DE2818822C2 - - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/22—Cyclohexane rings, substituted by nitrogen atoms
- C07H15/222—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms
- C07H15/226—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings
- C07H15/234—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings attached to non-adjacent ring carbon atoms of the cyclohexane rings, e.g. kanamycins, tobramycin, nebramycin, gentamicin A2
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Description
Die Erfindung betrifft den durch die Ansprüche näher gekennzeichneten
Gegenstand.
Aminoglycoside sind eine wohlbekannte Klasse von Antibiotika
und wurden in der Literatur ausführlich beschrieben. Eine
ausgezeichnete Zusammenfassung ist der Artikel "Structures
and Syntheses of Aminoglycoside Antibiotics" von Sumio
Umezawa, in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,
30, 111-182, Academic Press, N. Y. (1974). In diesem Artikel
(und auch in den darin zitierten Literaturstellen) sind
viele bekannte 1-N-(Acyl)aminoglycosid-Antibiotika beschrieben,
wie die 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-Derivate von
Kanamycin A, Kanamycin B, 3′,4′-Dideoxykanamycin B, Tobramycin,
Paromomycin I, Ribostamycin, 3′,4′-Dideoxyribostamycin und
Lividomycin A.
Die US-PS 40 29 882 beschreibt 1-N-Acyl-Derivate von Gentamycinen
A, B, B₁, C₁, C₁a, C₂, C₂a und X₂, Sisomicin, Verdamicin,
Mutamicinen 1, 2, 4, 5 und 6 und den Antibiotica
G-418, 66-40B, 66-40D, Ji-20A, JI-20B und G-52, worin die
Acylgruppen von einer geradkettigen, verzweigten oder
cyclischen Alkylgruppe mit 1 bis 8 C-Atomen abgeleitet sind,
welche einen Amino- oder einen Hydroxysubstituenten, oder
einen Amino- und einen Hydroxysubstituenten aufweisen können.
Die Verbindungen werden hergestellt durch Acylierung teilweise
neutralisierter Säureadditionssalze des Antibiotikums
mit einem acylierenden Derivat der gewünschten Nebenkettensäure.
Die US-PS 40 55 715 beschreibt die 1-N[L-(-)-γ-Amino-α-
hydroxybutyryl]-Derivate des Aminoglycosids XK-62-2, und
das Verfahren zu deren Herstellung durch Acylieren der
Verbindung XK-62-2, deren 2′-Amino-oder 2′- und 6′-Aminogruppen
durch eine bekannte Aminoschutzgruppe (wie die
Carbobenzyloxygruppe) geschützt sind, mit einem acylierenden
Derivat von L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybuttersäure (wie deren
N-Hydroxysuccinimidester).
Die GB-PS 15 00 218 beschreibt die D-, L-, und D,L-Formen von
1-N-[β-Amino-α-hydroxypropionyl]-XK-62-2 und deren Herstellung
durch ein Verfahren das im wesentlichen dem gemäß der
US-PS 40 55 715 entspricht.
Die GB-PS 14 99 041 beschreibt 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxy-
butyryl]-6′-N-alkylkanamycin A, worin die 6′-N-Alkylgruppe
1 bis 4 C-Atome enthält. Die Verbindungen werden unter anderem
hergestellt, indem man 6′-N-Alkylkanamycin A (entweder ungeschützt
oder in der Form, daß die 3- oder 3′′-Aminogruppe
durch eine herkömmliche Aminoblockierungsgruppe geschützt sind)
mit einem acylierenden Derivat von L-(-)-q-Amino-α-hydroxy
buttersäure umsetzt.
Die GB-PS 14 75 481 beschreibt 1-N-Acylderivate von 6′-N-Methyl-
3′,4′-dideoxykanamycin B, worin die Acylgruppen in der L- oder
D,L-Form vorliegen können und der Formel
entsprechen, worin n für 1, 2 oder 3 steht. Die Verbindungen
werden hergestellt, indem man das Aminoglycosid (dessen
6′-Amino- und gegebenenfalls 2′-Aminogruppen durch herkömmliche
Aminoblockierungsgruppen geschützt sind) mit einem
acylierenden Mittel, das die obige Acylgruppe enthält, gegebenenfalls
mit dessen N-Hydroxysuccinimidester, umsetzt.
Die südafrikanische PS 77/1944 beschreibt unter anderem ein
Verfahren zur Herstellung von 1-N-(niedrig)Alkanoyl-Derivaten
von Kanamycin A und B, wobei die Alkanoylgruppen durch Hydroxy-
und/oder Amino substituiert sein können. Bei dem Verfahren
acyliert man Kanamycin A oder B, wobei die 3-Aminogruppe
von Kanamycin A oder B und die 2′-Aminogruppe von Kanamycin B
(und gegebenenfalls die 6′-Aminogruppe jedes Antibiotikums)
durch eine herkömmliche Aminoblockierungsgruppe geschützt
sind. Die Acylierung erfolgt auf herkömmliche Weise, beispielsweise
durch Verwendung des N-Hydroxysuccinimidesters der
acylierenden Säure.
Die US-PS 39 74 137 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung
von 1-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-kanamycin A; gemäß
dem man 6′-Carbobenzyloxykanamycin A mit mindestens 3 Mol
Benzaldehyd, einem substituierten Benzaldehyd oder Pivaldehyd
umsetzt, wobei man das 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A erhält,
welches Schiff′sche Baseneinheiten an den 1,3- und
3′′-Positionen aufweist, und dann dieses tetra-geschützte
Kanamycin-A-Derivat mit dem N-Hydroxysuccinimidester von
L-(-)-q-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure acyliert
und anschließend die Schutzgruppen entfernt.
In The Journal of Antibiotics, 26, 790-3 (1973), T. P. Culbertson
et al. ist die Herstellung von 5′′-Amino-5′′-deoxybutirosinen
A und B aus Butirosin A und B beschrieben. Die ersten Synthesestufen
sind wie folgt:
- 1) teilweise N-Trifluoracetylierung der Butirosinbase durch zum Rückfluß Erhitzen in einer Mischung von Methanol und Äthyl-trifluoracetat,
- 2) Eindampfen zur Trockne, Lösen des Rückstands in Pyridin, Behandeln des Rückstands mit Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan, dann Abkühlen auf <10°C und Behandeln mit Trifluoressigsäureanhydrid,
- 3) Eindampfen zur Trockne und Hydrolysieren des Rückstands in einer 2 : 1 Mischung von Äthanol und 2n Essigsäure am Rückfluß, wobei man dann tetra-[N-(Trifluoracetyl)]- butirosin erhält.
Die Endprodukte des Reaktionsschemas, 5′′-Amino-5′′-deoxybutirosin
A und B, wurden ebenfalls nach den obigen drei
Stufen umgesetzt, wobei man penta-[N-(Trifluoracetyl)]-5′′-
amino-5′′-deoxy-butirosine A und B erhält. Auch diese Veröffentlichung
beschreibt die Acylierung eines trimethylsilylierten
(und teilweise acylierten) Aminoglycosidantibiotikums,
wobei man immer eine völlige Acylierung aller
primären Aminogrupppen im Molekül erhält (4 im Butirosinausgangsprodukt
und 5 im Produkt). Das erfindungsgemäße Verfahren
vermeidet im wesentlichen Polyacylierung und bringt
einen hohen Grad an selektiver Acylierung in der gewünschten
1-N-Stellung.
J. J. Wright et al, in The Journal of Antibiotics, 29, 714-719
(1976) beschreiben ein allgemeines Verfahren zur selektiven
1-N-Acylierung von Gentamicin-Sisomicin-Aminoglycosiden. Sie
berichten, daß die Selektivität der Acylierung vom pH-Wert
abhängig ist und daß die C-1-Aminogruppe für die Acylierung
am reaktivsten ist, wenn die Aminogruppen des Moleküls nahezu
vollständig protoniert sind. Diese Bedingungen erreicht man
durch Zugabe eines Äquivalents einer tert.-Aminbase zu
einer Lösung des völlig neutralisierten Säureadditionssalzes.
Wenngleich die Autoren eine 1-N-Selektivität bei der
Acylierung von Gentamicin C₁a, Sisomicin und Verdamicin
erreichten, so berichten sie, daß bei der Acylierung hoch
hydroxylierter Aminoglycoside, wie Gentamycin B und
Kanamycin A eine geringe Selektivität zu beobachten war.
In J. Antibiotics 24, 430-434 (1971) und Chemical Abstracts 79, 83498y
(1973) sind Verfahren zur Silylierung von Aminoglycosid-Antibiotika beschrieben.
Die Silylierung erfolgt dabei um flüchtige Derivate für die
Gaschromatographie zu erhalten, wobei die Produkte persilyliert sind.
GB-PS 14 60 039 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung
verschiedener Deoxyaminoglycosid-Antibiotika durch Halogenieren
eines phosphorylierten Aminoglycosids (bei dem die
zu entfernende Hydroxygruppe in eine Phosphonoxygruppe überführt
worden war), wobei man das entsprechende Aminoglycosid
erhält, dessen Hydroxygruppe in Halogen überführt wurde, und
Reduzieren der Halogenverbindung, wobei man dann das entsprechende
Deoxyaminoglycosid erhält. Bevor man das phosphorylierte
Aminogylcosid halogeniert, werden alle seine
funktionellen Gruppen vorzugsweise durch Silyl- oder Acylgruppen
geschützt.
Die vorliegende Erfindung betrifft polysilylierte Aminoglykolside
mit 2 bis 10 Silylgruppen, die erhältlich sind durch
Silylierung eines Aminoglycosids der Formel
worin R² für einen Hexopyranosylring der Formel
steht, worin R⁶ Wasserstoff oder CH₃, R⁷ Wasserstoff oder
CH₃, R⁸ oder NH₂, R⁹ Wasserstoff oder OH und R¹⁰
Wasserstoff oder OH bedeuten;
R³ für einen Hexopyranosylring der Formeln
steht, worin R¹¹ Wasserstoff oder CH₃ bedeutet;
R⁵ für Wasserstoff oder OH steht; und
R⁴ für Wasserstoff, OH oder einen Pentofuranosylring
der Formeln IX oder X steht:
worin R¹² für Wasserstoff oder einen Hexopyranosylring
der Formeln XI oder XII steht
worin R¹³ Wasserstoff oder α-D-Mannopyranosyl bedeutet;
wobei Voraussetzung ist, daß wenn R³ nicht Wasserstoff
bedeutet, einer der Reste R⁴ und R⁵ für Wasserstoff
steht und der andere OH bedeutet; und wobei weiterhin
Voraussetzung ist, daß wenn R³ für Wasserstoff steht,
R⁵ Wasserstoff bedeutet und R⁴ für einen Pentofuranosylring
der Formel IX oder X steht;
wobei das polysilylierte Aminogylcosid gegebenenfalls
1 bis 3 von Silyl verschiedene Aminoblockierungsgruppen
an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweist.
Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen polysilylierten
Aminoglycoside eine durchschnittliche Anzahl von 3 bis 8
Silylgruppen pro Molekül auf. Insbesondere bevorzugt handelt
es sich bei den Silylgruppen um Trimethylsilylgruppen. Bei
den Aminoblockierungsgruppen handelt es sich vorzugsweise
um eine Carbobenzyloxy- oder Trifluoracetylgruppe.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung
der erfindungsgemäßen polysilylierten Verbindungen, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Aminoglycosid der
allgemeinen Formel XIV
worin R², R³ und R⁵ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
in an sich bekannter Weise silyliert, gegebenenfalls
in Anwesenheit eines Silylierungskatalysators.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von 1-N-[ω-Amino-α-hydroxy-
alkanoyl]-aminoglycosid-Antibiotika der allgemeinen
Formel I:
oder pharmazeutisch verträglicher Säureadditionssalze
davon,
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet und
R², R³, R⁴ und R⁵ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen
besitzen,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein polysilyiertes
Aminoglycosid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in
einem im wesentlichen wasserfesten organischen Lösungsmittel
mit einem acylierenden Derivat einer Säure der
allgemeinen Formel XIII:
worin B eine Aminoblockierungsgruppe darstellt und
n die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, umsetzt;
und anschließend alle Blockierungsgruppen entfernt.
Die erfindungsgemäßen polysilyierten Aminoglykoside
weisen eine gute Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln
auf, so daß man mit realtiv konzentrierten Lösungen
arbeiten kann. Im allgemeinen wird man die Umsetzung
in einer Lösung durchführen, die etwa 10 bis 20% der
polysilyierten Aminoglykoside enthält. Ausgezeichnete
Ergebnisse werden jedoch auch dann erhalten, wenn die
Lösung etwa 50% Gew./Vol. (beispielsweise 50 g/100 ml
Lösung) enthält.
Wie bei den Arbeitsweisen des Standes der Technik ergibt
das erfindungsgemäße Verfahren eine Mischung acylierter
Produkte und das gewünschte Produkt wird von den anderen
Produkten durch Chromatographie abgetrennt. Die
Substitution wird jedoch viel selektiver, wenn man das erfindungsgemäße
Verfahren anwendet, wodurch man geringere
Mengen unerwünschter Nebenprodukte erhält, was sowohl die
Ausbeute an gewünschtem Produkt erhöht als auch die chromatographische
Reinigung vereinfacht.
Wenn man 1-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxy-
butyryl]-kanamycin A (Amikacin) mittels verschiedener Verfahren
nach dem Stand der Technik herstellt, erhält man auch das 3′′-N-
acylierte Produkt (BB-K11), das 3-N-acylierte Produkt (BB-K29),
das 6′-N-acylierte Produkt (BB-K6) und polyacyliertes
Material sowie nicht umgesetztes Kanamycin A.
Bei der gewerblichen Herstellung von Amikacin und Acylieren
von 6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A in wäßrigem Medium und
anschließendem Entfernen der Schutzgruppe wurde gefunden,
daß gewöhnlich etwa 10% des gewünschten Amikacins
verlorengingen, da BB-K11 als Nebenprodukt
vorhanden war. Das 3′′-N-acylierte
Material verursachte außerdem einen Verlust von etwa der gleichen
Menge an gewünschtem 1-N-acyliertem Produkt, da sich dieses
sehr schwer vom erstgenannten trennen läßt. Die
Selektivität der Substitution des erfindungsgemäßen Verfahrens
zeigt sich durch die extrem geringe Menge
an unerwünschtem 3′′-N-acyliertem Produkt, das sich bei der
erfindungsgemäßen Herstellung von BB-K8 ergibt. Es ist typisch,
daß sich BB-K11 in der Mischung nicht einmal nachweisen läßt.
Die Aminogruppe der acylierenden Säure der Formel XIII muß
während der Acylierungsreaktion durch eine aminoblockierende
Gruppe geschützt sein. Dies erfolgt normalerweise durch Verwendung
einer herkömmlichen Aminoblockierungsgruppe. Die
gleichen herkömmlichen Aminoblockierungsgruppen können zum
Schützen der anderen als der C-1-Aminogruppe des Aminoglycosids
verwendet werden. Solche herkömmlichen Aminoblockierungsgruppen
zum Schutz von primären Aminogruppen sind dem Fachmann
bekannt. Zu geeigneten Blockierungsgruppen gehören
Alkoxycarbonylgruppen, beispielsweise tert.-Butoxycarbonyl
und tert.-Amyloxycarbonylgruppen; Aralkoxycarbonylgruppen,
wie Benzyloxycarbonyl; Cycloalkyloxycarbonylgruppen, wie
Cyclohexyloxycarbonyl; Halogenalkoxycarbonylgruppen, wie
Trichloräthoxycarbonyl; Acylgruppen, wie Phthaloyl und
o-Nitrophenoxyacetyl; Halogenacetylgruppen, wie Trifluoracetyl;
und andere bekannte Blockierungsgruppen, beispielsweise
die o-Nitrophenylthiogruppe, die Tritylgruppe, und
dergleichen.
Die acylierende Säure der Formel XIII enthält ein asymmetrisches
Kohlenstoffatom und kann in ihrer (+) oder (-) isomeren Form,
oder als Mischung der beiden Isomeren (d,l-Form) vorliegen.
Auf diese Weise wird die entsprechende Verbindung der allgemeinen
Formel I gebildet, in der die 1-N-[ω-Amino-α-hydroxy-
alkanoyl)-gruppe in ihrer (+) [oder (R)]-Form oder ihrer
(-) [oder (S)]-Form, oder in einer Mischung davon vorliegt.
Jede isomere Form und deren Mischungen fallen in den Rahmen
der Erfindung, jedoch ist die (-)-Form bevorzugt.
Die Acylierung der polysilylierten Aminoglycoside (mit oder
ohne 1 bis 3 von Silyl verschiedenen Blockierungsgruppen
an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe) kann im
allgemeinen in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt
werden, in dem das Ausgangsmaterial genügend löslich ist.
Diese Ausgangsmaterialien sind in den üblichsten organischen
Lösungsmitteln sehr gut löslich. Geeignete Lösungsmittel
sind beispielsweise Aceton, Diäthylketon, Methyl-n-propyl-
keton, Methyl-isobutyl-keton, Methyl-äthyl-keton, Heptan,
Glyme, Diglyme, Dioxan, Toluol, Tetrahydrofuran, Cyclohexanon,
Pyridin, Methylenchlorid, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff.
Die Wahl des Lösungsmittels ist abhängig vom speziell
verwendeten Ausgangsmaterial. Ketone sind im allgemeinen bevorzugte
Lösungsmittel. Das jeweils günstigste Lösungsmittel
für eine bestimmte Kombination von Reaktionspartnern kann
durch Routineuntersuchungen leicht herausgefunden werden.
Zu geeigneten Silylierungsmitteln zur Verwendung bei der
Herstellung der hier verwendeten polysilylierten Aminoglycosid-
Ausgangsmaterialien gehören die der nachfolgenden allgemeinen
Formeln XV und XVI:
worin R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ jeweils für Wasserstoff, Halogen,
(niedrig)Alkyl, (niedrig)Alkoxy, Halogen(niedrig)alkyl und
und Phenyl stehen können, wobei mindestens eine der Gruppen
R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ von Halogen oder Wasserstoff verschieden
sind; R¹⁴ für (niedrig)Alkyl steht, m eine ganze Zahl von
1 bis 2 darstellt und Z die Bedeutungen Halogen und
hat, worin R¹⁸ für Wasserstoff oder (niedrig)Alkyl steht
und R¹⁹ die Bedeutungen Wasserstoff, Niedrigalkyl oder
hat, worin R¹⁵, R¹⁶ und R¹⁷ die oben angegebenen Bedeutungen
besitzen.
Als Beispiele für spezifische Silylverbindungen der Formeln XV
und XVI kann man nennen: Trimethylchlorsilan, Hexamethyldisilazan,
Triäthylchlorsilan, Methyltrichlorsilan, Dimethyldichlorsilan,
Triäthylbromsilan, Tri-n-propylchlorsilan, Methyldiäthylenchlorsilan,
Dimethyläthylchlorsilan, Dimethyl-tert.-
butylchlorsilan, Phenyldimethylbromsilan, Benzylmethyläthylchlorsilan,
Phenyläthylmethylchlorsilan, Triphenylchlorsilan,
Triphenylfluorsilan, Tri-o-tolylchlorsilan, Tri-p-dimethylaminophenylchlorsilan,
N-Äthyltriäthylsilylamin, Hexaäthyldisilazan,
Triphenylsilylamin, Tri-n-propylsilylamin, Tetraäthyldimethyldisilazan,
Hexaphenyldisilazan und Hexa-p-tolyldisilazan.
Ebenfalls brauchbar sind Hexaalkylcyclotrisilazane
und octa-Alkylcyclotetrasilazane. Andere geeignete
Silylierungsmittel sind Silylamide (beispielsweise Trialkyl-
silylacetamide und bis-Trialkylsilylacetamide), Silylharnstoffe
(beispielsweise Trimethylsilylharnstoffe) und Silylureide.
Man kann auch Trimethylsilylimidazol einsetzen.
Eine bevorzugte Silylgruppe ist die Trimethylsilylgruppe. Bevorzugte
Silylierungsmittel zur Einführung der Trimethylsilylgruppe
sind Hexamethyldisilazan, Bis(trimethylsilyl)acetamid,
Trimethylsilylacetamid und Trimethylchlorsilan. Am bevorzugtesten
ist das Hexamethyldisilazan.
Die Polysilylierung von Aminoglycosiden verändert die
Aktivität der darin enthaltenen Aminogruppen.
So ist die 6′-Aminogruppe des Kanamycins die aktivste. Wenn
ungeschütztes Kanamycin A oder B acyliert wird, sind die
hauptsächlichen Produkte die 6′-N-Acylkanamycine. Aus diesem
Grund war es bei Verfahren nach dem Stand der Technik zur
Herstellung von 1-N-Acylkanamycinen erforderlich, den 6′-N-
Aminorest (beispielsweise mit Carbobenzyloxy) zu schützen,
um gute Ausbeuten an 1-N-Acyl-Produkt zu erhalten. Wenn man
jedoch die polysilylierten Kanamycine acyliert, sind die
Hauptprodukte die 1-N-Acyl-Kanamycine. Man nimmt an, daß
dies der sterischen Wirkung angrenzender (oder nahebei liegender)
silylierter Hydroxygruppen (sowie angrenzenden Glycosidbindungen)
zuzuschreiben ist, welche die Acylierung an den
normalerweise aktiveren Aminogruppen verhindern.
Kanamycin B entspricht der allgemeinen Formel
Betrachtet man Kanamycin B, bei dem alle Hydroxygruppen
silyliert sind, im Lichte der obigen Theorie, so ist ersichtlich,
daß die 3′′-Aminogruppe durch die angrenzenden 2′′- und 4′′-
silylierten Hydroxygruppen sterisch gehindert ist. Man nimmt
an, daß man aus diesem Grunde normalerweise kein 3′′-acyliertes
Produkt entdeckt, wenn man polysilyliertes Kanamycin B
(oder die strukturell ähnlichen polysilylierten Kanamycine
A oder C) acyliert, wenngleich schwierige 3′′-N-acylierte Produkte
erhalten werden können, wenn man Verfahren nach dem Stand
der Technik anwendet. Ähnlich ist die 6′-Aminogruppe durch die
nahebei liegenden 4′- und 3′-silylierten Hydroxygruppen gehindert.
Die 2′-Aminogruppe ist durch die angrenzende 3′-silylierte
Hydroxygruppe und die angrenzende Glycosidbindung gehindert.
Weitere Aminoglycoside, welche strukturell mit den Kanamycinen
verwandt sind, und wenn sie polysilyliert werden, in erster
Linie das 1-N-Acyl-Produkt ergeben, sind beispielsweise
3′-Deoxykanamycin A, 3′-Deoxykanamycin B (Tobramycin),
die 6′-N-Alkylkanamycine A, die 6′-N-Alkylkanamycine B, die
3′-Deoxy-6′-N-alkylkanamycine A, die 3′-Deoxy-6′-N-alkylkanamycine
B, Gentamicine A, B, B₁ und X₂, Seldomycin Faktoren
1 und 3 und Aminogylcoside NK-1001 und NK-1012-1. Jede
dieser Verbindungen und andere strukturell ähnliche Aminoglycoside
ergeben hauptsächlich das 1-N-substituierte Produkt,
wenn man sie in Form ihrer polysilylierten Derivate acyliert.
Es werden jedoch geringe Mengen 6′-N- und 3-N-substituierter
Produkte gebildet, und einer oder beide dieser Aminogruppen
kann gewünschtenfalls, beispielsweise durch eine Carbabenzyloxygruppe,
geschützt werden.
Eine weitere Gruppe von Aminogylcosiden enthalten, wenngleich
sie den oben beschriebenen Kanamycin-Typen strukturell
ähnlich sind, weder 3′- noch 4′-Hydroxygruppen (d. h. es sind
3′,4′-Dideoxy-Verbindungen). Werden diese polysilyliert,
so hindern sie die 6′-Aminogruppe (oder die 2′-Aminogruppe,
falls vorhanden) nicht sterisch, und die 6′-N-substituierten
(oder 2′,6′-di-N-substituierten) Verbindungen sind die
Hauptacylierungsprodukte. Bei diesen Aminoglycosiden muß
man die 6′-Aminogruppe (und, falls vorhanden, die 2′-Aminogruppe)
mit einer von Silyl verschiedenen Aminoschutzgruppe
(beispielsweise mit Carbobenzyloxy) schützen und das
polysilylierte 6′-N-blockierte (oder 2′,6′-di-N-blockierte)
Aminoglycosid acylieren. Aminoglycoside, welche in diese
Gruppe fallen, sind beispielsweise 3′,4′-Dideoxykanamycin A,
3′,4′-Dideoxykanamycin B, die 6′-N-Alkyl-3′,4′-dideoxykanamycine
A, die 6′-N-Alkyl-3′,4′-dideoxykanamycine B,
Gentamicine C₁, C₁a, C₂ und C₂a, Aminoglycoside XK-62-2,
Aminoglycosid 66-40D, Verdamicin und Sisomicin.
Eine weitere Klasse von Aminoglycosiden bilden diejenigen,
bei denen die Glycosidbindung an den 4- und 5-Stellungen
des Deoxystreptaminrings sind anstelle der 4- und 6-Stellungen,
wie bei den oben beschriebenen Aminoglycoside vom
Kanamycintyp. Diese können dargestellt werden durch das
Ribostamycin der Formel
Bei Aminoglycosiden vom Ribostamycin-Typ hindert die Polysilylierung
die gewünschte 1-N-Gruppe mehr als die unerwünschte
3-N-Gruppe (wobei die anderen Aminogruppen wie
oben für die Kanamycin-Typen beschrieben gehindert werden).
Somit bilden polysilylierte Antibiotika vom Ribostamycin-
Typ nach der Acylierung hauptsächlich das 3-N-substituierte
Produkt, und deshalb muß die 3-Aminogruppe durch eine
Aminoblockierungsgruppe, wie Carbobenzyloxy geschützt werden,
um nach der Acylierung des polysilylierten Ausgangsmaterials
das 1-N-substituierte Produkt zu erhalten. Weitere Aminoglycoside,
welche in diese Klasse fallen, sind beispielsweise
die Neomycine B und C, die Paromomycine I und II, die Lividomycine
A und B, Aminoglycosid 2230-C und Xylostasin, sowie
deren 3′-Deoxy-Derivate. Die 6′-N-Alkyl- und 3′-Deoxy-6′-N-
alkyl-Varianten jeder dieser oben erwähnten Antibiotika vom
Ribostamycin-Typ, welche eine 6′-Aminogruppe enthalten,
fallen ebenfalls unter diese Klasse. Einige der Aminoglycoside
dieser Klasse enthalten eine 6′-Hydroxygruppe anstelle einer
6′-Aminogruppe.
Eine weitere Gruppe von Aminoglycosiden sind die des oben
beschriebenen Ribostamycin-Typs, welche jedoch 3′,4′-Dideoxykanamycin-
Aminoglycosiden, die oben beschrieben wurden, werden die
2′- und 6′-Aminogruppen (derjenigen Aminoglycoside dieser
Klasse, welche eine 6′-Aminogruppe enthalten) durch Polysilylierung
nicht gehindert. Somit muß man bei Verbindungen
wie 3′,4′-Dideoxyribostamycin, 3′,4′-Dideoxy-neomycinen B und
C, und 3′,4′-Dideoxyxylostasin, sowie bei deren 6′-N-Alkyl-
Analogen, die 2′- 3- und 6′-Aminogruppen durch eine Aminoblockierungsgruppe,
wie Carbobenzyloxy, schützen, damit man
bei der Acylierung des polysilylierten Ausgangsmaterials
hauptsächlich das 1-N-Acyl-Produkt erhält. Bei denjenigen
Aminogylcosiden dieser Klasse, welche eine 6′-Hydroxygruppe
anstelle einer 6′-Aminogruppe aufweisen (beispielsweise
3′,4′-Dideoxyparomomycin I und II und 4′-Deoxylividomycin
A oder B) muß man nur die 2′- und 3-Aminogruppen schützen.
Verwendet man als Ausgangsmaterial ein polysilyliertes Aminoglycosid,
das 1 bis 3 von Silyl verschiedene Aminoblockierungsgruppen
an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweist,
so kann das Ausgangsmaterial entweder durch Polysilylierung
des gewünschten N-blockierten Aminoglycosids oder durch Einführen
der gewünschten N-Blockierungsgruppe in das polysilylierte
Aminoglycosid hergestellt werden (gegebenenfalls nach
teilweiser Desilylierung durch Hydrolyse oder Solvolyse).
Verfahren zur Einführung von Silylgruppen in organische Verbindungen,
einschließlich gewisser Aminoglycoside, sind nach
dem Stand der Technik bekannt. Die polysilylierten Kanamycine
(mit oder ohne von Silyl verschiedene Blockierungsgruppen an
Aminoresten, die von der C-1-Aminogruppe verschieden sind)
können auf an sich bekannte Weise oder wie in der vorliegenden
Beschreibung dargestellt hergestellt werden.
Die bei der Beschreibung der Erfindung verwendete Bezeichnung
polysilyliertes Aminoglycosid umfaßt kein persilyliertes Aminoglycosid.
So umfaßt beispielsweise der Begriff polysilyliertes
Kanamycin A, Kanamycin A mit 2 bis 10 Silylgruppen im Molekül
[wobei insgesamt 11 Positionen (4-Aminogruppen und 7 Hydroxygruppen)
silyliert werden könnten].
Die genaue Anzahl der Silylgruppen (oder deren Stellung) in den
polysilylierten Aminoglycosid-Ausgangsmaterialien (mit oder
ohne 1 bis 3 von Silyl verschiedenen Blockierungsgruppen an
anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe) ist nicht bekannt.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Untersilylierung und
Übersilylierung die Ausbeute an gewünschtem Produkt absenken
und zu einem Ansteigen anderer Produkte führen. Im Falle
einer starken Unter- oder Übersilylierung kann es dazu
kommen, daß nur wenig oder überhaupt kein gewünschtes Produkt
gebildet wird. Der Silylierungsgrad, der zur größten Ausbeute
an gewünschtem Produkt führt, hängt von den jeweiligen Reaktionspartnern
ab, die bei der Acylierungsstufe eingesetzt werden.
Der jeweils vorteilhafteste Silylierungsgrad bei irgendeiner
Kombination von Reaktionspartnern kann durch routinemäßiges
Ausprobieren leicht festgestellt werden.
Die bevorzugte durchschnittliche Anzahl von Silylgruppen im
polysilylierten Aminoglycosid-Ausgangsmaterial liegt im allgemeinen
zwischen einer unteren Grenze von 4 und einer
oberen Grenze, welche gleich der Gesamtzahl der Hydroxygruppen
ist oder eine darüberhinaus, die im Aminoglycosid-Molekül
enthalten sind, und daß diese oberen und unteren Grenzen
für jede im Aminoglycosid enthaltenen Aminoblockierungsgruppen
um jeweils 1 Gruppe verringert werden. Diese Erklärung ist
jedoch nur theoretischer Natur.
Polysilylierte Aminoglycoside, welche die gewünschte Anzahl
von Silylgruppen enthalten, können hergestellt werden, indem
man entweder einer Menge an Silylierungsmittel verwendet,
welche ausreichend ist, um die gewünschte Anzahl von
Silylgruppen einzuführen, oder indem man einen Überschuß
an Silylierungsmittel verwendet und das Aminoglycosid
persilyliert, und dann durch Hydrolyse oder Solvolyse
teilweise desilyliert.
Wenn man beispielsweise 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]-
kanamycin A herstellt, indem man polysilyliertes Kanamycin A
mit dem N-Hydroxysuccinimidester von L-(-)-γ-Benzyloxy-
carbonylamino-a-hydroxybuttersäure in Acetonlösung acyliert,
so erhält man gute Ausbeuten des gewünschten Produkts,
wenn man polysilyliertes Kanamycin A verwendet, welches hergestellt
wurde durch Umsetzung von etwa 4 bis etwa 5,5 Mol
Hexamethyldisilazan pro Mol Kanamycin A.
Es können größere oder geringere Mengen an Hexamethyldisilazan
verwendet werden, jedoch wird dadurch die Ausbeute
an gewünschtem Produkt in der nachfolgenden Acylierungsstufe
bedeutend verringert. Bei dem speziellen oben beschriebenen
Verfahren verwendet man vorzugsweise 4,5 bis etwa 5 Mol
Hexamethyldisilazan pro Mol Kanamycin, um bei der Acylierungsstufe
eine maximale Produktausbeute zu erhalten.
Pro Mol Hexamethyldisilazan können zwei Äquivalente der Trimethylsilylgruppe
in Kanamycin A oder B eingeführt werden. Sowohl
Kanamycin A wie auch Kanamycin B weisen insgesamt
11 Stellen (NH₂- und OH-Gruppen) auf, die silylierbar sind,
während Kanamycin A und Kanamycin B, die eine von Silyl verschiedene
Aminogruppe an einer anderen Aminogruppe als der
C-1-Aminogruppe aufweisen, insgesamt 10 derartige Stellen
aufweisen. So müßten 5,5 Mol Hexamethyldisilazan pro Mol
Kanamycin A oder B theoretisch zu einer vollständigen
Silylierung sämtlicher OH- und NH₂-Einheiten des Kanamycins
führen, während 5,0 Mol Hexamethyldisilazan zu einer vollständigen
Silylierung von einem Mol Kanamycin A oder B,
das eine von Silyl verschiedene Blockierungsgruppe an einer
anderen Aminogruppe als der C-1-Aminogruppe aufweist, führen
sollte. Jedoch wird erfindungsgemäß angenommen daß eine
derartig extensive Silylierung bei diesen molaren Verhältnissen
während vernünftiger Reaktionszeiten
nicht erfolgt, obgleich man bei vorgegebener Reaktionszeit
höhere Silylierungsgrade erzielt, wenn man einen Silylierungskatalysator
zugibt.
Silylierungskatalysatoren führen zu einer beträchtlichen Erhöhung
der Silylierungsgeschwindigkeit. Geeignete Silylierungskatalysatoren
sind bekannt. Hierzu gehören unter anderem Aminsulfate
(beispielsweise Aminoglycosidsulfat), Sulfaminsäure, Imidazol
und Trimethylchlorsilan. Silylierungskatalysatoren fördern
im allgemeinen einen höheren Silylierungsgrad als beim erfindungsgemäßen
Verfahren erforderlich. Man kann jedoch auch übersilylierte
Aminogylcoside als Ausgangsmaterial beim erfindungsgemäßen
Verfahren einsetzen, wenn man sie zuerst mit einem
Desilylierungsmittel behandelt, um den Silylierungsgrad zu vermindern,
bevor die Acylierungsreaktion durchgeführt wird.
Man erhält gute Ausbeuten an gewünschtem Produkt, wenn man
polysilyliertes Kanamycin A acyliert, das unter Verwendung
eines 5,5 : 1 molaren Verhältnisses von Hexamethyldisilazan zu
Kanamycin A hergestellt wurde. Wenn man jedoch Kanamycin A mit
einem 7 : 1 molaren Verhältnis an Hexamethyldisilazan (oder mit
einem 5,5 : 1 molaren Verhältnis in Gegenwart eines Silylierungskatalysators)
in Aceton mit dem N-Hydroxysuccinimidester der
L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure acyliert,
so erhält man weniger als eine 1%-ige Ausbeute des gewünschten
Produkts. Wenn man jedoch dasselbe "übersilylierte" Kanamycin
A mit demselben Acylierungsmittel in einer Acetonlösung
acyliert, zu dem man 1 Stunde vor der Acylierungsreaktion Wasser
[21 Mol Wasser pro Mol Kanamycin/2,5% Wasser (Gew./Vol.)]
als Desilylierungsmittel zugesetzt hatte, so erhält man eine
Ausbeute von angenähert 40% des gewünschten Produkts. Dieselben
Ergebnisse werden erhalten, wenn das Wasser durch Methanol
oder durch eine andere Verbindung mit aktivem Wasserstoff ersetzt
wird, die zu einer Desilylierung führen kann, beispielsweise
durch Äthanol, Propanol, Butandiol, Methylmercaptan,
Äthylmercaptan oder Phenylmercaptan.
Obgleich man beim Arbeiten mit silylierten Materialien üblicherweise
trockene Lösungsmittel einsetzt, wurde überraschend gefunden,
daß selbst in Abwesenheit einer "Übersilylierung" die
Zugabe von Wasser zum Reaktionslösungsmittel vor der Acylierung
häufig gleich gute Ausbeute ergibt, ja bisweilen sogar zu besseren
Ausbeuten an gewünschtem Produkt als in einem trockenen
Lösungsmittel, führt. Bei Acylierungsreaktionen, die in Aceton
bei den üblichen Konzentrationen von 10 bis 20% (Gew./Vol.)
polysilyliertem Kanamycin A durchgeführt werden, wurde erfindungsgemäß
festgestellt, daß man ausgezeichnete Ausbeuten an
1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]kanamycin A erhält, wenn
man bis zu 28 Mol Wasser pro Mol polysilyliertes Kanamycin A
zusetzt. Arbeitet man bei 20%iger Konzentration, so bedeuten
28 Mol pro Mol angenähert 8% Wasser. Mit anderen Kombinationen
von Reaktionspartnern kann man sogar die Anwesenheit von noch
mehr Wasser dulden; sie kann sogar vorteilhaft sein. Die Acylierungsreaktion
kann in Lösungsmitteln durchgeführt werden,
die bis zu ungefähr 40% Wasser enthalten, obgleich man bei
derart hohen Wasserkonzentrationen kurze Acylierungszeiten
wählen muß, um eine übermäßige Desilylierung des polysilylierten
Aminoglycosid-Ausgangsmaterials zu vermeiden. Wenn
demgemäß im vorliegenden Falle der Begriff "im wesentlichen
wasserfreies organisches Lösungsmittel" gebraucht wird, so
umfaßt dieser Begriff auch Lösungsmittel, die bis zu ungefähr
40% Wasser enthalten. Ein bevorzugter Bereich geht bis zu ungefähr
20% Wasser, ein bevorzugter Bereich geht bis ungefähr
8% Wasser und ein am meisten bevorzugter Bereich geht
bis zu ungefähr 4% Wasser.
Mit Ausnahme der oben beschriebenen Fälle für Lösungsmittel,
welche große Mengen Wasser enthalten, ist die Acylierungsdauer
nicht kritisch.
Temperaturen im Bereich von etwa -30°C bis etwa 100°C
können während Reaktionszeiten von etwa 1 Stunde bis zu
1 Tag oder mehr verwendet werden. Erfindungsgemäß wurde
festgestellt, daß die Reaktion bei Raumtemperatur üblicherweise
gut verläuft, und aus Gründen der Einfachheit und
Wirtschaftlichkeit ist bevorzugt, die Reaktion bei Umgebungstemperatur
durchzuführen. Wenn es jedoch um maximale Ausbeuten
und um selektive Acylierung geht, wird bevorzugt, die
Acylierung bei einer Temperatur von ungefähr 0°C bis 5°C
durchzuführen.
Die Acylierung der 1-Aminogruppe des polysilyierten Aminoglycosids
(mit oder ohne von Silyl verschiedenen Blockierungsgruppen
an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe)
kann mit irgendeinem acylierenden Derivat der Säure der
allgemeinen Formel XIII durchgeführt werden, von dem bekannt
ist, daß es sich zur Acylierung einer primären Aminogruppe
eignet. Zu Beispielen für geeignete acylierende
Derivate der freien Säure gehören die entsprechenden
Säureanhydride, gemischten Anhydride, beispielsweise
Alkoxyameisensäureanhydride, Säurehalogenide, Säureazide,
aktive Ester und aktive Thioester. Man kann die freie Säure
mit dem polysilylierten Aminoglycosid-Ausgangsmaterial kuppeln,
nachdem man zuerst die freie Säure mit N,N′-Dimethylchlorformiminiumchlorid
[vgl. GB-PS 10 08 170 und Novak und Weichet,
Experienta XXI, 6, 360 (1965)] umgesetzt hat oder mit Hilfe eines
N,N′-Carbonyldiimidazols oder eines N,N′-Carbonylditriazols
[vgl. südafrikanische Patentschrift 63/2684] oder mit Hilfe
eines Carbodiimidreagenzes [insbesondere N,N′-Dicyclohexyl-
carbodiimid, N,N′-Diisopropylcarbodiimid oder N-Cyclohexyl-N′-
(2-morpholinoäthyl)carbodiimid; vgl. Sheehan und Hess, J. A. C. S.,
77, 1967 (1955)] oder mit Hilfe eines Alkynylaminreagenzes
[vgl. R. Buÿle und H. G. Viehe, Angew. Chem. International Edition,
3, 582 (1964)] oder mit Hilfe eines Isoxazoliumsalzreagenzes
[vgl. R. B. Woodward, R. A. Olofson und H. Mayer, J. Amer.
Chem. Soc., 83, 1010 (1961)] oder mit Hilfe eines Keteniminreagenzes
[vgl. C. L. Stevens und M. E. Munk, J. Amer. Chem. Soc., 80,
4065 (1958)] oder mit Hilfe eines Hexachlorcyclotriphosphatriazins
oder Hexabromcyclotriphosphatriazins (US-PS Nr. 36 51 050)
oder mit Hilfe von Diphenylphosphorylazid [DDPA; J. Amer. Chem.
Soc., 94, 6203-6205 (1972)] oder mit Hilfe von Diäthylphosphorylcyanid
[DEPC; Tetrahedron Letters Nr. 18, Seiten 1595-1598
(1973)] oder mit Hilfe von Diphenylphosphit [Tetrahedron Letters
Nr. 49, Seiten 5047-5050 (1972)] umgesetzt hat. Ein anderes Äquivalent der
Säure ist ein entsprechendes Azolid, d. h. ein Amid der entsprechenden
Säure, deren Amidstickstoff Glied eines quasi-aromatischen
5-gliedrigen Rings ist, der mindestens zwei Stickstoffatome
enthält, d. h. Imidazol, Pyrazol, die Triazole, Benzimidazol,
Benzotriazol und deren substituierte Derivate. Für den
Fachmann liegt es auf der Hand, daß es bisweilen wünschenswert
oder erforderlich sein kann, die Hydroxylgruppe des acylierenden
Derivats der Säure der allgemeinen Formel XIII zu schützen,
beispielsweise wenn man acylierende Derivate, wie beispielsweise
Säurehalogenide, einsetzt. Der Schutz der Hydroxy-gruppe kann
auf an sich bekannte Weise erfolgen, z. B. unter Verwendung einer
Carbobenzyloxygruppe, durch Acetylieren und durch Silylieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist
das acylierende Derivat der Säure der Formel XIII ein
aktiver Ester, und bevorzugt deren aktiver Ester mit
N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid
oder N-Hydroxyphthalimid. Gemäß einer anderen bevorzugten
Ausführungsform ist das acylierende Derivat der Säure
der Formel XIII ein Gemisch des Säureanhydrids, und vorzugsweise
ein Gemisch des Säureanhydrids mit Pivalinsäure,
Benzoesäure, Isobutylkohlensäure oder Benzylkohlensäure.
Nach Beendigung der Acylierungsreaktion des polysilylierten
Aminoglycosids werden sämtliche Blockierungsgruppen in an
sich bekannter Weise entfernt, um das gewünschte Produkt
der allgemeinen Formel I zu liefern
Die Silylgruppen kann man beispielsweise leicht dadurch entfernen,
daß man mit Wasser hydrolysiert. Dies erfolgt vorzugsweise
bei niedrigem pH. Aminoblockierungsgruppen am Aminoglycosidmolekül
(falls vorhanden) oder an der Acyl-Seitenkette
können ebenfalls nach bekannten Methoden entfernt
werden. So kann man beispielsweise eine tert.-Butoxycarbonyl-
gruppe durch Verwendung von Ameisensäure entfernen, eine
Carbobenzyloxygruppe durch katalytisches Hydrieren, eine
2-Hydroxy-1-naphthcarbonylgruppe durch saure Hydrolyse,
eine Trichloräthoxycarbonylgruppe durch Behandlung mit
Zinkstaub in Eisessig, die Phthaloylgruppe durch Behandlung
mit Hydrazinhydrat in Äthanol unter Erhitzen und die Trifluoracetylgruppe
durch Behandeln mit NH₄OH entfernen.
Bevorzugte Aminoblockierungsgruppen, welche zum Schutz der
Aminogruppen im Aminoglycosidmolekül, sowie zum Schutz
der Aminogruppe der acylierenden Säure der Formel XIII
brauchbar sind, entsprechen den Gruppen der nachstehenden
Formeln:
worin R²⁰ und R²¹, die gleich oder verschieden sein können,
jeweils Wasserstoff, F, Cl, Br, NO₂, OH (niedrig)Alkyl oder
(niedrig)Alkoxy bedeuten, X für Cl, Br, F oder J steht und
Y Wasserstoff, Cl, Br, F oder J bedeutet. Eine zur Verwendung
im Aminoglycosidmolekül besonders bevorzugte Aminoblockierungsgruppe
ist die Carbobenzyloxygruppe. Besonders bevorzugte
Aminoblockierungsgruppen zur Verwendung bei der acylierenden
Säure der Formel XIII sind die Carbobenzyloxy, Trifluoracetyl-
und tert.-Butyloxycarbonyl-gruppen.
Einige der Verbindungen der Formel I enthalten eine Doppelbindung
(d. h. wenn der Substituent R² der Formel IV entspricht).
Dies sind Verbindungen, welche von Aminoglycosiden, wie
Sisomicin, Verdamicin, G-52, 66-40B und 66-40D, abgeleitet sind.
Verwendet man solche Verbindungen, so ist jedem Fachmann bekannt,
daß man sämtliche Reduktionstechniken, welche die
Doppelbindung reduzieren könnten, vermeiden muß. So sollten
beispielsweise Aminoblockierungsgruppen verwendet werden,
welche durch Hydrolyse oder durch ein Alkalimetall in
flüssigem Ammoniak entfernt werden können, um die Reduktion
der Doppelbindung zu vermeiden, welche bei Methoden wie
katalytischer Hydrogenolyse eintreten würde.
Die Ausbeuten an Produkt wurden nach verschiedenen Methoden
bestimmt. Nach Entfernung sämtlicher Blockierungsgruppen und
Chromatographie an einer CG-50®(NH₄⁺) Säule, ließ sich die
Ausbeute durch Isolierung des kristallinen Feststoffs aus den
entsprechenden Fraktionen oder durch mikrobiologische Untersuchung
(turbidimetrische Methode oder Plattentest) der
entsprechenden Fraktionen bestimmen. Eine andere erfindungsgemäß
eingesetzte Technik war Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
der nicht reduzierten Acylierungsmischung,
d. h. mit Hilfe der wäßrigen Lösung, die nach der Hydrolyse
der Silylgruppen und Entfernung des organischen Lösungsmittels
erhalten wurde, jedoch vor der Hydrogenolyse zur Entfernung
der verbleibenden Blockierungsgruppe(n). Diese Untersuchung
ist keine direkte Untersuchung auf das Endprodukt, sondern
auf die entsprechenden N-blockierten Verbindungen.
Als Instrument verwendete man einen
Hochdruck-Flüssigkeitschromatograph mit einem
Absorptionsdetektor und einer 30 cm × 3,9 mm (Innendurchmesser)
µ-Bondapak C-18®-Säule, und zwar unter den folgenden
Bedingungen:
Mobile Phase: | |
25% 2-Propanol 75% 0,01 m Natriumacetat pH4,0 | |
Flußrate: | 1 ml/Minute |
Detektor: | UV bei 254 nm |
Empfindlichkeit: | 0,04 AUFS |
Verdünnungsmittel: | DMSO |
Injizierte Menge: | 5 µl |
Konzentration: | 10 mg/ml |
Die Schreibergeschwindigkeit variierte, jedoch waren 2 Minuten/
2,54 cm typisch. Die obigen Bedingungen ergaben UV-Spuren
mit Peaks, die quantitativ leicht zu bestimmen waren. Die Ergebnisse
der obigen Analysen sind im vorliegenden Text als
HLPC-Tests bezeichnet.
Um die Wiederholung komplizierter chemischer Bezeichnungen zu
vermeiden, werden im vorliegenden Text bisweilen die nachfolgenden
Abkürzungen gebraucht:
AHBA | |
L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybuttersäure | |
BHBA | N-Carbobenzyloxyderivat von AHBA |
HONB | N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid |
NAE (oder BHBA-′ONB′) | Ester von BHBA |
HONS | N-Hydroxysuccinimid |
SAE (oder BHBA-′ONS′) | N-Hydroxysuccinimid-aktivierter Ester von BHBA |
DCC | Dicyclohexylcarbodiimid |
DCU | Dicyclohexylharnstoff |
HMDS | Hexamethyldisilazan |
BSA | Bis(trimethylsilyl)acetamid |
MSA | Trimethylsilylacetamid |
TFA | Trifluoracetyl |
t-BOC | tert.-Butyloxycarbonyl |
"Dicalite®" ist
ein Produkt aus Diatomeenerde.
"Amberlite CG-50®" ist
ein schwach-saures Kationenaustauscherharz des Carbonsäure-
polymethacrylsäuretyps von chromatographischer Qualität.
"µ-Bondapak®" bezeichnet
eine Reihe von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiesäulen.
Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Die Begriffe "(niedrig)Alkyl" und "(niedrig)Alkoxy" beziehen
sich auf Alkyl- oder Alkoxygruppen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome
aufweisen.
Die in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendete
Bezeichnung "pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz"
einer Verbindung der Formel I bezeichnet ein Mono-,
Di-, Tri-, Tetra- (oder ein höheres) Salz, das durch Einwirkung
eines Moleküls einer Verbindung der Formel I auf
eines oder mehrere Äquivalente einer nicht-toxischen,
pharmazeutisch verträglichen Säure, abhängig von der speziellen
Verbindung der Formel I, gebildet wurde. Es versteht sich,
daß ein Säureadditionssalz an jeder Aminogruppe im Molekül
gebildet werden kann, sowohl im Aminoglycosidkern als auch
in der Acylseitenkette. Zu diesen Säuren gehören Essigsäure,
Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure,
Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure,
Äpfelsäure und Citronensäure und die anderen Säuren, welche
herkömmlicherweise zur Herstellung von Salzen aminhaltiger
Pharmazeutika verwendet werden.
Die meisten der erfindungsgemäß als Ausgangsmaterialien verwendeten
Aminoglycoside sind nach dem Stand der Technik bekannt.
Jedes spezielle Aminoglycosid, das nicht per se bekannt
ist, (z. B. ein zuvor noch nicht beschriebenes 6′-N-Methyl-
Derivat eines bekannten Aminoglycosids) kann nach bekannten
Verfahren wie sie zur Herstellung analoger Verbindungen verwendet
werden, leicht hergestellt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen der Formel I
sind sowohl gegen gram-positive als auch gram-negative Bakterien
aktiv und werden analog zu anderen bekannten Aminoglycosiden
verwendet. Viele der Verbindungen der Formel I sind per se
bekannt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
werden polysilylierte Aminoglycoside der Formel XIV
oder polysilylierte Aminogylcoside der Formel XIV, welche
1 bis 3 von Silyl verschiedene Blockierungsgruppen an anderen
Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweisen, hergestellt.
Man schlämmt 15 g (24,24 mMol) 6′-N-Carbonbenzyloxykanamycin A
in 90 ml trockenem Acetonitril auf und erhitzt unter einer Stickstoffatmosphäre
zum Rückfluß. Dann gibt man im Verlauf von
30 Minuten langsam 17,5 g (108,48 mMol) Hexamethyldisilazan zu
und hält die erhaltene Lösung 24 Stunden lang am Rückfluß. Nach
Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum (40°C) und vollständigem
Trocknen unter Vakuum (10 mm) erhält man 27,9 g eines
weißen, amorphen Feststoffs. Ausbeute 90,71%, berechnet als
6′-N-Carbobenzyloxykanamycin A (Silyl)₉.
Diesen Feststoff löst man in 150 ml trockenem Diäthylketon bei
einer Temperatur von 23°C auf. Man gibt 11,05 g (26,67 mMol)
L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-
5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE), gelöst in 100 ml trockenem
Diäthylketon bei 23°C unter gutem Rühren im Verlauf von einer
halben Stunde langsam zu. Man rührt die Lösung 78 Stunden lang
bei 23°C. Man verdünnt die gelbe, klare Lösung (pH 7,0) mit
100 ml Wasser. Der pH der Mischung wird mit 3 n HCl auf 2,8
eingestellt und man rührt 15 Minuten lang heftig bei einer
Temperatur von 23°C. Die wässerige Phase wird abgetrennt, und
die organische Phase wird mit 50 ml Wasser von pH 2,8 extrahiert.
Die vereinigten wässerigen Fraktionen wäscht man mit
50 ml Äthylacetat. Man gibt die Lösung in eine 500 ml-Parr-
Vorrichtung zusammen mit 5 g 5%igem Palladium-auf-Aktivkohle-
Katalysator und reduziert 2 Stunden lang bei
23°C bei einem Druck von 3.4475 bar (50 psi) H₂. Man filtriert
die Mischung durch ein Filterbett aus Dicalite®, das dann mit
zusätzlichen 30 ml Wasser gewaschen wird. Man konzentriert
das farblose Filtrat im Vakuum (40 bis 45°C) auf 50 ml. Die
Lösung wird auf eine 5 × 100 cm CG-50®(NH₄+)-Ionenaustauschersäule
aufgegeben. Nach dem Waschen mit 1000 ml Wasser eluiert
man unumgesetztes Kanamycin A, 3-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl]
kanamycin A (BB-K29) und Amikacin mit 0,5 n Ammoniumhydroxyd.
Mit 3 n Ammoniumhydroxyd wird Polyacylmaterial wiedergewonnen.
Zur Überwachung der fortlaufenden Eluierung wählt man
Biotest, Dünnschichtchromatographie und optische Drehung.
Volumen, beobachtete optische Drehung jeder Fraktion des Eluats
und Gewicht und prozentuale Ausbeute des aus jeder Fraktion
durch Eindampfen zur Trockene isolierten Feststoffs sind nachstehend
zusammengestellt:
Durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wird gezeigt,
daß die verbrauchte Diäthylketonschicht weitere 3 bis 5% Amikacin
enthält.
Man löst das rohe Amikacin (6,20 g) in 20 ml Wasser auf und
verdünnt mit 20 ml Methanol und setzt dann 20 ml Isopropanol
zu, um die Kristallisation einzuleiten. Man erhält 6,0 g
(45,8%) kristallines Amikacin.
Man schlämmt Kanamycin A in Form der freien Base mit 18 g
Aktivität (37,15 mMol) in 200 ml trockenem Acetonitril auf
und erhitzt zum Rückfluß. Im Verlauf von 30 Minuten gibt
man 29,8 g (184,6 mMol) Hexamethyldisilazan zu und rührt
die Mischung 78 Stunden am Rückfluß, wobei man eine hellgelbe
klare Lösung erhält. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels
unter Vakuum bleibt ein amorpher, fester Rückstand
übrig. Die Ausbeute beträgt 43 g (94%, berechnet als Kanamycin
A (Silyl)₁₀).
Man schlämmt 5,56 g (20,43 mMol) p-(Benzylcarbonyloxy)-
benzoesäure in 50 ml trockenem Acetonitril bei einer Temperatur
von 23°C auf. Dann gibt man unter gutem Rühren 8,4 g
(41,37 mMol) N,O-bis-Trimethylsilylacetamid zu. Die Lösung
wird 30 Minuten bei 23°C gehalten und dann im Verlauf von
3 Stunden unter heftigem Rühren zu einer Lösung von 21,5 g
(17,83 mMol, berechnet als (Silyl)₁₀-Verbindung) Poly(trimethylsilyl)
kanamycin A in 75 ml trockenem Acetonitril von
23°C zugegeben. Man rührt die Mischung 4 Stunden lang, entfernt
das Lösungsmittel im Vakuum (40°C) und löst dann den
öligen Rückstand in 50 ml trockenem Aceton mit einer Temperatur
von 23°C.
Im Verlauf von 5 Minuten gibt man 8,55 g (20,63 mMol) L-(-)-
γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-N-hydroxy-5-
norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE) in 30 ml Aceton zur
obigen Lösung. Man erhält die Mischung 78 Stunden bei 23°C.
Dann verdünnt man die Lösung mit 100 ml Wasser und senkt den
pH (7,0) mit 6 n HCl auf 2,5 ab. Die Mischung wird in eine
500 ml Parr-Flasche zusammen mit 3 g 5% Palladium-auf-Aktivkohle-
Katalysator gegeben und 2 Stunden bei
einer Temperatur von 23°C bei einem Druck von 2.758 bar
(40 psi) H₂ reduziert. Man filtriert die Mischung durch ein
Filterbett aus Diatomeenerde, das anschließend mit 20 ml
Wasser gewaschen wird. Bei den vereinigten Filtraten und
Waschflüssigkeiten (168 ml) wird durch mikrobiologischen
Test gegen E. coli festgestellt, daß sie angenähert
11 400 mcg/ml Amikacin enthalten (Ausbeute 19%).
Eine Suspension von 10 g (20,6 mMol) Kanamycin A in 100 ml
trockenem Acetonitril und 25 ml (119 mMol) 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan
wird 72 Stunden lang am Rückfluß gehalten.
Man erhält eine klare, hellgelbe Lösung. Die Lösung wird im
Vakuum bei 30 bis 40°C zur Trockene eingedampft. Man erhält
21,3 g Poly(trimethylsilyl)kanamycin A in Form eines hellockerfarbenen,
amorphen Pulvers. Die Ausbeute beträgt 85%,
berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.
Zu einer Lösung von 2,4 g (2,0 mMol) Poly(trimethylsilyl)-
kanamycin A in 30 ml trockenem Aceton gibt man langsam 2,0 mMol
L-(-)-γ-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure-
N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (NAE) in 10 ml
trocknem Aceton bei einer Temperatur von 0 bis 5°C zu. Die
Reaktionsmischung wird 1 Woche lang bei 23°C gerührt und
dann im Vakuum bei einer Badtemperatur von 30 bis 40°C zur
Trockne eingedampft. Dann gibt man 60 ml Wasser zum Rückstand,
gefolgt von 70 ml Methanol, um eine Lösung zu erhalten.
Die Lösung wird mit 3 n HCl auf pH 2,0 angesäuert und
dann 2 Stunden lang bei einem Druck von 3.4475 bar (50 psi)
H₂ reduziert, wobei man 500 mg 5% Palladium-auf-Aktivkohle-
Katalysator verwendet. Das Material wird filtriert, und vereinigte
Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mit dem mikrobiologischen
Test gegen E. coli untersucht. Man stellt fest,
daß eine Ausbeute von 29,4% Amikacin erhalten wurde.
Man löst 5,066 g (20,0 mMol) BHBA, 4,068 g (20,0 mMol) BSA
und 2,116 g (22,0 mMol) Triäthylamin in 200 ml Tetrahydrofuran,
das zuvor über einem Molekularsieb getrocknet wurde.
Man hält die Lösung 2 1/4 Stunden am Rückfluß und kühlt dann
auf -10°C ab. Im Verlauf von 2 bis 3 Minuten gibt man 2,412 g
noch 2 Stunden lang bei -10°C. Dann läßt man die Temperatur
auf 23°C ansteigen.
5,454 g (4,97 mMol, berechnet als 6′-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉)
Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, wie in Beispiel 1
hergestellt, wird in 50 ml trockenem (Molekularsieb) Tetrahydrofuran
von 23°C aufgelöst. Man gibt die Hälfte der Lösung des
wie in Stufe A beschrieben hergestellten gemischten Anhydrids
(10,0 mMol) im Verlauf von 20 Minuten unter Rühren zu und
rührt dann noch weitere 7 Tage.
Dann gibt man 100 ml Wasser zur Reaktionsmischung und stellt
den pH (5,4) mit 3 m H₂SO₄ auf 2,0 ein. Man rührt noch
1 Stunde und extrahiert dann die Lösung mit Äthylacetat.
Die Kristallisation von polyacyliertem Material setzt ein,
so daß die Reaktionsmischung gefiltert wird. Nach dem Trocknen
über P₂O₅ wiegen die gewonnenen Feststoffe 0,702 g. Die
Extraktion der Reaktionsmischung wird insgesamt mit 4 × 75 ml
Äthylacetat durchgeführt. Anschließend wird das überschüssige
Äthylacetat aus der wässerigen Schicht entfernt. Man führt
einen Test mit Hilfe von HPLC bei einem aliquoten Anteil der
wässerigen Lösung durch. Die erhaltene Kurve zeigt eine
Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 26,4%.
Dann hydriert man die wässerige Schicht in einer Parr-Vorrichtung
2 Stunden lang bei einem H₂-Druck von 3,4475 bar
(50 psi), wobei man 0,5 g 10% Pd-auf-Aktivkohle-Katalysator
verwendet. Man filtriert das Material und stellt bei dem
vereinigten Filtrat und den Waschflüssigkeiten durch Test
gegen E. coli fest, daß eine Ausbeute an Amikacin von 31,2%
vorliegt. Das Verhältnis Amikacin/BB-K29 beträgt angenähert
9-10/1. Es liegen Spuren von Polyacylverbindungen und unumgesetzten
Kanamycin A vor.
1,267 g (5,0 mMol) BHBA und 1,313 g (10,0 mMol) N-Trimethylsilylacetamid
(MSA) in 20 ml über Molekularsieb-getrocknetem
Aceton wird bei 23°C gerührt und man gibt 0,70 ml (5,0 mMol)
Triäthylamin (TEA) zu. Die Mischung wird 2 1/2 Stunden unter
einer N₂-Atmosphäre am Rückfluß gehalten. Man kühlt die
Mischung auf -20°C ab und gibt 0,751 g (0,713 ml; 5,50 mMol)
Isobutylchlorformiat zu. Es setzt eine sofortige Abscheidung
von Triäthylaminhydrochlorid ein. Man rührt die Mischung
1 Stunde bei -20°C.
Man löst 6,215 g (4,9 mMol), berechnet als (Silyl)₉-Verbindung)
Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in
Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in 20 ml Molekularsieb-
getrocknetem Aceton unter Rühren bei 23°C auf. Man
kühlt die Lösung auf -20°C ab und gibt langsam im Verlauf
von 30 Minuten die kalte Lösung des gemischten Anhydrids
aus Stufe A zu. Man rührt die Reaktionsmischung weitere
1 1/2 Stunden bei -20°C und anschließend 17 Stunden bei 23°C.
Die Reaktionsmischung wird dann unter Rühren in 150 ml Wasser
von 23°C gegossen, der pH (7,75) wird mit 3 n HCl auf
2,5 eingestellt, und das Rühren wird noch 15 Minuten fortgesetzt.
Dann wird das Aceton im Vakuum bei 40°C entfernt.
Man führt einen Test mit HPLC bei einem Aliquot der erhaltenen
wässerigen Lösung durch. Die erhaltene Kurve zeigt eine
Ausbeute an di-Cbz-Amikacin von 34,33% an.
Der Hauptteil der wässerigen Lösung wird 3 1/4 Stunden bei
23°C unter einem H₂-Druck von 3,4475 bar (50 psi) reduziert,
wobei man 2,0 g Pd/C-Katalysator einsetzt. Der Katalysator
wird durch Filtrieren entfernt, und bei den vereinigten
Filtraten und Waschflüssigkeiten wird durch mikrobiologische
Untersuchung gegen E. coli festgestellt, daß eine Ausbeute
von 35,0% an Amikacin vorliegt.
A) 2,537 g (2,0 mMol), berechnet als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉)
Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel
1 beschrieben hergestellt wurde, in 300 ml trockenem
Cyclohexanon wird 20 Stunden bei 23°C mit einer NAE-Lösung
in trockenem Cyclohexanon (10,8 ml einer 0,1944 mMol/ml-Lösung,
2,10 mMol) acyliert. Dann gibt man die Reaktionsmischung
zu 150 ml Wasser unter Rühren zu und stellt den pH (5,6)
mit 3 n HCl auf 2,5 ein. Das Cyclohexanon wird im Vakuum
bei 40°C entfernt, und ein aliquoter Anteil der verbliebenen
wässerigen Phase wird zur Untersuchung mit HPLC herangezogen.
Man reduziert die Hauptmenge der wässerigen Phase 3 Stunden
lang bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,4475 bar (50 psi),
wobei man 1,0 g eines 10%igen Pd/C-Katalysators verwendet.
Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und vereinigte
Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mikrobiologisch auf
Amikacin untersucht.
B) Die obige Reaktion A wird wiederholt mit der Ausnahme, daß
die Acylierung diesmal nicht 20 Stunden lang, sondern 115
Stunden lang durchgeführt wurde.
A) Man wiederholt Beispiel 6, A mit der Ausnahme, daß man anstelle
von trockenem Cyclohexanon trockenes Tetrahydrofuran
als Lösungsmittel verwendet.
B) Man wiederholt Beispiel 6, B mit der Ausnahme, daß man anstelle
von trockenem Cyclohexanon trockenes Tetrahydrofuran
als Lösungsmittel verwendet.
A) Man wiederholt Beispiel 6, A mit der Ausnahme, daß man
unter Verwendung von trockenem Dioxan als Lösungsmittel
44 Stunden lang acyliert.
B) Man wiederholt das Beispiel 6, B mit der Ausnahme, daß man
unter Verwendung von trockenem Dioxan als Lösungsmittel
18 1/2 Stunden acyliert.
Zu einer gerührten Lösung von 2,537 g (2,0 mMol), berechnet
als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-
Cbz-Kanamycin A, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt
wurde, in 32 ml Molekularsieb-getrocknetem Diäthylketon bei 75°C
gibt man im Verlauf von 15 Minuten eine Lösung von NAE (10,8 ml
mit 0,1944 mMol/ml Diäthylketon, 2,10 mMol) zu. Man rührt noch
weitere 3 Stunden bei 75°C und gießt dann die Mischung in
150 ml Wasser. Der pH wird mit 3 n HCl auf 2,8 eingestellt und
das Diäthylketon wird bei 40°C im Vakuum entfernt. HPLC-Test
eines aliquoten Anteils der wässerigen Phase zeigt eine Ausbeute
an di-Cbz-Amikacin von 39,18% an.
Man reduziert die Hauptmenge der wässerigen Phase 3 1/4 Stunden
bei 23°C unter einem H₂-Druck von 3,4337 bar (49,8 psi),
wobei man 1,0 g Pd/C-Katalysator einsetzt. Der Katalysator
wird durch Filtrieren entfernt, und vereinigte Filtrate und
Waschflüssigkeiten werden mikrobiologisch auf Amikacin untersucht.
Die turbidimetrische Untersuchung zeigt eine Ausbeute
von 27,84% an, der Plattenrest ergibt eine Ausbeute von 28,6%.
Man bringt 10 g Kanamycin A (97,6% rein, 20,14 mMol) in
100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter einer
Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß. Zur rückflußkochenden
Reaktionsmischung gibt man im Verlauf von 10 Minuten eine
Mischung aus 22,76 g (141 mMol, 7 mMol pro Mol Kanamycin A)
HMDS und 1 ml (0,856 g, 7,88 mMol) TMCS. Man hält noch
4 3/4 Stunden am Rückfluß und kühlt dann die Mischung,
konzentriert im Vakuum zu einem gelben, viskosen Sirup und
trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum. Die Ausbeute an Produkt
beträgt 23,8 g (97,8%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀).
Man löst 23,8 g (20,14 mMol) Poly(trimethylsilyl)-kanamycin
A, das in Stufe A hergestellt wurde, in 250 ml Molekularsieb-
getrocknetem Aceton bei 23°C auf und kühlt dann auf
0 bis 5°C ab. Dann gibt man unter Rühren 3,63 ml (201,4 mMol),
10 Mol pro Mol polysilyliertem Kanamycin A) Wasser zu und
läßt die Mischung 30 Minuten lang unter mäßigem Vakuum stehen.
Im Verlauf von weniger als 1 Minute werden 19,133 mMol
(0,95 Mol pro Mol polysilyliertes Kanamycin A) NAE in
108,3 ml Aceton zugegeben. Man rührt die Mischung 1 Stunde
bei 0 bis 5°C, verdünnt mit Wasser, stellt den pH auf 2,5
ein und entfernt dann das Aceton im Vakuum. Dann wird die
wässerige Lösung 2 1/2 Stunden bei 23°C bei einem H₂-Druck
von 3,4475 bar (50 psi) reduziert, wobei man 2,0 g 10%
Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Die reduzierte
Reaktionsmischung wird durch Dicalite® filtriert, im Vakuum
bei 40°C auf ungefähr 100 ml konzentriert und dann auf eine
CG-50®(NH₄+)-Säule (6 Liter Harz, 5 × 100 cm) aufgegeben.
Man wäscht mit Wasser und eluiert dann mit 0,6 n-1,0 n-
3 n NH₄OH. Man erhält 60,25% Amikacin, 4,37% BB-K6,
4,35% BB-K29, 26,47% Kanamycin A und 2,18% Polyacylverbindungen.
Man bringt 20,0 g (32,4 mMol) 6′-N-Cbz-Kanamycin A in 200 ml
Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter einer Stickstoffatmosphäre
zum Rückfluß. Im Verlauf von 10 Minuten gibt
man 47,3 ml (226,8 mMol, 7 Mol pro Mol 6′-N-Cbz-Kanamycin A)
HMDS zu und setzt das Rückflußkochen noch 20 Stunden fort.
Dann kühlt man die Mischung, konzentriert im Vakuum und
trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum, wodurch man 39,1 g
weißen amorphen Feststoff erhält. Ausbeute 95,4%, berechnet
als 6′-N-Cbz-Kanamycin A (Silyl)₉.
Man löst 39,1 g (32,4 mMol) Poly(trimethylsilyl)-6′-N-Cbz-
Kanamycin A, das in der obigen Stufe A hergestellt wurde,
in 400 ml trockenem Aceton unter Rühren bei 23°C auf. Man
gibt 6,6 ml (162 mMol, 5 Mol pro Mol polysilyliertes 6′-N-
Cbz-Kanamycin A) Methanol zu und rührt die Mischung 1 Stunde
unter einer starken Stickstoffspülung bei 23°C. Die Mischung
wird auf 0 bis 5°C abgekühlt, und eine Lösung von
11,35 g (32,4 mMol) SAE in 120 ml zuvor abgekühltem, trockenem
Aceton wird zugesetzt. Man rührt die Mischung weitere
3 Stunden bei 0 bis 5°C und gibt sie dann 1 Woche lang in
einem bei 4°C gehaltenen Kälteraum. Dann gibt man 300 ml
Wasser zu, stellt den pH auf 2,0 ein, rührt die Mischung
1 Stunde und entfernt das Aceton im Vakuum. Die erhaltene
wässerige Lösung wird 17 Stunden bei 23°C unter einem H₂-Druck
von 3,7233 bar (54,0 psi) reduziert, wobei man 3,0 g
10%iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet.
Dann filtriert man durch Dicalite®, konzentriert im Vakuum
auf 75 bis 100 ml, gibt auf eine CG-50®(NH₄+)-Säule auf und
eluiert mit Wasser und 0,6 n NH₄OH. Man erhält 52,52% Amikacin,
14,5% BB-K29, 19,6% Kanamycin A und 1,71% Polyacylverbindungen.
Man suspendiert 4,88 g (10,07 mMol) Kanamycin A in 100 ml
Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei
23°C. Zur gerührten Suspension gibt man 16,234 g (140,98 mMol,
14 Mol pro Mol Kanamycin A) Tetramethylguanidin (TMG).
Man erhitzt die Mischung zum Rückfluß und gibt im Verlauf
von 15 Minuten 15,32 g (140,98 mMol, 14 Mol pro Mol Kanamycin
A) TMCS zu. Ungefähr 1/2 Stunde nach der Zugabe des
TMCS bildet sich ein weißer Niederschlag von TMG · HCl. Man
kühlt die Mischung auf Raumtemperatur, konzentriert zu einem
klebrigen Rückstand und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum.
Der Feststoff wird mit 100 ml trockenem THF verrieben, und
das unlösliche TMG · HCl wird abfiltriert und mit 5 × 20 ml-
Portionen THF gewaschen. Vereinigtes Filtrat und Waschflüssigkeiten
werden im Vakuum bei 40°C zu einem klebrigen Rückstand
konzentriert und 2 Stunden unter Hochvakuum getrocknet.
Man erhält 10,64 g eines hell-cremefarbigen, klebrigen Rückstands.
Die Ausbeute beträgt 87,6%, berechnet als Kanamycin
A (Silyl)₁₀.
Man löst 10,64 g (10,07 mMol) Poly(trimethylsilyl)-kanamycin
A, das in der obigen Stufe A hergestellt wurde, in
110 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton unter Rühren bei
23°C auf und kühlt die Lösung auf 0 bis 5°C. Dann gibt man
1,81 ml Wasser (100,7 mMol, 10 Mol pro Mol polysilyliertem
Kanamycin A) zu und rührt die Lösung 30 Minuten unter mäßigem
Vakuum. 3,70 g (10,57 mMol, 5%iger Überschuß) SAE
in 40 ml vorgekühltem, trockenem Aceton werden im Verlauf
von weniger als 1 Minute zugegeben, und die Mischung wird
1 Stunde gerührt. Man arbeitet die Mischung nach der allgemeinen
Arbeitsweise des Beispiels 16 B auf, wobei man ungefähr
50% Amikacin, ungefähr 10% BB-K29, 5 bis 8% BB-K6,
ungefähr 20% Kanamycin A und 5 bis 8% Polyacylverbindungen
erhält.
5,0 zu 97,6% reines Kanamycin A (10,07 mMol) werden in 100 ml
Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril bei 23°C suspendiert.
Man gibt 33,8 ml (24,5 g, 241,7 mMol) Triäthylamin zu und
bringt die Suspension zum Rückfluß. Eine Lösung von 23,7 ml
(21,3 g, 140,98 mMol) Triäthylchlorsilan in 25 ml trockenem
Acetonitril wird im Verlauf von 20 Minuten zugesetzt. Man hält
noch weitere 7 Stunden am Rückfluß und kühlt die Mischung auf
Raumtemperatur ab, worauf lange, feine Nadeln von TEA · HCl abgeschieden
werden. Man läßt die Mischung ungefähr 16 Stunden
bei Raumtemperatur stehen, konzentriert im Vakuum bei 40°C zu
einem klebrigen Feststoff und trocknet 2 Stunden unter Hochvakuum
zu einem dunkel-orangefarbenen, klebrigen Feststoff.
Man verreibt den Feststoff mit 100 ml trockenem THF von 23°C
und filtriert das unlösliche TEA · HCl ab, wäscht mit 5 × 20 ml
THF und trocknet. Hierbei erhält man 16,0 g TEA · HCl. Vereinigte
Filtrate und Waschflüssigkeiten werden im Vakuum zu einem Feststoff
konzentriert. Dann trocknet man 2 Stunden unter Hochvakuum.
Man erhält 19,3 g Poly(triäthylsilyl)-kanamycin A als
dunkelorangen, viskosen Sirup.
Man suspendiert 10,0 g zu 99,7% reines Kanamycin A (20,58 mMol)
in 200 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren
bei 23°C. Zur Suspension gibt man 29,45 g bis-Trimethylsilylharnstoff
(BSU) (144,01 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin) und
bringt die Mischung unter einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß.
Man hält noch 17 Stunden am Rückfluß und kühlt dann die
Reaktionsmischung auf Raumtemperatur ab. Eine kleine Menge
unlösliches Material wird durch Filtrieren entfernt, mit 3 × 10
ml-Portionen Acetonitril gewaschen und getrocknet (1,1381 g).
Infrarot-Spektroskopie zeigt, daß es sich hierbei um BSU und eine
kleine Menge unumgesetztes Kanamycin A handelt. Vereinigte
Filtrate und Waschflüssigkeiten werden 16 Stunden auf 4°C abgekühlt.
Es scheidet sich weiterer Feststoff ab, der wie oben
beschrieben gewonnen wird. Man erhält 7,8 g. Durch Infrarotanalyse
wird gezeigt, daß es sich um BSU und Harnstoff handelt.
Das hellgelbe Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden im
Vakuum bei 40°C konzentriert. Anschließend trocknet man unter
Hochvakuum, wobei man 27,0 g eines weißen Feststoffs erhält,
der teilweise klebrig ist und teilweise aus feinen, nadelartigen
Kristallen besteht. Man behandelt den Feststoff mit 150 ml
Heptan von 23°C, entfernt den unlöslichen Anteil durch Filtrieren,
wäscht mit 2 × 50 ml-Portionen Heptan und trocknet. Hierbei
erhält man 6,0 g weiße Nadeln, bei denen es sich nach Infrarotanalyse
um BSU und Harnstoff handelt. Vereinigtes Filtrat
und Waschflüssigkeit werden im Vakuum bei 40°C konzentriert.
Dann trocknet man 2 Stunden lang unter Hochvakuum, wobei man
20,4 g weiße Nadeln erhält. Deren Infrarotspektrum ist typisch
für polysilyliertes Kanamycin A. Berechnungen zeigen, daß das
Produkt durchschnittlich 7,22 Trimethylsilylgruppen enthält.
Man suspendiert 10,0 g (20,639 mMol) Kanamycin A in 100 ml
Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Rühren bei
23°C. Man bringt die Suspension unter Stickstoffspülung zum
Rückflußkochen und gibt dann im Verlauf von 10 Minuten
23,322 g (144,5 mMol), 7 Mol pro Mol Kanamycin A) HMDS zu.
Man hält noch 16 Stunden lang am Rückfluß und kühlt dann
die Mischung auf Raumtemperatur ab und konzentriert dann
im Vakuum. Anschließend trocknet man 2 Stunden unter Hochvakuum.
Man erhält 24,3 g eines weißen, klebrigen Rückstands.
Die Ausbeute beträgt 92,1%, berechnet als Kanamycin A
(Silyl)₁₁.
24,3 g in Stufe A hergestelltes Per(trimethylsilyl)-kanamycin
A werden in 240 ml Molekularsieb-getrocknetem Aceton
bei 23°C unter Rühren gelöst. Zu dieser Lösung gibt man
9,25 ml 1,3-Butandiol (103,2 mMol, 5 Mol pro Mol Per(trimethylsilyl)-
kanamycin A). Man rührt die Mischung 2 Stunden
bei 23°C unter Stickstoffspülung und kühlt dann auf 0 bis
5°C ab. Im Verlauf von ungefähr 1 Minute gibt man 7,23 g
SAE (20,64 mMol) in 70 ml vorgekühltem Aceton zu. Die Mischung
wird 3 Stunden bei 0 bis 5°C gerührt und dann
ungefähr 16 Stunden lang in einem bei 4°C gehaltenen Kälteraum
stehengelassen. Man gibt 200 ml Wasser zu, stellt den
pH auf 2,5 ein und rührt die klare, gelbe Lösung 30 Minuten
bei 23°C. Das Aceton wird im Vakuum entfernt und die wässerige
Lösung wird 2 Stunden lang bei 23°C bei einem H₂-Druck
von 3,7923 bar (55,0 psi) reduziert, wobei man 3,0 g
10%iges Pd-auf-Aktivkohle als Katalysator verwendet. Dann
filtriert man die reduzierte Lösung durch Dicalite® und
chromatographiert wie in Beispiel 16 B beschrieben. Man erhält
47,50% Amikacin, 5,87% BB-K29, 7,32% BB-K6, 24,26%
Kanamycin A und 7,41% Polyacylverbindungen.
Zu einer unter Rückfluß gehaltenen Mischung von 5,0 g (10,32 mMol)
Kanamycin A in 50 ml Molekularsieb-getrocknetem Tetrahydrofuran
(THF) gibt man 100 mg Sulfaminsäure und 12,32 g
(76,33 mMol) HMDS. Man hält die Mischung 18 Stunden lang am
Rückfluß, wobei nach 6 Stunden vollständige Auflösung erfolgt.
Man kühlt die Lösung auf 23°C, behandelt mit 0,1 ml Wasser und
hält 30 Minuten bei 23°C. Eine Lösung von 3,61 g (10,3 mMol)
SAE in 36 ml THF wird im Verlauf von 30 Minuten zugesetzt. Nach
3-stündigem Rühren wird die Mischung mit 100 ml Wasser verdünnt
und der pH mit 10%iger H₂SO₄ auf 2,2 eingestellt. Man
rührt 30 Minuten lang bei 23°C und konzentriert dann im Vakuum,
um das THF zu entfernen. Die erhaltene wässerige Lösung wird
2 Stunden lang bei 23°C bei einem H₂-Druck von 3,4475 bar
(50 psi) reduziert, wobei man 10%iges Pd-auf-Aktivkohle als
Katalysator verwendet. Die reduzierte Lösung wird durch Dicalite®
filtriert, und die Feststoffe werden mit Wasser gewaschen. Vereinigte
Filtrate und Waschflüssigkeiten (150 ml) werden mikrobiologisch
gegen E. coli untersucht. Man stellt fest, daß sie
1225 mcg/ml (31,5% Ausbeute an aktivem Material) Amikacin
enthält.
Man löst 8 g (20,65 mMol) Dicarbobenzyloxy-L-(-)-α-amino-α-
hydroxybuttersäure und 2,37 g (20,65 mMol) N-Hydroxysuccinimid
in 50 ml trockenem Aceton von 23°C auf. 4,25 g (20,65 mMol)
Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 20 ml trockenem
Aceton, werden zugegeben und das Ganze wird 2 Stunden bei
23°C gerührt. Man filtriert den Dicyclohexylharnstoff ab,
wäscht den Filterkuchen mit 10 ml trockenem Aceton und vereinigt
Filtrate und Waschflüssigkeiten.
Aus 10,0 g (20,639 mMol) Kanamycin A nach der allgemeinen
Arbeitsweise des Beispiels 15 hergestelltes Poly(trimethylsilyl)-
kanamycin A wird in 100 ml trockenem Aceton gelöst.
Man kühlt die Lösung auf 0 bis 5°C ab, gibt 3,7 ml entionisiertes
Wasser zu und rührt die Lösung 30 Minuten unter
mäßigem Vakuum bei 0 bis 5°C.
Zu dieser Lösung gibt man die Lösung des in Stufe A hergestellten
di-Cbz-blockierten Acylierungsmittels und rührt
die Mischung dann 30 Minuten lang bei 0 bis 5°C. Die Mischung
wird mit Wasser verdünnt, der pH wird auf 2,2 eingestellt
und das Aceton wird im Vakuum entfernt. Man reduziert die
wässerige Lösung nach der allgemeinen Arbeitsweise des
Beispiels 22 und filtriert dann durch Dicalite®. Durch Chromatographie
wird festgestellt, daß 40 bis 45% Amikacin,
etwa 10% BB-K29, eine Spur BB-K6, ungefähr 30% Kanamycin
A und eine kleine Menge Polyacylverbindungen vorliegen.
Man erhitzt 11 g (22,7 mMol) Kanamycin A und 100 mg Imidazol
in 100 ml Molekularsieb-getrocknetem Acetonitril unter Stickstoffspülung
zum Rückfluß. Im Verlauf von 30 Minuten gibt man
18,48 g HMDS (114,5 mMol, 5 Mol pro Mol Kanamycin A) zu und
hält die Mischung 20 Stunden am Rückfluß. Nach ungefähr 2 1/2
Stunden erfolgt vollständige Auflösung. Man kühlt die Lösung
auf 23°C und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum, wobei
21,6 g Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A als schaumiger Rückstand
zurückbleiben. Die Ausbeute beträgt 93,1%, berechnet
als Kanamycin A (Silyl)₁₁.
25 g (51,7 mMol) Kanamycin B in 250 ml Molekularsieb-getrocknetem
Acetonitril werden unter einem Stickstoffstrom
zum Rückfluß erhitzt. Man gibt im Verlauf von 30 Minuten
62,3 g HMDS (385,81 mMol, 7,5 Mol pro Mol Kanamycin B), gefolgt
von 1 ml TMCS als Katalysator, zu. Die Mischung wird
21 Stunden unter Rückfluß gehalten, wobei nach 1 Stunde
vollständige Auflösung erfolgt. Dann wird das Lösungsmittel
bei 60°C im Vakuum entfernt. Den öligen Rückstand hält man
3 Stunden bei 60°C unter Hochvakuum. Man erhält 53,0 g
Poly(trimethylsilyl)-kanamycin B. Die Ausbeute beträgt
85,2%, berechnet als Kanamycin B (Silyl)₁₀.
53,0 g des in der obigen Stufe A hergestellten Poly(trimethylsilyl)-
kanamycins B werden in 500 ml trockenem Aceton
bei 0 bis 5°C aufgelöst. Man gibt 20,9 ml Methanol zu und
rührt die Mischung 30 Minuten bei 0 bis 5°C im Vakuum. Eine
Lösung von 18,1 g (51,67 mMol) SAE in 200 ml vorgekühltem,
trockenem Aceton wird im Verlauf von weniger als 1 Minute
zugesetzt, und die Mischung wird 30 Minuten bei 0 bis 5°C
gerührt. Die Mischung wird nach der allgemeinen Arbeitsweise
des Beispiels 22 aufgearbeitet und dann auf eine Säule mit
CG-50®(NH₄+) (8 × 120 cm) aufgegeben. Man eluiert mit einem
NH₄OH-Gradienten von 0,6 n auf 3 n. Erhalten werden 38%
BB-K26, 5% des entsprechenden 6′-N-acylierten Kanamycins B
(BB-K22), 10% des entsprechenden 3-N-acylierten Kanamycins B
(BB-K46), 14,63% Kanamycin B und eine kleine Menge polyacyliertes
Kanamycin B.
19,5 g (40,246 mMol) Kanamycin A und 0,5 g (0,858 mMol) Kanamycin
A-Sulfat [insgesamt= 20,0 g, 41,0 mMol] in 200 ml Molekularsieb-
getrocknetem Acetonitril werden zum Rückfluß gebracht.
Man gibt langsam 60,3 ml HMDS (287,7 mMol, 7 Mol pro Mol Kanamycin
A) zu und hält die Mischung 28 Stunden am Rückfluß. Dann
wird am Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft und anschließend
unter Dampfstrahlvakuum getrocknet. Man erhält 47,5 g
Poly(trimethylsilyl)-kanamycin A als blaßgelbes Öl. Die Ausbeute
beträgt 95,82%, berechnet als Kanamycin A (Silyl)₁₀.
Zu einer Suspension von 5,0 g (42 mMol) AHBA in 100 ml THF
gibt man 40 g (191 mMol) Trifluoressigsäureanhydrid unter
Rühren im Verlauf von 10 Minuten zu. Man rührt die Lösung
18 Stunden bei 23°C und konzentriert dann im Vakuum bei
50°C zur Trockne. Den Rückstand löst man in 100 ml wässerigem
Methanol (1 : 1) und rührt 1 Stunde. Dann konzentriert
man im Vakuum zur Trockne und löst in 50 ml H₂O wieder auf.
Die wässerige Lösung wird mit 3 × 50 ml-Portionen MIBK extrahiert,
und nach dem Trocknen über Na₂SO₄ wird der Extrakt
zu einem Öl konzentriert. Spuren an Lösungsmittel werden
durch Zusatz und Abdestillieren von 4 ml Wasser entfernt.
Beim Stehenlassen geht das Öl in einen wachsartigen, kristallinen
Feststoff über. Man erhält 2,5 g Produkt, Ausbeute
28%.
Man löst 2,4 g (11,3 mMol) des N-Trifluoracetyl-AHBA in
50 ml trockenem Aceton und gibt 1,30 g (11,31 mMol) N-Hydroxysuccinimid
zur Lösung. Eine Lösung von 2,33 g Dicyclohexylcarbodiimid
in 20 ml trockenem Aceton wird langsam zugesetzt.
Man rührt die Reaktionsmischung 2 Stunden lang bei 23°C und
entfernt dann den ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff durch
Filtrieren und wäscht mit einer kleinen Menge Aceton. Vereinigte
Filtrate und Waschflüssigkeiten (Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters
der N-Trifluoracetyl-AHBA) wird bei der
nachfolgenden Stufe ohne Isolierung verwendet.
Zu einer Lösung von 11,31 mMol Poly(trimethylsilyl)-kanamycin
A, das wie in Beispiel 20 beschrieben hergestellt wurde,
in 54 ml Aceton gibt man 2,0 ml (113,4 mMol) Wasser und
rührt die Mischung 30 Minuten im Vakuum bei 0 bis 5°C. Zu
der Mischung gibt man den in der obigen Stufe A hergestellten
N-Hydroxysuccinimidester der N-Trifluoracetyl-AHBA
(11,31 mMol) und hält die Mischung dann 1 Stunde bei 5°C.
Der pH wird mit 20%iger H₂SO₄ auf ungefähr 2,0 festgestellt,
die Mischung wird 30 Minuten gerührt und dann wird der pH
mit NH₄OH auf ungefähr 6,0 erhöht. Anschließend dampft man
die Mischung am Rotationsverdampfer zur Trockne ein. Man
erhält 14,4 g eines klebrigen, weißlichen Feststoffs. Der
Feststoff wird in 100 ml Wasser gelöst, der pH wird mit
10 n NH₄OH von 5,5 auf 11,0 angehoben und die Lösung wird
in einem Ölbad 1 Stunde bei 70°C erhitzt. Dann senkt man den
pH (9,5) mit HCl auf 7,0 ab, führt mit der Lösung eine Klarfiltration
durch, um eine kleine Menge unlösliche Materialien
zu entfernen und wäscht das Filter mit Wasser. Vereinigte
Filtrate und Waschflüssigkeiten (188 ml) werden auf eine
Säule mit CG-50®(NH₄+) (8 × 90 cm) aufgegeben, mit 2 Liter
Wasser gewaschen und mit einem NH₄OH-Gradienten (0,6 n-1,0 n
konzentriert) eluiert. Man erhält 28,9% Amikacin,
5,0% BB-K6, 5,7% BB-K29, 43,8% Kanamycin A, 3,25% Polyacylverbindungen
und 14,3% eines unbekannten Materials, das
in der ersten Funktion aus der Säule austritt.
Eine Lösung von 5,0 g (42 mMol) AHBA in 100 ml Wasser und
20 ml Aceton wird mit 10 n NaOH auf pH 10 eingestellt. Im
Verlauf von 3 bis 4 Minuten gibt man 11,6 g (53 mMol) Di-
tert.-butyldicarbonat zu und rührt die Lösung 35 Minuten,
während man den pH durch periodische Zugabe von 10 n NaOH
bei pH 10 hält. Das Aceton wird im Vakuum entfernt, und die
wässerige Phase wird mit 40 ml Äthylacetat gewaschen. Man
senkt den pH der wässerigen Lösung mit 3 n HCl auf 2,0 ab
und extrahiert dann mit 3 × 30 ml MIBK. Die vereinigten
MIBK-Extrakte werden über Na₂SO₄ getrocknet und zu einem
klaren, öligen Rückstand konzentriert. Man erhält 8,2 g
Produkt, Ausbeute 89%.
4,25 g (19,4 mMol) des tert.-BOC-AHBA werden in 50 ml
Aceton gelöst, und man gibt 2,23 g (19,4 mMol) N-Hydroxysuccinimid
zu. Eine Lösung von 4,00 g (19,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid
in 20 ml Aceton wird langsam zugesetzt,
und die Mischung wird 2 Stunden bei 23°C gerührt. Man entfernt
den ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren
und wäscht mit einer kleinen Menge Aceton. Vereinigte
Filtrate und Waschflüssigkeiten (Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters
von tert.-BOC-AHBA) werden in der nachfolgenden
Stufe ohne Isolierung eingesetzt.
Zu einer Lösung von 41,28 mMol Poly(trimethylsilyl)-kanamycin
A, wie in Beispiel 20 beschrieben hergestellt, in 94 ml
Aceton gibt man 3,5 ml (194 mMol) Wasser und rührt die Lösung
30 Minuten im Vakuum bei 0 bis 5°C. 19,4 mMol des in
der obigen Stufe A hergestellten N-Hydroxysuccinimidesters
von tert.-BOC-AHBA werden zugesetzt und die Mischung wird
1 Stunde bei 5°C stehengelassen. Dann gibt man 200 ml Wasser
zu und senkt den pH (7,0) mit 20%iger H₂SO₄ auf 2,0 ab.
Nach 30-minütigem Rühren wird der pH mit NH₄OH auf ungefähr
6,0 angehoben, und die Mischung wird im Vakuum zur Trockne
eingedampft, wobei man 36,3 g eines goldfarbenen Öls erhält.
Das Öl wird in 200 ml Trifluoressigsäure gelöst. 15 Minuten
lang stehengelassen und dann am Rotationsverdampfer zur
Trockne eingedampft. Man wäscht das Öl mit Wasser und
destilliert das Wasser ab. Man gibt konzentriertes NH₄OH
auf pH 6,0 zu und destilliert dann ab. Der erhaltene Feststoff
wird in Wasser gelöst, filtriert, und das Filter wird
mit Wasser gewaschen. Man gibt vereinigte Filtrate und
Waschflüssigkeiten (259 ml) auf eine CG-50® (NH₄+)Säule
(8 × 92 cm), wäscht mit 4 Litern Wasser und eluiert mit
einem NH₄OH-Gradienten (0,6 n-1,0 n konzentriert). Man
erhält 40,32% Amikacin, 4,58% BB-K6, 8,32% BB-K29,
30,50% Kanamycin A und 7,43% Polyacylverbindungen.
2′,6′-Di-(N-trifluoracetyl)-sisomicin wird in trockenem
Acetonitril aufgeschlämmt und unter Stickstoffatmosphäre
4 Stunden am Rückfluß erhitzt. Man gibt während 30 Minuten
Hexamethyldisilazan zu [4 Mol pro Mol 2′,6′-Di-(N-trifluoracetyl)-
sisomicin] und erhitzt die sich ergebene Lösung 24 Stunden
zum Rückfluß. Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum ergibt
festes polysilyliertes 2′,6′-Di-(N-trifluoracetyl)-sisomicin.
Das polysilylierte 2′,6′-Di-(N-trifluoracetyl)-sisomicin wird gemäß der
allgemeinen Arbeitsweise von Beispiel 21 B mit dem N-Hydroxysuccinimidester
von L-(-)-γ-Trifluoracetylamino-a-hydroxybuttersäure
acyliert und wie in Beispiel 21 B beschrieben
aufbereitet, wobei man dann 1-N-[L-(-)-γ-Amino-α-hydroxybutyryl-
sisomicin erhält.
Siliziumgehalt: 23,3% (entsprechend (Silyl)₁₀).
Zu einer gerührten Lösung von 10,4 g (22,2 mMol) 4′-Deoxykanamycin
A und 27,5 g (111 mMol) Ni(OAc)₂ · 4H₂O in 450 ml
DMSO werden 7,0 g (22,4 mMol) N-Hydroxy-5-norbornen-2,4-dicarboximid-
Ester von Benzyloxyameisensäure (Cbz-ONB) bei
etwa 10°C hinzugefügt und es wird bei Zimmertemperatur über
Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wird im Vakuum eingeengt
und man erhält einen blauen, öligen Rückstand, der
über CG-50®-Harz chromatographiert wird (NH₄⁺, 500 ml), wobei
mit verdünntem Ammoniakwasser eluiert wird. Die auf Ninhydrin
positiv reagierenden Fraktionen, die aus dem Abwasser
(hervorgerufen durch ein Auslaufen des 3,6′-Di-N-Cbz-Derivats)
und dem Eluat mit 0,1 N Ammoniak gesammelt werden,
werden vereinigt und im Vakuum abgezogen. Der Rückstand
wird über Diaion HP-10®-Harz (400 ml) nochmals chromatographiert
unter Verwendung von einer wäßrigen Methanollösung
als Eluierungsmittel, um die Mono- und Di-Cbz-Derivate zu
trennen. Das 6′-N-Cbz-Derivat wird mit 30%iger wäßriger
Methanollösung eluiert und aus H₂O-Äthanol kristallisiert.
Man erhält 4,73 g (35%) farblose Kristalle. Schmelzpunkt
232 bis 233°C. IR(KBr): 1700, 1540, 1275, 1135, 1075, 1040,
770, 750, 695 cm-1.
Analyse für C₂₆H₄₂N₄O₁₂ · EtOH · 1/2H₂O:
ber.: | |
C 51,13, H 7,51, N 8,52% | |
gef.: | C 51,03, H 7,31, N 8,42% |
Das 3,6′-Di-N-Cbz-Derivat wird mit 90%iger wäßriger Methanollösung
eluiert und aus H₂O-Methanol kristallisiert. Man erhält
3,08 g (18,4%) Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 220 bis 221°C.
IR(KBr): 1690, 1545, 1260, 1135, 1075, 1045, 780, 750, 700 cm-1.
Analyse für C₃₄H₄₈N₄O₁₄ · H₂O:
ber.: | |
C 54,10, H 6,68, N 7,42% | |
gef.: | C 54,10, H 6,69, N 7,07% |
Zu einer gerührten Suspension von 4,70 g (7,8 mMol) 3,6′-Di-N-
Cbz-4′-deoxykanamycin A in 240 ml Methanol werden 29 ml
(307 mMol) Essigsäureanhydrid hinzugefügt. Die Mischung wird
über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und dann im Vakuum
abgezogen. Man erhält 5,68 g (100%) des obigen Tri-N-acetylderivats
mit einem Schmelzpunkt von 290 bis 291°C (Zers.).
IR(KBr): 1700, 1650, 1550, 1380, 1260, 1140, 1080, 1035,
745, 695 cm-1.
Analyse für C₃₂H₄₈N₄O₁₅ · H₂O:
ber.: | |
C 51,47, H 6,75, N 7,50% | |
gef.: | C 51,66, H 7,13, N 7,06% |
Eine Lösung von 5,5 g (7,6 mMol) 1,3,3"-Tri-N-acetyl-6′-
N-carbobenzyloxy-4′-deoxykanamycin A in 80 ml einer 50%igen
wäßrigen Äthanollösung wird in Anwesenheit eines 10%igen
Pd-C-Katalysators bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur
hydriert. Der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt
und das Filtrat wird unter reduziertem Druck abgezogen und
man erhält 4,49 g (100%) der obigen Verbindung. Eine analytische
Probe wird durch Säulenchromatographie auf Amberlite
IRA-410®-Harz (OH-) und Kristallisation aus H₂O-Methanol
mit einem Schmelzpunkt von 280 bis 283°C erhalten.
IR(KBr): 1650, 1550, 1380, 1135, 1080, 1035 cm-1.
Analyse für C₂₄H₄₂N₄O₁₃ · MeOH · 1/2 H₂O:
ber.: | |
C 47,24, H 7,45, N 8,81% | |
gef.: | C 47,61, H 7,45, N 8,58% |
Eine Lösung von 4,39 g (7,39 mMol) 1,3,3′′-Tri-N-acetyl-4′-
deoxykanamycin A und 5 ml Benzaldehyd in 60 ml wäßriger
Methanollösung werden 30 Minuten auf 60°C erhitzt. Die Reaktionsmischung
wird gekühlt, mit 4,0 g (106 mMol) NaBH₄ behandelt,
zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt und anschließend
im Vakuum abgezogen. Der ölige Rückstand wird
über HP-10®-Harz (150 ml) unter Verwendung von wäßrigem
Methanol als Eluierungsmittel chromatographiert und man
erhält 3,86 g (74%) der obigen Verbindung und 1,70 g
feuchtes Ausgangsmaterial, welches in demselben Verfahren
zurückgeführt wird und aus welchem man zusätzliche 1,32 g
(26%) der obigen Verbindung erhält. Eine analytische Probe
wird hergestellt durch nochmalige Chromatographie auf HP-10®-
Harz und Kristallisation aus H₂O-Äthanol. Schmelzpunkt über
300°C. IR(KBr): 3280, 1640, 1555, 1380, 1135, 1080, 1040,
750, 700 cm-1.
Analysen für C₃₁H₄₈N₄O₁₃:
ber.: | |
C 54,38, H 7,07, N 8,18% | |
gef.: | C 54,01, H 7,16, N 7,87% |
Zu einer gerührten Mischung von 3,86 g (5,6 mMol) 1,3,3′′-
Tri-N-acetyl-6′-N-benzyl-4′-deoxykanamycin A und 5,6 ml
37%ige wäßrige HCHO in 85 ml 95%igem Methanol werden
850 mg (13,5 mMol) NaBH₃CN gegeben. Die Mischung wird 4 Stunden
bei Zimmertemperatur gerührt und zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird unter Verwendung von wäßrigem Methanol
als Eluierungsmittel über HP-10®-Harz chromatographiert und
man erhält 3,88 g (100%) der obigen Verbindung. Eine analytische
Probe wird durch Kristallisation aus H₂O-Äthanol
mit einem Schmelzpunkt von 295 bis 297°C (Zers.) erhalten.
IR(KBr): 3280, 1645, 1500, 1375, 1145, 1075, 1040, 740,
700 cm-1.
NMR(D₂O): δ in ppm von DSS, 2,27 (3H, s, N-CH₃), 7,34 (5H, s, Ar-H).
Analyse für C₃₂H₅₀N₄O₁₃ · 1/2H₂O:
ber.: | |
C 54,30, H 7,26, N 7,92% | |
gef.: | C 54,30, H 7,33, N 7,64% |
Eine Mischung von 5,18 g (7,42 mMol) 1,3,3′′-Tri-N-acetyl-6′-
N-benzyl-4′-deoxy-6′-N-methylkanamycin A und 15 g NaOH in
80 ml Wasser werden über Nacht am Rückfluß gehalten. Die
Mischung wird abgekühlt, mit konzentrierter HCl neutralisiert
und zur Entfernung der unlöslichen Bestandteile
filtriert. Das Filtrat wird auf eine Säule mit CG-50®-Harz
(NH₄⁺, 370 ml) aufgegeben. Nach dem Waschen mit 1,5 Liter
Wasser wird die Säule nacheinander mit 2 Liter 0,05 N NH₄OH
und 2 Liter 0,1 N NH₄OH eluiert. Das Eluat, welches auf
Ninhydrin eine positive Reaktion zeigt, wird abgezogen
und man erhält 3,23 g (76%) der obigen Verbindung.
Zu einer gerührten Lösung von 2,94 g (5,14 mMol) 6′-N-
Benzyl-4′-deoxy-6′-N-methylkanamycin A (BB-K312) und 6,37 g
(25,7 mMol) Ni(OAc)₂ · 4H₂O in 100 ml DMSO werden 1,62 g
(5,20 mMol) Cbz-ONB hinzugefügt und es wird bei Zimmertemperatur
weiter gerührt. Nach 2 Tagen werden 72 ml einer 0,2 M
wäßrigen EDTA-Lösung und 30 ml konzentrierte NH₄OH zu der
Reaktionsmischung hinzugefügt. Die erhaltene blaue Lösung
wird auf eine Säule mit HP-10®-Harz (150 ml) aufgegeben.
Nach dem Waschen mit 200 ml 7 N NH₄OH und anschließend mit
300 ml H₂O wird die Säule mit 400 ml 80%igem wäßrigem
Methanol eluiert und man erhält 2,65 g (73%) der obigen
Verbindung. Eine analytische Probe wird durch Kristallisation
aus Methanol mit einem Schmelzpunkt 216 bis 217°C
erhalten. IR(KBr): 3340, 1690, 1540, 1290, 1135, 1045, 745,
700 cm-1.
Analyse für C₃₄H₅₀N₄O₁₂ · 1/2 H₂O:
ber.: | |
C 57,06, H 7,18, N 7,83% | |
gef.: | C 57,29, H 7,22, N 7,58% |
Eine Suspension von 2,49 g (3,53 mMol) 6′-N-Benzyl-3-N-
benzyloxycarbonyl-4′-deoxy-6′-N-methylkanamycin A und 5 ml
HMDS in 40 ml trockenem CH₃CN wird über Nacht am Rückfluß
gehalten. Die erhaltene klare Lösung wird zur Trockne eingeengt.
Zu einer gerührten Lösung des öligen Rückstandes
in 50 ml Diäthylketon werden 1,23 g (3,51 mMol) SAE hinzugefügt.
Die Mischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt
und anschließend im Vakuum eingeengt. Man erhält
einen öligen Rückstand, der mit H₂O-Äthanol behandelt und
mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von ca. 3 eingestellt wird
und den man dann 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen
läßt. Die Lösung, die das acylierte Produkt enthält (eine
kleine Probe, die der Lösung entnommen wird, zeigt eine
Carbonylabsorptionsbande bei 1655 cm-1, die auf ein Amid
zurückzuführen ist), wird über Nacht bei Atmosphärendruck
und Zimmertemperatur in Anwesenheit von 1 g eines 10%igen
Pd-C-Katalysators hydriert. Der Katalysator wird durch
Filtrieren entfernt und das Filtrat wird im Vakuum abgezogen.
Der Rückstand wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst
und die Lösung wird auf eine Säule mit CG-50®-Harz
(NH₄⁺, 160 ml) aufgegeben. Nach dem Waschen mit 250 ml
Wasser wird die Säule nacheinander mit 250 ml 0,1 N NH₄OH,
1 Liter 0,2 N NH₄OH und 1 Liter 0,5 N NH₄OH eluiert. Das
Eluat wird in 20 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen
85 bis 100, die eine positive Ninhydrinreaktion zeigen,
werden im Vakuum abgezogen und man erhält einen öligen
Rückstand. Der Rückstand verfestigt sich in H₂O-Äthanol und
man erhält 1,255 g eines kristallinen Produktes und 144 mg
einer zweiten Ausbeute, insgesamt also 1,399 g (68%) der
obigen Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 182 bis 184°C.
[α] +93° (c 1, H₂O).
Analyse für C₂₃H₄₅N₅O₁₂ · EtOH · H₂O:
ber.: | |
C 46,36, H 8,25, N 10,81% | |
gef.: | C 46,37, H 8,40, N 10,38% |
Dieses Produkt wird nochmals über CG-50®-Harz (NH₄⁺, 100 ml)
unter Verwendung von carbonatfreiem wäßrigem Ammoniak als
Eluierungsmittel chromatographiert und aus H₂O-Methanol-
Isopropanol kristallisiert und man erhält 927 mg der obigen
Verbindung in Form farbloser Nadeln mit einem Schmelzpunkt
von 193 bis 194°C.
[α] +101° (c 1, H₂O).
NMR(D₂O): δ in ppm von DSS 1,37 (2H, q, J=12, 2-Hax und 4-Hax), 1,86 (4H, m, 2-Häq, 4-Häq und β-CH₂), 2,29 (3H, s, N-CH₃), 4,14 (1H, dd, J=8 und 4,5, α-CH), 5,00 (1H, d, J=3,5, 1′′-H), 5,24 (1H, d, J=3,5, 1′-H).
IR(KBr): 1640, 1540, 1135, 1080, 1040, 955 cm-1.
[α] +101° (c 1, H₂O).
NMR(D₂O): δ in ppm von DSS 1,37 (2H, q, J=12, 2-Hax und 4-Hax), 1,86 (4H, m, 2-Häq, 4-Häq und β-CH₂), 2,29 (3H, s, N-CH₃), 4,14 (1H, dd, J=8 und 4,5, α-CH), 5,00 (1H, d, J=3,5, 1′′-H), 5,24 (1H, d, J=3,5, 1′-H).
IR(KBr): 1640, 1540, 1135, 1080, 1040, 955 cm-1.
Analyse für C₂₃H₄₅N₅O₁₂ · 2 H₂O:
ber.: | |
C 44,58, H 7,97, N 11,30% | |
gef.: | C 44,85, H 7,90, N 11,85% |
Eine Suspension von 2,27 g (3,08 mMol) 3,6′-Di-N-carbobenzyloxy-
4′-deoxykanamycin A und 5 ml HMDS in 35 ml trockenem CH₃CN
wird 2 Tage lang am Rückfluß gehalten. Die erhaltene klare
Lösung wird im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird in
40 ml trockenem Diäthylketon gelöst. Zu dieser Lösung werden
1,08 g (3,08 mMol) SAE unter Rühren hinzugefügt. Die Mischung
wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und anschließend
zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthanol-H₂O behandelt
und mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 3 eingestellt.
Nach 30-minütigem Stehen wird die angesäuerte Lösung 3 Tage
lang bei Atmosphärendruck und Zimmertemperatur in Anwesenheit
von 1,2 g eines 10%igen Pd-C-Katalysators hydriert. Der
Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat
wird im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird in einer kleinen
Menge Wasser gelöst und die Lösung wird auf eine Säule mit
CG-50®-Harz (NH₄⁺, 130 ml) aufgegeben. Nach dem Waschen mit
500 ml H₂O wird die Säule nacheinander mit 1 Liter 0,2 N
NH₄OH und 1 Liter 0,5 N NH₄OH eluiert. Das Eluat wird in
20 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 79 bis 95, die
eine positive Ninhydrinenreaktion zeigen, werden zusammengefügt
und im Vakuum abgezogen. Man erhält 1 g (56,1%) der obigen
Verbindung in Form eines amorphen Pulvers. Das Produkt wird
nach demselben Verfahren, das für die Verbindung BB-K311 in
Stufe H) des Beispiels 31 verwendet wurde, umkristallisiert.
Es hat einen Schmelzpunkt von 179 bis 180°C.
[α] +99° (c 1, H₂O).
IR(KBr): 1640, 1535, 1120, 1065, 1030, 945 cm-1.
NMR(D₂O): δ in ppm 1,37 (2H, q, J=12,2- und 4′-Hax), 186 (4H, m, 2- und 4′-Häq und β-CH₂), 4,13 (1H, dd, J=8 und 4,5, a-CH), 5,02 (1H, d, J=3, 1′′-H), 5,28 (1H, d, J=3,5, 1′-H).
[α] +99° (c 1, H₂O).
IR(KBr): 1640, 1535, 1120, 1065, 1030, 945 cm-1.
NMR(D₂O): δ in ppm 1,37 (2H, q, J=12,2- und 4′-Hax), 186 (4H, m, 2- und 4′-Häq und β-CH₂), 4,13 (1H, dd, J=8 und 4,5, a-CH), 5,02 (1H, d, J=3, 1′′-H), 5,28 (1H, d, J=3,5, 1′-H).
Analyse für C₂₂H₄₃N₅O₁₂ · 1/2 MeOH · 2 H₂O:
ber.: | |
C 43,47, H 7,95, N 11,27% | |
gef.: | C 43,69, H 7,92, N 10,91% |
Claims (6)
1. Polysilylierte Aminoglykoside mit 2 bis 10 Silylgruppen,
erhältlich durch Silylierung eines Aminoglycosids
der Formel
worin R² für einen Hexopyranosylring der Formel
steht, worin R⁶ Wasserstoff oder CH₃, R⁷ Wasserstoff oder
CH₃, R⁸ OH oder NH₂, R⁹ Wasserstoff oder OH und R¹⁰
Wasserstoff oder OH bedeuten;
R³ für einen Hexopyranosylring der Formeln steht, worin R¹¹ Wasserstoff oder CH₃ bedeutet;
R⁵ für Wasserstoff oder OH steht; und
R⁴ für Wasserstoff, OH oder einen Pentofuranosylring der Formeln IX oder X steht: worin R¹² für Wasserstoff oder einen Hexopyranosylring der Formeln XI oder XII steht worin R¹³ Wasserstoff oder α-D-Mannopyranosyl bedeutet;
wobei Voraussetzung ist, daß wenn R³ nicht Wasserstoff bedeutet, einer der Reste R⁴ und R⁵ für Wasserstoff steht und der andere OH bedeutet; und wobei weiterhin Voraussetzung ist, daß wenn R³ für Wasserstoff steht, R⁵ Wasserstoff bedeutet und R⁴ für einen Pentofuranosylring der Formel IX oder X steht;
wobei das polysilylierte Aminoglycosid gegebenenfalls 1 bis 3 von Silyl verschiedene Aminoblockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweist.
R³ für einen Hexopyranosylring der Formeln steht, worin R¹¹ Wasserstoff oder CH₃ bedeutet;
R⁵ für Wasserstoff oder OH steht; und
R⁴ für Wasserstoff, OH oder einen Pentofuranosylring der Formeln IX oder X steht: worin R¹² für Wasserstoff oder einen Hexopyranosylring der Formeln XI oder XII steht worin R¹³ Wasserstoff oder α-D-Mannopyranosyl bedeutet;
wobei Voraussetzung ist, daß wenn R³ nicht Wasserstoff bedeutet, einer der Reste R⁴ und R⁵ für Wasserstoff steht und der andere OH bedeutet; und wobei weiterhin Voraussetzung ist, daß wenn R³ für Wasserstoff steht, R⁵ Wasserstoff bedeutet und R⁴ für einen Pentofuranosylring der Formel IX oder X steht;
wobei das polysilylierte Aminoglycosid gegebenenfalls 1 bis 3 von Silyl verschiedene Aminoblockierungsgruppen an anderen Aminogruppen als der C-1-Aminogruppe aufweist.
2. Polysilylierte Aminoglycoside gemäß Anspruch 1 mit
einer durchschnittlichen Anzahl von 3 bis 8 Silylgruppen
pro Molekül.
3. Polysilylierte Aminoglycoside gemäß den Ansprüchen
1 oder 2, wobei die Silylgruppen Trimethylsilylgruppen
sind.
4. Polysilylierte Aminoglycoside gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß die Aminoblockierungsgruppen
die Carbobenzyloxy- oder Trifluoracetylgruppe sind.
5. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach einem
der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminoglycosid der
allgemeinen Formel XIV:
worin R², R³, R⁴ und R⁵ die in Anspruch 1 angegebenen
Bedeutungen besitzen, in an sich bekannter Weise silyliert, gegebenenfalls in
Anwesenheit eines Silylierungskatalysators.
6. Verfahren zur Herstellung von 1-N-[ω-Amino-α-hydroxy-
alkanoyl]-aminoglycosid-Antibiotika der allgemeinen
Formel I:
oder pharmazeutisch verträglicher Säureadditionssalze
davon,
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet und
R², R³, R⁴ und R⁵ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen,
dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein polysilyiertes Aminoglycosid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel mit einem acylierenden Derivat einer Säure der allgemeinen Formel XIII: worin B eine Aminoblockierungsgruppe darstellt und n die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, umsetzt; und anschließend alle Blockierungsgruppen entfernt.
worin n eine ganze Zahl von 0 bis 4 bedeutet und
R², R³, R⁴ und R⁵ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen,
dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein polysilyiertes Aminoglycosid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem im wesentlichen wasserfreien organischen Lösungsmittel mit einem acylierenden Derivat einer Säure der allgemeinen Formel XIII: worin B eine Aminoblockierungsgruppe darstellt und n die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, umsetzt; und anschließend alle Blockierungsgruppen entfernt.
Applications Claiming Priority (2)
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---|---|---|---|
US79180677A | 1977-04-28 | 1977-04-28 | |
US88858578A | 1978-03-20 | 1978-03-20 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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ID=27121201
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19782818992 Granted DE2818992A1 (de) | 1977-04-28 | 1978-04-28 | Verfahren zur herstellung von 1-n-eckige klammer auf omega-amino- alpha-hydroxyalkanoyl eckige klammer zu -kanamycinen und neue zwischenprodukte zu deren herstellung |
DE19782818822 Granted DE2818822A1 (de) | 1977-04-28 | 1978-04-28 | Verfahren zur herstellung von 1-n- eckige klammer auf omega-amino-alpha-hydroxyalkanoyl eckige klammer zu -aminoglycosid-antibiotika und neue zwischenprodukte zu deren herstellung |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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