DE2818992A1 - Verfahren zur herstellung von 1-n-eckige klammer auf omega-amino- alpha-hydroxyalkanoyl eckige klammer zu -kanamycinen und neue zwischenprodukte zu deren herstellung - Google Patents

Description

PAT ENTAN WX LTC

DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KiNZEBACH

' BAUERSTRASSE 22. Ο-ΘΟΟΟ MÜNCHEN AO - FERNRUFfOSS) 37 63 33 · TELEX 52152Oa [SAR D

POSTANSCHRIFT: POSTFACH 78O. D-SOOO MÜNCHEN 43

München, 28. April 1978 M/19 100

j 345 Park Avenue

BRISTOL-MYERS COMPANY 345 Park Avenue

New York, N.Y.10022 / USA

Verfahren zur Herstellung von 1-N-^j-

Amino-oi-hydroxyal kanoyl7kanainyeinen

und neue Zwischenprodukte zu deren Her- !

stellung

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Die Erfindung betrifft den durch die Ansprüche gekennzeichneten-Gegenstand.

Kanamycine sind wohlbekannte Antibiotika. Sie sind beispielsweise im Merck Index, 8. Ausgabe, Seiten 597 bis 598, beschrieben. Es gibt auch zahlreiche Derivate der Kanamycine. Die
Strukturformeln der Kanamycine A und B sind nachstehend angegeben. Dort findet sich auch das allgemein verwendete Standardnumerierungssystem. Nachstehend werden die verschiedenen Kanamycinderivate als Derivate des Kanamycins A oder B bezeichnet, um die Notwendigkeit eines Vergleichs komplexer Strukturformeln zur Feststellung von Unterschieden zu vermeiden.

HO

NH-

NH

Kanamycin A: Kanamycin B:

R = OH R= NH

Die US-Patentschrift 3 781 268 offenbart das l-/t-(-)-f-Aminoo<-hydroxybutyryVkanamycin A (Amikacin) und B, sowie deren

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; Mono- und Dicarbobenzylaxy-geschützten Derivate. Höhere und

niedrigere Homologe sind in den US-Patentschriften 3 886 139 j und 3 904 597 offenbart. Die Verbindungen werden hergestellt, \ ι indem man ein 6'-N-geschütztes Kanamycin A oder B mit einem · acylierenden Derivat einer N-geschützten L-(-) -'f-Amino-itf-hydroxy'-buttersäure in einem wässerigen Medium acyliert und anschließend! eine oder beide N-schUtzenden Gruppen entfernt.

Die US-Patentschrift 3 974 137 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von l-/l-(-)-7^N'-Amino-'3<-hydroxybutyryUkanamycin A, das darin besteht_s daß man 6'-Carbobenzyloxykanamyciη A mit mindestens 3 Mol Benzaldehyd, einem substituierten Benzaldehyd oder Pivaldehyd umsetzt, um das 6'-N-Carbobenzyloxykanamycin A, welches Schiffsche Baseneinheiten an den 1,3- und 3^M-Positionen enthält, herzustellen und dann dieses Tetra-geschützte Kanamycin Α-Derivat mit dem N-Hydroxysuccinimidester der L-(-}-f-Benzyloxycarbonylamino-(X-hydroxybuttersäure acyliert und anschließend die Schutzgruppen entfernt.

Die belgische Patentschrift 828 192 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von l-/l-(-)-7""-Amino-x-hydroxybutyryl7kanamycin A durch Herstellung desselben Tetra-geschützten Kanamycin Α-Derivats wie in der US-Patentschrift 3 974 137 beschrieben, anschließendes Acylieren mit dem N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester der L- (-)-7^v- Benzyl oxy car bony !amino —X- hy droxybuttersäure und schließlich Entfernen der Schutzgruppen.

Die Erfindung betrifft ein verbessertes und in wirtschaftlicher Hinsicht brauchbares Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I. Die Verwendung eines polysiIyIierten Kanamycins A oder B als Ausgangsmaterial ergibt eine große Löslichkeit im organischen Lösungsmittel system. Dies erlaubt die Durchführung der Reaktion bei hohen Konzentrationen. Obgleich man die Reaktion üblicherweise in Lösungen durchführt,

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die ungefähr 10 bis 2ü % polysilyliertes Kanamycin-Ausgangsmaterial enthalten, erzielt man auch ausgezeichnete trgebnisse ] bei Konzentrationen von ungefähr 50 g/100 ml lösungsmittel.

Wie bei den Arbeitsweisen des Standes der Technik ergibt das erfindungsgemäße Verfahren eine Mischung acylierter Produkte. Das gewünschte 1-N-acylierte Produkt wird von den anderen Produkten durch Chromatographie abgetrennt- Gewünschtenfal1s kann man die Nebenprodukte zum Ausgang-Skanamycin hydrolysieren, um dieses wieder einzusetzen. Im Gegensatz hierzu wurde bei xien Arbeitsweisen des Standes der Technik festgestellt_s daß jegliches gebildetes, in 3"-5tel limg N-acyliertes Material den Yerlust einer ungefähr gleichen Menge des gewünschten ijri 1-Stellung J<-acyl ierten Produkts bedeutete und zwar aufgrund aer großen Schwierigkeit, das letztere von der ersten 1/erbindung abzutrennen. Ein besonders günstiges Merkmal des erfi-ndungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß nur eine extrem geringe Menge an unerwünschtem in 3"-Stellung J^-acylierten Produkt gebildet wird (üblicherweise läßt sich die Anwesenheit dieses Produkts überhaupt nicht feststellen).

Wenn man das \-£l-(-)-*-Amino-o?-hydroxybutyry!/kanamycin A₅ d.h. das Amikacin nach verschiedenen Arbeitsweisen des Standes der Technik herstellt, wird üblicherweise auch das in 3"-Stellung N-acylierte Produkt {BB-Kll), das in 3-Stellunf N-acylierte Produkt (BB-K29), das in 6'-Stellung N-acylierte Produkt (BB-K6) und polyacyliertes Material gebildet. Ferner fällt unumgesetztes Kanamycin A an. Es wurde somit bei der Herstellung von Amikacin in industriellem Maßstaß durch Acylierung von 6'-N-Carbobenzyloxykanamycin A in einem wässerigen Medium, gefolgt von Entfernen der Schutzgruppe, festgestellt, daß ungefähr 10 % des gewünschten Amikacins (2,5 kg bei einem Ansatz von 25 kg) üblicherweise verlorengeht» und zwar aufgrund der Anwesenheit von BB-Kll als Nebenprodukt. Wenn man dagegen

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Amikacin durch das erfindunssgemäße Verfahren herstellt, läßt
sich üblicherweise das BB-KIl in der ReaktionsmiscJiung noch
nicht einmal nachweisen. j

ί Die Erfindung schafft somit ein Verfahren zur Herstellung eines j l-N-Zw-Amino-oc-hydroxyalkanoyUkanamycins A oder B der al Ige- I meinen Formel I:

NH

worin R für OH oder NHp steht und η eine ganze Zahl von O bis 2 j ! darstellt, oder nicht-toxischer, pharmazeutisch verträglicher j Säureadditionssalze dieser Verbindungen, das dadurch gekenn- j zeichnet ist, daß man polysiIyIiertes Kanamycin A oder B oder
polysilyliertes Kanamycin A oder B, das an der 6'-Aminogruppe
eine von Silyl verschiedene Blockierungsgruppe enthält, mit
einem acylierenden Derivat der Säure der allgemeinen Formel II

B-HN-CH₂-(CH₂)_n-CH-C00H (II)

OH

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worin η eine ganze ZahT von ö bis 2 bedeutet und B eine AminobTockierende Gruppe bedeutet, in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend sämtliche BTockierungsgruppen entfernt. ;

Bei den zum Schützen der 6'-Aminogruppe des Kanamycins und der Aminogruppe der acylierenden Säure (Gruppe B in Formel II) verwendeten BTockierungsgruppe kann es sich um übliche Blockierungsgruppen zum Schutz primärer Aminogruppen handeln. Diese i sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Blockierungsgruppen gehören Alkoxycarbonylgruppen, beispielsweise tert.-Butoxy-

carbonyl und tert.-Amyloxycarbonyl , Aralkoxycarbonylgruppen, j beispielsweise Benzyloxycarbonyl, Cycloalkyl οxycarbony!gruppen,I beispielsweise Cyclohexyloxycarbonyl, Halogenalkoxycarbonyl- ι gruppen, beispielsweise Trichloräthoxycarbonyl , Acylgruppen, | beispielsweise Phthaloyl und o-Nitrophenoxyacetyl , und andere i bekannte Blockierungsgruppen, beispielsweise die o-Nitrophenyl-[ thiogruppe, die Tritylgruppe, und dergleichen. j

Die acylierende Säure aer allgemeinen Formel II kann in ihrer J (+) oder (-) isomeren Form oder als Mischung der beiden Iso- i meren (d,l-Form) vorliegen. Auf diese Weise wird die entspre™ j chende Verbindung der allgemeinen Formel I gebildet, in der die l-N-^-Amino-tf-hydroxyalkanoylJ-Gruppe in ihrer ( + ) /"oder

(R)7-Form oder ihrer (-) /"öder (S)7-Form, oder in einer Mischung davon, vorliegt. Jede isomere Form, und deren Mischung fallen ! in den Rahmen der Erfindung. Bei einer bevorzugten Ausflihrungs-j form liegt die acylierende Säure der allgemeinen Formel II in ihrer (-)-Form vor. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt die acylierende Säure der allgemeinen Formel II in ihrer (+)-Form vor.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Ausgangsmaterial polysilyliertes Kanamycin A oder B (und vorzugsweise polysily-

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liertes Kanamycin fr}. In einer anderen AtisführungsfornL handelt es sieb beim Ausgangsmaterial um polysilyliertes Kanamycin A oder B (und vorzugsweise polysilyliertes Kanamycin A), das an der 6^r-Aminogruppe eine von Silyl verschiedeae &lockierungsgruppe enthält. Diese Blackierungsgrupge ist vorzugsweise ausgewählt unter den Gruppen der nachfolgenden Formeln:

ff

CH, O

CE--C-G-C-CH,

Y₂XCC-

S-'

X₃C-CH₂-O-C- und

1 2
worin R und R gleich oder verschieden sind und jeweils für H, F₅ Cl₅ Br₅ NO₂J OH₅ (niedrig)Alkyl oder (niedrig)Alkoxy stehen und X für Cl₅ Br₅ F oder J steht und Y die Bedeutungen H,

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tm -ta-

€1, Br, F oder Jl l3esitzt. Öle bevorzugteste Bl ockieriings gruppe ■ist die

in einer ievorzugten Äusfuη rungsform jde.r Erfindung handelt es sich beim acyliereniien Derivat der Saure der allgemeinen Formel II um einen aktiven Ester. Vorzugsweise handelt es sich um den aktivenister mit ft-flydroxysuccinimid, ft-Hydroxy-1J-niirbo.rn.en-2,3-dicarboximid oder W-ttydroxyptitiiaHinid. In einer weitere« bevorzugten Äusführüngsform handeit es sicli beim acylierendeii Derivat der 5'Sure der allgemeinen forme? Il vm ein Gemisch -des-S'äiireafihydrids, vorzugsweise um das Gem is cti -as-s Säyreanhydrids mit PivalinsStfTe, Benzoesltjre-, IsofeutylicoiiJensäiire oder ßenzyJ-1cöt»i ensaure.

In einer besonders bevorzugten Au sfiih rungs form betrifft die Erfindung die Herstellung von 1 -1!t-ifL-{-)-f-&mno-oL-hyaroxy■-"butyryijfkanamycin A₃ oder eines nicnt-toxischen, pnar-roazeutisxh verträglichen Siiüreadditionssaizes davon, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man polysilyliertes Kanamycin A mit einem- gemischten Säirreanhydrid der L-{-}-^"-Benzyloxycarbonyl amino-oi-nydroxybuttersäure {vorzugsweise sein gemischtes SSureanh^drid mit Pivalinsäure, Benzoesäure, Isobutylkohlensäure oder BenzylkohTensäure} in einem ira wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend sämtliche Blockierungsgruppen entfernt.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Herstellung von 1-N-/1- (-)-'/-Ann no-jjihydroxybutyryl7kanamycin A oder nicht-toxischer, pharmazeutisch verträglicher Säureadditionssalze davon, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man polysiIyIiertes Kanamycin A das an der 6'-Aminogruppe eine Carbobenzyloxygruppe aufweist, mit einem gemischten Säureanhydrid der L-i-J-^Benzyloxycarbonylamino-o(-hydroxybuttersäure (vorzugsweise sein gemisch-

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tes Anhydrid mit fivalinsäure, Benzoesäure, Isobutylkohlensäure oder Benzyl kohl en sä* ure) in einem im wesentlichen wasserfreien organischen lösungsmittel acyliert und anschließend alle Blockiejrungsgruppen entfernt.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft! die Erfindung die Herstellung von 1 -N-/L-{-)-/"-Ämino-oi-hydroxybutyry!/kanamycin A oder eines ßicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon, wobei das Verfahren ! dadurch gekennzeichnet ist, daß man polysilyliertes Kanamycin Ä j mit einem aktiven Ester 4er L-{-)-?^v-Benzyl oxycarbonyl amino-«*- ] hydroxybuttersäure (und vorzugsweise ihrem aktiven Ester rait I K-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbörnefl-2»2-di£arfroxiiBid j oder N-Hydroxyphthaliraid) in einem im wesentlichen wasserfreien j organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend sämtliche ί Blockierungsgruppen entfernt. !

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform b-etrifft j die Erfindung die Herstellung von l-N-/L~{-)-'}-Annno-ai-hydrQxy- ! butyryUkanamycin A oder eines nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon, wobei das Verfahren ί dadurch gekennzeichnet ist, daß man polysilyliertes Kanamycin A das an der 6'-Aminogruppe eine Carbobenzyloxygruppe enthält, mit einem aktiven Ester der L-(-)-^"-Benzyl oxycarbonylaraino-oihydroxybuttersäure (und vorzugsweise ihrem aktiven Ester mit N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-iiorbornen-2_s3-dicarboximid oder N-Hydroxyphthalimid} in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend sämtliche Blockierungsgruppen entfernt.

Die Erfindung betrifft auch polysilyliertes Kanamycin A oder B, das an der 6¹-Aminogruppe eine von SiIyI verschiedene Blockierungsgruppe enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Material um polysilyliertes Kanamycin A

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ader B (und vorzugsweise polysilyliertes Kanamycin A), ; cta-s eine durchschnittliche Anzahl, von 4 bis S Silylgruppen | J (vorzugsweise TrtmethylsiTylgruppen} pro Molekül enthält. Blei j einer weiteren bevorzugten Äusführungsform handelt es sich ί beim Material um pOlysilyliertes Kanamycin Ä oder B (Vorzugs- i weise fro-Tysilyliertes ICanamycin A^, das an der 6 '-Aminagruppe eine von SiIyV verschiedene frlackierungsgruppe aufweist urtd eine durchschnittliche Anzahl von 3 bis 7 SJ Iy T gruppe η ζ vorzugsweise TrimethylsilylgruppenJ pro tfoleküt enthält.

&er hier verwendete Begriff "nieht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches Säoreadditioassalz" einer Verbindung der allge- | meinen Formel £ bedeutet ein Etano-» Dri-_V Tri- oder Tetrasalz^ das durch Reaktion- eiaes Moleküls einer Verbindung der allgemeinen Formel I mit 1 bis 4 Äquivalenten einer nicht-toxischen * pharmazeutisch verträglichen Säure gebildet ist. Zu derartigen Säuren gehören Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure» Schwefelsäure Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure Ascorbinsäure» Apfelsäure und Zitronensäure, sowie alle anderen Sauren-* die üblicherweise zur Bildung von Salzen mit Aminenthaltenden Pharmazeut!ka gebraucht werden.

t Die Acylierung des polysilylierten Kanamycin A oder B-Ausgangsj materials ( mit oder ohne eine von Silyl verschiedene Blockierungsgruppe an der 6'-Aminogruppe) kann im allgemeinen in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, indem das Ausgangsmaterial eine ausreichende Löslichkeit besitzt. Die Ausgangsmaterialien sind gut löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören beispielsweise Aceton, Diäthylketon, Methyl-n-propylketon, Methylisobutylketon, Methyläthyl keton, Acetonitril, Glyme, Diglyme, Dioxan, Toluol, Tetrahydrofuran, Cyclohexanon, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und Mischungen aus Aceton/Butanol oder Diäthylketon/Butanol . Die Wahl des Lösungsmittels

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- lft -

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hängt vom jPeweils eingesetztem Ätrsgangsmaterial ab. Im allgemeinensirtd Ketone bevorzugte Lösungsmittel. Das jeweils : günstigste Lösungsmittel für eine bestimmte Kombination von .: Reaktionspartnem kann durch Routineuntersuchungen leicht heraus gefunden werden. :

Zu geeigneten Silylierungsmitteln zur Verwendung be-i der HersteTttrng der hier verwendeten poTysilytierten Kanaroyctfi-Äusgangsmaterialfen gehören die tfer nachfolgenden allgemeinen Formelrv IV und V:

NH

NH

■Si

>R

und

R⁶-Si-X

IV

worin R₅ R und R jeweils für Wasserstoff, Halogen, (niedrig)-Alkyl, Halogen(nisdriq)alkyl und Phenyl stehen können, wobei mindestens eine der Gruppen R , R und R von Halogen oder Wasserstoff verschieden sind, R für (niedrig)Alkyl steht, m eine ganze Zahl von 1 bis 2 darstellt und X die Bedeutungen Halogen und

-n:

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R für Hasserstoff oder tnietfriulATskyl steht unß R- die Äasserstsff,-fniedrig311i<y1 oder:

besitzt.» worin fi , S° und R die vorstellenden Bedeutungen lie-

-A5s Beispiele fflr spezifische Sily^T/erbinäün-gen tie*· IV und V ίς^Λίΐ -nian nennen: Trimethyl^?orsnIa^, iiexametfeyldi- ■ ; silazan, Triathyichlors iian , Methyl trkh^siU«, Biraeth^ldl- j Triäthyl bronsilan , Tri-«-propy1xh1orsi lan-, Methyl- !

lati» OimethyläthylchlOirsiJan., Dimethyl -tert^ Tiutylehlorsilan, PhertyldimetiiyibriJinsiian, Senzylraetnyiätfiyichlorsilan» Phenyläthylmethyl chlorsiSan, fri^henylcnlOrsilan, TripiieTii'lfluorsilan, Tri-Q-to?yJi;ii3©rsi1aTi, Trΐ -p-dimethylarain-ophenyl chlorsi lan, N-Ätfeyl triät-hylsilylarain , Hexaäthyldisilazan» Triphenyisilylamin , Tri-n-propjlsjiylamin, Tetraäthyldimethyldisi 1 azan , Hexaphenyldisil azan , Hexa-p-tolyMisi la· zan, und dergleichen. Ebenfalls brauchbar sind Hexaalkylcyclotrisilazane und octa-Ali<yl cycl otetrasi lazane. Andere geeignete Silylierungsmittel sind Silylaraide (beispielsweise Trialkylsilylacetamide und bis-Trialkylsilylacetamide), Silylharnstoffe (beispielsweise Trimethylsi IyI harnstoff) und Silylureide. Man kann auch Trimethylsilylimidazol einsetzen.

Eine bevorzugte Silylgruppe ist die Trimethylsilylgruppe. Bevorzugte Silylierungsmittel zur Einführung der Trimethylsilylgruppe sind Hexamethyldisil azan , Bis(trimethyl silyl )acetaniid und Trimethyl si IyI acetamid. Am bevorzugtesten ist das Hexamethyldisilazan.

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Verwendet roan ein polysilyl vertes Kanamycin A oder 8, ^as ae der 6* -Afflinogrupp* eine von SI IyI verschiedene Slocfcienmgsgruppe enthält, so kann dieses Atisgangsmaterial entweder dadurch hergestellt werden, daß «an das gewünschte» ia 5¹-5tsllttng H-blockierte Kanamycin Ä oder £ polysilyliert oder die gemiBsefete ö'-N-Biocicierungsgmppe ie polysiiyl iertes Kanajayci« A eder { S etnfönrt.

Methoden zur Einführung sron Silylgruppen in organische düngen, einschließlich bestimmter Aainoglyc^side, sind bekannt. ! Die polysilylierten Kanamycine {jnit aaer dhx\& eine 31-ockierimfs gruppe an der 6³-Aminogruppe-, die von Silyl verschieden ist) können nach Methoden hergestellt werden, die an sich bekannt sind oder im vorliegenden Text besenrieben 5ind^

0er hier verwendete Begriff "polysilyl iertes Kanamycin A ©-der ! ß" betrifft Kanamycin A -oder Ή, das 2 bis 10 Silylgruppen ira ! Molekül aufweist- So umfaßt ^Jer Begriff "polysilyliertes Kanafliycin A öder S" nicht ein persilyliertes Kanamycin A oder 8, ; das 11 Silylgruppen im Molekül enthielte-I

Die genaue Anzahl der Silylgruppen {oder deren Stellung) im j polysilylierten Kanawycin-Ausgangsmaterial (mit oder ohne eine J Blockierungsgruppe an der 6'-Aminogruppe, die von Silyl verschieden ist) ist nicht bekannt. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß UntersiIyIierung und Qbersilylierung die Ausbeute an gewünschtem Produkt absenken und zu einem Ansteigen anderer Produkte führen. Im Falle einer starken Unter- oder übersilyl ie·· ■ rung kann es dazu kommen, daß nur wenig oder überhaupt kein

gewünschtes Produkt gebildet wird. Der Silylierungsgrad, der ι zur größten Ausbeute an gewünschtem Produkt führt, hängt von

^: den jeweiligen Reaktionspartnern ab, die bei der Acylierungsstufe eingesetzt werden. Der jeweils vorteilhafteste Silylierungsgrad bei irgendeiner Kombination von Reaktionspartnern

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kann d/trreh- F-outirremä^iges ÄuspxoMeren- leicht festgestellt

Bei der Herstellung «ort t-Pf-/t-(-y-f-AmirKF-of-ttydroxybutyryl/- j kanamycin ä durch Acylierung verr polysilyltertem Kanamycin A j mirt dem Pt-Kydroxysuceinimidester der L-f-y-^BenryloxycarbonyT- f anrino-sf-hydrtixybuttersäure in Acetonl&sung wurde erfindungsge- [ maß festgestellt, da,3 man gute Ausbeuten art gewünschtem Produkt | erhält, wenrt man Bolysilyüertes Kanamycin Ä einsetzt, das ί

! durch Rea-ktton von ungefähr <$ bis ungefähr 5»5 Mal HexamethyT-disilazan pro Molekül Kanamycin A hergestellt wurde. Man kctnn
! era-eh größere oder kleinere Mengen an Hexamethyldisilazan ein- ι setzen, jedoch wird h-ierdurcn die Ausbeute an gewünschtem Pro- i j dukt bei d^r nachfolgenden Acylierungsstufe merklich verringert»

\ &ei der obigen spezifischen Arbeitsweise wird bevorzugt, unge- [ [ fähr 4,5 bis ungefähr 5,0 Mol Hexamethyldisilazan pro Mol ; ^ Kanamycin einzusetzen, um bei der Acylierungsstufe eine maximale Produktausb-eute zu erzielen.

Pro Mol Hexamethyldisilazan können zwei Äquivalente der Tri- | methylsilylgruppe in Kanamycin A oder B eingeführt werden. So- ; wohl Kanamycin A wie auch Kanamycin B weisen insgesamt
11 Stellen (NH₂- und OH-Gruppen) auf, die silylierbar sind, I während Kanamycin A und Kanamycin B, die an der 6'-Aminogruppe ', eine von Si IyI verschiedene Blockierungsgruppe aufweisen, ins- ; gesamt 10 derartige Stellen aufweisen. So müßten 5,5 Mol Hexa- j methyIdisi1azan pro MoT Kanamycin A oder B theoretisch zu einer! vollständigen Silylierung sämtlicher OH- und NH₂-Einheiten j des Kanamycins führen, während 5,0 Mol Hexamethyldisilazan zu
einer vollständigen Silylierung von einem Mol Kanamycin A oder
B, das in der 6¹-Aminogruppe eine von Si IyI verschiedene Blockie rungsgruppe aufweist, führen sollte. Jedoch wird erfindungsgemäß angenommen, daß eine derartig extensive Silylierung bei
diesen molaren Verhältnissen während vernünftiger Reaktions-

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j zeiten nicht erfolgt, obgleich mart bei v&rgegehener Reaktions- '■ zeit höhere SiTyTiertmgsgrade erzielt, wenn man einen SiTyHerungskstalysatar zugibt. ■

; SiTyTierungskataTysatoren führerv zu einer beträchtT ichen Er- j höhung der SiTyI ierungsgeschwindigkeit. Geeignete Silylierungs- I . kataTys.atoren sind bekannt. Hierzu gehören unter anderem Ämin-' sulfate (beispielweise KanamycinsuTfat), SuTfaminsäure, Imida- · zoT und TrimethylchTorsilan. SiTylierungskatalysatoren fördern ί im allgemeinere einen höheren Si lyTierungsgrad als beim erfin- \ dungsgemäßen Verfahren erforderlich. Man kann jedoch auch übet— , siTyTiertes Kanamycin A oder B als Ausgangsr.ateriaT t>eim erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen, wenn man es zuerst mit einem Desilyl i erungsmi ttel behandelt, irnt den Silyl i erungsgrad zu vermindern, bevor die Acyl ierur.gsreaktion durchgeführt wird.

Man erhält gute Ausbeuten an gewünschtem Produkt, wenn man polysilyliertes Kanamycin A acyliert, das unter Verwendung ; eines 5,5:1 molaren Verhältnisses von Hexamethyldis.iTazan zu Kanamycin A hergestellt wurde. Wenn man jedoch Kanamycin A mit einem 7:1 molaren Verhältnis an Hexamethyldisilazan (oder mit einem 5,5:1 molaren Verhältnis in Gegenwart eines Si TyTierungs- \ katalysators) in Aceton mit dem N-Hydroxysuccinimidester der j

L- ( -) - .'- Ben zy 1 ο xy ca r"bonyl ami no- >-hydroxy buttersäure acyliert, ! so erhält man weniger als eine 1 ^c--ige Ausbeute des gewünschten Produkts. Wenn man jedoch dasselbe "übersiIyIierte" Kanamycin A mit demselben Acylierungsmittel in einer AcetonTösung j acyliert, zu der man 1 Stunde vor der Acylierungsreaktion Was- i ser /f21 Mol Wasser pro Mol Kanamycin/2,5 % Wasser (Gew. /Vol. )J als DesiIyIierungsmittel zugesetzt hatte, so erhält man eine ! Ausbeute von angenähert 40 % des gewünschten Produkts. Dieselben Ergebnisse werden erhalten, wenn das Wasser durch Methanol oder durch eine andere Verbindung mit aktivem Wasserstoff ersetzt wird, die zu einer DesiIyIierung führen kann, beispiels-

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weise durcfi Äthanol, Propanoi , Butandio-1,

, V be ay T mercaptan, Oder dergleioheß-

Obgleich man beim -Arbeiten mit si IyI Werten 14ateria3 ien üi>licher-j weise trockene lösungsmittel einsetzt, wurde überraschend gefunden, .daß.-selbst in Abwesenheit einer ^1lü3jer$4ly1ierung^JI die
Zugabe von Wasser zum iieaktiQnslösungs-mi ttel vor der Acy
häuf4g gleich gute Ausbeute ergibt, ja bisweilen sogar zu besseren Ausbetten an gewünschtem Produkt als tn einein trockenem
Lösungsmittel, führt- Bei Acyl ieru.ngsreakt-iönen, die in Aceton , bei den üblichen Konzentrationen von IG bis 2Q % ^Gew,/¥o1^^ i polysi \yi iert^ni Kajiajüycin A durchgeführt werden, wurde erfijj- ; döTijsgemäß festgestellt, daß man ausgezeichnete Ausbeuten an I .l~tt-£l~{^$-'f-AminO-U-hyarQxybutyry3Jkanamy<;in A erhält, wenn j man bis zu 2B floJ Wasser pro Mol poJysilyliertes Kanamycin A ι zusetzt. Arbeitet man bei 2ΰ %-i^er Konzentration, so bedeuten 28 Mol pro Mol angenähert 8 % Wasser. Mit anderen Kombinationen von Reaktionspartnern kann man sogar die Anwesenheit von noch
mehr Wasser dulden; sie -kann sogar vorteilhaft sein. Die Acy-1 ieruwgsreaktion kann i^n Lösungsmi"tteln durchgeführt werden,
die bis zu ungefähr 40 -".' Wasser enthalten, obgleich man bei
derart hohen ¥asser-konzentrationen kürzte Acyl ierungszei ten ^}.

wählen muß, um eine übermäßige ßesiIyIierung des polysiIyIier- ; ten Kanamycin A oder B-Ausgangsmateri al s zu vermeiden, \-ienn \ demgemäß im vorliegenden Falle der Begriff "im wesentlichen j wasserfreies organisches Lösungsmittel" gebraucht wird, so |

umfaßt dieser Begriff auch Lösungsmittel, die bis zu ungefähr ^! 25 % Wasser enthalten. Ein bevorzugter Bereich geht bis zu un- ; gefahr 20 % Wasser, ein bevorzugterer Bereich geht bis unge- J fähr 8 % Wasser und ein am meisten bevorzugter Bereich geht I bis zu ungefähr 4 % Wasser. · !

Wie zuvor gesagt, kann der jeweils geeignetste Silylierungsgrad für jegliche Kombination von Acylierungs-Reaktionspartnern

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/ -zt-

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durch RoutineuntersüchUMjen leicht festgestellt werden. Cs

j angenommen, da& die Ijevo-rzugte durchschnittliche Anzahl an j

! Si I vT gruppen im Ausgangsmaterial üblicherweise 1)*i Xaaaayci» & j

] oder B zwischen 4 und 8 liegt und bei Kanamycin A oder δ, das ;

! an der 6⁴-Aminogruppe eine vo^ Silyl verschiedene ST-otfciere-mg-s- \

gruppe aufweist, zwischen 3 und 7 liegt. Dies ist jedoch ei^a j

mehr theoretische Betrachtung und stellt fliefet «n-bedimgt efnea i

wesentiichen Teil der £rff»du«f dar. !

Dauer und Temperatur der Acylierungsreaktίση sind nicht in
Temperaturen im Bereich vö*> ungefäJir -3fl°C bis ungefähr 1-0Q⁰C

sind brauchbar bei Reaktionszeiten, die v&n tragefaiir 1
bis zu einem Tag und mehr dauern. Erfinihingsgeraäß wurtie festgestellt, daß die Reaktion bei Raumtemperatur üblicherweise §*ut
verläuft, und aus Gründen der Einfachheit un4Mrfirtschaft1 ichfeeiti ist bevorzugt, die Reaktion bei Tlrageiningstemperatur durehz^j- j führen. Wenn es jedoch um Jtiaxiüiale Ausbeuten utjd um selektive j Acylierung geht, wird bevorzugt, die Jlcylierung bei eiH3er Tempei ratur von ungefähr O⁰C bis -im ge fähr 5⁰C du rchru führen.

Die Acylierung der 1-Aminogruppe des polysiIyIierten Kanamycins

A oder B (rait oder ohne eine Blockierungsgruppe an der B¹-Amino-] gruppe, die von SiIyI verschieden ist) kann fflit irgendeinem j acylierenden Derivat der Säure der allgemeinen Formel II durchgeführt werden, von dem bekannt ist, daß es sich zar Acylierung
einer primären Aminogruppe eignet. Zu Beispielen für geeignete
acylierende Derivate der freien Säure gehören die entsprechenden Säureanhydride, gemischten Anhydride, beispielsweise Alkoxyameisensäureanhydride, Säurehalogenide, Säureazide, aktive
Ester und aktive Thioester. Man kann die freie Säure mit dem
polysilylierten Kanamycin-Ausgangsmaterial kuppeln, nachdem
man zuerst die freie Säure mit N,N¹-Dimethylchlorformiminiumchlorid /vgl· GB-PS 1 008 170 und Novak und Weichet, Experientia XXI, 6, 360 (1965)7 umgesetzt hat, oder mit Hilfe eines
N ,N'-Carbonyldiimidazols oder eines N,N'-Carbonylditriazols

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pt/13 res ---23 -■

'r. Südafrikanische Patentschrift 63/2684J oder ntit Hilfe ;

etrtes Carb-adiimicfreagenzes /insbesondere Ff»MV-Oieycloh-exyl- t

carbodiimid, Ν-,Εί'-D-iisonrapyleerbodi invid oder M-GyclohexyT-ft*- (Z-Fnorpholinöäthyl )carbodi irnd ^ vgl. Sheefran und Hess, J-.A^CS--. _t 77, 196-7 £1955)7 ader mit Hilfe eines Älkynylaminreagenzes ·

/vgl- ft. Buijle tmd H.6.?iehe» Angew- Ch-em. International Eett- j tion» 3, 582 (1964)7 oder mit Hilfe eines Isaxazeliumsalzrea--■ f genzes /VgT. R. B. Woodward» R.A.Olofson and H.Mayer» J.Anver. ί

CfrenuSac, 83» 1010 (196I)J oder mit Hilfe eines Ketenimirt- >

reagenres /vgl. C.L.Stevens and M.E.Munk» Ü.ÄnTer.Chem.Soc., 80» ; 4065 (1955)7 oder mit Hilfe eines Hexachlorcyelotriptosphatria- ^l ! zins oder HexabrQincyelotriphosphatriazins (US-PS Nr. 3 651 050) .

i oder mit Hilfe von Di phenyl phosphorylazid ZDDPA; J.Amer.ihem, : ; Soc.» 94»_ 6203-6205 (1972)7 oder mit Hilfe von Diäthyl phosphorylcyanid /DEPC, Tetrahedron Letters Hr. 18, Seiten I595-I598 ^:

(2973)7 oder mit Hilfe von Di r;henyl phosphat /Tetrahedron Letters , Nr. 49, Seiten 5047-5050 (1972)7 unbesetzt hat. Ein anderes Äquivalent !der j Säure ist ein entsprechendes Azolid, d.h. ein Amid der entspre- ; i chenden Säure» deren Amidstickstoff Glied eines quasi-aroroati- . : sehen 5-gliedrigen Rings ist, der mindestens zwei Stickstoff- ' ;' atome enthält, d.h. Imidazo!, Pyrazol , die Triazole, Benzimii dazol, Benzotriazol und deren substituierte Derivate. Für den ι Fachmann liegt es auf dor Hand, daß es bisweilen wünschenswert j oder erforderlich sein kann, die Hydroxylgruppe des acylieren- |

L I

j den Derivats der Säure der allgemeinen Formel II zu schützen, j ί beispielsweise wenn man acyl lebende Derivate, wie beispielsweise;

i Säurehalogenide» einsetzt. Der Schutz der Hydroxylgruppe kann ;

! auf an sich bekannte Weise erfolgen, z.B. unter Verwendung einer • Carbobenzyloxygruppe, durch Acetylieren, durch Silylieren, ! !und dergleichen. :

Nach Beendigung der Acylierungsreaktion werden sämtliche Blockie

! rungsgruppen in an sich bekannter Weise entfernt_s um das gei wünschte Produkt der allgemeinen Formel I zu liefern.

I ■ JP

1 _ ji

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ioo - z$ - 2818332

SY-I533Ä

Die Silylgruppen kann man beispielsweise leicht dadurch entfernen j daß uran mit Wasser hydrolysiert. Dies erfolgt vorzugsweise bei niedrigem pH. Die Blocfcierungsgruppe B des acylierenden Derivats der Säure der allgemeinen Formel II und di~e Blockierungsgruppe an der 6^l-Ärainogruppe des polysilylierten Kanamycin-Ausgangsmaterials (falls vorhanden) können ebenfalls nach bekannten Methoden entfernt werden. So kann man beispielsweise eine tert.-Butoxyearbonylgruppe durch Verwendung von Ameisensäure entfernen, eine Carbobenzyloxygruppe durch katalytisches Hydrieren, eine 2-Hydroxy-l-naphthcarbonylgruppe durch saure Hydrolyse» eine Trichloräthoxycarbonylgruppe durch Behandlung mit Zinkstaub in Eisessig* die Phthaloylgruppe durch Behandlung mit Hydrazinhydrat in Äthanol unter Erhitzen, und dergleichen _ϊ entfernen.

Die Ausbeuten an Produkt wurden nach verschiedenen Methoden bestimmt. Nach Entfernung sämtlicher Blockierungsgruppen und Chromatographie auf einer Säule mit CG-50 (NH^ ) ließ sich die Ausbeute an Amikacin durch Isolierung des kristallinen Feststoffs aus den entsprechenden Fraktionen oder durch "mikrobiologische Untersuchung (turbidimetrische Methode oder Plattentest) der entsprechenden Fraktionen bestimmen. Eine andere erfindungsgemäß eingesetzte Technik war Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie der nicht reduzierten Acylierungsmischung, d.h. mit Hilfe der wässerigen Lösung, die nach der Hydrolyse der Silylgruppen und der Entfernung des organischen Lösungsmittels erhalten wurde, jedoch vor der Hydrogenolyse zur Entfernung der verbleibenden Blockierungsgruppe(n). Diese Untersuchung ist keine direkte Untersuchung auf Amikacin oder BB-K29, sondern auf die entsprechenden Mono- oder Di-N-blockierten Verbi ndungen.

Als Instrument verwendete man einen Waters Associates ALC/GPC 24J4 Hochdruck-Flüssigkeitschromatograph mit einem Waters Associates Model 440 Absorptionsdetektor und einer 30 cm χ 3,9 mm (Innen-

80 9847/0694

£-18-54ti?e, und z»ar unter ^den foigsrs-

"25 Λ 2

15 t δ ,103. «ι !iatriumacfitai J)H 4₃

UV ie3 1254
ΰ,β4 AUFS

ftengie: ^

St:tireltoergesc3iwv-ndig3ceit variiert«, Js4oc1i waren 2 tjeö/2₃54 an typäsxfi. Die obigen Bedingungen ergaben tJ?-5purefl in-it.^-eaks, 4ie quantitativ leicht zu bestimmen waren. Ove ir- ^ei3nisse xier Gbi^gen Analyse« sijid im vuri iegende» Text als HLPt-Tests

um die Wiederholung ^ompl izierter chemischer Bezeichnungen ztr vermeicLen, werden im vorliegenden Text tii^weiien die nachfolgenden Abkürzungen gebraucht:

AItBA L-(-)-f-Amino->;-hydroxybuttersäure

BHBA N-Carbobenzyloxyderivat von AHBA

HOWB N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-diQarboximid

NAE N-Hydroxy-5-norbornen-2 ^-dicarboximid-aktivierter

(oderBHBA-¹ONB¹) Ester von BHBA

HONS N-Hydroxysuccinimid

SAE N-Hydroxji'succinimid-aktivierter Ester

(oder BHBA-¹ONS¹) von ßHBA

DCC Di cyclohexyl carbodi imi-d

DCÜ Dicyclohexylharnstoff

HMDS Hexamethyldisiiazan

BSA Bis(trimethylsily])acetamid

MSA Trimethylsi IyI acetamid

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ioo --is-

TFA THfiijoracetyl

fr-88£ tert.-Sut^oxycarbooyi

^BicaVite* !st erne Handelsbezeichnung -der Great takes Corporation fur ein Produkt aus Oiatoaeenerde»

"AmberHte CG-Bܹ¹ i=st eine Handelsfeezeichnung der RuIm £ Haas Co. für ein schwach-saures Katisnenaustauscherharz 4es CarbonsKure-polymethacryisäuretyps λ/οπ chroiHatogra|rt3ischer

j ist eine Handel.sbez&ichnttn-% der Katers Associates

für eine Reihe yen Hochleistungs-

A13e Temperaturen sind in Grad Celsius

Die Begriffe "{niedrigJAIkyl" und ⁿ|niedrig)Alkoxy" beziehen ί : sich auf A14cy1- oder Alkoxygruppen, die I Ins B Kohlenstoff- i atome aufweisen.

Beispie? I^

Herstellung von l-N-ZX-(-)-f-Aiiiino-y-hydroxybiityryl/kanaiaycin A Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethy1si IyI)-6 '-N-carbobenzyi oxykanajnycin A in wasserfreiem Oiäthyl keton

Man schlämmt 15 g (24,24 raMol) 6'-N-Carbobenzyloxykanamycin A in 90 ml trockenem Acetonitril auf und erhitzt unter einer Stickstof fatmosphäre zum Rückfluß. Dann gibt man im Verlauf von 30 Minuten langsam 17,5 g (108,48 mMol)Hexamethyldisilazan zu und hält die erhaltene Lösung 24 Stunden lang am Rückfluß. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum (4O⁰C) und vollständi-

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w. : - -π-; 281SSt2

gem Trocknen unter Vakuum (10= mm J erhält man 27,% g ernes
weißen,, amorphen Feststoffs. Ausbeute ?fr,?l %* berechnet als
&^r-Pt-earbobentzyl oxy kanamycin A |S

Diesen Feststoff Tost man in 150 ml trockenem DiäthyTketon bei j einer Temperatur von 23⁰C auf. Man gtbt 11,&5 g (26,6? mMol} | L- (- y-'J- Bertzy Toxyca r bony lanvi no- ac-hydroxyb utter saure -Ρί-Hy dr oxy- | ! »3-dicarboximideste-r (PfAE), gelöst in IQQ ml trockenem bei 23⁰C unter gutem Rühren im Verlauf von einer ■ halben Stunde langsam ru. Nfan rührt die Lösung 7S Stunden Tang ; bei 23⁰C. Man verdünnt tfxe gelbe, klare Lösung (pH 7,CT) mit | 100 mT Wasser. Der pH der Mischung wird mit 3 η KCT auf 2,8 [ eingesteTTt und man rührt Ϊ5 Mvnuten Tang heftig bei einer j Temperatur von 23⁰C. Die wässerige Phase wird abgetrennt, und ; die organische Phase wird mit 50" ml Wasser von pH 2,S extra- j hiert. Die vereinigten wässerigen Fraktionen wäscht man mit \ 5D inT Äthylacetat. Man gibt die Lösung in eine 50.& ml-Parr- ί vorrichtung zusammen mit 5 g 5 t-igem PaTladium-auf-AktivkohTe-j Katalysator (Engelhard) und reduziert 2 Stunden lang bei [ 23⁰C bei einem Druck von 3,52 kg/cm (50 psi) H₂- Man filtriert j die Mischung durch ein Filterbett aus Dicalite, das dann mit
zusätzlichen 30 ml Wasser gewaschen wird. Man konzentriert
das farblose Filtrat im Vakuum (40 bis 45⁰C) auf 50 ml. Die
Lösung wird auf eine 5 χ 100 cm CG-50 (NH.+)-Ionenaustauschersäule aufgegeben. Nach dem Waschen mit 1000 ml Wasser eluiert
man unumgesetztes Kanamycin. A, 3-/L-(-)-7"-Amino-<x'-hydroxybutyryljkanamycin A (BB-K29) und Amikacin mit 0,5 η Ammoniumhydroxyd. Mit 3 η Ammoniumhydroxyd wird Polyacylmaterial wiedergewonnen. Zur überwachung der fortlaufenden Eluierung wählt man

Biotest, Dünnschichtchromatographie und optische Drehung.
Volumen, beobachtete optische Drehung jeder Fraktion des Eluats und Gewicht und prozentuale Ausbeute des aus jeder Fraktion
ι

ι durch Eindampfen zur Trockne isolierten Feststoffs sind nach-

[ stehend zusammengestellt:

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M/19 100	VoIumen	- 28 -	<y	578	Gewicht	2818992
SY-1533A	(ml)		+ 0,115	(g)
Material	1000	+ 0,24	0,989	% Ausbeute
	1750	+ 0,31	4,37
Kanamycin A	2000	+ 0,032	6,20	9,15
BB-K29	900		0,288	32,0
Ami kacin		47,4
Polyacyle	2,0

Durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wird gezeigt, ; daß die verbrauchte Diäthyl ketonschicht weitere 3 bis 5 % Amika-r ein enthält. !

Man löst das rohe Amikacin (6,20 g) in 20 ml Wasser auf und verdünnt mit 20 ml Methanol und setzt dann 20 ml Isopropanol zu, um die Kristallisation einzuleiten. Man erhält 6,0 g (45,8 %) kristallines Amikacin.

Beispiel Herstellung von l-N-/l-(-)-r-Amino-<x:-hydroxybutyryl.7kanamycin A

Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsi IyI)-6' -N-carbobenzyloxykanamycin A in wasserfreiem Aceton

Man löst 103 g (0,081 Mol, berechnet als 6'-N-Carbobenzyloxykanamycin A (Silyl)g) Poly(trimethylsi IyI)-6'-N-carbobenzyloxykanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 100 ml trockenem Aceton bei einer Temperatur von 23⁰C auf. Man gibt unter gutem Rühren langsam 35,24 g (0,085 Mol) L-(-) -f- Benzyl ο xy carbonyl amino-*- hy droxyb utter sau re-N -Hy droxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE), gelöst in 180 ml trockenem Aceton bei 23⁰C im Verlauf von 15 Minuten zur Lösung des Poly(trimethylsilyl)-6'-N-carbobenzyloxykanamycins A zu. Man rührt die Lösung 20 Stunden bei 23⁰C unter einer Stickstoff atmosphäre. Die blaß-gelbe, klare Lösung (pH 7,2) wird mit

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SY-1533A .

100 ml Wasser verdünnt. Der pH der Mischung wird mit 3 η HCI :

auf 2,5 eingestellt. Dann rührt man noch 15 Minuten bei 23⁰C. j

Das Aceton wird unter Verwendung eines Dampfstrahl Vakuums bei ι

ungefähr 35⁰C entfernt. Die Lösung wird in eine 500 mi-Parr- ·

Flasche gegeben und zwar zusammen mit 10 g 5 % Palladium-auf- ;

Aktivkohle-Katalysator (Engelhard). Man reduziert bei einer ! Temperatur von 23⁰C 2 Stunden lang bei einem Druck von 2,81 kg/cm

(40 psi) W₉. Dann filtriert man die Mischung durch ein Filter- I

bett aus Diatomeenerde, das anschließend mit weiteren 50 ml j

Wasser gewaschen wird. Nach dem Konzentrieren auf angenähert ι

1/3 des Volumens gibt man die Lösung (pH 6,9 bis 7,2) auf eine J

6 χ 110 cm CG-50 (NH₄+)-Ionenaustauschersäule und eluiert mit j einem stufenweisen Gradienten von Η~0 zu 0,6 η Ammoniumhydroxyd»¹

um das Amikacin zu gewinnen. Zur überwachung der fortlaufenden '·

Eluierung verwendet man ein automatisches Polarimeter. Die ί

Fraktionen werden auf der Grundlage der Bewertung durch Dünn- j

Schichtchromatographie vereinigt. Die vereinigten Amikacin- J

fraktionen werden auf einen Gehalt von 25 bis 30 % Feststoffen !

konzentriert. Man verdünnt die Lösung mit einem gleichen VoIu- j

men Methanol und gibt dann zwei Volumina Isopropanol zu, um |

die Kristallisation einzuleiten. Man gewinnt 18,2 g (40 %) j

kristallines Amikacin. j

Durch Wiedergewinnung von 12 % Kanamycin A, 40 % BB-K29 und \

5 % polyacyliertem Kanamycin erhält man eine Materialbi1anz ι

von 97 %. ■ ;

Beispiel Herstellung von l-N-//L-( -)-T-Arnino-^-hydroxybutyryl7kananiycin A

Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, wobei man in situ blockiert

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A) Po1y(trimethy1si IyI)kanamycin A

Man schlämmt Kanamycin A in Form der freien Base mit 18 g Aktivität (37,15 mMol) in 200 ml trockenem Acetonitril auf und erhitzt zum Rückfluß. Im Verlauf von 30 Minuten gibt

man 29,8 g (184,6 mMol) Hexamethyldisi 1azan zu und rührt |

die Mischung 78 Stunden am Rückfluß, wobei man eine hell- ;

gelbe klare Lösung erhält. Nach dem Entfernen des Lösungs- \

mittels unter Vakuum bleibt ein amorpher, fester Rückstand !

übrig. Die Ausbeute beträgt 43 g (94 %, berechnet als Kana- ι

mycin A (SiIyI)₁₀). |

B) 1-N-/JL-(-)-'7*-Ami η o-o(-hyd roxyb u ty ry U kanamycin A :

Man schlämmt 5,56 g (20,43 mMol) p-(Benzyloxycarbonyloxy)-

benzoesäure in 50 ml trockenem Acetonitril bei einer Tempe- j

ratur von 23⁰C auf. Dann gibt man unter gutem Rühren 8,4 g ι

(41,37 mMol) N,0-bis-TrimethylsiIyIacetamid zu. Die Lösung '

wird 30 Minuten bei 23⁰C gehalten und dann im Verlauf von ^;

3 Stunden unter heftigem Rühren zu einer Lösung von 21,5 g ;

(17,83 mMol, berechnet als (Si IyI) -^-Verbindung) Poly(tri- j

methylsilyl)kanamycin A in 75 ml trockenem Acetonitril von ;

23⁰C zugegeben. Man rührt die Mischung 4 Stunden lang, ent- I fernt das Lösungsmittel im Vakuum (4O⁰C) und löst dann den

öligen Rückstand in 50 ml trockenem Aceton mit einer Tempe- j

ratur von 23⁰C. j

Im Verlauf von 5 Minuten gibt man 8,55 g (20,63 mMol) L-(-)- f- Benzyl oxy car bony !amino -oi- hyd roxyb utter sä ure -N-Hy droxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE) in 30 ml Aceton zur obigen Lösung. Man hält die Mischung 78 Stunden bei 23⁰C. j Dann verdünnt man die Lösung mit 100 ml Wasser und senkt den pH (7,0) mit 6 η HCl auf.2,5 ab. Die Mischung wird in eine ι 500 ml Parr-Flasche zusammen mit 3 g 5 % Pailadium-auf-Aktivkohle-Katalysator (Engelhard) gegeben und 2 Stunden bei

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SY-1533A *^U l· υοο-ί.

einer Temperatur von 23⁰C bei einem Druck von 2,81 kg/cm i (40 psi) \^2 reduziert. Man filtriert die Mischung durch ein ' Filterbett aus Diatomeenerde, das anschließend mit 20 ml ι Wasser gewaschen wird. Bei den vereinigten Filtraten und j Waschflüssigkeiten (168 ml) wird durch mikrobiologischen Test gegen E. coli festgestellt daß sie angenähert 11 400 meg/ml Amikacin enthalten (Ausbeute 19 %).

B e i s pie!

Herstellung von l-N-^l-(-)-7^Amino-o^-hydroxybutyryl7kanamycin Aj Amikacin, durch selektive Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A

A) Poly(trimethylsilyl)kanamycin A

Eine Suspension von 10 g (20,6 mMol) Kanamycin A in 100 ml trockenem Acetonitril und 25 ml (119 mMol) 1,1,1,3 ,3,3-Hexa-; methyldisi1azan wird 72 Stunden lang am Rückfluß gehalten. Man erhält eine klare, hellgelbe Lösung. Die Lösung wird im \ Vakuum bei 30 bis 40⁰C zur Trockne eingedampft. Man erhält 21,3 g Poly(trimethylsilyl)kanamycin A in Form eines hellockerfarbenen, amorphen Pulvers. Die Ausbeute beträgt 85 %, berechnet als Kanamycin Ä (Silyl Kq.

j B) l-N-/'L-(-)-r"^^mi^no"^~hydroxybutyryl7kanamycin A

Zu einer Lösung von 2,4 g (2,0 mMol) Poly(trimethylsi IyI)-kanamycin A in 30 ml trockenem Aceton gibt man langsam 2_s0 mMol L-(-)-f- Benzyl oxycarbony 1 ami η ο-λ-hydroxybuttersäure-N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE) in 10 ml trockenem Aceton bei einer Temperatur von O bis 5⁰C zu. Die Reaktionsmischung wird 1 Woche lang bei 23⁰C gerührt und dann im Vakuum bei einer Badtemperatur von 30 bis 4O⁰C zur

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Trockne eingedampft. Dann gibt man 60 ml Wasser zum Rückstand, gefolgt von 70 ml Methanol, um eine Lösung zu erhalten. Die Lösung wird mit 3 η HCl auf pH 2,0 angesäuert und

2 dann 2 Stunden lang bei einem Druck von 3,52 kg/cm (50 psi) Ho reduziert, wobei man 500 mg 5 % Pailadium-auf-Aktivkohle-Katalysator verwendet. Das Material wird filtriert, und vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mit dem mikrobiologischen Test gegen E.coli untersucht. Man stellt fest, daß eine Ausbeute von 29,4 % Amikacin erhalten wurde.

Beispiel

Herstellung von Amikacin durch selektive N-Acylierung von Poly- j ι trimethylsilyi-e'-N-carbobenzoxy-kanamycin A in wasserfreiem ' Aceton.

I. Zusammenfassung

Die Silylierung von 6'-N-Carbobenzoxykanamycin A in Acetonitril unter Verwendung von Hexamethyldisilazan (HMDS) führt zum 6'-N-Carbobenzoxykanamycin A (Silyl)g-ZwischenproduktQ). Dieses silylierte Kanamycin A ist in den meisten organischen Lösungsmitteln leicht löslich. Die Acylierung mit NAE in wasserfreiem Aceton bei 23⁰C unter Verwendung eines 5 %-igen molaren Oberschusses an NAE bezogen auf das eingesetzte 6'-N-CbZ-Kar mycin A führt zu einer Mischung, die nur Cbz-Derivate des Amikacins und BB-K29, etwas unumgesetztes Kanamycin A und etwas Polyacylmaterial enthält. Bei keiner dieser Untersuchungen läßt sich BB-KIl entdecken. Eluieren eines Aceton-Acylierungsgemischs nach der Reduktion und Aufarbeitung durcr eine CG-50 (NH₄+)-Säule unter Verwendung eines Ammoniumhydroxydgradienten liefert Ausbeuten an reinem, isoliertem Amikacin im Bereich von 40 %.

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II. Reaktionsgleichungen A) HO

- 33 -

S'-N-Cbz Kana A

^C26^H42°13^N4

J₃Si-NH-Si(CH₃ HMDS (161.4)

CH^CN

Φ 6'-N-Cbz Kana A (Silyl}_g ^C53^H114°13^N4^Si9 (1268.3)

(K ana = Kanamycin)

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OH

B) CbZNH(CH₂J₂-CH-CCOH + HON

BHBA (253.4)

+ DCC (206)

HONB (179.2)

Aceton

OH 0

I Il

DCU + CbZHN(CH₂J₂-CH-C-O-N

(224.3)

C)

φ + 0 Aceton

© ΝΑΕ (414.6)

di^Cbz-Amikacin (854)

di-Cbz-.BB--K29
6'Cbz-l,3-di-BHBA-Kana A^-

Kana A

kiaikacin + BB-K29 + 1,3-di-J

AHBA-Kana A + Kana A ^i5aS-⁶²> (722.76) ^ (484.5)

CG-50(NH₄+) Amikacin

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III. Materialien

- 35 2818392

	Gew.	g	Vol. ml	Mol
6'-N-Cbz-Kanamycin A	50			0,081
HMDS	58	,9	76,5	0,365
Acetonitril			300
BHBA	21	,5		0,085
HONB	15	,2		0,085
DCC	17	,48		0,085
Aceton			260
CG-SO(NH4+) Methanol			3000 soviel wie erforderlich
IPA			soviel wie erforderlich

IV. Sicherheitsempfehlungen

6'-N-Cbz Kanamycin A Acetonitri1

Hexamethyldisilazan (HMDS)

6'-N-Cbz Kanamycin A (SiIyI)₉

BHBA HONB Keine direkte Information zugänglich. Man vermeide ί einen Kontakt mit dem Staufcj

Als Cyanid behandeln. Das Einatmen der Dämpfe ist zu vermeiden- Kann zu Hautreizungen führen.

Reizstoff, vorsichtig hand-i haben.

Keine direkte Information zugänglich. Vorsichtig hanc haben.

Die Toxizität ist nicht be kannt. Feststoffe nicht be rühren. .

Toxizität unbekannt. Vorsichtig zu handhaben.

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2618992

DCC

Aceton

NAE

Methanol

Isopropanol Ammoniumhydroxyd

CG-50 (NH₄+) Ein starkes Reizmittel für Haut [ und Augen. Das Einatmen der Dämpfe ist zu vermeiden. Toxisch.

Entzündlich. Einatmen kann zu Kopf¹ schmerzen, Schwäche, Aufregung, ' Bronchial Beschwerden und in großen; Mengen zur Narkose führen. i

Keine direkte Information zugänglich, wurde stets als Lösung in Aceton gehandhabt.

Entzündlich, Vergiftung Einnahme, Einatmen oder Absorption erfolgen.

kann durchi perkutane

Entzündlich. Einnahme oder Einatmen großer Mengen des Dampfes kann zu Kopfschmerzen, Benommenheit, Depressionen, Erbrechen und Narkose führen.

Dämpfe sind toxisch. Gesichtsmaske erforderlich. Kontakt mit der Flüssigkeit vermeiden.

Keine Toxizitätsdaten-verfügbar. Vorsichtig zu handhaben.

V. Arbeitsweise

A) Herstellung von 6 '-N-Carbobenzyloxykanamycin A (SITyI)g /f6'-N-Cbz-Kana A (SiIyI)₉/

1. Man schlämmt 50 g 6'-N-Carbobenzyloxykanamycin A (KF <4 %) in 300 ml Acetonitril (KF <0,01 %) auf.

Man bringt zum Rückfluß (74⁰C), wobei man einen trocke nen Stickstoffstrom durch die Aufschlämmung aufrechterhält.

2. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man langsam 75,8 ml Hexamethyldisilazan (HMDS) zu. Die vollständige Auf-

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lösung erfolgt unter Freisetzung von Ammoniakgas·.

3. Man setzt das Rückflußkochen 18 bis 20 Stunden unter Stickstoffspülung fort.

4. Man konzentriert die kl are,hei Igel be Lösung unter Vakuum (Badtemperatur 40 bis 50⁰C) zu einem schaumigen Feststoff. Die Ausbeute an Silylg-Verbindung beträgt 89 bis 92 g (90 bis 94 % der Theorie). j

Anmerkung: j

Bei anderen Lösungsmitteln wird dieser Feststoff UbIi- j

cherweise nicht isoliert, sondern direkt zur Acylierung ^:

verwendet. j

B) Herstellung des N-Hydroxy-S-norbornen^^-dicarboximid- ί esters der L-(-)-pt-Carbobenzyloxyamino-of-hydroxybuttersäure (ΝΑΕ) ^;

1. Man löst 21,5 g L-(-J^-Carbobenzyloxyamino-«'-hydroxybuttersäure (BHBA) in 100 ml trockenem Aceton j bei 23⁰C auf und gibt dann 15,2 g N-Hydroxy-5-norbor-_; nen-2 ,3-dicarboximid (HONB) zu. Man erhält eine j vollständige Auflösung. !

2. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man eine Lösung von ; 17,48 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 50 ml Aceton unter Rühren zu. Während der Zugabe steigt die Tempe-| ratur auf angenähert 40⁰C an, wobei Dicyclohexylharnstoff (DCU) ausfällt.

3. Man rührt die Aufschlämmung 3 bis 4 Stunden lang, während sich die Temperatur bei 23 bis 25⁰C einpendelt

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4. Man entfernt das Harnstoffderivat durch Filtrieren
und wäscht den Kuchen mit 30 ml Aceton. Das Filtrat
und die Waschflüssigkeiten werden für die nachfolgende Acylierungsstufe aufgehoben.

C) Acylierung von 6'-N-Cbz Kana A (SiIyT) _g j

1. Man löst das S'-N-Cbz Kana A (SiIyI)₉, das in Teil A, j Stufe 4 isoliert wurde, in 100 ml trockenem Aceton ^!

bei 23 bis 24⁰C auf. ■

2. Unter gutem Rühren gibt man langsam die ΝΑΕ-Lösung, j die in Teil B hergestellt wurde, im Verlauf von

15 Minuten zu. Die Temperatur steigt allmählich auf \ angenähert 4O⁰C an. Man läßt die Temperatur der Lösuncj auf 23⁰C einpendeln und rührt noch 18 bis 20 Stunden j unter einer Stickstoffatmosphäre.

3. Man gibt 100 ml Wasser zu und senkt den pH (6,9 bis j 7,2) mit 6 η Chiorwasserstoffsäure auf 2,2 bis 2,5 j ab. Man rührt 15 Minuten bei 23⁰C. j

(Anmerkung: Es kann sich eine zweite Schicht bilden, j dies stellt jedoch bei der Aufarbeitung kein Problem j dar.) j

4. Man entfernt das Aceton unter Vakuum bei einer Badtemperatur von 30 bis 35⁰C. Das Konzentrat wird in J ein geeignetes Hydriergefäß (das mit Stickstoff vor- ■ gespült ist) überführt. Man gibt 10 g 5 % Palladium- | auf-Aktivkohle-Katalysator zu und hydriert 2 bis 3 i Stunden lang bei 2,81 kg/cm² (40 psi).

5. Die Mischung wird durch ein Dicalite-Fi1terbett
durchfiltriert und man wäscht das Hydriergefäß und

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den Filterkuchen mit weiteren 50 ml Wasser.

6. Das Filtrat und die WaschfTüssigkeiten werden auf angenähert 1/3 ihres Volumens (50 ml) unter Vakuum bei 40 bis 45⁰C konzentriert. I

7. Man überwacht den pH. Er sollte im Bereich von 6,9 bis ! 7,2 liegen. Falls dies nicht der Fall ist, wird mit 1 η J Ammoniumhydroxyd eingestellt. Die Mischung wird auf eine ! 6 χ 110 cm CG-50 (NH₄+)-Säule aufgegeben. j

8. Man wäscht die Säule mit 1000 ml entionisiertem Wasser. Dann eluiert man mit 0,5 bis 0,6 η Ammoniumhydroxyd, wo- ι bei man zur überwachung des Fortschreitens der Elinerung ! ein atomatisches Polarimeter gebraucht. Die Reihenfolge der Eluierung ist wie folgt:

Verbliebenes Kanamycin A —> BB-K29 —> Amikacin.j Bei keiner der Aufarbeitungen der Acylierungsprodukte wird BB-KIl entdeckt. Polyacylmaterial , d.h. das 1,3-diAHBA-Analoge von Kanamycin A, wird durch Waschen der Säule mit 3 η Ammoniumhydroxyd wiedergewonnen.

9. Man vereinigt die Amikacin-Fraktionen und konzentriert auf einen Gehalt von 25 bis 30 % Feststoffen. Man verdünnt mit 1 Volumen Methanol und impft mit Amikacinkristallen an.

10. Man gibt langsam im Verlauf von 2 Stunden 2 Volumina Isopropanol (IPA) unter gutem Rühren zu und kristallisiert 6 bis 8 Stunden lang bei 23⁰C.

11. Man filtriert den Feststoff, wäscht mit 50 ml 1:1:2 Wasser:Methanol:IPA-Mischung und schließlich mit 25 ml

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12. Man trocknet im Vakuum 12 bis 16 Stunden bei 40⁰C.

Ausbeute: 17,3 bis 19,0 g (38 bis 42 %) Amikacin mit den folgenden Eigenschaften:

Dünnschichtchromatographie (TLC) CHCl, - Methanol NH₄OH - Wasser (1:4:2:1), 5 χ 20 cm SiIikagelplatten, bezogen von Quantum Industries, eine Zone, durch Ninhydrin festgestellt (Rf~0,4).

Spezifische Drehung:

23° H₉O 0,1 m NH₄OH 0,1 m H₉SO, ΓοΠ ^c * ^{c 4}

589 + 101,6 + 101,9 + 103,5

C = 1,0 % I

13. Die Wiedergewinnung des BB-K29 in diesem System erfolgt j ebenfalls zu 39 bis 42 %. Restliches Kanamycin A wird , zu 10 bis 14 % wiedergewonnen, und 1,3-di-AHBA-Kanamycin A wird zu angenähert 5 % wiedergewonnen, wodurch man eine Materialbilanz >95 % erhält.

Beispiel

Herstellung von Amikacin durch selektive N-Acylierung von PoIytrimethylsiIyI-kanamycin A in wasserfreiem Aceton

I. Zusammenfassung

Silylierung von Kanamycin A-"Base" in Acetonitril unter Verwendung von Hexymethyldisilazan (HMDS) führt zu Polytrimethyl si IyI-kanamycin A. Das Ausmaß der Silylierung ist noch ungewiß, jedoch wird derzeit vermutet, daß es sich bei der Substanz um Kanamycin A (Silyl),q handelt. Polysilyliertes

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Kanamycin A ist in den meisten organischen Lösungsmitteln
leicht löslich. Acylierung mit SAE in wasserfreiem Aceton
bei 23⁰C unter Verwendung eines 1:1 molaren Verhältnisses
von SAE zu eingesetztem Kanamycin A liefert eine Mischung,
die Cbz-Derivate des Amikacins und BB-K29 enthält, und zwar
üblicherweise im Verhältnis 2 bis 3/1; man erhält BB-K6

(angenähert 5 bis 8 %), unumgesetztes Kanamycin A (15 bis J 20 %) und etwas Polyacylmaterial (angenähert 5 bis 10 %). j Auch bei diesen Experimenten wird wie bei den vorherigen j Arbeiten zur Acylierung von Polytrimethylsilyl-6'-N-carbo- | benzoxy-kanamycin A keinerlei BB-KIl festgestellt. Reduktion j und Aufarbeitung einer Acylierungsmischung in Aceton, ge- | folgt von Chromatographie auf einer CG-50 (NH₄+)-Säule unter j Verwendung von 0,5 η Ammoniumhydroxyd liefert isoliertes ! kristallines Amikacin im Bereich von 34 bis 39 %.

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2818392

11. Reakti* ο η sgi ei chungen

OH

OH OH

Kana A 'base'

^C18^H36°11^N4

+ (CH₃)₃ Si-NH-Si(CH₃) HMDS (161.4)

CH-,CN

RHN^ Tj

R ι Si(CH₃J₃ φ Kana A (SiIyI)₁₀

^C48^H116°lA^Si10

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OH

Bi CbZNH(CH₂J₂-CH-COOH + HO-N

C\

ΒΗΒΛ (253.4)

+ DCC

N-HOS (206.3) (115.9)

EtOAc

•OH O DCU + CbzNH(CH₂)₂CH-C-O-N

(224.3)

Q SAE
(350.33)

Aceton 23°

H.

5% Pd/C

Cb:: Amikacin (720)

+
CbZ BB-K29

CbZ B3-K6 +

Kana A

Polyacyüe (hauptsächlich 1,3-diBK3A-Kana A)

Ami3cacin+BB-K29 + BB-K6 + 1.3-diAHBA-Kana A + Kana A'

(585.62)

(722.76)

CG-50 (NH₄+)

Amikac in

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III. Materialien

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	A-"Base"	Gew.	g	Vol. ml
Kanamycin	.Gew. 0,774)	50
HMDS (spez	1	86	,68	112
Acetonitri				600
SAE		35	,03
Aceton	+ )			850
CG-50 (NH4				3000
Methanol				soviel wie erforder! i cn
IPA			soviel wie erforderl ich

Mol

0,103 0,537

0,10

Sicherheitsempfehlungen Kanamycin A-"Base"

Kanamycin A (SiIyI)₁₀ Andere Materialien

Arbeitsweise

Bekanntes Pharmakon - übliche! Vorsichtsmaßregeln empfohlen.

Keine direkte Information ver-j fügbar, vorsichtig handhaben.

Vergleiche Beispiel 5.

A) Herstellung von Kanamycin A (SiTyI),q

1. Man schlämmt 50 g Kanamycin A-"Base" (KF 2,5 bis 3,5 *) in 500 ml Acetonitril (KF <0,01 %) auf. Man bringt zum Rückfluß (74⁰C), während man einen Strom aus trockenem Stickstoff durch die Aufschlämmung aufrechterhält.

2. Man gibt langsam im Verlauf von 30 Minuten 112 ml Hexamethyldisilazan (HMDS) zu. Innerhalb von 4 bis 5 Stunden erfolgt vollständige Auflösung unter Entweichung von Ammoniakgas.

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3. Man hält noch 22 bis 26 Stunden unter Stickstoffspülung am Rückfluß.

4. Man konzentriert die klare, blaßgelbe Lösung unter Vakuum (4O⁰C) zu einem sirupartigen Rückstand. Man \ spült mit weiteren 100 ml Acetonitril und trocknet I vollständig unter Hochvakuum während 3 bis 6 Stunden, j Die Ausbeute an weißlichem, amorphem Feststoff beträgt j 109 bis 115 g (90 bis 95 % der Theorie, als Kanamycin A (SiIyI)₁₀ berechnet).

B) Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters von L-(-)-tt- Carbo benzyl oxyami no -tf. -hydroxybuttersäure (SAE)

1. Man löst 100 g L-(-)-^-Benzyloxycarbonylamino-oihydroxybuttersäure (BHBA) und 45,38 g N-Hydroxysuccin- J imid (N-HOS) in 1300 ml Äthylacetat (KF<0,05 %) unter \ Rühren bei 23⁰C auf.

• Z. Man löst 81,29 g Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in ! 400 ml Äthylacetat (KF <0,05 %) bei 23⁰C auf. Unter

gutem Rühren gibt man diese Lösung im Verlauf von ! 30 Minuten zu der Lösung gemäß Stufe 1. Die Temperatur steigt auf ungefähr 40 bis 42 C, während gleichzeitig j Dicyclohexylharnstoff (DCU) ausfällt.

' Man rührt die Aufschlämmung 3 bis 4 Stunden, und läßt die Temperatur bei 23⁰C einpendeln.

3. Man filtert den DCU ab, wäscht den Filterkuchen mit 250 ml Äthylacetat (KF <0,05 %). Der DCU-FiIterkuchen wird verworfen. Man hebt das Filtrat und die Waschflüssigkeiten auf.

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4. Man konzentriert das Filtrat und die Waschfllissigkei- j ten auf ungefähr 500 ml (im Vakuum bei 30 bis 35⁰C). ! Etwas Produkt kristallisiert aus.

5. Man gibt das Konzentrat in ein geeigntes Gefäß und ! gibt unter heftigem Rühren 100 ml Heptan zu. Falls er- | forderlich gibt man Impfkristalle von SAE zu. Die ! Kristallisation erfolgt beinahe sofort. Man rührt die ' Aufschlämmung 30 Minuten bei 23⁰C. \

6. Im Verlaufe von 30 Minuten gibt man 400 ml Heptan zu '

und rührt die Aufschlämmung 4 bis 5 Stunden lang bei ί 23⁰C. I

7. Man filtriert und wäscht den Filterkuchen mit 200 ml !

3:1 Heptan/fithylacetat, gefolgt von 100 ml Heptan. j

8. Man trocknet im Vakuumofen 18 bis 20 Stunden lang bei ; 30 bis 35⁰C. Die Ausbeute beträgt 110,1 bis 131,4 g ' (80 bis 95 %). i

Schmelzpunkt 119 bis 12O⁰C unter Erweichung bei 114⁰C
(korrigiert).

TLC 4 A'ceton:12 Benzol :1 CHoCOoH-Entwicklung mit
1 % wässerigem KMnO*.

R_f 0,7 für SAE, 0,2 für BHBA auf 2 χ 10 cm vorbehandelten Si 1ikagelplatten von Analtech Inc.

C) Acylierung von Kanamycin A (SiIyI),₀

1. Man löst das Kanamycin A (Silyl),_n, das in Teil A,
Stufe 4 isoliert wurde, in 500 ml trockenem Aceton
bei 23⁰C auf.

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SY-1533A /luiu

2. Unter gutem Rühren gibt man schnell das in Teil B hergestellte SAE (35,03 g) in Form einer 10 %-igen Lösung in trockenem Aceton im Verlauf von 5 bis 10 Minuten
zu. Die Temperatur steigt angenähert um 5⁰C an. Man
läßt die Temperatur der Lösung bei 23⁰C einpendeln und rührt dann noch weitere 18 bis 20 Stunden.

3. Die hell-orangefarbene, klare Lösung wird mit 400 ml

Wasser verdünnt, und der pH (7,0 bis 7,5) wird mit ^!

3 η Chlorwasserstoffsäure auf 2,2 bis 2,5 abgesenkt. ;

Dann rührt man die klare Lösung 15 bis 30 Minuten lang j

bei 23⁰C. :

4. Das Aceton wird unter Vakuum bei einer Badtemperatur
von 30 bis 35⁰C entfernt (bei dieser Stufe kann sich ! eine kleine Menge Material abscheiden, dies stellt je- ' doch kein Problem dar). Man gibt das Konzentrat in ein i geeignetes Hydriergefäß. Man gibt 10 g 5 % Palladium- j auf-Aktivkohle-Katalysator zu und hydriert 2 bis 3 j Stunden lang bei 3,52 kg/cm² (50 psi).

5. Man filtriert die Mischung durch ein Dicalite-Filterbett und wäscht das Hydriergefäß und den Kuchen mit
weiteren 2 χ 50 ml Wasser.

6. Man konzentriert das Filtrat und die Waschflüssigkeiten auf angenähert 1/3 des Volumens (150 bis 165 ml) unter Vakuum bei 40 bis 45⁰C.

7. In dieser Stufe liegt der pH im Bereich von 6,0 bis
7,0. Man gibt die Mischung auf eine' CG-50 (NH₄+)-Säule (6 χ 110 cm) auf.

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Die Säule wird mit 1000 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Man eluiert mit 0,5 η Ammoniumhydroxyd, wobei man ein automatisches Polarimeter verwendet, um das Fortlaufen des Eluiervorgangs zu überwachen. Die Reihenfolge der Eluierung ist wie folgt:

Verbliebenes Kanamycin A —> BB-K6 —> BB-K29 —ί Ami kacin.

Bei keiner der Untersuchungen wird die Anwesenheit von BB-KIl festgestellt.

; 9. Man vereinigt die Amikacin-Fraktionen und k°n~ j j zentriert auf einen Gehalt von 25 bis 30 % Feststoffen. !

Man verdünnt mit 1 Volumen Methanol und impft mit j Amikacinkristal1 en an. j

10. Im Verlauf von 2 Stunden gibt man langsam unter gutem j Rühren 2 Volumina IPA zu und kristallisiert'6 bis 8 ΐ

j Stunden lang bei 23⁰C. j

" j

ι 11. Man filtriert den Feststoff, wäscht mit 35 ml 1:1:2 ' ! Wasser/Methanol/IPA und schließlich mit 35 ml IPA. !

! I

: 12. Man trocknet in einem Vakuumofen 16 bis 24 Stunden 1 am j bei 40⁰C.

Die Ausbeute beträgt 19,91 bis 22,84 g (34 bis 39 35). Die IR-, PMR- und CMR-Spektraldaten, die zusätzlich zur spezifischen Rotation bestimmt wurden, stehen in vollständiger Obereinstimmung mit der gewünschten Struktur.

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TLC-System

CHC1₃/Methanol/NH₄OH/Wasser (1:4:2:1), 5 χ 20 cm Silikagelplatten von Quantum Industries; 1 Zone Amikacin mit Rf^O,4 (Bestimmung durch Ninhydrin).

Beispiel

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsi IyI)-6'-N-Cbz-Kanamycin A in Tetrahydrofuran mit dem gemischten Säureanhydrid aus Pi val ins'a'ure und BHBA

A) Herstellung des gemischten Anhydrids j

Man löst 5,066 g (20,0 mMol) BHBA, 4,068 g (20,0 mMol) BSA |

und 2,116 g (22,0 mMol) Triäthylamiη in 200 ml Tetrahydro- ^!

furan, das zuvor über einem Molekularsieb getrocknet wurde. '

Man hält die Lösung 2 1/4 Stunden am Rückfluß und kühlt dann i auf -1O⁰C ab. Im Verlauf von 2 bis 3 Minuten gibt man 2,412 g;

(20,0 mMol) Pivaloylchlorid unter Rühren zu und rührt dann |

noch 2 Stunden lang bei -10⁰C. Dann läßt man die Temperatur j

auf 23⁰C ansteigen. ι

B) Acylierung von Po1y(trimethylsilyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A I ι

5,454 g (4,97 mMol, berechnet als 6'-Cbz-Kanamycin A (SiIyI)₉) Poly(trimethylsiIyI)-6'-N-Cbz-Kanamycin A, wie in Beispiel 1 j hergestellt, wird in 50 ml trockenem (Molekularsieb) Tetra- j

j hydrofuran von 23⁰C aufgelöst. Man gibt die Hälfte der Lösung des

! wie in Stufe A beschrieben hergestellten gemischten Anhydrids!

ι I

(10,0 mMol) im Verlauf von 20 Minuten unter Rühren zu und rührt dann noch weitere 7 Tage.

Dann gibt man 100 ml Wasser zur Reaktionsmischung und stellt den pH (5,4) mit 3 m H₂SO₄ auf 2,0 ein. Man rührt noch

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1 Stunde und extrahiert dann die Lösung mit Äthylacetat. Die Kristallisation von polyacyliertem Material setzt ein, so daß die Reaktionsmischung gefiltert wird. Nach dem Trock- ; nen über Po^c wiegen die gewonnenen Feststoffe 0,702 g. Die j Extraktion der Reaktionsmischung wird insgesamt mit 4 χ 75 ml Äthylacetat durchgeführt. Anschließend wird das überschüssige Äthylacetat aus der wässerigen Schicht entfernt. Man führt j einen Test mit Hilfe von HPLC bei einem aliquoten Anteil der i wässerigen Lösung durch. Die erhaltene Kurve zeigt eine , Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 26,4 % an. i

Dann hydriert man die wässerige Schicht in einer Parr-Vor-

2 richtung 2 Stunden lang bei einem H2~Druck von 3,52 kg/cm

(50 psi), wobei man 0,5 g 10 % Pd-auf-Aktivkohle-Katalysator verwendet. Man filtriert das Material und stellt bei dem vereinigten Filtrat und den Waschflüssigkeiten durch Test gegen E.coli fest, daß eine Ausbeute an Amikacin von 31,2 % \ vorliegt. Das Verhältnis Amikacin/BB-K29 beträgt angenähert 9-10/1. Es liegen Spuren von Polyacylverbindungen und unumi' gesetzten Kanamycin A vor.

Beispiel 8

Einfluß von Wasser auf die Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Po1y(trimethy1silyl)kanamycin A in Acetoniösung bei 23⁰C

A) Wasserfreies Lösungsmittel

Man löst 2,40 g (2,0 mMol , als Kanamycin A (SiIyI)₁₀ berechnet) Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde, in 20 ml Aceton, das über einem Molekularsieb getrocknet worden war. Man rührt die Lösung bei 23⁰C und gibt eine Lösung von 0,701 g (2,0

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mMol) SAE in 10 ml mit einem Molekularsieb-getrocknetem ' Aceton im Verlauf von 10 Sekunden zu. Man rührt noch 22 Stun-i den bei 23⁰C. Dann gibt man 50 ml Wasser zu und stellt den j pH (7,5) auf 2,5 ein. Das Aceton wird im Vakuum bei 4O⁰C ; entfernt, anschließend wird die wässerige Lösung bei einem s H₉-DrUCk von 3,59 kg/cm² (51 psi) 2 Stunden lang bei 23⁰C \ reduziert, wobei man 1,0 g 10 % Pd-auf-Akti vkohl e als Kataly-i sator verwendet. Die mikrobiologische Untersuchung zeigt j eine Ausbeute an Amikacin von 31,24 %. \

B) Wasserzusatz zum Lösungsmittel

Man wiederholt die obige Stufe A mit der Ausnahme, daß man ι 1,0 ml Wasser (56 mMol) zu der Lösung des Poly(trimethyl-

silyl)-kanamycins A zugibt und vor der Acylierung mit SAE j

15 Minuten lang rührt. Die mikrobiologische Untersuchung j

zeigt eine Ausbeute an Amikacin von 33,80 %. '■

Beispiel

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsi IyI)-6'-N-Cbz-kanamycin A in Aceton mit dem gemischten Anhydrid aus BHBA und Isobutylkohlensäure

A) Herstellung des gemischten Anhydrids

1,267 g (5,0 mMol) BHBA und 1,313 g (10,0 mMol) N-Trimethyl- j silylacetamid (MSA) in 20 ml über Molekularsieb-getrocknetem! Aceton wird bei 23⁰C gerührt und man gibt 0,70 ml (5,0 mMol) Triäthylamin (TEA) zu. Die Mischung wird.2 1/2 Stunden unter einer ^-Atmosphäre am Rückfluß gehalten. Man kühlt die
Mischung auf -2O⁰C ab und gibt 0,751 g (0,713 ml; 5,50 mMol) Isobutylchlorformiat zu. Es setzt eine sofortige Abscheidung von Triäthylaminhydrochlorid ein. Man rührt die Mischung
1 Stunde bei -2O⁰C.

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B) Acyl ierting

Man löst 6,215 g (4,9 mMol , berechnet als (Silyl )_g-Verbindung) Poly(trimethylsi IyI)-6'-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 20 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton unter Rühren bei 23⁰C auf. Man j kühlt die Lösung auf -2O⁰C ab und gibt langsam im Verlauf ! von 30 Minuten die kalte Lösung des gemischten Anhydrids : aus Stufe A zu. Man rührt die Reaktionsmischung weitere ; 1 1/2 Stunden bei -20⁰C und anschließend 17 Stunden bei 23⁰C. Die Reaktionsmischung wird dann unter Rühren in 150 ml Was- ' ser von 23⁰C gegossen, der pH (7,75) wird mit 3 η HCl auf I 2,5 eingestellt, und das Rühren wird noch 15 Minuten fortgesetzt. Dann wird das Aceton im Vakuum bei 4O⁰C entfernt. : Man führt einen Test mit HPLC bei einem Aliquot der erhaltenen wässerigen Lösung durch. Die erhaltene Kurve zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 34,33 % an.

Der Hauptteil der wässerigen Lösung wird 3 1/4 Stunden bei 23⁰C unter einem Hg-Druck von 3,52 kg/cm (50 psi) reduziert^ wobei man 2,0 g Pd/C-Katalysator einsetzt. Der Katalysator | wird durch Filtrieren entfernt, und bei den vereinigten i

I

ι FiI traten und Waschflüssigkeiten wird durch mikrobiologische} Untersuchung gegen E. coli festgestellt, daß eine Ausbeute |

von 35,0 % an Amikacin vorliegt. \

Beispiel 10 Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethyl-

silyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A.in 3-Pentanon i

g (23,65 mMol, als 6'-N-Cbz-Kanamycin A (SiIyI)₉ berechnet) Poly(trimethylsilyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel beschrieben hergestellt wurde, und das in 100 ml Molekular-

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sieb-getrocknetem 3-Pentanon gelöst ist, wird bei 23⁰C gerührt.

Im Verlauf von 40 Minuten gibt man 26,02 mMol NAE (10 %-iger j

Überschuß) zu. Man rührt noch 113 Stunden lang bei 23⁰C und j

gibt die Mischung dann unter heftigem Rühren zu 250 ml Wasser. !

Der pH (7,3) wird mit 3 η HCl auf 2,5 eingestellt, die Mischung !

wird weitere 30 Minuten gerührt, und das 3-Pentanon wird im |

Vakuum bei 4O⁰C entfernt. Man extrahiert die wässerige Lösung ι

mit 4 χ 100 ml Äthylacetat. Dann wird ein aliquoter Anteil der j

wässerigen Lösung einer Untersuchung mit HPLC unterworfen. Die ^:

erhaltene Kurve zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von i

46,12 % an. !

i Man reduziert den Hauptteil der wässerigen Reaktionsmischung j

2 1/2 Stunden lang bei 23 C unter einem H₂-Druck von 3,59 kg/cm
(51,0 psi), wobei man 3,0 g 10 % Pd/C-Katalysator einsetzt.

Die mikrobiologische Untersuchung eines aliquoten Anteils der
vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten zeigt eine Ausbeute j an Amikacin von 40,24 % an. Anschließend konzentriert man den i Hauptteil der reduzierten wässerigen Reaktionsmischung im Vakuum, bei 40⁰C auf angenähert 100 ml und fraktioniert auf einer j CG-50 (NH₄+)-Ionenaustauschersäule (10,2 cm χ 122 cm (4 inches ! χ 4 feet), die angenähert 10 Liter Harz enthält). Man belädt ; die Säule mit der wässerigen Lösung, wäscht mit 5 Liter Wasser * und eluiert dann das Material mit 0,5 η ΝΗ,ΟΗ (gefolgt von j

3 η NH₄OH, um polyacylierte Produkte zu eluieren). Polarimetrie der

Fraktionen zeigt eine 42,7 %-ige Ausbeute an Amikacin, eine ! 12,0 %-ige Ausbeute an unumgesetztem Kanamycin A, eine 12,4 %-ige Ausbeute an polyacyliertem Material und eine 23,2 %-ige Ausbeute an BB-K29 an. |

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B e i

ρ i e T

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethyl ■ silyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Cyclohexanon bei unterschied!ichen Reaktionszeiten

A) 2,537 g (2,0 mMol , berechnet als 6'-N-Cbz-Kanamycin A (SiIyI)J₉) Poly(trimethylsi IyI)-6'-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Bei- \ spiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 300 ml trockenem ; Cyclohexanon wird 20 Stunden bei 23⁰C mit einer NAE-Lösung in trockenem Cyclohexanon (10,8 ml einer 0,1944 mMol/ml-Lö- i sung, 2,10 mMol) acyliert. Dann gibt man die Reaktionsmischung zu 150 ml Wasser unter Rühren zu und stellt den pH (5,6) ί mit 3 η HCl auf 2,5 ein. Das Cyclohexanon wird im Vakuum bei 40 C entfernt, und ein aliquoter Anteil der verbliebenen wässerigen Phase wird zur Untersuchung mit HPLC herangezogen.

Man reduziert die Hauptmenge der wässerigen Phase 3 Stunden lang bei 23⁰C unter einem Hg-Druck von 3,52 kg/cm (50 psi), j wobei man 1,0 g eines 10 %-igen Pd/C-Katalysators verwendet. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und vereinigte¹ Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mikrobiologisch auf Amikacin untersucht.

B) Die obige Reaktion A wird wiederholt mit der Ausnahme, daß die Acylierung diesmal nicht 20 Stunden lang, sondern 115 Stunden lang durchgeführt wurde.

Ausbeuten

Reaktion A Reaktion B

HPLC-Test (di-Cbz-Ami kaci n)

49,18 % 56,17 %

Mikrobiologische Untersuchung auf Amikacin

turbidimetrisch Platte

42,87 % 55,39 %

39,16 % 38,45 %

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M/19 loo - 55 -

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Beispiel 12

Mikrobiologische Unter-HPLC-Test suchung auf Amikacin

(di-Cbz-Amikacin) turbidimetrisch PIatte

Reaktion A 29,27 % 28,34 % 28,18 %

Reaktion B 33,39 % 21,52 % 28,63 %

Beispiel

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethyl silyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Dioxan während unterschied!icher Reaktionszeiten

A) Man wiederholt Beispiel 11, A mit der Ausnahme, daß man unter Verwendung von trockenem Dioxan als Lösungsmittel 44 Stunden lang acyliert.

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethyl- |

silyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Tetrahydrofuran bei \

unterschiedlichen Reaktionszeiten !

A) Man wiederholt Beispiel 11, A mit der Ausnahme, daß man anstelle von trockenem Cyclohexanon trockenes Tetrahydrofuran als Lösungsmittel verwendet.

B) Man wiederholt Beispiel 11, B mit der Ausnahme, daß man an- J stelle von trockenem Cyclohexanon trockenes Tetrahydrofuran j als Lösungsmittel verwendet. ι

Ausbeuten

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B) Man wiederholt das Beispiel 11, B mit der Ausnahme, daß man unter Verwendung von trockenem Dioxan als Lösungsmittel 18 1/2 Stunden acyliert.

Ausbeuten

Mikrobiologische Unter-HPLC-Test suchung auf Amikacin

(di-Cbz-Amikacin) turbidimetrisch Platte

Reaktion A 39,18 % 43,27 % 33,36 %

Reaktion B 42,82 % 22,55 % 33,37 %

Beispiel 14_

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsilyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A in wasserfreiem Diäthylketon bei 75⁰C

Zu einer gerührten Lösung von 2,537 g (2,0 mMol , berechnet als 6'-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)_g) Poly(trimethylsi IyI)-6'-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt [ wurde, in 32 ml Molekularsieb-getrocknetem Diäthylketon bei 75⁰Q gibt man im Verlauf von 15 Minuten eine Lösung von NAE (10,8 ml mit 0,1944 mMol/ml Diäthylketon, 2,10 mMol) zu. Man rührt noch weitere 3 Stunden bei 75⁰C und gießt dann die Mischung in 150 ml Wasser.Der pH wird mit 3 η HCl auf 2,8 eingestellt und ' das Diäthylketon wird bei 40 C im Vakuum entfernt. HPLC-Test j eines aliquoten Anteils der wässerigen Phase zeigt eine Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 39,18 % an. !

Man reduziert die Hauptmenge der wässerigen Phase 3 1/4 Stunden bei 23⁰C unter einem Hg-Druck von 3,49 kg/cm (49,8 psi),

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wobei man 1,0 g Pd/C-Katalysator einsetzt. Der Katalysator
wird durch Filtrieren entfernt, und vereinigte Filtrate und
Waschflüssigkeiten werden mikrobiologisch auf Amikacin untersucht. Die turbidimetrische Untersuchung zeigt eine Ausbeute
von 27,84 % an, der Plattentest ergibt eine Ausbeute von 28,6 %.

Beispiel 15

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethyl- I silyi)-kanamycin A mit NAE bei 0 bis 5⁰C nach "Rück"-Hydrolyse ■ mit Wasser

A) Silylierung von Kanamycin A unter Verwendung von HMDS mit ' TMCS als Katalysator ;

Man bringt 10 g Kanamycin A (97,6 % rein, 20,14 mMol) in | 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter einer ι Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Zur rückflußkochenden | Reaktionsmischung gibt man im Verlauf von 10 Minuten eine
Mischung aus 22,76 g (141 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin A)
HMDS und 1 ml (0,856 g, 7,88 mMol) TMCS. Man hält noch
4 3/4 Stunden am Rückfluß und kühlt dann die Mischung, j konzentriert im Vakuum zu einem gelben, viskosen Sirup und j trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum. Die Ausbeute an Produkt! beträgt 23,8 g (97,9 %, berechnet als Kanamycin A (SiIyI)₁₀)J

B) Acylierung

Man löst 23,8 g (20,14 mMol) Poly(trimethylsiIyI)-kanamycin
A, das in Stufe A hergestellt wurde, in 250 ml Molekular- j sieb-getrocknetem Aceton bei 23⁰C auf und kühlt dann auf j 0 bis 5⁰C ab. Dann gibt man unter Rühren 3,63 ml (201,4 mMolJ 10 Mol pro Mol polysilyliertem Kanamycin A) Wasser zu und
läßt die Mischung 30 Minuten lang unter mäßigem Vakuum ste-

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ι hen. Im Verlauf von weniger als 1 Minute werden 19,133 mMol j (0,95 Mol pro Mol polysiIyIiertes Kanamycin A) MAE in

108,3 ml Aceton zugegeben. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei 0 bis 5⁰C, verdünnt mit Wasser, stellt den pH auf 2,5 ein und entfernt dann das Aceton im Vakuum. Dann wird die • wässerige Lösung 2 1/2 Stunden bei 23⁰C bei einem Ho-Druck von 3,52 kg/cm (50 psi) reduziert, wobei man 2,0 g 10 %

Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Die reduzierte Reaktionsmischung wird durch Dicalite filtriert, im Vakuum bei 40⁰C auf ungefähr 100 ml konzentriert und dann auf eine CG-50 (NH₄+)-Säule (6 Liter Harz, 5 χ 100 cm) aufgegeben. j Man wäscht mit Wasser und eluiert dann mit 0,6 n-1,0 n- ! 3 η NH₄OH. Man erhält 60,25 % Amikacin, 4,37 % BB-K6, ! 4,35 % BB-K29, 26,47 % Kanamycin A und 2,18 % Polyacylverbindungen.

Beispiel 1J5 ι

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethyl- i silyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A mit SAE bei 0 bis 5⁰C nach "Rück"- ! Methanolyse

———·—^^——_— ₍

A) Silylierung von 6' -N-Cbz-Kanamycin A

Man bringt 20,0 g (32,4 mMol) 6'-N-Cbz-Kanamycin A in 200 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Im Verlauf von 10 Minuten gibt man 47,3 ml (226,8 mMol, 7 Mol pro Mol 6'-N-Cbz-Kanamycin A) _; HMDS zu und setzt das Rückflußkochen noch 20 Stunden fort. Dann kühlt man die Mischung, konzentriert im Vakuum und j trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum, wodurch man 39,1 g ! weißen amorphen Feststoff erhält. Ausbeute 95,4 %, berechnet als 6'-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)_g.

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B) Acylierung

Man löst 39,1 g (32_S4 mMol) Poly(trimethylsilyl)-6'-N-Cbz-Kanamycin A, das in der obigen Stufe A hergestellt wurde, in 400 ml trockenem Aceton unter Rühren bei 23⁰C auf. Man gibt 6,6 ml (162 mMol, 5 Mol pro Mol polysiIyIiertes 6'-N-Cbz-Kanamycin A) Methanol zu und rührt die Mischung 1 Stunde unter einer starken Stickstoffspülung bei 23⁰C. Die Mischung wird auf 0 bis 5⁰C abgekühlt, und eine Lösung von 11,35 g (32,4 mMol) SAE in 120 ml zuvor abgekühltem, trockenem Aceton wird zugesetzt. Man rührt die Mischung weitere 3 Stunden bei 0 bis 5⁰C und gibt sie dann 1 Woche lang in einen bei 4⁰C gehaltenen Kälteraum. Dann gibt man 300 ml Wasser zu, stellt den pH auf 2,0 ein, rührt die Mischung 1 Stunde und entfernt das Aceton im Vakuum. Die erhaltene wässerige Lösung wird 17 Stunden bei 23⁰C unter einem H₀-Druck

2 '

von 3,80 kg/cm (54,0 psi) reduziert, wobei man 3,0 g j 10 %-iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. | Dann filtriert man durch Dicalite, konzentriert im Vakuum ■ auf 75 bis 100 ml, gibt auf eine CG-50 (NH₄+)-Säule auf und ^; eluiert mit Wasser und 0,6 η NH₄OH. Man erhält 52,52 % Amika-t ein, 14,5 % BB-K29, 19,6 % Kanamycin A und 1,71 % Polyacyl- :

verbindungen. !

B e i s ρ i e 1 17

Herstellung von Ami	IyI)-Kanamycin A	ikacin du	rch	Acyl	lerung	von	Poly(trimethyl -	reakzeptor
si	t Wasser	mit SAE	bei	0 bi	s 50C	nach	"Rück"-Hydrolyse
mi	Silylierung von
A)	Verwendung von	Kanamyci	η Α	mit	TMCS i	η Acetonitril unter
	fetramethylguanid	in als	Sau

Man suspendiert 4,88 g (10,07 mMol) Kanamycin A in 100 ml

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Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei
23⁰C. Zur gerührten Suspension gibt man 16,234 g (140,98
mMol, 14 Mol pro Mol Kanamycin A) Tetramethylguanidin (TMG).
Man erhitzt die Mischung zum Rückfluß und gibt im Verlauf
von 15 Minuten 15,32 g (140,98 mMol, 14 Mol pro Mol Kanamycin A) TMCS zu. Ungefähr 1/2 Stunde nach der Zugabe des
TMCS bildet sich ein weißer Niederschlag von TMG-HCl. Man
kühlt die Mischung auf Raumtemperatur, konzentriert zu einem¹ klebrigen Rückstand und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum.!

Der Feststoff wird mit 100 ml trockenem THF verrieben, und
j das unlösliche TMG-HCl wird abfiltriert und mit 5 χ 20 ml- J j Portionen THF gewaschen. Vereinigtes Filtrat und Waschflüssig keiten werden im Vakuum bei 40 C zu einem klebrigen Rück- i stand konzentriert und 2 Stunden unter Hochvakuum getrocknet^ Man erhält 10,64 g eines hei 1-cremefarbigen, klebrigen Rück-j Stands. Die Ausbeute beträgt 87,6 %, berechnet als Kanamy- j c i η A (S i 1 y 1) ^ _Q. ;

B) Acyli erung '

! Man löst 10,64 g (10,07 mMol) Poly(trimethylsi IyI)-kanamy- \ ein A, das in der obigen Stufe A hergestellt wurde, in
110 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton unter Rühren bei ι 23⁰C auf und kühlt die Lösung auf 0 bis 5⁰C. Dann gibt man i 1,81 ml Wasser (100,7 mMol, 10 Mol pro Mol polysiIyIiertem ι Kanamycin A) zu und rührt die Lösung 30 Minuten unter mäßi- j gem Vakuum. 3,70 g (10,57 mMol, 5 %-iger Oberschuß) SAE ] in 40 ml vorgekühltem, trockenem Aceton werden im Verlauf ι von weniger als 1 Minute zugegeben, und die Mischung wird
1 Stunde gerührt. Man arbeitet die Mischung nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 16 B auf, wobei man ungefähr 50 % Amikacin, ungefähr 10 % BB-K29, 5 bis 8 % BB-K6,
ungefähr 20 % Kanamycin A und 5 bis 8 % Polyacylverbindungen erhält.

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Beispiel 18

Herstellung von Poly(trimethylsi IyI)-kanamycin A in Pyridin unter Verwendung von HMDS i

Man suspendiert 10,0 g (20,64 mMol) Kanamycin A in 100 ml , Molekularsieb-getrocknetem, frisch destilliertem Pyridin bei \ 23⁰C. Man beginnt eine StickstoffspUlung und bringt die Suspension zum Rückfluß. 17,33 g (107,32 mMol, 5,2 Mol pro Mol Kana- ■ mycin A) HMDS werden im Verlauf von 10 Minuten zugesetzt, und ι die Mischung wird 19 Stunden am Rückfluß gehalten. Dann kühlt j man auf Raumtemperatur, konzentriert im Vakuum zu einem hell- | gelb-goldenen Sirup und trocknet unter Hochvakuum, wobei man j

einen weißen, amorphen Feststoff erhält. Man erhält 22,1 g ι Produkt. Ausbeute 92,6 %, berechnet als Kanamycin A (SiTyI)^q' '

Beispiel 19

Herstellung von Poly(triäthylsilyl)-kanamycin A unter Verwen- ι dung von Triäthylchiorsilan mit Triäthylamin als Säureakzeptor '

5,0 g zu 97,6 % reines Kanamycin A (10,07 mMol) werden in 100 ml'

Molekülarsieb-getrocknetem Acetonitril bei 23⁰C suspendiert. ■

Man gibt 33,8 ml (24,5 g, 241,7 mMol) Triäthylamin zu und j

bringt die Suspension zum Rückfluß. Eine Lösung von 23,7 ml '

(21,3 g, 140,98 mMol) Trichioräthylsi 1 an in 25 ml trockenem j

Acetonitril wird im Verlauf von 20 Minuten zugesetzt. Man hält '

noch weitere 7 Stunden am Rückfluß und kühlt die Mischung auf j

Raumtemperatur ab, worauf lange, feine Nadeln von TEA-HCl ab- i

geschieden werden. Man läßt die Mischung ungefähr 16 Stunden .

bei Raumtemperatur stehen, konzentriert im Vakuum bei 40 C zu I einem klebrigen Feststoff und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum zu einem dunkel-orangefarbenen, klebrigen Feststoff.
Man verreibt den Feststoff mit 100 ml trockenem THF von 23⁰C

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und filtriert das unlösliche TEA-HCl ab, wäscht mit 5 χ 20 ml THF und trocknet. Hierbei erhält man 16,0 g TEA-HCl. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten v/erden im Vakuum zu einem Feststoff konzentriert. Dann trocknet man 2 Stunden unter Hochvakuum. Man erhält 19,3 g Poly(triäthylsiIyI)-kanamycin A als dunkelorangen, viskosen Sirup.

Bei spiel

Herstellung von Poly(trimethylsiiyl)-kanamycin A unter Verwendung von bis-Trimethylsilylharnstoff

Man suspendiert 10,0 g zu 99,7 "' reines Kanamycin A (20,58 mMol in 200 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei 23⁰C. Zur Suspension gibt nan 29,45 g bis-TrimethylsiIyI-harnstoff (BSU) (144,01 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin) und bringt die Mischung unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Man hält noch 17 Stunden am Rückfluß und kühlt dann die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur ab. Eine kleine Menge unlösliches Material wird durch Filtrieren entfernt, mit 3 χ 10 ml-Portionen Acetonitril gewaschen und getrocknet (1,1381 g) Infrarot-Spektroskopie zeigt, daß es sich hierbei um BSU und eine kleine Menge unumgesetztes Kanamycin A handelt. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten werden 16 Stunden auf 4⁰C abgekühlt. Es scheidet sich weiterer Feststoff ab, der wie oben beschrieben gewonnen wird. Man erhält 7,8 g. Durch Infrarotanalyse wird gezeigt, daß es sich um BSU und Harnstoff handelt. Das hellgelbe Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 4O⁰C konzentriert. Anschließend trocknet man unter Hochvakuum, wobei man 27,0 g eines weißen Feststoffs erhält, der teilweise klebrig ist und teilweise aus feinen, nadelartigen Kristallen besteht. Man behandelt den Feststoff mit 150 ml Heptan von 23⁰C, entfernt den unlöslichen Anteil durch Filtrieren, wäscht mit 2 χ 50 ml-Portionen Heptan und trocknet. Hier-

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bei erhält man 6,0 g weiße Nadeln, bei denen es sich nach Infrarotanalyse um BSU und Harnstoff handelt. Vereinigtes Filtrat i und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum bei 4O⁰C konzentriert, j Dann trocknet man 2 Stunden lang unter Hochvakuum, wobei man j 20,4 g weiße Nadeln erhält. Deren Infrarotspektrum ist typisch j für polysilyliertes Kanamycin A. Berechnungen zeigen, daß das ^: Produkt durchschnittlich 7,22 Trimethylsilylgruppen enthält. |

Beispiel 21

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Per(trimethylsilyl)-kanamycin A nach teilweiser Desilylierung mit 1,3-Butandiol

A) Herstellung von Per(trimethylsi IyI)-kanamycin A

Man suspendiert 10,0 g (20,639 mMol) Kanamycin A in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei 23⁰C. Man bringt die Suspension unter Stickstoffspülung zum Rückflußkochen und gibt dann im Verlauf von 10 Minuten 23,322 g (144,5 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin A) HMDS zu. Man hält noch 16 Stunden lang am Rückfluß und kühlt dann die Mischung auf Raumtemperatur ab und konzentriert dann im Vakuum. Anschließend trocknet man 2 Stunden unter Hoch- j vakuum. Man erhält 24,3 g eines weißen, klebrigen Rückstands! Die Ausbeute beträgt 92,1 %. berechnet als Kanamycin A i (SiIyI)_n.

B) Acylierung

24,3 g in Stufe A hergestelltes Per(trimethyl si TyI ^kanamycin A werden in 240 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton bei 23⁰C unter Rühren gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 9,25 ml 1,3-Butandiol (103,2 mMol, 5 Mol pro Mol Per(tri-

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methylsilyl)-kanamycin A). Man rührt die Mischung 2 Stunden bei 23⁰C unter Stickstoffspülung und kühlt dann auf 0 bis 5⁰C ab. Im Verlauf von ungefähr 1 Minute gibt man 7,23 g SAE (20,64 mMol) in 70 ml vorgekühltem Aceton zu. Die Mi-

O I

schung wird 3 Stunden bei 0 bis 5 C gerührt und dann \ ungefähr 16 Stunden lang in einem bei 4⁰C gehaltenen Kälte- j raum stehengelassen. Man gibt 200 ml Wasser zu, stellt den ; pH auf 2,5 ein und rührt die klare, gelbe Lösung 30 Minuten bei 23⁰C. Das Aceton wird im Vakuum entfernt und die wässerige Lösung wird 2 Stunden lang bei 23⁰C bei einem H₀-Druck i

2 '

von 3,87 kg/cm (55,0 psi) reduziert, wobei man 3,0 g 10 %-iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Dann : filtriert man die reduzierte Lösung durch Dicalite und chromatographiert wie in Beispiel 16 B beschrieben. Man er- ι hält 47,50 % Amikacin, 5,87 % BB-K29, 7,32 % BB-K6, 24,26 % ' Kanamycin A und 7,41 % Polyacylverbindungen. ^!

Beispiel 22

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethyl- !

1 j

! silyl)-kanamycin A, das in THF unter Verwendung von SAE mit j

SuIfaminsäurekatalysator hergestellt wurde

Zu einer unter Rückfluß gehaltenen Mischung von 5,0 g (10,32 mMol) Kanamycin A in 50 ml Molekularsieb-getrocknetem Tetrahydrofuran (THF) gibt man 100 mg SuIfaminsäure und 12,32 g (76,33 mMol) HMDS. Man hält die Mischung 18 Stunden lang am Rückfluß, wobei nach 6 Stunden vollständige Auflösung erfolgt. Man kühlt die Lösung auf 23⁰C, behandelt mit 0,1 ml Wasser und hält 30 Minuten bei 23⁰C. Eine Lösung von 3,61 g (10,3 mMol) SAE in 36 ml THF wird im Verlauf von 30 Minuten zugesetzt. Nach 3-stündigem Rühren wird die Mischung mit 100 ml Wasser verdünnt und der pH mit 10 %-iger H₂SO₄ auf 2,2 eingestellt. Man

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rührt 30 Minuten lang bei 23⁰C und konzentriert dann im Vakuum, ·

um das THF zu entfernen. Die erhaltene wässerige Lösung wird 2 Stunden lang bei 23⁰C bei einem H₂~Druck von 3,52 kg/cm^{2 :} (50 psi) reduziert, wobei man 10 %-iges Pd-auf-Aktivkohle als ; Katalysator verwendet. Die reduzierte Lösung wird durch Dicalite filtriert, und die Feststoffe werden mit Wasser gewaschen. Vereinigte Filtrate und WaschflUssigkeiten (150 ml) werden mikro- j biologisch gegen E. coli untersucht. Man stellt fest, daß sie j 1225 mcg/ml (31,5 % Ausbeute an aktivem Material) Amikacin enthält.

Beispiel 23

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsi IyI)-kanamycin A mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Dicarbobenzyloxy-AHBA

A) Herstellung des Di carbobenzyloxy-L-(-)-^-amino-(y-hydroxy- ι buttersäure-N-hydroxysucciηimidesters

Man löst 8 g (20,65 mMol) Di carbobenzyl oxy-L-(-)-o^-ami no-c^- j hydroxybuttersäure und 2,37 g (20,65 mMol) N-Hydroxysuccin- j imid in 50 ml trockenem Aceton von 23⁰C auf. 4,25 g (20,65 j mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 20 ml trockenem Aceton, werden zugegeben und das Ganze wird 2 Stunden bei 23⁰C gerührt. Man filtriert den Di cyclohexyl harnstoff ab, wäscht den Filterkuchen mit 10 ml trockenem Aceton und vereinigt Filtrate und Waschflüssigkeiten.

B) Acylierung

Aus 10,0 g (20,639 mMol) Kanamycin A nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 21 hergestelltes Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A wird in 100 ml trockenem Aceton gelöst.

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Man kühlt die Lösung auf 0 bis 5 C ab, gibt 3,7 ml entionisiertes Wasser zu und rührt die Lösung 30 Minuten unter mäßigem Vakuum bei 0 bis 5⁰C. ^:

Zu dieser Lösung gibt man die Lösung des in Stufe A hergestellten di-Cbz-blockierten Acylierungsmitteis und rührt die Mischung dann 30 Minuten lang bei 0 bis 5⁰C. Die Mischung wird mit Wasser verdünnt» der pH wird auf 2,2 eingestellt und das Aceton wird im Vakuum entfernt. Man reduziert die wässerige Lösung nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 22 und filtriert dann durch Dicalite. Durch Chromatographie wird festgestellt, daß 40 bis 45 % Amikacin, etwa 10 % BB-K29, eine Spur BB-K6, ungefähr 30 % Kanamycin A und eine kleine Menge Polyacylverbindungen vorliegen. ;

Beispiel 24

Herstellung von Poly(trimethylsi IyI)-kanamycin A unter Verwendung von HMDS mit Imidazo! als Katalysator

Man erhitzt 11 g (22,7 mMol) Kanamycin A und 100 mg Imidazol in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Stickstoffspülung zum Rückfluß. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man 18,48 g HMDS (114,5 mMol, 5 Mol pro Mol Kanamycin A) zu und hält die Mischung 20 Stunden am Rückfluß. Nach ungefähr 2 1/2 Stunden erfolgt vollständige Auflösung. Man kühlt die Lösung auf 23 C und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum, wobei 21,6 g Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A als schaumiger Rückstand zurückbleiben. Die Ausbeute beträgt 93,1 %, berechnet als Kanamycin (SiIyI)₁₁.

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Beispiel 25 j

Herstellung von l-N-/L-(-)-^-Amino-c£-hydroxybutyryl.7kanamycin B ; (BB-K26) durch Acylierung von Po1y(trimethylsilyi)-kanamyciη Β ! mit SAE I

A) Herstellung von Poly(trimethylsilyi)-kanamycin B unter Verwendung von HMDS mit TMCS-Katalysator

25 g (51,7 mMol) Kanamycin B in 250 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril werden unter einem Stickstoffstrom
zum Rückfluß erhitzt. Man gibt im Verlauf von 30 Minuten
62,3 g HMDS (385,81 mMol, 7,5 Mol pro Mol Kanamycin B), gefolgt von 1 ml TMCS als Katalysator, zu. Die Mischung wird
21 Stunden unter Rückfluß gehalten, wobei nach 1 Stunde
vollständige Auflösung erfolgt. Dann wird das Lösungsmittel j bei 6O⁰C im Vakuum entfernt. Den öligen Rückstand hält man ; 3 Stunden bei 6O⁰C unter Hochvakuum. Man erhält 53,0 g \ Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B. Die Ausbeute beträgt
85,2 %, berechnet als Kanamycin B (Silyl),q.

B) Acylierung j

53,0 g des in der obigen Stufe A hergestellten Poly(tri- ! methylsilyl)-kanamycins B werden in 500 ml trockenem Aceton j bei 0 bis 5⁰C aufgelöst. Man gibt 20,9 ml Methanol zu und j rührt die Mischung 30 Minuten bei 0 bis 5⁰C im Vakuum. Eine ; Lösung von 18,1 g (51,67 mMol) SAE in 200 ml vorgekühltem, ' trockenem Aceton wird im Verlauf von weniger als 1 Minute
zugesetzt, und die Mischung wird 30 Minuten bei 0 bis 5⁰C
gerührt. Die Mischung wird nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 22 aufgearbeitet und dann auf eine Säule mit
CG-50 (NH₄+) (8 χ 120 cm) aufgegeben. Man eluiert mit einem NH₄0H-Gradienten von 0,6 η auf 3 n. Erhalten werden 38 %
BB-K26, 5 % des entsprechenden 6'-N-acylierten Kanamycins B

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(ΒΒ-Κ22), 10 % des entsprechenden 3-N-acylierten Kanamycins B (BB-K46), 14,63 % Kanamycin B und eine kleine Menge polyacyliertes Kanamycin B.

Beispiel 26

Herstellung von Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A unter Verwen- ! dung von HMDS mit Kanamycin Α-Sulfat als Katalysator j

19,5 g (40,246 mMol) Kanamycin A und 0,5 g (0,858 mMol) Kana- ' mycin Α-Sulfat /"insgesamt = 20,0 g, 41,0 mMol7 in 200 ml Mole- j kularsieb-getrocknetem Acetonitril werden zum Rückfluß gebracht; Man gibt langsam 60,3 ml HMDS (287,7 mMol, 7 Mol pro Mol Kana- ^: mycin A) zu und hält die Mischung 28 Stunden am Rückfluß. Dann · wird am Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft und anschließend unter Dampfstrahl vakuum getrocknet. Man erhält 47,5 g Poly(trimethylsi IyI)-kanamycin A als blaßgelbes öl. Die Aus- ! beute beträgt 95,82 %, berechnet als Kanamycin A (S

Beispiel 27

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Poly(trimethylsiIyI)-kanamycin A mit N-Trif1uoracetyl-blockiertem AHBA-N-hydroxysuccinimidester

A) Herstellung von N-Trifluoracetyl-AHBA und Umwandlung in
! den N-Hydroxysuccinimidester

' Zu einer Suspension von 5,0 g (42 mMol) AHBA in 100 ml THF
gibt man 40 g (191 mMol) Trifluoressigsäureanhydrid unter
, Rühren im Verlauf von 10 Minuten zu. Man rührt die Lösung

18 Stunden bei 23⁰C und konzentriert dann im Vakuum bei
5O⁰C zur Trockne. Den Rückstand löst man in 100 ml wässeri-

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gem Methanol (1:1) und rührt 1 Stunde. Dann konzentriert ] man im Vakuum zur Trockne und löst in 50 ml H₂O wieder auf. ' Die wässerige Lösung wird mit 3 χ 50 ml-Portionen MIBK extrahiert, und nach dem Trocknen über Na₂SO₄ wird der Extrakt ¹ zu einem öl konzentriert. Spuren an Lösungsmittel werden
durch Zusatz und Abdesti11ieren von 4 ml Wasser entfernt. ^; Beim Stehenlassen geht das öl in einen wachsartigen, kristal¹ linen Feststoff über. Man erhält 2,5 g Produkt, Ausbeute ; 28 %. ;

Man löst 2,4 g (11,3 mMol) des N-Trif1uoracetyl-AHBA in ■ 50 ml trockenem Aceton und gibt 1,30 g (11,31 mMol) N-Hydroxy succinimid zur Lösung. Eine Lösung von 2,33 g Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml trockenem Aceton wird langsam zugesetzt·. Man rührt die Reaktionsmischung 2 Stunden lang bei 23⁰C und i entfernt dann den ausgefallenen Di cyclohexyl harnstoff durch { Filtrieren und wäscht mit einer kleinen Menge Aceton. Ver- j einigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (Lösung des N-Hydroxy succinimidestersder N-Trif1uoracetyl-AHBA) wird bei der
nachfolgenden Stufe ohne Isolierung verwendet.

B) Acylierung

Zu einer Lösung von 11,31 mMol Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, das wie in Beispiel 26 beschrieben hergestellt wurde in 54 ml Aceton gibt man 2,0 ml (113,4 mMol) Wasser und
rührt die Mischung 30 Minuten im Vakuum bei 0 bis 5⁰C. Zu
der Mischung gibt man den in der obigen Stufe A hergestell- | ten N-Hydroxysuccinimidester der N-Trif1uoracetyl-AHBA
(11,31 mMol) und hält die Mischung dann 1 Stunde bei 5⁰C. ; Der pH wird mit 20 %-iqer H₂SO₄ auf ungefähr 2,0 eingestel 11|, die Mischung wird 30 Minuten gerührt und dann wird der pH
mit NH₄OH auf ungefähr 6,0 erhöht. Anschließend dampft man
die Mischung am Rotationsverdampfer zur Trockne ein. Man

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erhält 14,4 g eines klebrigen, weißlichen Feststoffs- 0er Feststoff wird in 100 ml Wasser gelöst, der pH wird mit 10 η ΝΗ,ΟΗ von 5,5 auf 11,0 angehoben und die Lösung wird in einem ölbad 1 Stunde bei 7O⁰C erhitzt. Dann senkt man den pH (9,5) mit HCl auf 7,0 ab, führt mit der Lösung eine Klarfiltration durch, um eine kleine Menge unlösliche Materialien zu entfernen und wäscht das Filter mit Wasser. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (188 ml) werden auf eine Säule mit CG-50 (NH₄+) (8 χ 90 cm) aufgegeben, mit 2 Liter Wasser gewaschen und mit einem NH^OH-Gradienten (0,6 η -

^H i

1,0 η konzentriert) eluiert. Man erhält 28,9 % Amikacin, j 5,0 % BB-K6, 5,7 % BB-K29, 43,8 % Kanamycin A, 3,25 % Poly- j acylverbindungen und 14,3 % eines unbekannten Materials, das in der ersten Fraktion aus der Säule austritt.

Beispiel 28

Herstellung von Amikacin durch Acylierung von Polyftrimethylsilyl)-kanamycin A mit tert.-Butoxycarbonyl-blockiertem AHBA-N-hydroxysuccinimidester ;

A) Herstellung von tert.-BOC-AHBA und Umwandlung in den N-Hydroxysuccinimidester

Eine Lösung von 5,0 g (42 mMol) AHBA in 100 ml Wasser und 20 ml Aceton wird mit 10 η NaOH auf pH 10 eingestellt. Im Verlauf von 3 bis 4 Minuten gibt man 11,6 g (53 mMol) Ditert.-butyldicarbonat zu und rührt die Lösung 35 Minuten, während man den pH durch periodische Zugabe von 10 η NaOH bei pH 10 hält. Das Aceton wird im Vakuum entfernt, und die wässerige Phase wird mit 40 ml Äthylacetat gewaschen. Man senkt den pH der wässerigen Lösung mit 3 η HCl auf 2,0 ab und extrahiert dann mit 3 χ 30 ml MIBK. Die vereinigten

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MIBK-Extrakte werden über Na₂SO₄ getrocknet und zu einem klaren, öligen Rückstand konzentriert. Man erhält 8,2 g Produkt, Ausbeute 89 % ,

4,25 g (19,4 mMol) des tert.-BOC-AHBA werden in 50 ml Aceton gelöst, und man gibt 2,23 g (19,4 mMol) N-Hydroxysuccinimid zu. Eine Lösung von 4,00 g (19,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Aceton wird langsam zugesetzt, und die Mischung wird 2 Stunden bei 23⁰C gerührt. Man entfernt den ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren und wäscht mit einer kleinen Menge Aceton. Vereinigte Filtrate und Waschflüssigkeiten (Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von tert.-BOC-AHBA) werden in der nachfolgenden i Stufe ohne Isolierung eingesetzt.

B) Acylierung

Zu einer Lösung von 41,28 mMol Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A, wie in Beispiel 26 beschrieben hergestellt, in 94 ml Aceton gibt man 3,5 ml (194 mMol) Wasser und rührt die Lösung 30 Minuten im Vakuum bei 0 bis 5⁰C. 19,4 mMol des in der obigen Stufe A hergestellten N-Hydroxysuccinimidesters von tert.-BOC-AHBA werden zugesetzt und die Mischung wird 1 Stunde bei 5⁰C stehengelassen. Dann gibt man 200 ml Wasser; zu und senkt den pH (7,0) mit 20 %-iger H₂SO₄ auf 2,0 ab. Nach 30-minütigem Rühren wird der pH mit NH₄OH auf ungefähr 6,0 angehoben, und die Mischung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man 36,3 g eines goldfarbenen Öls erhält Das öl wird in 200 ml Trif1uoressigsäure gelöst, 15 Minuten j lang stehengelassen und dann am Rotationsverdampfer zur ! Trockne eingedampft. Man wäscht das öl mit Wasser und destilliert das Wasser ab. Man gibt konzentriertes NH₄OH auf pH 6,0 zu und destilliert dann ab. Der erhaltene Feststoff wird in Wasser gelöst, filtriert, und das Filter wird mit Wasser gewaschen. Man gibt vereinigte Filtrate und

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SY-1533A £öiö33£

Waschflüssigkeiten (259 ml) auf eine CG-50 (NH₄+)-Säule (8 χ 92 cm), wäscht mit 4 Liter Wasser und eluiert mit einem NH^OH-Gradienten (0,6 η - 1,0 η konzentriert). Man erhält 40,32 % Amikacin, 4,58 % BB-K6, 8,32 % BB-K29, 30,50 % Kanamycin A und /,43 % Polyacylverbindungen.

Beispiel 29

Man wiederholt die allgemeine Arbeitsweise des Beispiels 1 mit der Ausnahme, daß man das dort verwendete 6'-N-Carbobenzyloxykanamycin A durch eine äquimolare Menge an 6'-N-Carbobenzyloxy- i kanamycin B ersetzt. Hierbei erhält man das l-N-^L-i-J-•y-hydroxybutyryUkanamycin B.

Beispiel 30

Man wiederholt die allgemeine Arbeitsweise des Beispiels 1 mit der Ausnahme, daß man den dort verwendeten L-(-)-^-Benzyloxy-

carbonylamino-ix-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-B-norbornen^.S- j dicarboximidester durch: !

L-(-)-ß-Benzy1 oxycarbonyl amino-d-hydroxypropionsäure-N-hydroxy-| 5-norbornen-2,3-dicarboximidester und

L- (-)-cf-Benzyl oxycarbonyl ami no-rf-hydroxyvaleri ans äure-N - hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester ersetzt, wodurch man

l-N-/l-(-)-ß-Amino-o*-hydroxypropionyl.7kanamycin A, bzw. l-N-/L-(-)-cf-Amino-^-hydroxyvaleryl7kanamycin A erhält.

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Beispiel 31

Man wiederholt die allgemeine Arbeitsweise des Beispiels 25 mit der Ausnahme, daß man den dort verwendeten L-(-)-7"'-Benzyl oxycarbony1 ami no-crf-hydroxybuttersäure-N-hydroxysucciηimidester durch:

L-(-)-ß-Benzyloxycarbonyl am in o-st- hydroxy propi on säure -N -hydro xysuccinimidester, bzw.

L-C-J-cT-Benzyloxycarbonylamino-^-hydroxyvaleriansäure-N-hydroxyr succinimidester ersetzt, wodurch man

l-N-/t-(-)-ß-Amino-:*-hydroxypropionyl.7kanamycin B, bzw.

l-N-/I-(-)-if-Annno-c/-hydroxyvaleryl7kanamycin B, erhält. j

21/V.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung eines l-N-/u-Amino-o<-hydroxy· al kanoyUkanamycins A oder ß der allgemeinen Formel I:

   KO

   NH,

   NH:

   L-C-) (I)

   worin R für OH oder NH₂ steht und η eine ganze Zahl von

   O bis 2 darstellt, oder eines nicht-toxischen, pharmazeu- j

   tisch verträglichen Säureadditionssalzes davon,

   dadurch gekennzeichnet, daß man polysiIyIiertes Kanamycin A oder B oder polysilyliertes Kanamycin A oder B, das an der 6' -Arninogruppe eine von Silyl verschiedene Blockierungsgruppe aufweist, mit einem acylierenden Derivat der Säure der allgemeinen Formel II:

   B-HN-CH₂-(CH₂J_n-CH-COOH

   OH

   (II)

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   ORIGINAL INSPECTED

   M/19 100 SY-1533A

   worin η eine ganze Zahl von 0 bis 2 darstellt und B eine Aminoblockierungsgruppe darstellt, in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel acyliert und anschließend sämtliche Blockierungsgruppen entfernt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als acylierendes Derivat der Säure einen aktiven Ester oder ein Gemisch des Säureanhydrids einsetzt.

   3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2» dadurch gekennzeichnet, daß die Amino-blockierende Gruppe des acylierenden Derivats der Säure den nachfolgenden Formeln entspricht:

   U
   C

   CH-, O I Il

   , CH₃-C-O-C-CH,

   X₃C-CH₂-O-C-

   und

   809847/0694

   Y₂XCC- ,

   M/19 loo - η - 28 Ί 8992

   SY-1533A ο

   1 2
   worin R und R gleich oder verschieden sind und jeweils \ für H, F, Cl, Br, NO₂, OH, (niedrig)Alkyl oder (niedrig)Alk-^; oxy stehen und X für Cl, Br, F oder J steht und worin Y

   für H, Cl, Br, F oder J steht. ί

   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekenn- ; zeichnet, daß man als acylierendes Derivat der Säure den ^! aktiven Ester mit N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid oder N-Hydroxyphthalimid₉ einsetzt. ί

   i ί ί

   ; 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man j ein acylierendes Derivat der Säure einsetzt, deren Amino- ^: ! blockierende Gruppe eine Carbobenzyloxygruppe ist. j

   6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ! als acylierendes Derivat der Säure das Gemisch des Säure- j anhydrids mit Pivalinsäure, Benzoesäure, Isobutylkohlensäurej oder Benzyl kohlensäure , einsetzt. ι

   7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn- ι

   zeichnet, daß das polysiIyIierte Kanamycin A oder B an der [ 6¹-Aminogruppe eine Carbobenzyloxygruppe aufweist.

   8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn- ■

   zeichnet, daß das polysi IyI ierte Kanamycin A oder B-Ausgangs|- material eine durchschnittliche Anzahl von 4 bis 8 Silyl- j j gruppen pro Molekül enthält. J

   !

   ■ 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn- j • zeichnet, daß das polysilylierte Kanamycin A oder B-Aus- : ; gangsmaterial , das an der 6'-Aminogruppe eine von Silyl ver-i schiedene Blockierungsgruppe aufweist, eine durchschnittliche Anzahl von 3 bis 7 Silylgruppen pro Molekül enthält.

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   16. PolysiIyIiertes Kanamycin A nach einem der Ansprüche 12 bis 15, worin die Blockierungsgruppe an der 6'-Aminogruppe den nachstehenden Formeln entsDricht:

   m/19 loo -5L- 2818992

   SY-1533A ι

   10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Silylgruppen um Trimethylsilylgruppen handelt. !

   11. Verfahren zur Herstellung eines l-N-Z*L-(-) -u-Ami no-«:-hydroxy-^ al kanoyUkanamycin A nach einem der Ansprüche 1 bis 10, j dadurch gekennzeichnet, daß man ein acylierendes Derivat der Säure der allgemeinen Formel:

   L-(-)-B-HN-CH^-(CH₂)_n-CH-COOH

   OH

   worin B eine Amino-blockierende Gruppe darstellt, einsetzt.

   12. PolysiIyIiertes Kanamycin A oder B oder polysiIyIiertes Kanamycin A oder B, das an der 6'-Aminogruppe eine von SiTyI verschiedene Blockierungsgruppe enthält. ₍

   13. PolysiIyIiertes Kanamycin gemäß Anspruch 12, worin die ! Silylgruppen Trimethylsilylgruppen sind. j

   14. PolysiIyIiertes Kanamycin A gemäß einem der Ansprüche 12 und 13 mit einer mittleren Anzahl von 4 bis 8 Silylgruppen pro Molekül.

   15. Polysilyliertes Kanamycin A gemäß einem der Ansprüche 12 und 13 mit einer von Silyl verschiedenen Blockierungsgruppe an der 6'-Aminogruppe und einer durchschnittlichen Anzahl von 3 bis 7 Silylgruppen pro Molekül.

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   M/19 100 5Y-1533A

   S -

   CH, O

   I ³ I!

   CH₀-C-Q-C-CH-,

   Y₂XC

   S -

   ο U X₃C-CH₂-O-C-

   urrd

   -ι ρ

   worin R und R gleich oder verschieden sind und jeweils für H, F, Cl, Br, N0_2> OH, (niedrig)AUyI oder (niedrig)-Alkoxy stehen und X für Cl, Br₃ F oder J steht und Y die Bedeutungen H, Cl, Br, F oder J besitzt.

   17. Polysilyliertes Kanamycin A nach einem der Ansprüche 12, 13, 15 und 16, worin es sich bei der Blockierungsgruppe an der 6'-Aminogruppe um die Carbobenzyloxygruppe handelt

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