon katalysator (Engelhard) og 20 reduceredes ved 2,72 atm. H2 i 2 timer ved 23°. Blandingen filtreredes gennem et lag diatoméjord, som derefter vaskedes med yderligere 50 ml vand. Efter koncentrering til omkring 1/3 volumen fyldtes opløsningen (pH 6,9-7,2) på en 6 x 110 cm "CG-50" (NH4+) ionbytningssøjle og eluere-des med en trinvis gradient fra HgO til 0,6 N ammoniumhydroxid til ud-25 vinding af amikacin. Et automatisk polarimeter anvendtes til registrering af elueringens fremadskriden. Kombinationer blev foretaget på basis af tyndtlagskromatografivurdering. De kombinerede amikacinfraktioner koncentreredes til 25-30% faststof. Opløsningen fortyndedes med et lige så stort volumen methanol efterfulgt af to volumener isopropanol til 30 fremkaldelse af krystallisation. Der blev udvundet 18,2 g (40%) krystallinsk amikacin.

Udvindingen af 12% kanamycin A, 40% BB-K29 og 5% polyacyleret kanamycin gav en materialebalance på 97%.

35 Eksempel 3

Fremstilling af l-N-fL-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryn kanamycin A, amikacin, ved selektiv acylering af poly(trimethylsilyl) kanamycin A, under anvendelse af blokering in situ

DK 165450 B

16

A. Poly(trimethylsilyl)kanamycin A

Kanamycin A fri base (18 g aktivitet, 37,15 m.mol) opslæmmedes i 200 ml tør acetonitril og opvarmedes til reflux. Hexamethyldisilazan 5 (29,8 g, 184,6 m.mol) blev tilsat i løbet af 30 minutter, og blandingen omrørtes under reflux i 78 timer til frembringelse af en lysegul, klar opløsning. Fjernelse af opløsningsmidlet under vakuum efterlod en amorf fast remanens (43 g, 94%) [beregnet som kanamycin A (silyl)^].

10 B. 1-N- TL- (-) -Ύ-amino-tt-hydroxybutyryl 1 kanamyciη A

p-(Benzyloxycarbonyloxy)benzoesyre (5,56 g, 20,43 m.mol) opslæmmedes i 50 ml tør acetonitril ved 23°. N,0-bis-trimethylsilylacet-amid (8,4 g, 41,37 m.mol) tilsattes under god omrøring. Opløsningen blev holdt ved 23° i 30 minutter og sattes så i løbet af 3 timer under kraf-15 tig omrøring til en opløsning af poly(trimethylsilyl)kanamycin A (21,5 g, 17,83 m.mol, beregnet som (si lyl ^forbindelsen) i 75 ml tør acetonitril ved 23°. Blandingen omrørtes i 4 timer, opløsningsmidlet fjernedes i vakuum (40°), og den olieagtige remanens opløstes i 50 ml tør*acetone ved 23°C.

20 L- (-) -γ-benzyl oxycarbonyl amino-a-hydroxysmørsyre N-hydroxy-5-nor- bornen-2,3-dicarboximidester (NAE) (8,55 g, 20,63 m.mol) i 30 ml acetone sattes til ovenstående opløsning i løbet af et tidsrum på 5 minutter. Blandingen blev holdt ved 23°C i 78 timer. Opløsningen fortyndedes med 100 ml vand, og pH-værdien (7,0) sænkedes til 2,5 (6 N HC1). Blandingen 25 anbragtes i en 500 ml Parr-flaske sammen med 3 g 5% palladium-på-carbon katalysator (Engelhard) og reduceredes ved 2,72 atm. i 2 timer ved 23°. Blandingen filtreredes gennem et lag diatomé jord, som dernæst vaskedes med 20 ml vand. Det kombinerede filtrat og vaskevand (168 ml) bestemtes ved mi krobi ologi sk analyse over for E. coli til at indeholde om-30 kring 11.400 mcg/ml (19% udbytte) amikacin.

Eksempel 4

Fremstilling af 1-N- TL- (-) -Ύ-amino-tt-hydroxybutyryl 1 kanamyci n A, amikacin, ved selektiv acylering af poly (tri methyl si ly!) kanamycin A 35

A. Poly (trimethyl si ly!) kanamycin A

En suspension af 10 g (20,6 m.mol) kanamycin A i 100 ml tør acetonitril og 25 ml (119 m.mol) 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazan refluxedes i

DK 165450 B

17 72 timer. Dette gav en klar lysegul opløsning. Opløsningen inddampedes til tørhed i vakuum ved 30-40°C. Der opnåedes 21,3 g po1y(trimethylsi-lyl) kanamycin A som et lyst gulbrunt amorft pulver [85% udbytte beregnet som kanamycin A (silyl)1Q]· 5

B. l-N-fL-(-)-y-amino-a-hydroxvbutyryl1kanamyciη A

Til en opløsning af 2,4 g (2,0 m.mol) poly(trimethylsilyl) kanamycin A i 30 ml tør acetone sattes langsomt 2,0 m.mol L-(-)-7-benzyloxy-carbonylamino-a-hydroxysmørsyre N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid-10 ester (NAE) i 10 ml tør acetone ved 0-5°C. Reaktionsblandingen omrørtes ved 23°C i en uge og inddampedes dernæst til tørhed i vakuum ved en badtemperatur på 30-40°C. Vand (60 ml) sattes dernæst til remanensen efterfulgt af 70 ml methanol til frembringelse af en opløsning. Opløsningen blev gjort sur med 3 N HC1 til pH 2,0 og reduceredes dernæst ved 3,40 15 atm. H2 i 2 timer under anvendelse af 500 mg 5% palladium-på-carbon katalysator. Materialet filtreredes, og kombineret filtrat og vaskevæske bestemtes ved mi krobiologisk analyse over for E. coli til at indeholde amikacin i et udbytte på 29,4%.

20 Eksempel 5

Fremstilling af amikacin ved selektiv N-acylering af polytrimethylsilyl β'-N-carbobenzoxy kanamycin A i vandfri acetone I. Sammendrag 25 Silylering af 6'-N-carbobenzoxy kana A i acetonitril under anvendelse af hexamethyldisilazan (HMDS) giver 6'-N-carbobenzoxy kana A (silyl)9-mellemproduktet1. Dette silylerede kana A er let opløseligt i de fleste organiske opløsningsmidler. Acylering med NAE i vandfri acetone ved 23° under anvendelse af et 5% molært overskud af NAE i forhold 30 til det anvendte 6'-N-Cbz kana A gav en blanding kun indeholdende Cbz-derivater af amikacin og BB-K29, noget uomsat kana A og noget polyacyl-materiale. Intet BB-K11 kunne påvises ved nogen af disse undersøgelser. Eluering af en acetoneacyleringsblånding efter reduktion og oparbejdning fra en "CG-50" (NH^+) søjle under anvendelse af en ammoniumhydroxidgra-35 dient gav isolerede udbytter af ren amikacin i området omkring 40%.

DK 165450B

18 ^1* fteaktionsskemaer A.

H0-. /0E H°->\/0H /°H

w_n r / Η.·Λ££η^ο/ 5 6> [/ 2 >»h2 f-° o [

61-N-Cbz Kana A ?H

C26H42°13N4 (618/65) fQj + (CH3)3Si-NH-Si(CH3)3 HMDS (161,4) Δ ch3cn Ψ

Ar Ro-7^ Γ ^/°R

RO / OH

HHN>-/7 ^ 6’ " 0R y/ A-NHR ^~0

+NH_ i 3 CH

R = Si(CH3)3 1 ®6'-N-Cbz Kana A (Silyi) (O) C53H114°i3N4Sig (1268,3) 19 °H . ^(ΤΊί

B. CbzNH(CH2)2-CH-COOH + HON M + DCC

(206) 0 BHBA (253,4) HONB (179,2)

Acetone

V

°H" Αά DCU + CbzHN(CH2)2-CH-C-0-N / | (224,3) 0 © NAE (414,6) C / * diCbzamikacin (854) + ^ + ^ Acetone y diCbzBB-K29 23° +

61Cbz-1,3-diBHBA-Kana A

H2 Γ“

5% Pd/C Ψ 6'Cbz Kana A

r-^N

Amikacin + BB-K29 + 1,3-diAHBA-Kana A + Kana A (585,62) (722,76) (484,5) *'CG-50"(NH4+)

Amikacin

DK 165450B

20 III. Materialer Vægt g Vol. ml Mol 5 6'-N-Cbz Kana A 50 0,081 HMDS 58,9 76,5 0,365

Acetonitril 300 BHBA 21,5 0,085 HONB 15,2 0,085 10 DCC 17,48 0,085

Acetone 260 CG-50" (NH4+) 3000

Methanol efter behov IPA efter behov 15 IV. Sikkerhed 6'-N-Cbz Kana A - Ingen direkte oplysninger til gængelige. Undgå støvkontakt.

20 Acetonitril - Behandles som et cyanid.

Undgå indånding af dampe.

Kan forårsage hudirritation.

Hexamethyldisilazan - Irritationsfremkaldende, 25 (HMDS) omgås med forsigtighed.

6'-N-Cbz Kana A (silyl)g - Ingen direkte oplysninger tilgængelige, omgås med forsigtighed.

30 BHBA - Toxicitet ikke fastslået.

Undgå eksponering for faststof.

HONB - Toxicitet ukendt. Udvis for- 35 sigtighed under håndtering.

21 DCC - Alvorligt hud- og øjen-irri terende. Undgå inhalering af tåge eller dampe. Toxisk.

5 Acetone - Brændbar. Inhalering kan frem kalde hovedpine, træthed, ophidselse, bronchial irritation og i store mængder narkose.

10 NAE - Ingen direkte information til gængelig; anvendes altid direkte som opløsning i acetone.

Methanol - Brændbar. Forgiftning kan ind- 15 træffe ved indgivelse, inhale ring eller perkutan absorption.

Isopropanol - Brændbar. Indgivelse eller in halering af store mængder af 20 dampene kan forårsage hoved pine, svimmelhed, mental depression, opkastning, narkose.

Ammoniumhydroxid - Toxiske dampe. Bær maske, undgå 25 kontakt med væske.

"CG-50" (NH4+) Ingen toxicitetsdata tilgænge lige, omgås med forsigtighed.

30 V. Fremgangsmåde A. Fremstilling af β'-N-carbobenzyloxykanamycin A (silyl)g Γβ'-N-Cbz Kana A (silyl)gl 1. Opslæm 50 g 6'-N-carbobenzyloxykanamycin A (KF <4%) i 300 ml 35 acetonitril (KF <0,01%). Bring opslæmningen til reflux (74°) under opretholdelse af en strøm af tør nitrogen gennem opslæmningen.

2. Tilsæt langsomt i løbet af et tidsrum på 30 minutter 75,8 ml hexamethyldisilazan (HMDS), Fuldstændig opløsning vil indtræffe med ud

DK 165450 B

22 vikling af ammoniakgas.

3. Fortsæt reflux i 18-20 timer under nitrogengenrremblæsning.

4. Koncentrer den klare, lysegule opløsning under vakuum (badtemperatur 40-50°) til et skumlignende faststof. Udbytter af silylg- 5 forbindelsen 89-92 g. (90-94% af teoretisk).

NB: For fremtidig reference; i andre opløsningsmiddel undersøgelser isoleres dette faststof sædvanligvis ikke, men anvendes direkte til acyleringen.

10 B. Fremstilling af N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester af L-M-Q!-carbobenzy1 oxvamino-o;-hydroxysmørsyre (NAE) 1. Opløs 21,5 g L-(-)-y-carbobenzyloxyamino-a-hydroxysmørsyre (BHBA) i 100 ml tør acetone ved 23° og derefter 15,2 g N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (Η0ΝΒ). Der fås en fuldstændig opløsning.

15 2. Tilsæt i løbet af 30 minutter en opløsning af 17,48 g dicyclo- hexylcarbodiimid (DCC) i 50 ml acetone under omrøring. Temperaturen vil stige til omkring 40° under tilsætningen med udfældning af dicyclohexyl-urinstof (DCU).

3. Omrør opslæmningen i 3-4 timer, idet temperaturen tillades at 20 udlignes til 23-25°.

4. Fjern urinstofderivatet ved filtrering; vask kagen med 30 ml acetone. Gem filtratet plus vaskevæskerne til nedenstående acylerings-trin.

25 C. Acylering af 6'-N-Cbz Kana A (silyl)g 1. Opløs 6'-N-Cbz Kana A (silyl)g isoleret under del A, trin 4, i 100 ml tør acetone ved 23-24°.

2. Tilsæt langsomt under god omrøring den under del B fremstillede NAE-opløsning i løbet af et tidsrum på 15 minutter. Temperaturen vil 30 gradvis stige til omkring 40°. Lad opløsningen komme i ligevægt ved 23°, og fortsæt omrøringen i 18-20 timer under nitrogenatmosfære.

3. Tilsæt 100 ml vand, og sænk pH-værdien (6,9-7,2) til 2,2-2,5 med 6 N saltsyre. Omrør i 15 minutter ved 23°.

(NB: Et yderligere lag kan dannes. Dette frembyder ikke noget 35 problem ved oparbejdningen).

4. Fjern acetone under vakuum ved en badtemperatur på 30-35°. Overfør koncentratet til en passende hydrogeneringsbeholder (på forhånd gen-nemblæst med nitrogen). Tilsæt 10 g 5% palladium-på-carbon katalysator, 23 og hydrogener ved 2,72 atm. i 2-3 timer.

5. Filtrer blandingen gennem et "Dicalite" lag, vask hydrogeneringsbeholderen og kagen med yderligere 50 ml vand.

O

6. Koncentrer filtratet plus vaskevæsken til omkring en trediedel 5 volumen (50 ml) under vakuum ved 40-45°.

7. Kontroller pH-værdien. Den bør være i intervallet 6,9 - 7,2.

Hvis ikke, indstil med 1 N ammoniumhydroxid. Fyld blandingen på en "CG-50" (NH4+) søjle (6 x 110 cm).

8. Vask søjlen med 1000 ml deioniseret vand. Eluer dernæst med 0,5-10 0,6 N ammoniumhydroxid under anvendelse af et automatisk polarimeter til registrering af elueringens fremskriden. Elueringsrækkefølgen er som følger:

Rest kana A......> BB-K29......> amikacin.

15 Der påvistes ikke noget BB-K11 ved nogen af acyleringsoparbejdningerne. Polyacylmateriale, dvs. 1,3-diAHBA-analogen til kana A, udvindes ved udvaskning af søjlen med 3 N ammoniumhydroxid.

20 9. Kombiner amikacin-fraktionerne og koncentrer til 25-30% fast stof. Fortynd med 1 volumen methanol, og pod med amikaci nkrystal ler.

10. Tilsæt langsomt i løbet af 2 timer 2 volumener isopropanol (IPA) under god omrøring, og krystalliser ved 23° i 6-8 timer.

11. Frafiltrer det faste stof, vask med 50 ml 1:1:2 vand/methanol/ 25 IPA-blånding, og til sidst med 25 ml IPA.

12. Tør under vakuum ved 40° i 12-16 timer. Udbytte: 17,3-19,0 g (38-42%) amikacin med følgende egenskaber:

TLC

30 CHClg - methanol - NH^OH - vand (1:4:2:1), 5 x 20 cm silikagelpla-der fra Quantum Industries - én zone som påvist med ninhydrin (RF -0,4).

Specifik drejning 35 23° H20 0,1 H NH40H 0,1 M H2S04 [a] 589 + 101,6 + 101,9 + 103,5 C = 1,0%

DK 165450 B

24 13. Udvindingen af BB-K29 i dette system var også 39-42%, restkana A 10-14% og 1,3-diAHBA-kana A omkring 5%, hvilket givef en materialebalance >95%.

5 Eksempel 6

Fremstilling af amikacin ved selektiv N-acylering af polytrimethylsilyl kana A i vandfri acetone I. Sammendrag 10 Silylering af kana A "base" i acetonitril under anvendelse af hexamethyldisilazan (HMDS) gav polytrimethylsilyl kana A. Silylerings-graden er endnu uvis, men antages for nærværende at være kana A (silyl)jQ. Polysilyleret kana A er let opløseligt i de fleste organiske opløsningsmidler. Acylering med SAE i vandfri acetone ved 23° under an-15 vendel se af et 1:1 molært forhold af SAE til anvendt kana A gav en blanding indeholdende Cbz-derivater af amikacin og BB-K29, sædvanligvis i forholdet 2-3/1; BB-K6 (omkring 5-8%), uomsat kana A (15-20%) og noget polyacylmateri ale (omkring 5-10%). Ligesom det var tilfældet ved det tidligere arbejde med acylering af polytrimethylsilyl 6'-N-carbobenzoxy 20 kana A, påvistes intet BB-K11 ved nogen af disse forsøg. Reduktion og oparbejdning af en acetoneacyleringsblånding efterfulgt af kromatografi på en "CG-50"-(NH^+) søjle under anvendelse af 0,5 N ammoniumhydroxid gav isoleret krystallinsk amikacin i området 34-39%.

25 II· Reaktionsskemaer A.

A HO OH .0H

HO / 0H

>-A AmWtKo/1 S' 6‘ NH2 2 OH I 2 f—NH2

Kana A "base" C18H36°11N4 (484,51) + (ch3)3 Si-NH-Si(CH3)3 HMDS (161,4) Δ ch3cn

V

. OR OR

A R0

RO —^ / 0R OH

ΔνΔ-9 y^xZ—S< 6* NHR

RHn 7Ί /RHN^-Ι^Γ'0

OR 1 X 3 NHR

¢/ +nh3 R = Si(CH3)3 (l) Kana A (silyl)^^ C48H116°llN4Si10 (1206,35)

DK 165450 B

26

O

?h y~]

B. CbzNH(CH2) 2-CH-COOH + HO-N + DCC

0^ BHBA N-HOS (206,3) (253,4) (115,9)

EtOAc ^ OH O - I II /

DCU + CbzNH(CH2)2CH-C-0-N

(224,3) f © SAE (350,33) f C. Cbz Amikacin (720) 4*

Cbz BB-K29 + @ + ©-Acetone ^ ^ cbz BB_K6 23° I +

Kana A

1— + H2 Polyacyler (hovedsagelig 1,3- 5% Pd/C diBHBA-Kana A) ,--:-,

Amikacin+BB-K29 + BB-K6 + 1,3-diAHBA-kana A + kana A (585,62) (722,76) "CG-50"(NH4+)

V

Amikacin

DK 165450 B

27 III. Materi al er

Vagt g Vol. ml Mol 5 Kana A "base" 50 0,103 HMDS (massefylde 0,774) 86,68 112 0,537

Acetonitril 600 SAE 35,03 0,10

Acetone 850 10 "CG-50" (NH4+) 3000

Methanol efter behov IPA efter behov IV. Sikkerhed 15 Kana A "base" - Kendt lægemiddel - sædvanlig forsigtighed tilrådes.

Kana A (silyl)1Q - Ingen direkte oplysninger tilgængelige, omgås med 20 forsigtighed.

Andre materialer - Se eksempel 5.

V. Fremgangsmåde 25

A. Fremstilling af Kana A (silyl)1Q

1. Opslæm 50 g kana A "base" (KF 2,5 - 3,5%) i 500 ml acetonitril (KF <0,01%). Bring opslæmningen til reflux (74°) under opretholdelse af en strøm af tør nitrogen gennem opslæmningen.

30 2. Tilsæt langsomt i løbet af 30 minutter 112 ml hexamethyl- disilazan (HMDS). Fuldstændig opløsning vil indtræffe inden for 4-5 timer med udvikling af ammoniakgas.

3. Fortsæt reflux i 22-26 timer under nitrogengennemblæsning.

4. Koncentrer den klare, svagt gule opløsning under vakuum (40°) 35 til en sirupsagtig remanens. Skyl med yderligere 100 ml acetonitril og tør fuldstændigt under højvakuum i 3-6 timer. Udbytter af hvidligt amorft faststof er 109-115 g. (90-95% af teoretisk, beregnet som kana A (silyl)1Q).

DK 165450B

28 B. Fremstilling af N-hydroxysuccinimidester af L-(-)-oi-carbo-bénzyloxyami no-a-hydroxysmørsyre (SAE)

1. Opløs 100 g L-(-)-Y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmørsyre (BHBA) og 45,38 g N-hydroxysuccinimid (N-HOS) i 1300 ml ethylacetat (KF

5 <0,05%) under omrøring ved 23°C.

2. Opløs 81,29 g dicyclohexylcarbodiimid (DCC) i 400 ml ethylacetat (KF <0,05%) ved 23°C. Tilsæt under god omrøring denne opløsning i løbet af 30 minutter til opløsningen fra trin 1. Temperaturen vil stige til omkring 40-42°C under samtidig udfældning af dicyclohexyl uri nstof (DCU).

10 Omrør opslæmningen 3-4 timer, idet temperaturen tillades at ligevægtsindstilles til 23°C.

3. Frafiltrer DCU; vask kagen med 250 ml ethylacetat (KF <0,05%). Bortkast DCU-kagen. Gem filtratet og vaskevæskerne.

4. Koncentrer filtratet plus vaskevæskerne til omkring 500 ml (i 15 vakuum ved 30-35°C). Noget produkt vil udkrystalliseres.

5. Overfør koncentratet til en passende beholder, og tilsæt under kraftig omrøring 100 ml heptan. Tilsæt om nødvendigt SAE podekrystaller. Krystallisation vil begynde næsten øjeblikkeligt. Omrør opslæmningen i 30 minutter ved 23°C.

20 6. Tilsæt i løbet af 30 minutter 400 ml heptan, og omrør opslæm ningen 4-5 timer ved 23°C.

7. Filtrer og vask kagen med 200 ml 3:1 heptan/ethylacetat efterfulgt af 100 ml heptan.

8. Tør i en vakuum-ovn ved 30-35°C i 18-20 timer.

25 Udbyttet er 110,1-131,4 g (80-95%). Smp. 119-120° med blødgørtng ved 114° (korr.) TLC - 4 acetone:12 benzen:l CHgCOgH - påvisning 1% vandig KMO^.

Rf - 0,7 for SAE; 0,2 BHBA på 2 x 10 cm formærkede sil i kagelpi ader fra Analtech Inc.

30

C. Acylerinq af Kana A (silyl)1Q

1. Opløs det under afsnit A, trin 4, isolerede kana A (silyl)j0 i 500 ml tør acetone ved 23°C.

2. Tilsæt hurtigt under god omrøring det under afsnit B frem- 35 stillede SAE (35,03 g) som en 10% opløsning i tør acetone i løbet af 5-10 minutter. Temperaturen vil stige omkring 5°. Lad opløsningen ligevægtsindstilles til 23°, og fortsæt omrøring i 18-20 timer.

3. Den lysorange, klare opløsning fortyndes med 400 ml vand, og pH- 29

DK 165450 B

værdien (7,0-7,5) sænkes til 2,2-2,5 med 3 N saltsyre. Den klare opløsning omrøres nu ved 23° i 15-30 minutter.

4. Acetone fjernes under vakuum ved en badtemperatur på 30-35° (en lille materialemængde kan udskilles på dette tidspunkt, men frembyder 5 ikke noget problem). Overfør koncentratet til en passende hydrogeneringsbeholder. Tilsæt 10 g palladium-på-carbon katalysator, og hydrogener ved 3,40 atm. i 2-3 timer.

5. Filtrer blandingen gennem et "Dicalite" lag, og vask hydrogeneringsbeholderen og kagen med yderligere 2 x 50 ml vand.

10 6. Koncentrer filtratet plus vaskevæskerne til omkring en trediedel volumen (150-165 ml) under vakuum ved 40-45°.

7. pH-værdien er på dette punkt i intervallet 6,0-7,0. Blandingen hældes på en "CG-50" (NH4+) søjle (6 x 110 cm).

8. Vask søjlen med 1000 ml deioniseret vand. Eluer med 0,5 N ammo- 15 niumhydroxid under anvendelse af et automatisk polarimeter til overvågning af elueringens fremadskriden. Elueringsrækkefølgen er som følger:

Rest kana A ---> BB-K6 —> BB-K29 —> amikacin.

Der påvistes ikke noget BB-K11 ved nogen af forsøgene.

20 9. Kombiner amikacinfraktionerne og koncentrer til 25-30% faststof. Fortynd med 1 volumen methanol, og pod med amikacinkrystaller.

10. Tilsæt langsomt i løbet af 2 timer 2 volumener IPA under god omrøring, og krystalliser ved 23° i 6-8 timer.

25 11. Filtrer faststoffet, vask med 35 ml 1:1:2 vand/methanol/IPA og til sidst med 35 ml IPA.

12. Tør i en vakuum-ovn ved 40° i 16-24 timer. Udbytte: 19,91- 22,84 g (34-39%) IR, PMR og CMR spektraldata var ligesom specifik rotation fuldstændig i overensstemmelse med den ønskede struktur.

30 TLC-system CHClj/methanol/NH^OH/vand (1:4:2:1) 5 x 20 cm si li kagel pi ader fra Quantum Industries -- 1 zone amikacin med Rf -0,4 (ninhydrinpåvisning).

35

DK 165450 B

30

Eksempel 7

Fremstilling af amikacin ved acylering af poly (trimethyl si lyl) 6'-N-Cbz kana Å i tetrahydrofuran med det blandede syreanhydrid af pivalinsvre og BHBA 5 A. Fremstilling af blandet anhydrid BHBA (5,066 g, 20,0 m.mol), BSA (4,068 g, 20,0 m.mol) og triethyl-amin (2,116 g, 22,0 m.mol) opløstes i 200 ml sigtetørret tetrahydrofuran. Opløsningen refluxedes i 2 1/4 time og køledes så til -110°C.

10 Pivaloylchlorid (2,412 g, 20,0 m.mol) tilsattes i løbet af 2-3 minutter under omrøring, og omrøringen fortsattes i 2 timer ved -10°C. Temperaturen fik derefter lov til at stige til 23°C.

B. Acylering af poly(trimethylsilyl) 6'-N-Cbz kana A

15 Poly(trimethylsilyl) 6'-N-Cbz kana A fremstillet som i eksempel 1 (5,454 g, 4,97 m.mol, beregnet som 6'-Cbz kana A (silyl)g) opløstes i 50 ml tør (molekylsigte) tetrahydrofuran ved 23°C. Halvdelen af den under trin A ovenfor fremstillede opløsning af blandet anhydrid (10,0' m.mol) tilsattes i løbet af 20 minutter under omrøring, og omrøringen 20 fortsattes i 7 dage.

Vand (100 ml) tilsattes derefter til reaktionsblandingen, og pH (5,4) indstilledes til 2,0 med 3 M HgSO^. Omrøring fortsattes i 1 time, og opløsningen ekstraheredes med ethylacetat. Polyacyleret materiale begyndte at udkrystalliseres, så reaktionsblandingen filtreredes. Efter 25 tørring over P205 vejede det udvundne faststof 0,702 g. Ekstraktionen af reaktionsblandingen fortsattes med ialt 4 x 75 ml ethyl acetat, hvorefter overskydende ethyl acetat blev afdrevet fra det vandige lag. En aliquot af den vandige opløsning underkastedes analyse med HPLC. Den resulterende kurve indikerede et 26,4% udbytte af di-Cbz amikacin.

30 Det vandige lag hydrogeneredes dernæst i et Parr-apparat ved 3,40 atm Hg-tryk i 2 timer under anvendelse af 0,5 g 10% Pd-på-carbon katalysator. Materialet filtreredes, og kombineret filtrat og vaskevæsker bestemtes over for E. coli til at indeholde et 31,2% udbytte af amikacin. Amikacin/BB-K29 forhold omkring 9-10/1; spor af polyacyl og uom-35 sat kana A til stede.

DK 165450 B

31

Eksempel 8

Indvirkning af vand på fremstillingen af amikacin ved acylering af poly-(trimethylsilyl) kana A i acetone-opløsning ved 23°C

5 A. Vandfrit opløsningsmiddel

Poly(trimethylsilyl) kana A fremstillet som i eksempel 3 (2,40 g, 2,0 m.mol, beregnet som kana A (silyl)iq) opløstes i 20 ml acetone, som var blevet tørret med en molekyl sigte. Opløsningen omrørtes ved 23°C, og en opløsning af SAE (0,701 g, 2,0 m.mol) i 10 ml sigtetørret acetone 10 tilsattes i løbet af 10 sekunder. Omrøring fortsattes ved 23°C i 22 timer. Vand (50 ml) tilsattes, og pH (7,5) indstilledes til 2,5. Acetonen blev afdrevet i vakuum ved 40°C, og den vandige opløsning reduceredes dernæst ved et Hg-tryk på 3,47 atm. ved 23°C i 2 timer under anvendelse af 1,0 g 10% Pd-på-carbon som katalysator. Mi krobiologisk analyse viste 15 et 31,24% udbytte af amikacin.

B. Opløsningsmiddel tilsat vand

Trin A ovenfor blev gentaget, bortset fra at 1,0 ml (56 m.mol) vand sattes til poly(trimethylsilyl) kana A opløsningen, og der omrørtes i 15 20 minutter forud for acylering med SAE. Mikrobiologisk analyse viste et 33,80% udbytte af amikacin.

Eksempel 9

Fremstilling af amikacin ved acylering af poly(trimethylsilyl) 6'-N-Cbz 25 kana A i acetone med det blandede anhydrid af BHBA og isobutylcarboxyl-syre A. Fremstilling af blandet anhydrid BHBA (1,267 g, 5,0 m.mol) og N-trimethylsilylacetamid (MSA) (1,313 30 g, 10,0 m.mol) i 20 ml sigtetørret acetone omrørtes ved 23°C, og tri -ethylamin (TEA) (0,70 ml, 5,0 m.mol) tilsattes. Blandingen refluxedes under N2-atmosfære i 2 ½ time. Blandingen afkøledes ved -20°C, og iso-butylchlorformiat (0,751 g, 0-713 ml, 5,50 m.mol) tilsattes. Triethylamin,hydrochlorid begyndte øjeblikkeligt at udskilles.

35 Blandingen omrørtes i 1 time ved -20°C.

B. Acylering

Poly(trimethylsilyl) 6'-N-Cbz kana A fremstillet som i eksempel 1

DK 165450 B

32 (6,215 g, 4,9 m.mol, beregnet som (silyl)g-forbindelsen) opløstes i 20 ml sigtetørret acetone under omrøring ved 23°C. Opløsningen afkøledes til -20°C, og den kolde opløsning af blandet anhydrid fra trin A tilsattes langsomt i løbet af 30 minutter. Reaktionsblandingen omrørtes i 5 yderligere 1 ½ time ved -20°C og derefter i 17 timer ved 23°C. Reaktionsblandingen blev så hældt i 150 ml vand ved 23°C under omrøring, pH (7,75) indstilledes til 2,5 med 3 N HC1, og omrøring fortsattes i 15 minutter. Acetone blev derefter afdrevet i vakuum ved 40°C. En aliquot af den resulterende vandige opløsning underkastedes analyse ved HPLC.

10 Den resulterende kurve viste et 34,33% udbytte af di-Cbz amikacin.

Hovedparten af den vandige opløsning reduceredes ved 3,40 atm. Hg-tryk ved 23°C i 3 1/4 time under anvendelse af 2,0 g Pd/C katalysator. Katalysatoren fjernedes ved filtrering, og kombineret filtrat og vaskevæsker bestemtes ved mi krobiologi sk analyse over for E. coli til at in-15 deholde et 35,0 % udbytte af amikacin.

Eksempel 10

Fremstilling af amikacin ved acylering af pol y( tri methyl s i ly!) 6'-N-Cbz kana A i 3-pentanon 20 Poly (tri methyl si lyl) 6'-N-Cbz kana fremstillet som i eksempel 1 (30 g, 23,65 m.mol, beregnet som 6'-N-Cbz kana A (silyl)g) opløst i 100 ml sigtetørret 3-pentanon omrørtes ved 23°C, og NAE (26,02 m.mol, 10% overskud) tilsattes i løbet af 40 minutter. Omrøring fortsattes i 113 timer ved 23°C, og blandingen sattes så til 250 ml vand under kraftig omrø-25 ring. pH (7,3) indstilledes til 2,5 med 3 N HC1, blandingen omrørtes i yderligere 30 minutter, og 3-pentanonen blev afdrevet i vakuum ved 40°C.

Den vandige opløsning ekstraheredes med 4 x 100 ml ethyl acetat. En aliquot af den vandige opløsning underkastedes dernæst analyse med HPLC.

Den resulterende kurve viste et 46,12% udbytte af di-Cbz amikacin.

30 Hovedparten af den vandige reaktionsblanding reduceredes ved 3,47 atm. Hg-tryk ved 23°C 12½ time under anvendelse af 3,0 g 10% Pd/C katalysator. Hikrobiologisk analyse af en aliquot af kombineret filtrat og vaskevæsker viste et 40,24% udbytte af amikacin. Hovedparten af den reducerede vandige reaktionsblanding koncentreredes dernæst i vakuum ved 35 40°C til omkring 100 ml og fraktioneredes på en "CG-50" (NH^+) ionbytningssøjle (ca. 10 cm x ca. 120 cm, indeholdende omkring 10 liter harpiks). Den vandige opløsning blev hældt på søjlen, søjlen vaskedes med 5 liter vand, og materialet elueredes med 0,5 N NH^OH (efterfulgt af 3 N

DK 165450 B

33 NH^OH til eluering af polyacylerede produkter). Polarimetri af fraktionerne viste et 42,7% udbytte af amikacin, et 12,0% udbytte af uomsat ka-namycin A, et 12,4% udbytte af polyacyleret materiale og et 23,2% udbytte af BB-K29.

5

Eksempel 11

Fremstilling af amikacin ved acylering af poly(trimethylsilyl) 6'-N-Cbz kana A i vandfri cyclohexanon i varierende tidsrum 10 A. Poly(trimethylsilyl) 6'-N-Cbz kana A fremstillet som i eksempel 1 (2,537 g, 2,0 m.mol, beregnet som 6'-N-Cbz kana A (silyl)g) i 300 ml tør cyclohexanon acyleredes i 20 timer ved 23°C med en NAE-opløsning i tør cyclohexanon (10,8 ml af en 0,1944 m.mol/ml opløsning, 2,10 m.mol). Reaktionsblandingen blev så sat til 150 ml vand under omrøring, og pH 15 (5,6) indstilledes til 2,5 med 3 N HC1. Cyclohexanonen blev afdrevet i vakuum ved 40°C, og en aliquot af den resterende vandige fase blev udtaget til analyse ved HPLC.

Hovedparten af den vandige fase reduceredes under 3,40 atm. Hg^ryk i 3 timer ved 23°C under anvendelse af 1,0 g 10% Pd/C katalysator. Kata-20 lysatoren fjernedes ved filtrering, og kombineret filtrat og vaskevæsker analyseredes mi krobiologisk for amikacin.

B. Omsætning A ovenfor blev gentaget, bortset fra at acyleringen blev fortsat i 115 timer i stedet for 20 timer.

25 Udbytter HPLC-analyse Mi krobiologi sk analyse amikacin (di-Cbz amikacin) Turbidimetrisk Plade

Omsætning A 49,18% 42,87% 39,16% 30 Omsætning B 56,17% 55,39% 38,45%

Eksempel 12

Fremstilling af amikacin ved acylering af poly(trimethylsilyl) β'-N-Cbz kana A i vandfri tetrahydrofuran i varierende tidsrum 35 A. Eksempel 11 A blev gentaget bortset fra, at der som opløsnings middel i stedet for tør cyclohexanon anvendtes tør tetrahydrofuran.

B. Eksempel 11 B blev gentaget bortset fra, at der som opløsningsmiddel i stedet for tør cyclohexanon blev anvendt tør tetrahydrofuran.

DK 165450 B

34

Udbytter HPLC-analyse Mi krobiologisk~analyse amikacin (di-Cbz amikacin) Turbi dimetri sk. Plade

Omsætning A 29,27% 28,34% 28,18% 5 Omsætning B 33,39% 21,52% 28,63%

Eksempel 13

Fremstilling af amikacin ved acylering af poly (trimethyl si lyl) 6'-N-Cbz kana A i vandfri dioxan i varierende tidsrum 10 A. Eksempel 11A blev gentaget bortset fra, at acyleringen fortsattes i 44 timer under anvendelse af tør dioxan som opløsningsmiddel.

B. Eksempel 11B blev gentaget bortset fra, at acyleringen fortsattes i 18 ½ time under anvendelse af tør dioxan som opløsningsmid-15 del.

Udbytter HPLC-analyse Mikrobiologisk analyse amikåcin (di-Cbz amikacin) Turbidimetrisk Plade 20

Omsætning A 39,18% 43,27% 33,36%

Omsætning B 42,82% 22,55% 33,37%

Eksempel 14

25 Fremstilling af amikacin ved acylering af poly(trimethylsilyl) 6'-N-Cbz kana A i vandfri diethyl keton ved 75°C

Til en omrørt opløsning af poly(trimethyl si lyl) 6'-N-Cbz kana A fremstillet som i eksempel 1 (2,537 g, 2,0 m.mol, beregnet som 6'-N-Cbz kana A (silyl)g) i 32 ml sigtetørret diethyl keton ved 75°C sattes en op-30 løsning af NAE (10,8 ml med 0,1944 m.mol/ml diethylketon, 2,10 m.mol) i løbet af 15 minutter. Omrøring fortsattes ved 75°C i yderligere 3 timer, hvorefter blandingen blev hældt i 150 ml vand. pH-værdien indstilledes til 2,8 med 3 N HC1, og diethyl ketonen blev afdrevet i vakuum ved 40°C. HPLC-analyse af en aliquot af den vandige fase viste et 39,18% udbytte 35 af di-Cbz amikacin.

Hovedparten af den vandige fase reduceredes under 3,39 atm. Hg-tryk i 3 1/4 time ved 23°C under anvendelse af 1,0 g Pd/C katalysator. Katalysatoren fjernedes ved filtrering, og kombineret filtrat og vaskevæsker

DK 165450 B

35 analyseredes mi krobiologi sk for amikacin. Turbidimetrisk analyse viste 27,84% udbytte, og pladeanalyse viste 28,6% udbytte. ~

Eksempel 15 5 Fremstilling af amikacin ved acylering af poly(trimethvlsilyl) kana A med NAE ved 0-5° efter tilbagehydrolysering med vand A. Silylering af kanamycin A under anvendelse af HMDS med THCS som katalysator 10 Kanamycin A (10 g med renhed 97,6%, 20,14 m.mol) i 100 ml sigte-tørret acetonitril blev bragt til reflux under nitrogenatmosfære. En blanding af HMDS (22,76 g, 141 m.mol, 7 mol pr. mol kanamycin A) og TMCS (1 ml, 0,856 g, 7,88 m.mol) blev sat til den under reflux værende reaktionsblanding i løbet af 10 minutter. Reflux fortsattes i 4 3/4 time, og 15 blandingen afkøledes dernæst, koncentreredes i vakuum til en gul viskos sirup og tørredes under højvakuum i 2 timer. Udbyttet af produkt var 23,8 g (97,9%, beregnet som kanamycin A (silyl)10).

B. Acylering 20 Poly(trimethylsilyl) kanamycin A (23,8 g, 20,14 m.mol) fremstillet under trin A ovenfor opløstes i 250 ml sigtetørret acetone ved 23° og køledes derefter til 0-5°. Vand (3,63 ml, 201,4 m.mol, 10 mol pr. mol polysilyleret kanamycin A) tilsattes under omrøring, og blandingen blev henstillet under moderat vakuum i 30 minutter. NAE (19,133 m.mol, 0,95 25 mol pr. mol polysilyleret kanamycin A) i 108,3 ml acetone tilsattes dernæst i løbet af mindre end 1 minut. Blandingen omrørtes ved 0-5° i 1 time, fortyndedes med vand, pH indstilledes til 2,5, og acetonen fjernedes dernæst i vakuum. Den vandige opløsning reduceredes så ved 3,40 atm. H2” tryk ved 23° i 2 % time under anvendelse af 2,0 g 10% Pd/C som katalysa-30 tor. Den reducerede reaktionsblanding filtreredes gennem "Dicalite", koncentreredes til ca. 100 ml i vakuum ved 40° og blev dernæst hældt på en "CG-50” (NH^+) søjle (6 liter harpiks, 5 x 100 cm). Den vaskedes med vand og elueredes så med 0,6N-1,0N-3N NH^OH. Der opnåedes 60,25% amikacin, 4,37% BB-K6, 4,35% BB-K29, 26,47% kanamycin A og 2,18% polyacyl-35 forbindelser.

DK 165450 B

36

Eksempel 16

Fremstilling af amikacin ved acylerinq af poly(trimethylsilyl) β'-N-Cbz kana A med SAE ved 0-5° efter tilbaqemethanolyse.

5 A. Silylering af 6'-N-Cbz kanamycin A

6'-N-Cbz kanamycin A (20,0 g, 32,4 m.mol) i 200 ml sigtetørret ace-tonitril blev bragt til reflux under nitrogenatmosfære. HMDS (47,3 ml, 226,8 m.mol, 7 mol pr. mol 6'-N-Cbz kana A) blev tilsat i løbet af 10 minutter, og reflux fortsattes i 20 timer. Blandingen køledes dernæst, 10 koncentreredes i vakuum og tørredes under højvakuum i 2 timer til frembringelse af 39,1 g hvidt amorft faststof (95,4% udbytte, beregnet som 6'-N-Cbz kana A (silyl)g).

B. Acylerinq 15 Poly(trimethylsilyl) 6'-N-Cbz kana A (39,1 g, 32,4 m.mol) fremstillet under trin A ovenfor opløstes i 400 ml tør acetone under omrøring ved 23°. Methanol (6,6 ml, 162 m.mol, 5 mol pr. mol polysilyleret 6'-N-Cbz kana A) tilsattes, og blandingen omrørtes ved 23° i 1 time'under en stærk nitrogenstrøm. Blandingen afkøledes til 0-5°, og en opløs-20 ning af SAE (11,35 g, 32,4 m.mol) i 120 ml for-kølet tør acetone tilsat tes. Blandingen omrørtes i yderligere 3 timer ved 0-5° og anbragtes dernæst i et 4° koldt rum i 1 uge. Vand (300 ml) tilsattes, pH indstilledes til 2,0; blandingen omrørtes i 1 time, og acetonen blev derefter afdrevet i vakuum. Den resulterende vandige opløsning reduceredes ved 3,67 25 atm. Hg-tryk i 17 timer ved 23° under anvendelse af 3,0 g 10%-Pd/C som katalysator. Den filtreredes dernæst gennem "Dicalite", koncentreredes i vakuum til 75-100 ml, blev fyldt på en "CG-50" (NH4+) søjle og eluerét med vand og 0,6 N NH^OH. Der opnåedes 52,52% amikacin, 14,5% BB-K29, 19,6% kanamycin A og 1,71% polyacyl-forbindel ser.

30

Eksempel 17

Fremstilling af amikacin ved acylerinq af poly(trimethylsilyl) kana A med SAE ved 0-5° efter tilbagehydrolysering med vand 35 A. Silylering af kanamycin A med TMCS i acetonitril under anvendelse af tetramethylguanidin som syreacceptor Kanamycin A (4,88 g, 10,07 m.mol) suspenderedes i 100 ml sigtetørret acetonitril under omrøring ved 23°. Til den omrørte suspension sat-

DK 165450 B

37 tes tetramethylguanidin (TMG) (16,234 g, 140,98 m.mol, 14 mol pr. mol kanamycin A). Blandingen opvarmedes til reflux, og TMCS“(15,32 g, 140,98 m.mol, 14 mol pr. mol kanamycin A) blev tilsat i løbet af 15 minutter.

Et hvidt bundfald af TMG.HC1 dannedes, efter at ca. halvdelen af TMCS 5 var blevet tilsat. Blandingen afkøledes til stuetemperatur, koncentreredes til en klæbrig remanens og tørredes under højvakuum i 2 timer. Det faste stof tritureredes med tør THF (100 ml), og det uopløselige TMG.HC1 frafi 1 treredes og vaskedes med 5 x 20 ml portioner THF. Kombineret filtrat og vaskevæsker koncentreredes i vakuum ved 40° til en klæbrig rema- 10 nens og tørredes under højvakuum i 2 timer. Der opnåedes 10,64 g af en lys flødefarvet, klæbrig remanens (87,6% udbytte, beregnet som kanamycin A (silyl)1Q).

B. Acylering 15 Poly(trimethylsilyl) kanamycin A (10,64 g, 10,07 m.mol) fremstillet under trin A ovenfor opløstes i 110 ml sigtetørret acetone under omrøring ved 23°, og opløsningen afkøledes til 0-5°. Vand (1,81 ml, 100,7 m.mol, 10 mol pr. mol polysilyleret kana A) tilsattes, og opløsningén omrørtes i 30 minutter under moderat vakuum. SAE (3,70 g, 10,57 m.mol, 20 5% overskud) i 40 ml for-kølet tør acetone tilsattes i løbet af mindre end 1 minut, og blandingen omrørtes i 1 time. Blandingen oparbejdedes ved den generelle fremgangsmåde i eksempel 16 B til frembringelse af ca.

50% amikacin, ca. 10% BB-K29, 5-8% BB-K6, ca. 20% kanamycin A og 5-8% polyacylforbi ndel ser.

25

Eksempel 18

Fremstilling af poly(trimethylsilyl) kanamycin A i pyridin under anvendelse af HMDS

Kanamycin A (10,0 g, 20,64 m.mol) suspenderedes i 100 ml sigtetør-30 ret friskdestilieret pyridin ved 23°. Nitrogengennemstrømning startedes, og suspensionen blev bragt til reflux. HMDS (17,33 g, 107,32 m.mol, 5,2 mol pr. mol kanamycin A) blev tilsat i løbet af 10 minutter, og blandingen refluxedes i 19 timer. Den afkøledes dernæst til stuetemperatur, koncentreredes i vakuum til en lysegul-gylden sirup og tørredes under 35 højvakuum til et hvidt amorft fast stof. Der opnåedes 22,1 g (92,6% udbytte, beregnet som kanamycin A (silyl)-^q) .

DK 165450 B

38

Eksempel 19

Fremstilling af poly(triethyl silyl) kanamycin A under afvendelse af tri-ethvlchlorsilan med triethylamin som syreacceptor

Kanamycin A (5,0 g af 97,6% renhed, 10,07 m.mol) suspenderedes i 5 100 ml sigtetørret acetonitril ved 23°. Triethylamin (TEA) (33,8 ml, 24,5 g, 241,7 m.mol) tilsattes, og suspensionen blev bragt til reflux.

En opløsning af trichlorethyl sil an (23,7 ml, 21,3 g, 140,98 m.mol) i 25 ml tør acetonitril tilsattes i løbet af 20 minutter. Reflux fortsattes i yderligere 7 timer, og blandingen køledes til stuetemperatur, hvorefter 10 lange fine nåle af TEA.HC1 udskiltes. Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 16 timer, koncentreret i vakuum ved 40° til et klæbrigt fast stof og tørret i 2 timer under højvakuum til et dyb-orange klæbrigt fast stof. Det faste stof tritureredes med 100 ml tør THF ved 23°, og det uopløselige TEA.HC1 frafiltreredes, vaskedes med 5 x 20 ml THF og 15 tørredes til frembringelse af 16,0 g TEA.HC1. Kombineret filtrat og vaskevæsker koncentreredes i vakuum til et fast stof og tørredes under høj-vakuum i 2 timer. Der opnåedes 19,3 g poly(triethyl silyl) kanamycin A som en dyb-orange viskos sirup.

20 Eksempel 20

Fremstilling af poly(trimethylsilyl) kanamycin A under anvendelse af bis-trimethylsilylurinstof

Kanamycin A (10,0 g af 99,7% renhed, 20,58 m.mol) suspenderedes i 200 ml sigtetørret acetonitril under omrøring ved 23°. Til suspensionen 25 sattes bis-trimethylsilylurinstof (BSU) (29,45 g, 144,01 m.mol, 7 mol pr. mol kanamycin), og blandingen blev bragt til reflux under nitrogenatmosfære. Reflux fortsattes i 17 timer, og reaktionsblandingen afkøledes derefter til stuetemperatur. En lille mængde tilstedeværende uopløseligt materiale fjernedes ved filtrering, vaskedes med 3 x 10 ml por-30 tioner acetonitril og tørredes (1,1381 g). Infrarød analyse viste, at dette var BSU plus en lille mængde uomsat kanamycin A. Kombineret filtrat og vaskevæsker afkøledes til 4° i 16 timer. Yderligere fast stof skiltes ud, fjernedes som ovenfor (7,8 g) og vistes ved infrarød analyse at være BSU plus urinstof. Det lysegule filtrat og vaskevæskerne kon-35 centreredes i vakuum ved 40° og tørredes under højvakuum til frembringelse af 27,0 g af et hvidt fast stof, som dels var klæbrigt og dels var fine nålelignende krystaller. Det faste stof behandledes med 150 ml hep-tan ved 23°, den uopløselige del fjernedes ved filtrering, vaskedes med

DK 165450 B

39 2 x 50 ml portioner heptan og tørredes til frembringelse af 6,0 g hvide nåle (vistes ved infrarød analyse at være BSU plus urinstof). Kombineret filtrat og vaskevæsker koncentreredes i vakuum ved 40° og tørredes under højvakuum i 2 timer til frembringelse af 20,4 g hvide nåle, hvis infra-5 røde spektrum var typisk for polysilyleret kanamycin A. Beregninger viste, at produktet i gennemsnit indeholdt 7,22 trimethylsilylgrupper.

Eksempel 21

Fremstilling af amikacin ved acvlering af per(trimethylsilyl) kanamycin 10 A efter partiel desilylering med 1,3-butandiol

A. Fremstilling af per(trimethyl si1yl) kanamycin A

Kanamycin A (10,0 g, 20,639 m.mol) suspenderedes i 100 ml sigte-tørret acetonitril under omrøring ved 23°. Suspensionen blev bragt til 15 reflux under en nitrogenstrøm, og HMDS (23,322 g, 144,5 m.mol, 7 mol pr. mol kanamycin A) tilsattes i løbet af 10 minutter. Reflux fortsattes i 16 timer, og blandingen køledes dernæst til stuetemperatur, koncentreredes i vakuum og tørredes i 2 timer under højvakuum. Der opnåedes 24;3 g af en hvid, klæbrig remanens (92,1% udbytte beregnet som kanamycin A 20 (silylJjj).

B. Acylering

Per(trimethylsilyl) kanamycin A (24,3 g) fremstillet under trin A ovenfor opløstes i 240 ml sigtetørret acetone under omrøring ved 23°.

25 Til denne opløsning sattes 1,3-butandiol (9,25 ml, 103,2 m.mol, 5 mol pr. mol per(trimethyl silyl) kanamycin A. Blandingen omrørtes ved 23° i 2 timer under en nitrogenstrøm og køledes så til 0-5°. SAE (7,23 g, 20,64 m.mol) i 70 ml for-kølet acetone tilsattes i løbet af ca. 1 minut. Blandingen omrørtes ved 0-5° i 3 timer og blev så henstillet i et 4° koldt 30 rum i ca. 16 timer. Vand (200 ml) tilsattes, pH indstilledes til 2,5, og den klare gule opløsning omrørtes ved 23° i 30 minutter. Acetonen blev afdrevet i vakuum, og den vandige opløsning reduceredes ved 3,74 atm.

H2-tryk ved 23° i 2 timer under anvendelse af 3,0 g 10% Pd-på-carbon som katalysator. Den reducerede opløsning filtreredes gennem "Dicalite" og 35 kromatograferedes som i eksempel 16 B til frembringelse af 47,50% amikacin, 5,87% BB-K29, 7,32% BB-K6, 24,26% kanamycin A og 7,41% polyacylfor-bindelser.

DK 165450 B

40

Eksempel 22

Fremstilling af amikacin ved acylering af pol.y (trimethyl silyl) kanamycin A fremstillet i THF under anvendelse af SAE med sul faminsyrekatalysator Til en under reflux værende blanding af kanamycin A (5,0 g, 10,32 5 m.mol) i 50 ml sigtetørret tetrahydrofuran (THF) sattes sulfaminsyre (100 mg) og HMDS (12,32 g, 76,33 m.mol). Blandingen refluxedes i 18 timer, idet fuldstændig opløsning indtraf efter 6 timer. Opløsningen afkø-ledes til 23°, behandledes med 0,1 ml vand og blev holdt på 23° i 30 minutter. En opløsning af SAE (3,61 g, 10,3 m.mol) i .36 ml THF tilsattes i 10 løbet af 30 minutter. Efter omrøring i 3 timer fortyndedes blandingen med 100 ml vand, og pH indstilledes til 2,2 med 10% HgSO^. Den omrørtes i 30 minutter ved 23° og koncentreredes så i vakuum til fjernelse af THF. Den resulterende vandige opløsning reduceredes ved 3,40 atm. Hg-tryk i 2 timer ved 23° under anvendelse af 10% Pd-på-carbon som kataly-15 sator. Den reducerede opløsning filtreredes gennem "Dicalite", og det faste stof vaskedes med vand. Kombineret filtrat og vaskevæsker (150 ml) bestemtes ved mi krobiologisk analyse over for E. coli til at indeholde 1225 mcg/ml (31,5% aktivitetudbytte) af amikacin.

20 Eksempel 23

Fremstilling af amikacin ved acylering af poly(trimethyl silyl) kanamycin A med N-hydroxysuccinimidesteren af di-carbobenzyloxy AHBA

A. Fremstilling af di-carbobenzyloxy L- (-) -ot-ami no-ot-hydroxy smørsyre N-25 hydroxysucci nimi dester

Di-carbobenzyloxy L-(-)-a-amino-a-hydroxysmørsyre (8 g, 20,65 m.mol) og N-hydroxysuccinimid (2,37 g, 20,65 m.mol) opløstes i 50 ml tør acetone ved 23°. Dicyclohexylcarbodiimid (4,25 g, 20,65 m.mol) opløst i 20 ml tør acetone tilsattes, og det hele omrørtes ved 23° i 2 timer. Di-30 cyclohexylurinstof frafiltreredes, filterkagen vaskedes med 10 ml tør acetone, og filtratet og vaskevæskerne kombineredes.

B. Acylering

Poly(trimethylsilyl) kanamycin A fremstillet i overensstemmelse med 35 den generelle fremgangsmåde i eksempel 21 ud fra 10,0 g (20,639 m.mol) kanamycin A opløstes i 100 ml tør acetone. Opløsningen køledes til 0-5°, 3,7 ml deioniseret vand tilsattes, og opløsningen omrørtes ved 0-5° i 30 minutter under moderat vakuum.

DK 165450 B

41

Til denne opløsning sattes den under trin A fremstillede opløsning af det di-Cbz-blokerede acyleringsmiddel, og blandingerr omrørtes ved 0-5° i 30 minutter. Blandingen fortyndedes med vand, pH indstilledes til 2,2, og acetonen blev fjernet i vakuum. Den vandige opløsning reducere-5 des ved den generelle fremgangsmåde i eksempel 22 og filtreredes dernæst gennem "Dicalite". Kromatografi viste 40-45% amikacin, ca. 10% BB-K29, spormængder af BB-K6, ca. 30% kanamycin A og en ringe mængde polyacyl-forbindel ser.

10 Eksempel 24

Fremstilling af poly(trimethylsilyl) kanamycin A under anvendelse af HMDS med imidazol som katalysator

Kanamycin A (11 g, 22,7 m.mol) og 100 mg imidazol opvarmedes til reflux i 100 ml sigtetørret acetonitril under en nitrogenstrøm. HMDS 15 (18,48 g, 114,5 m.mol, 5 mol pr. mol kanamycin A tilsattes i løbet af 30 minutter, og blandingen refluxedes i 20 timer. Fuldstændig opløsning indtraf på ca. 2 ½ time. Opløsningen afkøledes til 23°, og opløsningsmidlet fjernedes i vakuum og efterlod 21,6 g poly(trimethylsilyl) kanamycin A som en skumagtig remanens (93,1% udbytte beregnet som kanamycin 20 (silyl)n).

Eksempel 25

Fremstilling af l-N-fL-(-)-y-amino-tt-h.ydroxybutyryl] kanamycin B (BB-K26) ved acylering af poly(trimethylsilyl) kanamycin B med SAE 25 A. Fremstilling af poly(trimethvlsi1,yl) kanamycin B under anvendelse af HMDS med TMCS-katalysator

Kanamycin B (25 g, 51,7 m.mol) i 250 ml sigtetørret acetonitril opvarmedes til reflux under en nitrogenstrøm. HMDS (62,3 g, 385,81 30 m.mol, 7,5 mol pr. mol kanalycin B) tilsattes i løbet af 30 minutter efterfulgt af 1 ml TMCS som katalysator. Blandingen refluxedes i 21 timer med fuldstændig opløsning efter 1 time. Opløsningsmidlet fjernedes i vakuum ved 60°, og den olieagtige remanens blev holdt ved 60° under højvakuum i 3 timer. Der opnåedes 53,0 g poly(trimethylsilyl) kanamycin B 35 (85,2% udbytte beregnet som kanamycin B (silyl)1Q).

DK 165450 B

42 B. Acylering

Det under trin A ovenfor fremstillede poly(trimethyl silyl) kanamycin B (53,0 g) opløstes i 500 ml tør acetone ved 0-5°, methanol (20,9 ml) tilsattes, og blandingen omrørtes i vakuum i 30 minutter ved 5 0-5°. En opløsning af SAE (18,1 g, 51,67 m.mol) i 200 ml for-kølet acetone tilsattes i løbet af mindre end 1 minut, og blandingen omrørtes i 30 minutter ved 0-5°. Blandingen oparbejdedes i overensstemmelse med den generelle fremgangsmåde i eksempel 22 og blev så fyldt på en søjle af "CG-50" (NH4+) (8 x 120 cm). Den elueredes med en NH^OH gradient fra 10 0,6 N til 3 N. Der opnåedes 38% BB-K26, 5% af det tilsvarende 6'-N-acylerede kanamycin B (BB-K22), 10% af det tilsvarende 3-N-acylerede kanamycin B (BB-K46) 14,63% kanamycin B og en lille mængde polyacyleret kanamycin B.

15 Eksempel 26

Fremstilling af pol y (tri methyl si lyl) kanamycin A under anvendelse af HMDS med kanamycin A sulfat som katalysator

Kanamycin A (19,5 g, 40,246 m.mol) og kanamycin A sulfat (0,5 g, 0,858 m.mol) [ialt = 20,0 g, 41,0 m.mol] i 200 ml sigtetørret aceto-20 nitril blev bragt til reflux. HMDS (60,3 ml, 287,7 m.mol, 7 mol pr. mol kanamycin A) blev langsomt tilsat, og blandingen refluxedes i 28 timer.

Den blev dernæst inddampet til tørhed i en rotationsinddamper og tørredes under dampinjektorvakuum. Der opnåedes 47,5 g poly(trimethylsilyl) kanamycin A som en bleggul olie (95,82% udbytte beregnet som kanamycin A 25 (silyl)10).

Eksempel 27

Fremstilling af amikacin ved acylering af poly(trimethylsilyl) kanamycin A med N-trifluoracetyl -blokeret AHBA N-hydroxysuccinimidester 30 A. Fremstilling af N-trifluoracetyl AHBA og omdannelse til dens N-hydroxysuccinimidester

Til en suspension af AHBA (5,0 g, 42 m.mol) i 100 ml THF sattes trifluoreddikesyreanhydrid (40g, 191 m.mol) under omrøring i løbet af 10 35 minutter. Opløsningen omrørtes i 18 timer ved 23° og koncentreredes dernæst til tørhed i vakuum ved 50°. Remanensen opløstes i 100 ml vandig methanol (1:1) og omrørtes i 1 time. Den koncentreredes dernæst til tørhed i vakuum og genopløstes i 50 ml H2O. Den vandige opløsning ekstrahe- 43

DK 165450 B

redes med 3 x 50 ml portioner af MIBK, og ekstrakten koncentreredes efter tørring over Na2S04 til en olie. Opløsningsmiddelspor fjernedes ved tilsætning og afdestillation af 4 ml vand. Ved henstand ændredes olien til et voksagtigt krystallinsk faststof (2,5 g, 28% udbytte).

5 N-trifluoracetyl AHBA (2,4 g, 11,3 m.mol) opløstes i 50 ml tør acetone, og N-hydroxysuccinimid (1,30 g, 11,31 m.mol) sattes til opløsningen. En opløsning af dicyclohexylcarbodiimid (2,33 g) i 20 ml tør acetone tilsattes langsomt. Reaktionsblandingen omrørtes i 2 timer ved 23°, og det udfældede di cyclohexyl uri nstof fjernedes ved filtrering og 10 vaskedes med en lille portion acetone. Kombineret filtrat og vaskevæsker (en opløsning af N-hydroxysuccinimidesteren af N-tri fluoracetyl AHBA) anvendtes under det næste trin uden isolering.

B. Acylering 15 Til en opløsning af poly(trimethylsilyl) kanamycin A fremstillet som i eksempel 26 (11,31 m.mol) i 54 ml acetone sattes 2,0 ml (113,4 m.mol) vand, og blandingen omrørtes i vakuum ved 0-5° i 30 minutter. N-hydroxysuccinimidesteren af N-trifluoracetyl AHBA fremstillet under'trin A ovenfor (11,31 m.mol) sattes til blandingen, og den blev derefter 20 holdt på 5° i 1 time. pH-værdien indstilledes så til ca. 2,0 med 20% H2S04, blandingen omrørtes i 30 minutter, og pH-værdien hævedes så til ca. 6,0 med NH^OH. Blandingen blev derefter inddampet til tørhed i en rotationsinddamper til frembringelse af 14,4 g af et klæbrigt off-white fast stof. Det faste stof opløstes i 100 ml vand, pH-værdien hævedes fra 25 5,5 til 11,0 med 10 N NH^OH, og opløsningen opvarmedes i et oliebad ved 70° i 1 time. pH (9,5) sænkedes til 7,0 med HC1, opløsningen finfiltre-redes til fjernelse af en lille mængde uopløselige bestanddele, og filteret vaskedes med vand. Kombineret filtrat og vaskevæsker (188 ml) til -førtes en "CG-50" (NH^+) søjle (8 x 90 cm), vaskedes med 2 liter vand og 30 elueredes med en NH^OH gradient (0,6N-l,0N-koncentreret). Der opnåedes 28,9% amikacin, 5,0% BB-K6, 5,7% BB-K29, 43,8% kanamycin A, 3,25% poly-acylforbindel ser plus 14,3% af et ukendt materiale, som var i den første fraktion fra søjlen.

35

DK 165450 B

44

Eksempel 28

Fremstilling af amikacin ved acylerinq af poly(trimethyisilyl) kanamycin A med t-butyloxycarbonyl-blokeret AHBA N-hydroxysuccinimidester 5 A. Fremstilling af t-BOC AHBA og omdannelse til dens N-hydroxvsuccin-imidester

En opløsning af AHBA (5,0 g, 42 m.mol) i 100 ml vand og 20 ml acetone indstilledes til pH 10 med 10 N NaOH. I løbet af 3-4 minutter tilsattes 11,6 g (53 m.mol) di-t-butyldicarbonat), og opløsningen om-10 rørtes i 35 minutter, idet pH-værdien blev holdt på 10 ved periodisk tilsætning af 10 N NaOH. Acetonen fjernedes i vakuum, og den vandige fase vaskedes med 40 ml ethyl acetat. pH-værdien af den vandige opløsning sænkedes til 2,0 med 3 N HC1, og opløsningen ekstraheredes dernæst med 3 x 30 ml MIBK. De kombinerede MIBK ekstrakter tørredes over NagSO^ og 15 koncentreredes til en klar olieagtig remanens (8,2 g, 89%).

t-B0C-AHBA (4,25 g, 19,4 m.mol) opløstes i 50 ml acetone, og N-hydroxysuccinimid (2,23 g, 19,4 m.mol) tilsattes. En opløsning af di-cyclohexylcarbodiimid (4,00 g, 19,4 m.mol) i 20 ml acetone tilsattes langsomt, og blandingen omrørtes i 2 timer ved 23°. Det udfældede di-20 cyclohexyl uri nstof fjernedes ved filtrering og vaskedés med en lille mængde acetone. Kombineret filtrat og vaskevæsker (en opløsning af N-hydroxysuccinimidesteren af t-B0C-AHBA) anvendtes ved det næste trin uden isolering.

25 B. Acylerinq

Til en opløsning af poly(trimethylsilyl) kanamycin A fremstillet som i eksempel 26 (41,28 m.mol) i 94 ml acetone sattes 3,5 ml (194 m.mol) vand, og blandingen omrørtes i vakuum ved 0-5° i 30 minutter. N-hydroxysuccinimidesteren af t-B0C-AHBA fremstillet under trin A ovenfor 30 (19,4 m.mol) tilsattes, og blandingen henstod ved 5° i 1 time. Vand (200 ml) tilsattes, og pH (7,0) sænkedes til 2,0 med 20% HgSO^. Efter 30 minutters omrøring hævedes pH til ca. 6,0 med NH^OH, og blandingen inddampedes til tørhed i vakuum til frembringelse af 36,3 g af en gylden olie. Olien opløstes i 200 ml tri fluoreddikesyre, henstod i 15 minutter 35 og inddampedes til tørhed i en rotationsinddamper. Olien vaskedes med vand, og vandet flash-afdampedes. Koncentreret NH^OH tilsattes til pH

6,0 og flash-afdampedes. Det resulterende faste stof opløstes i vand, filtreredes, og filteret vaskedes med vand. Kombineret filtrat og vaske-

DK 165450 B

45 væsker (259 ml) blev fyldt på en "CG-50" (NH^+) søjle (8 x 92 cm), vasket med 4 liter vand og elueret med en NH^OH gradient (0,6N-l,0N-koncen-treret). Der opnåedes 40,32% amikacin, 4,58% BB-K6, 8,32% BB-K29, 30,50% kanamycin A og 7,43% polyacylforbi ndel ser.

5

Eksempel 29

Den generelle fremgangsmåde fra eksempel 1 gentages, bortset fra at det deri anvendte 6'-N-carbobenzyloxykanamycin A erstattes med en ækvi-molær vægtmængde 6'-N-carbobenzyloxykanamycin B, og der fremstilles der-10 ved et l-N-[L-(-)-7-amino-a-hydroxybutyryl) kanamycin B.

Eksempel 30

Den generelle fremgangsmåde fra eksempel 1 gentages, bortset fra at den deri anvendte L-(-)-y-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxysmørsyre N-15 hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester erstattes med henholdsvis L-(-) -β-benzyl oxycarbonyl ami no -a- hydroxyprop i onsy re N - hydroxy- 5- norbornen - 2,3-di carboximidester og L-(-)-6-benzyloxycarbonylami no-a-hydroxyvale-rianesyre N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester, og der fremstilles derved henholdsvis l-N-[L-(-)-)3-amino-a-hydroxypropionyl]kanamycin A 20 og l-N-[L-(-)-5-amino-a-hydroxyvaleryl]kanamycin A.

Eksempel 31

Den generelle fremgangsmåde fra eksempel 25 gentages, bortset fra at der i stedet for den deri anvendte L-(-)-γ-benzyloxycarbonylamino-e-25 hydroxysmørsyre N-hydroxyester anvendes henholdsvis L-(-)-/?-benzyloxycarbonyl amino-a-hydroxypropionsyre N-hydroxysuccinimidester og L-(-)-6-benzyloxycarbonylamino-a-hydroxyvalerianesyre N-hydroxysuccinimidester, og der fremstilles derved henholdsvis l-N-[L-(-)-/i-amino-a-hydroxy-propionyl]kanamycin B og l-N-[L-(-)-6-amino-a-hydroxyvaleryl]kanamycin 30 B.

Eksempel 32

Fremstilling af BB-K8 ved acylering af po1.y(trimethy1silyl)-3,6/-di-N-carbobenzyloxykanamycin A i vandfri diethyl keton 35

A. S^'-di-N-carbobenzyloxykanamycin A

En suspension af 7,26 g (15 mmol) kanamycin A (fri base) og 18,6 g (75 mmol) nikkelacetattetrahydrat i 300 ml dimethyl sul foxid (DMS0) op-

DK 165450 B

46 varmedes til 100°C i ca. 30 minutter under omrøring, indtil der opnåedes en klar, grøn opløsning. Efter afkøling sattes en opløsning af 11,8 g (37,6 mmol) N-carbobenzyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid i 50 ml DMSO til opløsningen. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur natten over, be-5 handledes med 100 ml kone. ammoniakvand og 1 liter vand, omrørtes ved stuetemperatur i 1 time og overførtes til toppen af en "Diaion HP-10" søjle (300 ml). Søjlen underkastedes trinvis eluering, først med 7 N NH^OH, så med methanol-vand (1:1) og endelig med methanol-vand (10:1) under opsamling af 20 ml fraktioner og overvågning véd hjælp af tyndt-10 lagskromatografi på "Merck Silica Gel 60 F-254" plader under anvendelse af chloroform-ethanol-28% ammoniumhydroxid (1:2:1). En portion af det ønskede produkt, som krystalliserede som fine nåle fra fraktioner indeholdende produktet i høje koncentrationer, frafiltreredes, hvorved man fik en analytisk prøve. Filtratet og de andre fraktioner indeholdende 15 det ønskede produkt (Rf 0,42) kombineredes, og opløsningen inddampedes i vakuum. Remanensen tritureredes med diethylether, hvorved man fik ialt 9,7 g (86%) af det i overskriften anførte produkt. Smp. >300°C.

IR (KBr): vc=o 1690 cm'1. NMR (DMS0-dg + DC1, pD ca. 3): 8 4,76- 5,26 (ΘΗ,πι,Η^,Hj" og CO-OCHg-CgHg x 2), 7,26(10H,s,CO-0CH2-CgH5 x 2).

20 Analyse beregnet for ^^gN^Ojg.HgO: C, 52,98; H, 6,54; N, 7,27

Fundet: C, 53,20; H, 6,42; N, 7,04.

B. Poly(tri methyl sily1)-3,67-di-N-carbobenzyloxykanamyci η A

En blanding af 1,5 g (2 mmol) 3,6'-di-N-carbobenzyloxykanamyciη A 25 fra trin A ovenfor og 1,29 g (8 mmol) hexamethyldisilazan i 15 ml tør acetonitril til bagesval edes i 16 timer. Den klare opløsning koncentreredes til tørhed i vakuum, og remanensen opløstes i 20 ml tør diethyl-keton. Opløsningen anvendtes direkte i det næste trin.

30 C. Acylering af polyitrimethylsilyD-S^'-di-N-carbobenzyloxy- kanamycin A under anvendelse af en ækvimolær mængde acylerinqsmiddel Til opløsningen fra trin B ovenfor sattes under omrøring 700 mg (2 mmol) L- (-) -ai-carbobenzyl oxyamino-a-hydroxysmørsyre-N-hydroxysuccin-imidester (SAE). Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 19 timer, be-35 handledes så med 8 ml vand og 35 ml tetrahydrofuran (THF), indstilledes til pH 3 med vandig saltsyre, omrørtes i 30 minutter og koncentreredes til tørhed i vakuum. Remanensen opløstes i en blanding af 30 ml vand, 40 ml methanol, 10 ml n-butanol og 40 ml THF og hydrogeneredes natten over 47

DK 165450 B

i nærværelse af 500 mg 10% palladium-på-carbon. Katalysatoren fjernedes ved filtrering, og filtratet inddampedes i vakuum og lyofili seredes, hvorved man fik 1,7 g rå BB-K8. Det amorfe pulver genopløstes i vand, og opløsningen indstilledes til pH 4 med vandig saltsyre og kromatografere-5 des på en søjle af "Amberlite CG-50" + cyklen. Søjlen underkastedes trinvis eluering med vand, 0,1 N i NH4 NH^OH, 0,3 N NH^OH, 0,5 N 4NH^0H og 2 N NH^OH, under opsamling af 10 ml fraktioner og overvågning ved hjælp af tyndtlagskromatografi under anvendelse af "Merck Silica Gel 60 F-254" plader under anvendelse af chloroform-methanol-28% ammonium-10 hydroxid-vand (1:4:2:1). De homogene fraktioner kombineredes, inddampedes og lyofili seredes til sidst. Fraktioner indeholdende BB-K8 og fraktioner indeholdende genvundet kanamycin A analyseredes under anvendelse af hhv. K. pneumoni a A20680 og B.subtil is PCI 129.

15 Fraktion NH40H Vægt Udbytte Produkt Rf- nr. (N) (%) værdi 32-39 0,1; 0,3 102 mg partielt af blokeret produkt 20 40-46 0,3 174 mga 7C kanamycin A 0,42 47-59 0,3; 0,5 106 mg uidentificeret 0,33 produkt 60-78 0,5 816 mgb 67c BB-K8 0,18 89-95 2 70 mg 5 diacylkanamycin A 0,05 25 .......................-.........-.....................................

(a) 408 mcg/mg (b) 956 mcg/mg (c) baseret på bioanalyse.

Hydrogenolyse af det partielt afbi okerede produkt med Pd-C efterfulgt af isolering på en "CG-50" søjle gav yderligere 30 mg (2%) 30 BB-K8. Det samlede udbytte af BB-K8 blev 846 mg (69%).

D. Acylering af po1.y(trimethylsil.yl-3,6'-di-N-carbobenzyloxy- kanamycin A under anvendelse af 1,2 ækvivalenter acyleringsmiddel Trin C ovenfor blev gentaget, bortset fra, at der anvendtes et 20% 35 overskud af acyleringsmiddel. Der opnåedes følgende resultater.

DK 165450 B

48

Fraktion NH^OH Vægt Udbytte Produkt Rf- nr‘. (N) (%) - værdi 28-29 0,2 107 mg partielt af- 5 blokeret produkt 30-41 0,2 157 mg uidentificeret 0,35 produkt 42-52 0,3 120 mg uidentificeret produkt 0,30 10 53-81 0,3;0,5 750 mga 60b BB-K8 0,14 94-116 1; 2 147 mg 11 diacylkanamycin A 0,05 (a) 933 mcg/mg (b) baseret på bioanalyse.

15 Hydrogenolyse af det partielt afbl okerede produkt med Pd-C

efterfulgt af isolering på en "CG-50" søjle gav yderligere 21 mg (2%) BB-K8. Det samlede udbytte af BB-K8 blev 771 mg (62%).

E. Acylering af pol.y(trimethylsilyl-3,6'-di-N-carbobenzyl-20 oxykanamycin A under anvendelse af 1,5 ækvivalenter acylerinqsmiddel Trin C ovenfor blev gentaget, bortset fra at der anvendtes et 50% overskud af acyleringsmiddel. Der opnåedes følgende resultater.

DK 165450B

49

Fraktion NH^OH Vægt Udbytte Produkt Rf- nr. (N) (%) " værdi (fremkaldt to gange) 5 ------------------------------------------------------------------------ 29-39 0,2 293 mg partielt af blokeret produkt 40-47 0,3 95 mga 6C kanamycin A 0,67 65-80 0,5 582 mgb 29c BB-K8 0,33 10 100-130 1; 2 543 mg 26 diacylkanamycin A 0,09 (a) 860 mcg/mg (b) 880 mcg/mg (c) baseret på bioanalyse.

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af l-N-tø-amino^-hydroxy-alkanoyl]kanamycin A eller B med den almene formel (I)

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den aminobloke-20 rende gruppe B er en carbobenzyloxygruppe.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at der som udgangsmateriale anvendes et polysilyleret kanamycin A eller B, som indeholder en blokerende gruppe udvalgt blandt grupper med formlerne 25 R1 \ __, Λ OH·, o n )f^\ ° I II ° ^ y—ch2oc-, ch3-c-o-C“ , y2xcc- , 3o “3 P Q- ' no2 DK 165450 B O II O \ Il Y X3C-CH2-0“C- og 5 π 12. hvori R og R er ens eller forskellige, og hver især betegner H, F, Cl, Br, NOg, OH, (lavere)al kyl eller (lavere)alkoxy, og X betegner Cl, Br, F eller I, og Y betegner H, Cl, Br, F eller I, på 6'-aminogruppen.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at der som ud- 10 gangsmateriale anvendes et polysilylert kanamycin A eller B, som indeholder en carbobenzyloxygruppe på 6'-aminogruppen.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, KENDETEGNET ved, at der som udgangsmateriale anvendes kanamycin A eller B indeholdende et gennemsnitligt antal silylgrupper pr. molekyle på 4-8.

5 CH-NH- HCK NH2 R I 10 y λ TvA / Ni NH HO-^ CH,OH / C=0 / ΗΟ-ί H \ / (0H_) \ \ / i z n

15 NH27x\ / ?H2 HO \ / NH2 hvori R betegner OH eller NH2, og n er et helt tal på 0 til 2, eller et 20 ikke-toxisk, farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf, KENDETEGNET ved, at man acylerer polysilyleret kanamycin A eller B eller polysi-lyleret kanamycin A eller B indeholdende en blokerende gruppe, som er forskellig fra silyl på 6'-aminogruppen, med a) en aktiv ester af N-hydroxysuccinimid, N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dicarboxamid eller N- · 25 hydroxyphthalimid, eller b) et blandet syreanhydrid af pivalinsyre, benzoesyre, isobutylcarboxylsyre eller benzylcarboxyl syre og en syre med den almene formel (II) B-HN-CH2-(CH2)n-CH-C00H (II)

30 OH hvori n er et helt tal på 0 til 2, og B betegner en aminoblokerende gruppe med formlen

35 R1 ch. O o T\-cJL. CHj-C-oi- , Y2xcc- , 2)LJ k3 ΈΓ DK 165450 B ^ “ p- O- Ο-p- 5. o o II 10 0 II X3C-CH2-0-C- eller S 12. hvori R og R er ens eller forskellige, og hver især betegner H, F, Cl,

15 Br, N02, OH, (lavere)alkyl eller (lavere)alkoxy, og X betegner Cl, Br, F eller I, og Y betegner H, Cl, Br, F eller I, i et organisk opløsningsmiddel, der eventuelt indeholder op til ca. 25% vand, og derefter fjerner alle blokerende grupper.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, KENDE TEGNET ved, at der som udgangsmateriale anvendes kanamycin A eller B indeholdende en blokerende gruppe forskellig fra silyl på 6'aminogruppen og et gennemsnitligt antal silylgrupper pr. molekyle på 3-7.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, KENDE-

20 TEGNET ved, at silylgrupperne er trimethylsilyl.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af l-N[L-(-)-<a-amino-a-hydroxy-alkanoyl]kanamycin A ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, KENDETEGNET ved, at acyleringen udføres med a) en aktiv ester af N-hydroxy-succinimid, N-hydroxy-5-norbonen-2,3-dicarboxamid eller N-hydroxyphthal- 25 imid, eller b) et blandet syreanhydrid af pivalinsyre, benzoesyre, iso-butyl carboxyl syre eller benzyl carboxyl syre og en syre med formlen L-(-)-B-HN-CH2-(CH2)n-CH-C00H OH 30 hvori B og n har de i krav 1 anførte betydninger. 35