NO154697B - Derivat av kanamycin a eller b. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et derivat av kanamycin A eller kanamycin B til anvendelse ved fremstilling av 1-N-|'w-amino-a-hydroksyalkanoyl"J-kanamycin A eller B som har den generelle formel (I)

hvor R er OH eller NH2 og n er et helt tall fra 0 til 2, eller et ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav.

Kanamycinene er velkjente antibiotika, som f.eks. er beskrevet i Merck Index, 8. utgave, side 597-598. Det er kjent tallrike derivater av kanamycinene. Strukturformlene for kanamycin A og B er angitt nedenfor sammen med det på området anvendte standard nummereringssystem. I det etterfølgende vil de forskjellige derivater av kanamycin, hvor det vil være lett forståelig, bli omtalt som derivater av kanamycin A eller B fremfor ved strukturformelen, slik at behovet for å sammenligne komplekse strukturer for å fastslå forskjeller unngås.

US-patentskrift 3.781.268 vedrører 1- [L-(-)-y-amino-a-hydroksybutyryl] -kanamycin A (amikacin) og B, samt de mono- og dikarbobenzyloksybeskyttende derivater av disse. Når det gjelder lavere og høyere homologer henvises det til US-patentskrifter 3.886.139 og 3.904.597. Forbindelsene fremstilles ved acylering av et 6'-N-beskyttet kanamycin A eller B med et acylerende derivat av en N-beskyttet L-(-)-y-amino-a-hydroksysmørsyre i et vandig medium, etterfulgt av fjerning av den ene N-beskyttende gruppe eller begge N-beskyttende grupper.

Fra US-patentskrift 3.974.137 er det kjent en fremgangsmåte til fremstilling av 1-[l-(-)-y-amino-a-hydroksybutyryl]-kanamycin A, som omfatter at man omsetter 6 1 -ka-rbobenzyloksy-kanamycin—A—med— minst 3 mol benzaldehyd, et substituert benzaldehyd eller piv-aldehyd, til dannelse av 6'-N-karbobenzyloksykanamycin A som inneholder Seiffske-basegrupper i 1,3- og 3"-stillingene, acylerer dette tetra-beskyttende kanamycin A derivat med N-hydroksysuccinimidesteren av L-(-)-Y-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre og deretter fjerner de beskyttende grupper.

Fra belgisk patentskrift 828.192 er det kjent en fremgangsmåte til fremstilling av 1-[L-(-)-Y-amino-a-hydroksybutyryl ]-kanamycin A ved fremstilling av samme tetra-beskyttende kanamycin A derivat som ifølge US-patentskrift 3.974.137, acylering med N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimidesteren av L-(-)-y-benzy1-oksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre og etterfølgende fjerning av de beskyttede grupper.

Anvendelsen av et polysilylert kanamycin A eller B som utgangsmateriale ved fremstilling av forbindelser med formelen (I) gir stor løselighet i det organiske løsningsmiddelssystem, noe som muliggjør reaksjon ved høye konsentrasjoner. Selv om reaksjonen vanligvis utføres i løsninger som inneholder 10-20% polysilylert kanamycin-utgangsmateriale, er meget gode resultater blitt oppnådd ved konsentrasjoner på ca. 50 g/100 ml løs-ningsmiddel .

Fremstillingen gir en blanding av acylerte produkter. Det ønskete 1-N-acylerte produkt fraskilles fra de andre produkter ved krom-atografi, og dersom det er ønskelig kan biproduktene hydrolyseres til utgangskanamycinen med henblikk på resirkulering. Det har tidligere vist seg at eventuelt 3"-N-acylert materiale som ble dannet forå rsaket et tap på omtrent en tilsvarende mengde av

det ønskete 1-N-acylerte produkt på grunn av den store vanske-lighet med å fraskille sistnevnte fra førstnevnte. Et særlig attraktivt trekk ved fremgangsmåten hvor derivatene ifølge oppfinnelsen anvendes er den meget lave mengde uønsket 3"-N-acylert produkt som dannes (typisk påvises det intet).

Ved fremstilling av 1- [ L - ( - ) -y-atnino-o - hy droksybutyry 1 ] - kanamycin A, amikacin, ved forskjellige fremgangsmåter, dannes det typisk også det 3"-N-acylerte produkt (BB-K11), det 3-N-acylerte produkt (BB-K29), det 6'-N-acylerte produkt (BB-K6) og polyacylert materiale sammen med ureagert kanamycin A. Ved kom-mersiell fremstilling av amikacin ved acylering av 6'-N-karbobenzyloksy kanamycin A i et vandig medium etterfulgt av fjerning av den beskyttende gruppe, viste det seg således at ca. 10% av det ønskete amikacin (2,5 kg i en sats på 25 kg) vanligvis gikk tapt på grunn av nærværet av BB-Kll som koprodukt. Når amikacin fremstilles ved fremgangsmåten hvor derivatene ifølge oppfinnelsen anvendes, påvises BB-Kll typisk ikke i reaksjonsblandingen.

Denne fremgangsmåte omfatter at man

acylerer polysilylert kanamycin A eller B eller polysilylert kanamycin A eller B som inneholder en blokkerende gruppe som er forskjellig fra silyl, på 6'-aminogruppen, med et acylerende derivat av syren med den generelle formel (II):

hvor n er et helt tall fra 0 til 2 og B er en aminoblokkerende gruppe, i et stort sett vannfritt organisk løsningsmiddel, og at man deretter fjerner alle blokkerende grupper.

De blokkerende grupper som kan anvendes til beskyttelse

av 6'-aminogruppen på kanamycinet og aminogruppen på den acylerende syre (gruppe B i formel II) er konvensjonelle blokkerende grupper for beskyttelse av primære aminogrupper, og de er vel-kjent for fagfolk. Egnete blokkerende grupper omfatter alkoksy-karbonylgrupper, såsom tert-butoksykarbonyl og tert-amyloksy-karbonyl, aralkoksykarbonylgrupper som benzyloksykarbony1, cyklo-alkyloksykarbonylgrupper som cykloheksyloksykarbony1, halogen-alkoksykarbonylgrupper som trikloretoksykarbonyl, acylgrupper som ftaloyl og o-nitrofenoksyacetyl, samt andre kjente blokkerende grupper, såsom o-nitrofenyltiogruppen, tritylgruppen, etc.

Den acylerende syre med formelen (II) kan være i den (+)-eller (-)-isomere form eller en blanding av de to isomerer (d,l-formen), slik at det fremstilles den tilsvarende forbindelse med formelen (I), hvor 1-N-[u-amino-a-hydroksyalkanoyl]-gruppen er i sin (+)- [eller (R)]-form eller sin (-)- [eller (S)]-form, eller en blanding av disse.

Derivatet ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det har den generelle formel (!')• hvor Z er -0- eller -NH-, R' or H eller en silylgruppe med formelen Si (lavere alkyl)3, minst to og høyst ti R'-grupper er Si (lavere alkyl)^/ og R<1>' er R' eller en annen blokkerende gruppe enn en silylgruppe, og valgt blondt grupper med formlene

hvor R 1 og R 2 er like eller forskjellige, og hver er H, F* Cl, Br, NO^ 0H~, —lavere alkyl eller lavere alkoksy, X er Cl, Br, F. eller I, og Y er H, Cl, Br, F eller I.

Det acylerende derivat av syren med formelen (II) er fortrinnsvis en aktiv ester, fortrinnsvis dens aktive ester med N-hydroksyftalimid. Det acylerende derivat av syren med formelen (II) kan også være et blandet syreanhydrid, fortrinnsvis dens blandete syreanhydrid med pivalinsyre, benzoesyre, isobutylkarbonsyre eller benzylkarbonsyre.

Ved fremstilling av 1-N-|-L-(-)-v-amino-^-hydroksybutyryl|-kanamycin A eller et ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt av denne omfatter fremgangsmåten at man acylerer polysilylert kanamycin A med et blandet syreanhydrid av L-( - )-\'-benzyloksykarbonylamino-e*-hydroksysmørsyre (fortrinnsvis dens blandete syreanhydrid med pivalinsyre, benzoesyre, isobutyrlkarbonsyre eller benzylkarbonsyre) i et stort sett vannfritt organisk løsningsmiddel, 'og at man deretter fjerner alle blokkerende grupper.

Ved fremstilling av 1-N-[L-(-)-Y-amino-a-hydroksybutyry1]-kanamycin A eller et ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt av denne omfatter fremgangsmåten at man acylerer polysilylert kanamycin A som inneholder en karbobenzyloksygruppe på 6'-aminogruppen med et blandet syreanhydrid av L-(-)-y-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre (fortrinnsvis dens blandete syreanhydrid med pivalinsyre, benzoesyre, isobutylkarbonsyre eller benzylkarbonsyre) i et stort sett vannfritt organisk løsningsmiddel, og at man deretter fjerner alle blokkerende grupper.

Ved fremstilling av 1-N-[L-(-)-Y~amino-a-hydroksybutyry1]-kanamycin A eller et ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabelt syre-addis j onssalt av denne omfatter fremgangsmåten-at -man—acylerer - polysilylert kanamycin A med en aktiv ester av L-(-)-Y-benzyloksykarbony lamino-a-hydroksy smørsyre (fortrinnsvis dens aktive ester med N-hydroksysuccinimid, N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboks-imid eller N-hydroksyftalimid) i et stort sett vannfritt organisk løsningsmiddel, og at man deretter fjerner alle blokkerende grupper.

Ved fremstilling av 1-N-[L-(-)-Y-amino-a-hydroksybutyry1]-kanamycin A eller et ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabelt syre-addis jonssalt av denne omfatter fremgangsmåten at man acylerer polysilylert kanamycin A som inneholder en karbobenzyloksygruppe på 6<1->aminogruppen, med en aktiv ester av L-(-)-Y-benzyloksykarbony lamino-a-hydroksysmørsyre (fortrinnsvis dens aktive ester med N-hydroksysuccinimid, N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboks-imid eller N-hydroksyftalimid) i et stort sett vannfritt organisk løsningsmiddel og at man deretter fjerner alle blokkerende grupper.

I en foretrukket utførelsesform er derivatet polysilylert kanamycin A eller B (fortrinnsvis polysilylert kanamycin A) som inneholder et gjennomsnittlig antall silylgrupper (fortrinnsvis trimetylsilylgrupper) pr. molekyl på fra 4 til 8. I en annen foretrukket utførelsesform er derivatet polysilylert kanamycin A eller B (fortrinnsvis polysilylert kanamycin A) som inneholder en annen blokkerende gruppe enn silyl på 6'-aminogruppen og inneholder et gjennomsnittlig antall silylgrupper (fortrinnsvis trimetylsilylgrupper) pr molekyl på f.r_a_3_ til 7.

Betegnelsen "ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabelt syre-addis jonssalt" av en. forbindelse med formelen (I) betyr her et

nono-, di-, tri- eller tetrasalt dannet ved reaksjon mellom ett molekyl av en forbindelse med formelen (I) og 1-4 ekvivalenter av en ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabel syre. Disse syrer omfatter eddiksyre, saltsyre, svovelsyre, maleinsyre, fosfor-syre, salpetersyre, hydrobromsyre, askorbinsyre, eplesyre og sitronsyre, samt de andre syrer som vanligvis anvendes til fremstilling av salter av aminoholdige legemidler.

Acylering av det polysilylerte kanamycin A eller B (med eller uten en blokkerende gruppe som er forskjellig fra silyl på 6'-aminogruppen) kan vanligvis utføres i et organisk løsnings-middel som utgangsmaterialet har tilstrekkelig løselighet i. Disse materialer er godt løselige i de fleste vanlige organiske løs-ningsmidler. Egnete løsningsmidler er f.eks. aceton, dietylketon, metyl-n-propylketon, metylisobutylketon, metyletylketon, acetonitril, glyme, diglyme, dioksan, toluen, tetrahydrofuran, cykloheksanon, metylenklorid, kloroform, karbontetraklorid og blan-dinger av aceton/butanol eller dietylketon/butanol. Valget av løsningsmiddel avhenger av det spesielle utgangsmateriale som anvendes. Ketoner er vanligvis de foretrukne løsningsmidler.

Det mest fordelaktige løsningsmiddel for den spesielle kombinasjon av reaksjonsdeltakere som anvendes kan lettvint bestemmes ved rutineforsøk.

Egnete silyleringsmidler for anvendelse ved fremstilling av de polysilylerte kanamyciner omfatter silyleringsmidlene med de generelle formler:

5 6 1 hvor R , R og R er hydrogen, halogen, (lavere)alkyl, halogen-(lavere)alkyl eller fenyl, idet minst én av gruppene R 5 , R 6 og R 7 ikke er halogen eller hydrogen, R 4 er (lavere)alkyl, m er et helt tall på 1 eller 2 og X er halogen eller hvor R 8 er hydrogen eller (lavere)alkyl og R <9>er hydrogen, (lavere)alkyl eller

hvor R^, R^ og R7 har den ovenfor angitte betydning.

Spesifikke silylforbindelser med formlene IV og V er: trimetylklorsilan, heksametyldisilazan, trietylklorsilan, metyl-triklorsilan, dimetyldiklorsilan, trietylbromsilan, tri-n-pro-pylklorsilan, metyldietylklorsilan, dimetyletylklorsilan, di-metyl-t-butylklorsilan, fenyldimetylbromsilan, benzylmetylety1-klorsilan, fenyletylmetylklorsilan, trifenylklorsilan, trifenyl-fluorsilan, tri-o-tolylklorsilan, tri- p- dimety laminof enyJLklor-silan, N-etyltrietylsilylamin, heksaetyldisilazan, trifenylsilyl-amin, tri-n-propylsilylamin, tetraetyldimetyldisilazan, heksa-fenyldisilazan, heksa-p-tolyldisilazan, etc. Også heksaalkyl-cyklotrisilazaner og okta-alkylcyklotetrasilazaner er anvend-bare. Andre egnete silyleringsmidler er silylamider (såsom trialkylsilylacetamider og bis-trialkylsilylacetamider), silylurea såsom trimetylsilylurea samt silylureider. Også trimetylsily1-imidazol kan anvendes.

En foretrukket silylgruppe er trimetylsilylgruppen, og foretrukne silyleringsmidler for innføring av trimetylsilylgruppen er heksametyldisilazan, bis-(trimetylsilyl)-acetamid samt trimetylsilylacetamid. Heksametyldisilazan er det mest foretrukne.

Når det anvendes polysilylert kanamycin A eller B som inneholder en annen blokkerende gruppe enn silyl på 6<1->aminogruppen, kan dette fremstilles enten ved polysilylering av det ønskete 6'-N-blokkerte kanamycin A eller B, eller ved innføring av den ønskete 6'-blokkerende gruppe i polysilylert kanamycin A eller B.

Fremgangsmåter for innføring av silylgrupper i organiske forbindelser, inklusive visse aminoglykosider, er kjent på området. De polysilylerte kanamyciner (med eller uten en annen blokkerende gruppe enn silyl på 6'-aminogruppen) kan fremstilles ved i og for seg kjente fremgangsmåter eller slik som beskrevet i denne beskrivelse.

Betegnelsen polysilylert kanamycin A eller B refererer slik den er anvendt her til kanamycin A eller B som inneholder fra 2 til 10 silylgrupper i molekylet. Betegnelsen polysilylert kanamycin A eller B omfatter således ikke persilylert kanamycin A eller B, som ville inneholde 11 silylgrupper i molekylet.

Det nøyaktige antall silylgrupper som er til stede i de polysilylerte kanamycin-utgangsmaterialer (med eller uten en blokkerende gruppe som er forskjellig fra silyl på 6'-aminogruppen) eller deres stilling er ikke kjent. Det har vist seg at både undersilylering og oversilylering minsker utbyttet av det ønskete produkt og øker utbyttet av andre produkter. I tilfelle kraftig under- og oversilylering kan det bli dannet litt eller over hode ikke noe av det ønskete produkt. Den silyleringsgrad som vil gi det største utbytte av ønsket produkt vil avhenge av de spesielle reaksjonsdeltakere som anvendes i acyleringstrinnet. Den mest fordelaktige silyleringsgrad under anvendelse av en vilkårlig kombinasjon av reaksjonsdeltakere kan lettvint fastslåes ved rutineforsøk.

Ved fremstilling av 1-N- [ h-(-)-y-amino-a-hydroksybutyry1] - kanamycin A ved acylering av polysilylert kanamycin A med N-hydroksysuccinimidesteren av L-(-)-y-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre i acetonløsning har det vist seg at gode utbytter av det ønskete produkt oppnås ved anvendelse av polysilylert kanamycin A, som er blitt fremstilt ved omsetning av fra 4 til

5,5 mol heksametyldisilazan pr. mol kanamycin A. Større eller mTfrdr"é~~mÆngder héksame~tyldisilazan kan anvendes, men utbyttet

av det ønskete produkt i det etterfølgende acyleringstrinn minskes betraktelig. Ved den spesielle fremgangsmåte som er anført ovenfor, foretrekkes det å anvende fra 4,5 til 5,0 mol heksametyldisilazan pr. mol kanamycin med henblikk på oppnåelse av maksi-malt produktutbytte i acyleringstrinnet.

Det vil forståes at hvert mol heksametyldisilazan er i stand til å innføre to ekvivalenter av trimetylsilylgruppen i kanamycin A eller B. Både kanamycin A og B har ialt 11 stillinger (NH2- og OH-grupper) som kan silyleres, mens kanamycin A og B som inneholder en blokkerende gruppe som er forskjellig fra silyl på 6'-aminogruppen, har totalt 10 slike stillinger. 5,5 mol heksametyldisilazan pr. mol kanamycin A eller B kunne således teoretisk silylere alle OH- og N^-gruppene på kanamycinet fullstendig, mens 5,0 mol heksametyldisilazan fullstendig kunne silylere ett mol kanamycin A eller B som inneholder en blokkerende gruppe forskjellig fra silyl på 6'-aminogruppen. Det menes imidlertid at en så vidtgående silylering ikke finner sted med disse molare forhold innenfor rimelige reaksjonstidsrom, selv om høyere silyleringsgrader oppnås i løpet av et gitt reaksjonstidsrom når det tilsettes en silyleringskatalysator.

Silyleringskatalysatorer akselererer i høy grad silyler-ingshastigheten. Egnete silyleringskatalysatorer er velkjente på området og omfatter blant annet aminsulfater, f.eks. kanamycin-sulfat, sulfaminsyre, imidazol samt trimetylklorsilan. Silyleringskatalysatorer fremmer vanligvis en høyere silyleringsgrad enn det som er nødvendig.

Oversilylert kanamycin A eller B kan imidlertid anvendes som utgangsmateriale dersom det først behandles med et desilyleringsmiddel for minskning av silyleringsgraden før acyleringsreaksjonen utføres.

Gode utbytter av det ønskete produkt oppnås når man acylerer polysilylert kanamycin A fremstilt under anvendelse av et 5,5:1 molart forhold av heksametyldisilazan til kanamycin A. Når imidlertid kanamycin A silylert med et 7:1 molart forhold av heksametyldisilazan (eller med et 5,5:1 molart forhold under nærvær av en silyleringskatalysator) ble acylert i aceton med N-hydroksysuccinimidesteren av L-(-)-y-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksy-smørsyre, ble det oppnådd mindre enn 1% utbytte av det ønskete produkt. Når imidlertid samme "oversilylerte" kanamycin A ble acylert med samme acyleringsmiddel i acetonløsning, som var tilsatt vann (21 mol vann pr. mol kanamycin, 2,5% vann(vekt/volum) som desilyleringsmiddel 1 time før acyleringen, ble det oppnådd et utbytte på ca. 4 0% av det ønskete produkt. Samme resultater oppnås dersom vannet erstattes med metanol eller en annen aktiv hydrogenforbindelse som er i stand til å bevirke desilylering, f.eks. etanol, propanol, butandiol, metylmerkaptan, etylmerkaptan, fenylmerkaptan eller liknende.

Selv om det er vanlig å anvende tørre løsningsmidler når det arbeides med silylerte materialer, har det overraskende vist seg at tilsetning av vann til reaksjonsløsningsmidlet før acylering selv uten "oversilylering" ofte gir like gode utbytter og av og til bedre utbytter av ønsket produkt enn et tørt løsnings-middel. Ved acyleringsreaksjoner gjennomført i aceton i de vanlige konsentrasjoner på 10-20% (vekt/volum) av polysilylert kanamycin A, har det vist seg at meget høye utbytter av 1-N-[ h-(-)-y-amino-a-hydroksybutyryl]-kanamycin A ble oppnådd når det ble tilsatt inntil 28 mol vann pr. mol polysilylert kanamycin A. Ved en konsentrasjon på 20% er 28 mol pr. mol ca. 8% vann. Ved andre kombinasjoner av reaksjonsdeltakere kan sogar mer vann tolereres eller være gunstig. Acyleringsreaksjonen kan utføres i løsnings-midler som inneholder opptil ca. 4 0% vann, selv om man ved så

høye vannkonsentrasjoner må anvende korte acyleringstider for å

unngå for sterk desilylering av det polysilylerte kanamycin A

eller B utgangsmateriale. Følgelig er det hensikten med betegn-

elsen "stort sett vannfritt organisk løsningsmiddel" slik det er anvendt her å omfatte løsningsmidler som inneholder opptil ca.

25% vann. Et foretrukket intervall er opptil ca. 20%, et mer foretrukket intervall er opptil 8% vann, og et særlig fore-

trukket intervall er opptil ca. 4% vann.

Som anført ovenfor kan den mest ønskelige silylerings-

grad for en vilkårlig kombinasjon av acyleringsreaksjonsdeltakere lettvint bestemmes ved rutineforsøk. Det menes at det foretrukne gjennomsnittlige antall silylgrupper i utgangsmaterialet van-

ligvis vil være mellom 4 og 8 for kanamycin A eller B og mellom 3 og 7 for kanamycin A.eller B som inneholder en blokkerende

gruppe forskjellig fra silyl på 6'-aminogruppen, men dette er bare teori og betraktes ikke som en vesentlig del av oppfinnelsen.

Varigheten av og temperaturen under acyleringsreaksjonen

er ikke kritisk. Temperaturer i intervallet fra -30 til 100°C

kan anvendes ved reaksjonstider i området fra ca. 1 time og

"opptil en dag eller~mer. Det har vist seg at reaksjonen vanligvis forløper godt ved romtemperatur, og av bekvemmelighets grunner og økonomiske grunner foretrekkes det å utføre reaksjonen ved omgivel-sestemperatur. Med henblikk på oppnåelse av maksimale utbytter og selektiv acylering foretrekkes det imidlertid å utføre acyleringen ved fra 0 til 5°C.

Acylering av 1-aminogruppen i det polysilylerte kanamycin

A eller B (med eller uten en blokkerende gruppe som er forskjellig fra silyl på 6<1->aminogruppen) kan utføres med et vilkårlig acyl-eringsderivat av syren med formelen II, som er kjent på området at er egnet til acylering av en primær aminogruppe. Eksempler på egnete acyleringsderivater av den frie syre omfatter de tilsvarende syreanhydrider, blandete anhydrider, f.eks. alkoksymaursyreanhyd-rider, syrehalogenider, syreazider, aktive estre og aktive tio-estre. Den frie syre kan koples med det polysilylerte kanamycin-utgangsmateriale etter at den frie syre først er omsatt med N,N'-

dimetylkloroforminiumklorid [se britisk patentskrift 1.008.17 0

og Novak og Weichet, Experientia XXI, 6, 360 (1065)] eller ved anvendelse av et N,N<*->karbonyldiimidazol eller N,N<1->karbonyl-ditriazol (se sydafrikansk patentskrift 63/2684) eller et karbo-diimidreagens [særlig N,N<1->dicykloheksylkarbodiimid, N,N'-di-isopropylkarbodiimid eller N-cykloheksyl-N'-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid: se Sheenan og Hess, J.A.C.S., 77 1967 (1955)] , eller av et alkynylaminreagens [se R. Buijle og H.G. Viehe, angew. Chem. International Edition, 3, 582 (1964)] eller av et isoksazoliumsaltreagens [se R.B. Woodward, R.A. Olofson og H. Mayer, J. Amer. Chem. Soc, 83, 1010 (1961)] , eller av et keten-iminreagens [se CL. Stevens og M.E. Munk, J. Amer. Chem. Soc, 80, 4065 (1958)J eller av heksaklorcyklotrifosfatriazin eller heksabromcyklotrifosfatriazin (US-patentskrift 3.651.050) eller av difenylfosforylazid [DDPA, J. Amer. Chem. Soc., 94, 6203-6205

(1972)]] eller av dietylfosforylcyanid [DEPC, Tetrahedron Letters

nr. 18, sider 1595-1598 (1973)] eller av difenylfosfit [Tetrahedron Letters nr. 49, sider 5047-5050 (1972)]. Et annet derivat som er ekvivalent med syren er et tilsvarende azolid, dvs. et amid av den tilsvarende syre hvis amidnitrogen inngår i en quasiaroma-tisk 5-leddet ring som inneholder minst to nitrogenatomer, dvs. imidazol, pyrazol, triazolene, benzimidazol, benzotriazol og deres substituerte derivater. Som fagfolk vil forstå kan det av og til være Ønskelig eller nødvendig å beskytte hydroksylgruppen på det acylerte derivat av syren med formelen (II), f.eks. når det anvendes acyleringsderivater såsom et syrehalogenid. Beskyttelse av hydroksylgruppen kan utføres på måter som er kjent på området^—f—eks.—ved anvendelse av en karbobenzyloksygruppe, ved acetylering, ved silylering eller liknende.

Etter avslutning av acyleringsreaksjonen fjernes alle blokkerende grupper på i og for seg kjent måte til dannelse av det ønskete produkt med formelen (I). Silylgruppene kan f.eks. lettvint fjernes ved hydrolyse med vann, fortrinnsvis ved lav pH-verdi. Også den blokkerende gruppe B på acyleringsderivatet av syren med formelen (II) og den blokkerende gruppe på 6'-aminogruppen på det polysilylerte kanamycin-utgangsmateriale (dersom denne er til stede) kan fjernes ved hjelp av kjente metoder. Således kan en tert-butoksykarbonylgruppe fjernes under anvendelse av maursyre, en karbobenzyloksygruppe ved katalytisk hydrogenering, en 2-hydroksy-l-naftkarbonylgruppe ved sur hydrolyse, en triklor-etoksykarbonylgruppe ved behandling med sinkstøv i iseddik, ftaloyl-i 78 timer. Den gule, klare løsning (pH 7,0) ble tynnet med 100 ml vann. Blandingens pH-verdi ble innstilt på 2,8 (3N HCl), og blandingen ble omrørt kraftig ved 23°C i 15 minutter. Den vandige fase ble fraskilt, og den organiske fase ble ekstrahert med 50

ml vann med pH 2,8. De kombinerte vandige fraksjoner ble vasket med 50 ml etylacetat. Løsningen ble anbrakt i en 500 ml Parr-flaske sammen med 5 g 5% palladium-på-karbon katalysator og redusert ved 3,4 atm. H2 i 2 timer ved 23°C. Blandingen ble filtrert gjennom et lag "Dicalite" som deretter ble vasket med ytterligere 30 ml vann. Det fargeløse filtrat ble konsentrert under vakuum (40-45°C) til 50 ml. Løsningen ble fyllt på en 5 x 100 cm "CG-50" (NH4<+>) ionebytterkolonne. Etter vasking med 1000 ml vann ble ikke-reagert kanamycin A, 3-[l-(-)-y-amino-a-hydroksy-butyry lj-kanamycin A (BB-K29) og amikacin eluert med 0,5 N ammoniumhydroksyd. Polyacylmateriale ble utvunnet med 3N ammoniumhydroksyd. Bioanalyse, tynnsjiktskromatografi og optisk dreining ble anvendt for registrering av elueringens fremadskridelse. Volumet og den iakttatte optiske dreining for hver eluatfraksjon samt vekten og det prosentuelle utbytte av fast stoff isolert fra hver fraksjon ved inndamping til tørr tilstand er sammenfattet nedenfor:

Det brukte dietylketonsjikt viste seg ved meget effektiv væskekromatografi å inneholde ytterligere 3-5% amikacin.

Det rå amikacin (6,20 g) ble løst i 20 ml vann og tynnet med 20 ml metanol, og 20 ml isopropanol ble tilsatt for å frembringe krystallisasjon. Det ble oppnådd 6,0 g (45,8%) krystallinsk amikacin.

Eksempel 2

Fremstilling av 1-N-[l-(-)-y-amino-a-hydroksybutyryl] -kana-* mycin A, amikacin, ved selektiv acylering av poly-(trimetylsilyl) 6'-N-karbobenzyloksykanamycin A i vannfri aceton.

103 g (0,081 mol, regnet som 6<1->N-karbobenzyloksykanamycin

A (silyl) g) poly-(tr ime tyl silyl)-6 ' -N-karbobenzyloksy kanamycin A fremstilt som i eksempel 1 ble løst i 100 ml tørr aceton ved 23°C. 35,24 g (0,085 mol) L-(-)-y-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre-N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimidester (NAE) løst i 100 ml tørr aceton ved 23°C ble langsomt tilsatt under god omrøring til løsningen av poly-(trimetylsilyl)-61 - N-karbobenzyloksykanamycin A i løpet av et tidsrom på 15 minutter. Løsningen ble omrørt ved 23°C i 20 timer under nitrogenatmosfære. Den blekgule, klare løsning (pH 7,2) ble tynnet med 100 ml vann. Blandingens pH-verdi ble innstilt på 2,5 (3N HCl), og omrøringen ble fortsatt ved 23°C i 15 minutter. Aceton ble fjernet under anvendelse av dampejektorvakuum ved ca. 3 5°C. Løsningen ble anbrakt i en 500 ml Parr-flaske sammen med 10 g 5% palladium-på-karbon katalysator (Engelhard) og redusert ved 2,72 atm. H2 i 2 timer ved 23 C. Blandingen ble filtrert gjennom et lag diatoméjord som deretter ble vasket med ytterligere 50 ml vann. Etter konsentrering til ca. 1/3 volum ble løsningen (pH 6,9-7,2) fyllt i en 6 x 110 cm "CG-50" (NH^<+>) ionebytterkolonne og eluert med en trinnvis gradient fra H20 til 0,6 N ammoniumhydroksyd for ut-vinnelse av amikacin. Et automatisk polarimeter ble anvendt for registrering av elueringens fremadskridelse. Kombinasjoner ble foretatt på basis av tynnsjiktskromatografivurdering. De kombinerte amikacinfraksjoner ble konsentrert til 25-30% tørrstoff. Løs-ningen ble tynnet med et like stort volum metanol, etterfulgt av 2 volumer isopropanol for å frembringe krystallisasjon. Det ble utvunnet 18,2 g (40%) krystallinsk amikacin.

Utvinningen av 12% kanamycin A, 40% BB-K29 og 5% polyacylert kanamycin ga en materialbalanse på 97%.

Eksempel 3

Fremstilling av 1-N- [L-(-)-y-amino-a-hydroksybutyryl] - kanamycin A, amikacin, ved selektiv acylering av poly-(trimetylsilyl) -kanamycin A under anvendelse av blokkering in situ.

A. Poly-( trimetylsilyl)- kanamycin A.

Kanamycin A fri base (18 g aktivitet, 37,15 mmol) ble oppslemmet i 200 ml tørr acetonitril og oppvarmet til tilbakekjøling. 29,8 g (184,6 mmol) heksametyldisilazan ble tilsatt i løpet av 30 minutter, og blandingen ble omrørt med tilbakekjøling i 78 timer, hvorved det-ble-oppnådd en__lysegul, klar løsning. Fjerning av løsningsmidlet under vakuum etterlot 43 g [94%, regnet som kanamycin A (silyl) 1Q] av en amorf-, fast rest.

B. 1-N- [.L- (-)- y- amino- g- hydroksybutyryl] - kanamycin A.

5,56 g (20,43 mmol) p-(benzyloksykarbonyloksy)-benzoesyre ble oppslemmet i 50 ml tørr acetonitril ved 23°C. 8,4 g (41,37 mmol) N,0-bis-trimetylsilylacetamid ble tilsatt under god omrøring. Løsningen ble holdt ved 23°C i 30 minutter og ble deretter i løpet av 3 timer under kraftig omrøring tilsatt til en løsning av 21,5 g (17,83 mmol, regnet som (silyl)1Q-forbindelsen) av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A i 7 5 ml tørr acetonitril ved 23°C. Blandingen ble omrørt i 4 timer, løsningsmidlet ble fjernet under vakuum (40°C), og den oljeaktige rest ble løst i 50 ml tørr aceton ved 23°C.

8,55 g (20,63 mmol) L-(-)-y-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre-N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarbokimidester (NAE) i 30 ml aceton ble tilsatt til løsningen ovenfor i løpet av et tidsrom på 5 minutter. Blandingen ble holdt ved 23°C i 78 timer. Løsningen ble tynnet med 100 ml vann, og pH-verdien

(7,0) ble senket til 2,5 (6N HCl). Blandingen ble anbrakt i en 500 ml Parr-flaske sammen med 3 g 5% palladium-på-karbon katalysator (Engelhard) og redusert ved 2,7 2 atm. H2 i 2 timer ved 23°C. Blandingen ble filtrert gjennom et lag diatoméjord som deretter ble vasket med 20 ml vann. Det ble ved mikrobiologisk analyse overfor E. coli påvist at det kombinerte filtrat og vaskevann (168 ml) inneholdt ca. 11.400 mcg/ml (19% utbytte) amikacin.

Eksempel 4

Fremstilling av 1-N-[L-(-)-y-amino-a-hydroksybutyryl] -kanamycin A, amikacin, ved selektiv acylering av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A.

A. Poly- ( trimetylsilyl)- kanamycin A.

En suspensjon av 10 g (20,6 mmol) kanamycin A i 100 ml tørr acetonitril og 25 ml (119 mmol) 1,1,1,3,3,3-heksametyldisilazan ble kokt med tilbakekjøling i 72 timer. Løsningen ble inndampet til tørr tilstand under vakuum ved 3 0-4 0°C. Det ble oppnådd 21,3

g poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A som et lyst, gulbrunt, amorft pulver [85% utbytte regnet som kanamycin A (silyl)^g]•

B. 1- N- LL-(-)- y- amino- a- hydroksybutyryl] - kanamycin A.

Til en løsning av 2,4 g (2,0 mmol) poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A i 3 0 ml tørr aceton ble det langsomt tilsatt 2,0 mmol L-(-)-y-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre-N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimidester (NAE) i 10 ml tørr aceton ved 0-5°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 23°C i 1 uke og deretter inndampet til tø£r tilstand under vakuum ved en badtemperatur på 30-40°C. Det ble deretter tilsatt 60 ml vann til resten etterfulgt av 7 0 ml metanol for å frembringe en løsning. Løsningen ble surgjort med 3N HCl til pH 2,0 og deretter redusert ved 3,4 0 atm. H2 i 2 timer under anvendelse av 500 mg 5% palladium-på-karbon katalysator. Materialet ble filtrert, og det ble ved mikrobiologisk analyse overfor E. coli påvist at kombinert filtrat og vaskevæske inneholdt amikacin i et utbytte på 29,4%.

Eksempel 5

Fremstilling av amikacin ved selektiv N-acylering av polytrimetylsilyl- 6'- N- karbobenzoksykanamycin A i vannfri aceton.

I. Sammendrag.

Silylering av 6'-N-karbobenzoksykanamycin A i acetonitril under anvendelse av heksametyldisilazan (HMDA) gir 6'-N-karbobenzoksykanamycin A (silyl)g-mellomproduktet © . Dette silylerte kanamycin A er lettløselig i de fleste organiske løsningsmidler. Acylering med NAE i vannfri aceton ved 23°C av et 5% molart overskudd av-NAE-i., f or ho ld til det anvendte 6'-N-Cbz kanamycin A ga en blanding som bare inneholdt Cbz-derivater av amikacin og BB-K29, noe uomsatt kanamycin A og noe polyacylmateriale. Det kunne ikke påvises BB-Kll ved noen av disse undersøkelser. Eluering av en acetonacyleringsblanding etter reduksjon og opp-arbeidelse fra en "CG-50" (NH4<+>) kolonne under anvendelse av en ammoniumhydroksydgradient ga isolerte utbytter av ren amikacin i området omkring 4 0%.

II. Reaksjonsskjemaer. A. III. Materialer

IV. Sikkerhet

6'- N- Cbz Kana A - Ingen direkte opplysninger tilgjengelig. Unngå støvkontakt.

Acetonitril - Behandles som et cyanid. Unngå

innånding av damper. Kan forårsake hudirritasjon.

Heksametyldisilazan - Irritasjonsfremkallende,

( HMDS) omgås med forsiktighet.

6'-N-Cbz Kana A (silyl)Ingen direkte opplysninger tilgjengelig, omgås med forsiktighet.

BHBA - Toksisitet ikke fastslått.

Unngå eksponering for fast stoff. —HONB = Toksisitet ukjent. Utvis forsiktighet under håndtering.

DCC - Alvorlig hud- og øye-irriterende. Unngå inhalering av tåke eller

damper. Toksisk.

Aceton - Brennbar. Inhalering kan frem-kalle hodepine, tretthet, opp-hisselse, bronkial irritasjon og i store mengder narkose.

NAE - Ingen direkte informasjon tilgjengelig, anvendes alltid direkte

som oppløsning i aceton.

Metanol - Brennbar. Forgiftning kan inntreffe ved svelging, inhalering eller perkutan absorpsjon.

Isopropanol - Brennbar. Svelging eller inhalering av store mengder av dampene kan forårsake hodepine, svimmelhet, mental depresjon, oppkast, narkose.

Ammoniumhydroksyd - Toksiske damper. Bær maske, unngå

kontakt med væske.

" CG- 50" ( NH. + ) - Ingen toksisitetsdata tilgjengelig,

omgås med forsiktighet.

V. Fremgangsmåte

A. Fremstilling av 6'-N-karbobenzyloksykanamycin A (silyl)g

[6'-N-Cbz Kana A (silyl) g]

1. 50 g 6<1->N-karbobenzyloksykanamycin A (KF<4%) oppslemmes i 300 ml acetonitril (KF< 0,01%). Oppslemmingen bringes til koking ved tilbakekjøling (74°c) mens det opprettholdes en strøm av tørr nitrogen gjennom oppslemmingen. 2. I løpet av et tidsrom på 3 0 minutter tilsettes det langsomt 75,8 ml heksametyldisilazan (HMDS). Fullstendig opp-løsning vil inntreffe med utvikling av ammoniakkgass. 3. Tilbakekjøling fortsettes i 18-20 timer under nitrogengjennomblåsing. 4. Den klare, lysegule løsning konsentreres under vakuum (badtemperatur 4 0-50°C) til et skumliknende fast stoff. Utbytter av silylg-forbindelsen 89-92 g (90-94% av teoretisk utbytte).

NB: For fremtidig referanse. I andre løsningsmiddelsunder-søkelser isoleres dette faste stoff vanligvis ikke, men anvendes direkte til acyleringen.

B. Fremstilling av N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimidester av L-(-)-y-karbobenzyloksyamino-a-hydroksy-smørsyre ( NAE)

1. 21,5 g L-(-)-y-karbobenzyloksyamino-a-hydroksysmørsyre (BHBA) løses i 100 ml tørr aceton ved 23°C og deretter 15,2 g N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimid (HOMB). Det oppnås en fullstendig oppløsning. 2. I løpet av 30 minutter tilsettes det en løsning av 17,48 g dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i 50 ml aceton under omrøring. Temperaturen vil stige til ca. 4 0°C under tilsetningen ved utfelling av dicykloheksylurea (DCU). 3. Oppslemmingen omrører i 3-4 timer idet temperaturen tillates å utlignes til 23-25°C. 4. Ureaderivatet fjernes ved filtrering. Filterkaken vaskes med 30 ml aceton. Filtratet pluss vaskevæskene oppbevares til acyleringstrinnet nedenfor.

C. Acylering av 6'-N-Cbz Kana A (silyl)g.

1. 6'-N-Cbz Kana-A (silyl)g isolert under del A, trinn 4, løses i 100 ml tørr aceton ved 23-24 c. 2. Langsomt og under god omrøring tilsettes den under del B fremstilte NAE-løsning i løpet av et tidsrom på 15 minutter. Temperaturen vil gradvis stige til ca. 40°C. Løsningen tillates å komme i likevekt ved 23°C og omrøringen fortsettes i 18-20 timer under nitrogenatmosfære. 3. 100 ml vann tilsettes og pH-verdien (6,9-7,2) senkes til 2,2-2,5 med 6N saltsyre. Det omrøres i 15 minutter ved 23°C. (NB: Et ytterligere sjikt kan dannes. Dette gir ikke noe problem ved opparbeidelsen). 4. Aceton fjernes under vakuum ved en badtemperatur på 30-35°C. Konsentratet overføres til en passende hydrogeneringsbeholder (på forhånd gjennomblåst med nitrogen). 10 g 5% palladium-på-karbon katalysator tilsettes, og det hydrogeneres ved 2,72 atm. i 2-3 timer. 5. Blandingen filtreres gjennom et "Dicalite"-lag og hydrogeneringsbeholderen og filterkaken vaskes med ytterligere 5 0 ml vann. 6. Filtratet pluss vaskevæsken konsentreres til ca. 1/3

av volumet (50 ml) under vakuum ved 4 0-4 5°C.

7. pH-verdien kontrolleres. Den bør ligge i intervallet 6,9-7,2. Dersom ikke innstilles den med IN ammoniumhydroksyd. Blandingen fylles på en "CG-50" (NH4<+>) kolonne (6 x 110 cm). 8. Søylen vaskes med 1000 ml avionisert vann. Deretter elueres det med 0,5-0,6 N ammoniumhydroksyd under anvendelse av et automatisk polarimeter for registrering av elueringens fremad- ~ skridelse~. "Elueringsrekkefølgen er som følger:

Det ble ikke påvist noe BB-Kll ved noen av acylerings-opparbeidelsene. Polyacylmateriale, dvs. 1,3-diAHBA-analogen til kana A, utvinnes ved utvasking av kolonnen med 3N ammoniumhydroksyd. 9. Amikacin-fraksjonene kombineres og konsentreres til 25-3 0% tørrstoff. Det tynnes med 1 volum metanol og podes med amikacinkrystaller. 10. Langsomt tilsettes det i løpet av 2 timer 2 volumer isopropanol (IPA) under god omrøring, og krystalliseres ved 23°C i 6-8 timer. 11. Det faste stoff frafiltreres, vaskes med 50 ml 1:1:2 vann/metanol/IPA-blanding og til slutt med 25 ml IPA. 12. Det tørkes under vakuum ved 40°C i 12-16 timer. Utbytte: 17,3-19,0 g (38-42%) amikacin med følgende egenskaper:

Tynnsj iktskromatografi.

CHCl3-metanol - NH^OH - vann (1:4:2:1), 5 x 20 cm silikagelplater fra Quantum Industries - én sone som påvist med nin-hydrin (RF~ 0,4).

Spesifikk dreining.

13. Utvinningen av BB-K29 i dette system var også 3 9-4 2%, restkana A 10-14% og 1,3-diAHBA-kana A ca. 5%, noe som gir en materialbalanse på over 95%.

Eksempel 6

Fremstilling av amikacin ved selektiv N-acylering av poly-trlmetylsilyl kana A i vannfri aceton.

I. Sammendrag.

Silylering av kana A "base" i acetonitril under anvendelse av heksametyldisilazan (HMDA) ga polytrimetylsilyl kana A. Silyleringsgraden er ennå uviss, men antas for tiden å være kana A (silyl)^q. Polysilylert kana A er lettløselig i de fleste organiske løsningsmidler. Acylering med SAE i vannfri aceton ved 23°C under anvendelse av et 1:1 molart forhold av SAE til anvendt kana A ga en blanding som inneholdt Cbz-derivater av amikacin og BB-K29, vanligvis i forholdet 2-3/1, BB-K6 (5-8%), uomsatt kana A (15-20%) samt noe polyacylmateriale (5-10%). Liksom det var tilfellet ved det tidligere arbeid med acylering av polytrimetylsilyl-6<1->N-karbobenzoksy kana A ble det ikke påvist noe BB-Kll ved noen av disse forsøk. Reduksjon og opp-arbeidelse av en acetonacyleringsblanding etterfulgt av kromato-grafi i en "CG-50"-(NH^<+>) kolonne under anvendelse av 0,5 N ammoniumhydroksyd ga isolert krystallinsk amikacin i området 34-39%.

II. Reaksjonsskjemaer. A. III. Materialer

IV. Sikkerhet

Kana A " base" - Kjent legemiddel - vanlig

forsiktighet tilrås.

Kana A (silyl) .. - Ingen direkte opplysninger tilgjengelig, omgås med forsiktighet.

Andre materialer - Se eksempel 5.

V. Fremgang små te

A. Fremstilling av Kana A (silyl)^q.

1. 50 g kana A "base" (KF 2,5-3,5%) oppslemmes i 500 ml aceton (KF<0,01%). Oppslemmingen bringes til tilbakekjøling (74°C) mens det opprettholdes en strøm av tørr nitrogen gjennom oppslemmingen. 2. I løpet av 3 0 minutter tilsettes det langsomt 112 ml heksametyldisilazan (HMDS). Fullstendig oppløsning vil inntreffe innen 4-5 timer med utvikling av ammoniakkgass. 3. Koking med tilbakekjøling fortsettes i 22-26 timer under nitrogengjennomblåsing. 4. Den klare, svakt gule løsning konsentreres under vakuum (40°C) til en tyktflytende rest. Det skylles med ytterligere 100 ml acetonitril og tørkes fullstendig under høyvakuum i 3-6 timer. Utbytte av hvitaktig, amorft, fast stoff er 109-115 g (90-95% av det teoretiske, regnet som kana A (silyl)^q)• B. Fremstilling av N-hydroksysuccinimidester av L-(-)-a-karbobenzyloksyamino- ct- hydroksysmørsyre ( SAE. 1. 100 g L-(-)-a-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre (BHBA) og 4 5,38 g N-hydroksysuccinimid (N-HOS) løses i 13 00 ml etylacetat (KF<0,05%) under omrøring ved 23°C. 2. 81,29 g dicykloheksylkarbodiimid (DCC) løses i 400 ml

etylacetat (KF<0,05%) ved 23°C. Under god omrøring tilsettes denne løsning i løpet av 3 0 minutter til løsningen fra trinn 1. Temperaturen vil stige til 4 0-42°C under samtidig utfelling av dicykloheksylurea (DCU).

Oppslemmingen omrøres i 3-4 timer hvorved temperaturen tillates å likevektsinnstilles på 23°C. 3. DCU f raf Utreres og filterkaken vaskes med 250 ml etylacetat (KF< 0,05%). DCU-kaken kastes mens filtratet og vaskevæskene oppbevares.

4. Filtratet pluss vaskevæskene konsentreres til ca. 500

ml (under vakuum ved 3 0-3 5°C). Litt produkt vil utkrystalliseres.

5. Konsentratet overføres til en passende beholder og under kraftig omrøring tilsettes det 100 ml heptan. Om nødvendig tilsettes SAE-podekrystaller. Krystallisasjon vil begynne nesten øyeblikkelig. Oppslemmingen omrøres i 30 minutter ved 23°C. 6. I løpet av 30 minutter tilsettes det 400 ml heptan, og oppslemmingen omrøres 4-5 timer ved 23°C. 7. Kaken filtreres og vaskes med 200 ml 3:1 heptan/etylacetat etterfulgt av 100 ml heptan. 8. Det tørkes i en vakuum-ovn ved 30-35°C i 18-20 timer.

Utbyttet er 110,1-131,4 g (80-95%).

Smp. : 119-120°C med mykning ved 114°C (korr.) Tynnsjiktskromatografi: 4 aceton:12 benzen:l CH^CO-H - på-visning 1% vandig KMO^.

Rf: 0,7 for SAE, 0,2 BHBA på 2 x 10 cm formerkete silikagelplater fra Analtech Inc.

C. Acylering av Kana A (silyl) ^q.

1. Det under avsnitt A, trinn 4, isolerte kana A (silyl) løses i 100 ml tørr aceton ved 23°C.

2. Hurtig og under god omrøring tilsettes det under avsnitt

B fremstilte SAE (35,03 g) som en 10 prosentig løsning i tørr aceton i løpet av 5-10 minutter. Temperaturen vil stige ca. 5°C. Løsningen tillates å likevektsinnstilles på 23°C, og omrøring fortsettes i 18-20 timer.

3. Den lysorange, klare løsning tynnes med 400 ml vann,

og pH-verdien (7,0-7,5) senkes til 2,2-2,5 med 3N saltsyre.

Den klare løsning omrøres nå ved 23°C i 15-30 minutter.

4. Aceton fjernes under vakuum ved en badtemperatur på 3 0-35°C (en liten materialmengde kan utskilles på dette tidspunkt, men betyr ikke noe problem). Konsentratet overføres til en passende hydrogeneringsbeholder. Det tilsettes 10 g palladium-på-karbon katalysator, og det hydrogeneres ved 3,4 0 atm. i 2-3 timer. 5. Blandingen filtreres gjennom et "Dicalite"-lag, og hydrogeneringsbeholderen og filterkaken vaskes med ytterligere

2 x 50 ml vann.

6. Filtratet pluss vaskevæskene konsentreres til ca en tredjedel av volumet (150-165 ml) under vakuum ved 40-45°C. 7. pH-verdien ligger på dette tidspunkt i intervallet 6,0-7,0. Blandingen helles i en "CG-50" (NH4<+>) kolonne (6 x 110 cm). 8. Kolonnen vaskes med 1000 ml avionisert vann. Det elueres med 0,5 N ammoniumhydroksyd under anvendelse av et automatisk polarimeter for overvåkning av elueringens fremadskridelse. Elueringsrekkefølgen er som følger:

Rest kana A BB-K6 BB-K29 amikacin.

Det ble ikke påvist noe BB-Kll ved noen av forsøkene.

9. Amikacinfraksjonene kombineres og konsentreres til 25-3 0% tørrstoff. Det tynnes med 1 volum metanol og podes med amikacinkrystaller. 10. I løpet av 2 timer tilsettes det langsomt 2 volumer IPA under god omrøring, og det krystalliseres ved 23°C i 6-8 timer. 11. Det faste stoff filtreres og vaskes med 35 ml 1:1:2 vann/metanol/IPA og til slutt med 3 5 ml IPA. 12. Det tørkes i en vakuum-ovn ved 40°C i 16-24 timer.

Utbytte: 19,91-22,84 g (34-39%). IR-, PMR- og CMR-spektral-data samt spesifikk dreining var fullstendig<1>overensstemmelse med den ønskete struktur.

Tynnsjiktskromatografisystem

CHCl3/metanol/NH4OH/vann (1:4:2:1) 5 x 20 cm silikagelplater fra Quantum Industries, 1 sone amikacin med Rf~ 0,4 (ninhydrin-påvisning).

Eksempel 7

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -6 ' -N-Cbz-kana A i tetrahydrofuran med blandet syreanhydrid av pivalinsyre og BHBA.

A. Fremstilling av blandet anhydrid.

5,066 g (20,0 mmol) BHBA, 4,068 g (20,0 mmol) BSA og 2,116 g (22,0 mmol) etylamin ble løst i 200 ml sikttørket tetrahydrofuran. Løsningen ble kokt med tilbakekjøling i 2 1/4 time og deretter avkjølt til -10°C. 2,412 g (20,0 mmol) pivaloylklorid ble tilsatt i løpet av 2-3 minutter under omrøring, og omrøringen ble fortsatt i 2 timer ved -10°C. Temperaturen fikk deretter stige til 23°C.

B. Acylering av poly-( trimetylsilyl)- 6'- N- Cbz kana A.

5,454 g (4,97 mmol, regnet som 6'-N-Cbz kana A (silyl)g) poly-(trimetylsilyl)-6<1->N-Cbz kana A fremstilt som i eksempel 1 ble løst i 50 ml tørr (molekylsikt) tetrahydrofuran ved 23°C. Halvparten av den i trinn A ovenfor fremstilte løsning av

blandet anhydrid (10,0 mmol) ble tilsatt i løpet av 20 minutter under omrøring, og omrøringen ble fortsatt i 7 dager.

Deretter ble det tilsatt 100 ml vann til reaksjonsblandingen, og pH (5,4) ble innstilt på 2,0 med 3 M H2S04- Omrøring ble fortsatt i 1 time, og løsningen ble ekstrahert med etylacetat. Polyacylert materiale begynte å krystallisere ut, så reaksjonsblandingen ble filtrert. Etter tørking over P2°5 veiet det ut~ vunnete faste stoff 0,702 g. Ekstraksjonen av reaksjonsblandingen ble fortsatt i totalt 4 x 7 5 ml etylacetat, hvoretter overskytende etylacetat ble drevet bort fra det vandige sjikt. En aliquot av den vandige løsning ble underkastet analyse ved hjelp av HPLC. Den resulterende kurve indikerte et utbytte på 26,4% av di-Cbz amikacin.

Det vandige sjikt ble deretter hydrogenert i et Parr-apparat ved 3,4 0 atm. H2~trykk i 2 timer under anvendelse av 0,5 g 10% Pd-på-karbon katalysator. Materialet ble filtrert, og det ble påvist overfor E. coli at kombinert filtrat og vaskevæsker inneholdt et 31,2% utbytte av amikacin. Amikacin/BB-K29-forholdet var ca. 9-10:1. Spor av polyacyl og ureagert kana A forelå.

Eksempel 8

Innvirkning av vann for fremstillingen av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl)-kana A i acetonløsning ved 23°C.

A. Vannfritt løsningsmiddel.

2,40 g (2,0 mmol, regnet som kana A (silyl)1Q) poly-(trimetylsilyl) kana A fremstilt som i eksempel 3 ble løst i 20 ml aceton som var blitt tørket med en molekylsikt. Løsningen ble omrørt ved 23°C, og en løsning av 0,701 g (2,0 mmol) SAE i 10 ml sikttørket aceton ble tilsatt i løpet av 10 sekunder. Omrøring ble fortsatt ved 23°C i 22 timer. Det ble tilsatt 50 ml vann,

og pH (7,5) ble innstilt på 2,5. Acetonen ble avdampet under vakuum ved 4 0°C, og den vandige løsning ble deretter redusert ved et H2~trykk på 3,47 atm. ved 23°C i 2 timer under "anvendelse av 1,0 g 10% Pd-på-karbon som katalysator. Mikrobiologisk analyse viste et 31,24% utbytte av amikacin.

B. Løsningsmiddel tilsatt vann.

Trinn A ovenfor ble gjentatt, bortsett fra at 1,0 ml (56 mmol) vann ble tilsatt til løsningen av poly-(trimetylsilyl)-kana A,

og det ble omrørt i 15 minutter før acylering med SAE. Mikrobiologisk analyse viste et utbytte på 33,80% amikacin.

Eksempel 9

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -6 1 -N-Cnz kana A i aceton med det blandete anhydrid av BHBA og isobutylkarbonsyre.

A. Fremstilling av blandet anhydrid.

1,267 g (5,0 mmol) BHBA og 1,313 g (10,0 mmol) N-trimetylsilylacetamid (MSA) i 20 ml sikttørket aceton ble omrørt ved 23°C, og 0,70 ml (5,0 mmol) trietylamin (TEA) ble tilsatt. Blandingen ble kokt med tilbakekjøling under ^-atmosfære i 2\ time. Blandingen ble avkjølt til -20°C, og 0,751 g (0,713 ml, 5,50 mmol) isobutylklorformiat ble tilsatt. Trietylaminhydroklorid begynte umiddelbart å utskilles. Blandingen ble omrørt i 1 time ved -20°C.

B. Acylering.

6,215 g (4,9 mmol, regnet som (silyl)^-forbindelsen) poly-(trimetylsilyl)-6'-N-Cbz-kana A fremstilt som i eksempel 1 ble løst i 20 ml sikttørket aceton under omrøring ved 23°C. Løsningen ble avkjølt til -20°C, og den kalde løsning av blandet anhydrid fra trinn A ble langsomt tilsatt i løpet av 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere lh time ved -20°C og deretter i 17 timer ved 23°C. Reaksjonsblandingen ble deretter helt i 150 ml vann ved 23°C under omrøring, pH (7,75) innstilt på 2,5 med 3N HCl, og omrøring ble fortsatt i 15 minutter. Aceton ble deretter avdampet under vakuum ved 4 0°C. En aliquot av den resulterende vandige løsning ble underkastet analyse ved hjelp av HPLC. Den resulterende kurve viste et utbytte på 34,33% di-Cbz-amikacin.

Hovedparten av den vandige løsning ble redusert ved 3,4 0 atm. H2~trykk ved 23°C i 3 1/4 time under anvendelse av 2,0 g Pd/C katalysator. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og ved mikrobiologisk analyse overfor E. coli ble det påvist at kombinert filtrat og vaskevæsker inneholdt et utbytte på 3 5,0% amikacin.

Eksempel 10

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl)- 6'- N- Cbz- kana A i 3- pentanon.

30 g (23,65 mmol, regnet som 6'-N-Cbz-kana A (silyl)g) poly-(trimetylsilyl)-6'-N-Cbz-kana fremstilt som i eksempel 1

og løst i 100 ml sikttørket 3-pentanon ble omrørt ved 23°C, og NAE (26,02 mmol, 10% overskudd) ble tilsatt i løpet av 40 minutter. Omrøring ble fortsatt i 113 timer ved 23°C, og blandingen ble deretter tilsatt til 250 ml vann under kraftig omrøring. pH (7,3) ble innstilt på 2,5 med 3N HCl, hvoretter blandingen ble omrørt i ytterligere 3 0 minutter og 3-pentanon avdrevet under vakuum ved 40°C. Den vandige løsning ble ekstrahert med 4 x 100 ml etylacetat. En aliquot av den vandige løsning ble deretter underkastet analyse ved hjelp av HPLC. Den resulterende kurve viste et utbytte på 4 6,12% di-Cbz-amikacin.

Hovedparten av den vandige reaksjonsblanding ble redusert ved 3,47 atm. H2_trykk ved 23°C i 2\ time under anvendelse av 3,0 g 10% Pd/C katalysator. Mikrobiologisk analyse av en aliquot av kombinert filtrat og vaskevæsker viste et utbytte på 4 0,24% amikacin. Hovedparten av den reduserte, vandige reaksjonsblanding ble deretter konsentrert under vakuum ved 40°C til ca. 100 ml og fraksjonert i en "CG-50" (NH4<+>) ionebytterkolonne (ca. 10 cm x ca. 120 cm, inneholdende ca. 10 liter harpiks). Den vandige løsning ble helt i kolonnen som ble vasket med 5 liter vann, og materialet ble eluert med 0,5N NH^OH, etterfulgt av 3N NH^OH

for eluering av polyacylerte produkter. Polarimetri av fraksjonene viste et utbytte på 4 2,7% amikacin, et utbytte på 12,0% ureagert kanamycin A, et utbytte på 12,4% polyacylert materiale og et utbytte på 23,2% BB-K29.

Eksempel 11

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -6 ' -N-Cbz-kana A i vannfri cykloheksanon i varierende tidsrom.

A. 2,537 g (2,0 mmol, regnet som 6<1->N-Cbz-kana A (silyl)g) poly-(trimetylsilyl)-6'-N-Cbz-kana A fremstilt som i eksempel 1

og løst i 3 00 ml tørr cykloheksanon ble acylert i 20 timer ved 23°C med en NAE-løsning i tørr cykloheksanon (10,8 ml av en 0,1944 mmol/ml løsning, 2,10 mmol). Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt til 150 ml vann under omrøring, og pH (5,6) ble innstilt på 2,5 med 3N HCl. Cykloheksanonen ble avdampet under

vakuum ved 4 0°C, og en aliquot av den resterende vandige fase ble tatt ut for analyse ved hjelp av HPLC.

Hovedparten av den vandige fase ble redusert under 3,4 0 atm. H2-trykk i 3 timer ved 23°C under anvendelse av 1,0 g 10% Pd/C katalysator. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og kombinert filtrat og vaskevæsker ble analysert mikrobiologisk på amikacin.

B. Reaksjon A ble gjentatt, bortsett fra at acyleringen ble fortsatt i 115 timer istedenfor 20 timer.

Eksempel 12

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -6 ' -N-Cbz-kana A i vannfri tetrahydrofuran i varierende tidsrom.

A. Eksempel 11 A ble gjentatt, bortsett fra at det som løs-ningsmiddel istedenfor tørr cykloheksanon ble anvendt tørr tetra-hydrof uran.

B. Eksempel 11 B ble gjentatt, bortsett fra at det som løs-ningsmiddel istedenfor tørr cykloheksanon ble anvendt tørr tetra-hydrof uran.

Eksempel 13

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -6 1 -N-Cbz-kana A i vannfri dioksan i varierende tidsrom.

A. Eksempel 11 A ble gjentatt, bortsett fra at acyleringen ble fortsatt i 44 timer under anvendelse av tørr dioksan som løsningsmiddel.

B. Eksempel 11 B ble gjentatt, bortsett fra at acyleringen ble fortsatt i 18^ time under anvendelse av tørr dioksan som løsningsmiddel.

Eksempel 14

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl)- 6'- N- Cbz- kana A i vannfri dietylketon ved 75°C.

Til en omrørt løsning av 2,537 g (2,0 mmol, regnet som 6'-N-Cbz-kana A (silyl)g) poly-(trimetylsilyl)-6'-N-Cbz-kana A fremstilt som i eksempel 1, i 32 ml sikttørket dietylketon ved 7 5°C ble det tilsatt en løsning av NAE (10,8 ml med 0,1944 mmol/ml dietylketon, 2,10 mmol) i løpet av 15 minutter. Omrøring ble fortsatt ved 7 5°C i ytterligere 3 timer, hvoretter blandingen ble helt i 150 ml vann. pH-verdien ble innstilt på 2,8 med 3N HCl, og dietylketonen ble avdampet under vakuum ved 4 0°C. HPLC-analyse av en aliquot av den vandige fase viste et utbytte på 39,18% di-Cbz-amikacin.

Hovedparten av den vandige fase ble redusert under 3,39 atm. H2-trykk i 3 1/4 time ved 23°C under anvendelse av 1,0 g Pd/C katalysator. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og kombinert filtrat og vaskevæsker ble analysert mikrobiologisk for amikacin. Turbidimetrisk analyse viste et utbytte på 27,84%, og plateanalyse viste 28,6% utbytte.

Eksempel 15

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -kana A med NAE ved 0-5°C etter tilbakehydrolysering med vann.

A. Silylering av kanamycin A under anvendelse av HMDS med

TMCS som katalysator.

10 g kanamycin A med renhet 97,6% (20,14 mmol) i 100 ml sikttørket acetonitril ble brakt til å koke med tilbakekjøling under nitrogenatmosfære. En blanding av 22,76 g (141 mmol, 7 mol pr. mol kanamycin A) av HMDS og 1 ml (0,856 g, 7,88 mmol) TMCS ble tilsatt til den tilbakekjølte reaksjonsblanding i løpet av 10 minutter. Tilbakekjøling ble fortsatt i 4 3/4 time hvoretter blandingen ble avkjølt og konsentrert under vakuum til en gul, viskøs væske og tørket under høyvakuum i 2 timer. Utbyttet av produkt var 23,8 g (97,9%, regnet som kanamycin A (silyl)1Q).

B. Acylering

23,8 g (20,14 mmol) poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A fremstilt under trinn A ovenfor ble løst i 250 ml sikttørket aceton ved 23°C og deretter avkjølt til 0-5°C. 3,63 ml vann (201,4 mmol, 10 mol pr. mol polysilylert kanamycin A) ble tilsatt under om-røring, og blandingen ble anbrakt under moderat vakuum i 30 minutter. NAE (19,133 mmol, 0,95 mol pr. mol polysilylert kanamycin A) i 108,3 ml aceton ble deretter tilsatt i løpet av mindre enn 1 minutt. Blandingen ble omrørt ved 0-5°C i 1 time,

tynnet med vann, pH ble innstilt på 2,5 og acetonen deretter fjernet under vakuum. Den vandige løsning ble deretter redusert ved 3,4 0 atm. H2~trykk ved 23°C i 1\ time under anvendelse av 2,0 g 10% Pd/C som katalysator. Den reduserte reaksjonsblanding ble filtrert gjennom "Dicalite", konsentrert til ca. 100 ml under vakuum ved 40°C og deretter helt i en %CG-50" (NH4<+>)

kolonne (6 liter harpiks, 5 x 100 cm). Den ble vasket med vann og deretter eluert med 0,6N-1,0N-3N NH^OH. Det ble oppnådd 60,25% amikacin, 4,37% BB-K6, 4,35% BB-K29, 26,47% kanamycin A og 2,18% polyacylforbindelser.

Eksempel 16

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -6 ' -N-Cbz-kana A med SAE ved 0-5°C etter tilbake-metanolyse.

A. Silylering av 6'- N- Cbz- kanamycin A.

20.0 g (32,4 mmol) 6'-N-Cbz-kanamycin A i 200 ml sikttørket acetonitril ble brakt til å koke med tilbakekjøling under nitrogenatmosfære. 47,3 ml HMDS (226,8 mmol, 7 mol pr. mol 6<1->N-Cbz-kana A) ble tilsatt i løpet av 10 minutter, og koking med tilbake-kjøling ble fortsatt i 20 timer. Blandingen ble deretter avkjølt, konsentrert under vakuum og tørket under høyvakuum i 2 timer, hvorved det ble oppnådd 39,1 g hvitt, amorft fast stoff (95,4% utbytte, regnet som 6<1->N-Cbz-kana A (silyl)g).

B. Acylering.

39.1 g (32,4 mmol) poly-(trimetylsilyl)-6'-N-Cbz-kana A fremstilt under trinn A ovenfor ble løst i 4 00 ml tørr aceton under omrøring ved 23°C. 6,6 ml metanol (162 mmol, 5 mol pr. mol polysilylert 6'-N-Cbz-kana A) ble tilsatt, og blandingen ble om-

rørt ved 23°C i 1 time under en sterk nitrogenstrøm. Blandingen ble avkjølt til 0-5°C, og en løsning av 11,35 g (32,4 mmol) SAE i 120 ml tørr aceton som var avkjølt på forhånd ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i ytterligere 3 timer ved 0-5°C og deretter anbrakt i et 4°C kaldt rom i 1 uke. 3 00 ml vann ble tilsatt og pH innstilt på 2,0. Blandingen ble omrørt i 1 time og acetonen deretter avdampet under vakuum. Den resulterende vandige løsning ble redusert ved 3,67 atm. t^-trykk i 17 timer ved 23°C under anvendelse av 3,0 g 10% Pd/C som katalysator. Den ble deretter filtrert gjennom "Dicalite", konsentrert under vakuum til 75-100 ml og fyllt i en "CG-50" NH4<+>) kolonne og eluert med vann og 0,6N NH4OH. Det ble oppnådd 52,52% amikacin, 14,5% BB-K29, 19,6% kanamycin A og 1,71% polyacylforbindelser.

Eksempel 17

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -kana A med SAE ved 0-5°C etter tilbakehydrolysering med vann.

A. Silylering av kanamycin A med TMCS i acetonitril under

anvendelse av tetrametylguanidin som syreakseptor.

4,88 g (10,07 mmol) kanamycin A ble suspendert i 100 ml sikttørket acetonitril under omrøring ved 23°C. Til den omrørte suspensjon ble det tilsatt 16,234 g (140,98 mmol, 14 mol pr. mol kanamycin A) tetrametylguanidin (TMG). Blandingen ble oppvarmet til tilbakekjøling, og 15,32 g (140,98 mmol, 14 mol pr. mol kanamycin A) TMCS ble tilsatt i løpet av 15 minutter. Det ble dannet et hvitt bunnfall av TMG*HCl etter at ca. halvparten av TMCS var blitt tilsatt. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur, konsentrert til en klebrig rest og tørket under høyvakuum i 2 timer.

Det faste stoff ble blandet grundig med 100 ml tørr THF, og det uløselige TMG*HCl ble frafiltrert og vasket med 5 x 20 ml porsjoner THF. Kombinert filtrat og vaskevæsker ble konsentrert under vakuum ved 4 0°C til en klebrig rest og tørket under høy-vakuum i 2 timer. Det ble oppnådd 10,64 g av en lys fløtefarget, klebrig rest (87,6% utbytte, regnet som kanamycin A (silyl)1Q)•

B. Acylering

10,64 g (10,07 mmol) poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A fremstilt under trinn A ovenfor ble løst i 110 ml sikttørket aceton under omrøring ved 23°C, og løsningen ble avkjølt til 0-5°C. Det ble tilsatt 1,81 ml (100,7 mmol, 10 mol pr. mol polysilylert kana A) vann, og løsningen ble omrørt i 3 0 minutter

I v/ T U / I

under moderat vakuum. 3,70 g (10,57 mmol, 5% overskudd) SAE i 40 ml aceton som var avkjølt på forhånd ble tilsatt i løpet av mindre enn 1 minutt, og blandingen ble omrørt i 1 time. Blandingen ble opparbeidet ved den generelle fremgangsmåte i eksempel 16B, hvorved det ble oppnådd ca. 50% amikacin, ca. 10% BB-K29, 5-8% BB-K6, ca. 20% kanamycin A og 5-8% polyacylforbindelser.

Eksempel 18

Fremstilling av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A i pyridin under anvendelse av HMDS.

10,0 g (20,64 mmol) kanamycin A ble suspendert i 100 ml sikttørket, nydestillert pyridin ved 23°C. Nitrogengjennomstrøm-ning ble påbegynt, og suspensjonen ble brakt til å koke med til-bakekjøling. 17,33 g (107,32 mmol, 5,2 mol pr. mol kanamycin A) HMDS ble tilsatt i løpet av 10 minutter, og blandingen ble kokt med tilbakekjøling i 19 timer. Den ble deretter avkjølt til romtemperatur, konsentrert under vakuum til en lysegul-gylden viskøs væske og tørket under høyvakuum til et hvitt, amorft fast stoff. Det ble oppnådd 22,1 g (92,6% utbytte, regnet som kanamycin A (silyl)1Q).

Eksempel 19

Fremstilling av poly- (trietylsilyl)-kanamycin A under anvendelse av trietylklorsilan med trietylamin som syreakseptor.

5,0 g kanamycin A av 97,6% renhet (10,07 mmol) ble suspendert i 100 ml sikttørket acetonitril ved 23°C. 33,8 ml, 24,5 g (241,7 mmol) trietylamin (TEA) ble tilsatt, og suspensjonen ble brakt til å koke med tilbakekjøling. En løsning av23,7 ml, 21,3 g (140,98 mmol) trikloretylsilan i 25 ml tørr acetonitril ble tilsatt i løpet av 20 minutter. Kokingen med tilbakekjøling ble fortsatt i ytterligere 7 timer, og blandingen ble avkjølt til romtemperatur hvoretter det ble utskilt lange, fine nåler av TEA-HCl. Blandingen ble hensatt ved romtemperatur i 16 timer, konsentrert under vakuum ved 4 0°C til et klebrig, fast stoff og tørket i 2 timer under høyvakuum til et dyporange, klebrig fast stoff. Det faste stoff ble blandet grundig med 100 ml tørr THF ved 23°C, og det uløselige TEA*HCl ble frafiltrert, vasket med 5 x 20 ml THF og tørket hvorved det ble oppnådd 16,0 g TEA*HCl. Kombinert filtrat og vaskevæsker ble konsentrert under vakuum til et fast stoff og tørket under høyvakuum i 2 timer. Det ble oppnådd 19,3 g poly-(trietylsilyl)-kanamycin A som en

dyporange, viskøs væske.

Eksempel 20

Fremstilling av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A under anvendelse av bis- trimetylsilylurea.

10,0 g kanamycin A av renhet 99,7% (20,58 mmol) ble suspendert i 200 ml sikttørket acetonitril under omrøring ved 23°C.

Til suspensjonen ble det tilsatt 29,45 g (144,01 mmol, 7 mol pr. mol kanamycin) bis-trimetylsilylurea (BSU), og blandingen ble brakt til å koke med tilbakekjøling under nitrogenatmosfære. Kokingen med tilbakekjøling ble fortsatt i 17 timer, hvoretter reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur. Et lite kvantum nærværende uløselig materiale ble fjernet ved filtrering, vasket med 3 x 10 ml porsjoner acetonitril og tørket (1,1381 g). IR-analyse viste at dette var BSU pluss et lite kvantum ureagert kanamycin A. Kombinert filtrat og vaskevæsker ble avkjølt til 4°C i 16 timer. Ytterligere fast stoff ble utskilt, fjernet som ovenfor (7,8 g) og viste seg ved IR-analyse å være BSU pluss urea. Det lysegule filtrat og vaskevæskene ble konsentrert under vakuum ved 40°C og tørket under høyvakuum, hvorved det ble frembrakt 27,0 g av et hvitt, fast stoff som dels var klebrig og dels var fine, nålliknende krystaller. Det faste stoff ble behandlet med 150 ml heptan ved 23°C. Den uløselige del ble fjernet ved filtrering, vasket med 2 x 50 ml porsjoner heptan og tørket, hvorved det ble frembrakt 6,0 g hvite nåler (viste seg ved IR-analyse å være BSU pluss urea). Kombinert filtrat og vaskevæsker ble konsentrert under vakuum ved 4 0°C og tørket under høyvakuum i 2 timer, hvorved det ble frembrakt 2 0,4 g hvite nåler hvis IR-spektrum var typisk for polysilylert kanamycin A. Beregninger viste at produktet i gjennomsnitt inneholdt 7,22 trimetylsilylgrupper.

Eksempel 21

Fremstilling av amikacin ved acylering av per-(trimetylsilyl) -kanamycin A etter partiell desilylering med 1,3-butandiol.

A. Fremstilling av per-( trimetylsilyl)- kanamycin A.

10,0 g (20,639 mmol) kanamycin A ble suspendert i 100 ml sikttørket acetonitril under omrøring ved 23°C. Suspensjonen ble brakt til å koke med tilbakekjøling under en nitrogenstrøm, og 23,322 g HMDS (144,5 mmol, 7 mol pr. mol kanamycin A) ble

Eksempel 24

Fremstilling av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A under anvendelse av HMDS med imidazol som katalysator. 11 g (22,7 mmol) kanamycin A og 100 mg imidazol ble oppvarmet til tilbakekjøling i 100 ml sikttørket acetonitril under en nitrogenstrøm. 18,48 g (114,5 mmol, 5 mol pr. mol kanamycin A) HMDS ble tilsatt i løpet av 3 0 minutter, og blandingen ble kokt med tilbakekjøling i 20 timer. Fullstendig oppløsning inntraff på ca. 2\ time. Løsningen ble avkjølt til 23°C, og løsnings-midlet ble fjernet under vakuum og etterlot 21,6 g poly-(trimetylsilyl) -kanamycin A som en skumaktig rest (93,1% utbytte regnet som kanamycin (silyl) -q).

Eksempel 25

Fremstilling av 1-N-[l-(-)-y-amino-a-hydroksybutyryl] - kanamycin B (BB-K26) ved acylering av poly-(trimetylsilyl)- kanamycin B med SAE.

A. Fremstilling av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin B under

anvendelse av HMDS med TMCS- katalysator.

25 g (51,7 mmol) kanamycin B i 250 ml sikttørket acetonitril ble oppvarmet til tilbakekjøling under en nitrogenstrøm. 62,3 g (385,81 mmol, 7,5 mol pr. mol kanamycin B) HMDS ble tilsatt i løpet av 3 0 minutter, etterfulgt av 1 ml TMCS som katalysator. Blandingen ble kokt med tilbakekjøling i 21 timer med fullstendig oppløsning etter 1 time. Løsningsmidlet ble fjernet under vakuum ved 60°C, og den oljeaktige rest ble holdt på 60°C under høy-vakuum i 3 timer. Det ble oppnådd 53,0 g poly-(trimetylsilyl)-kanamycin B (85,2% utbytte regnet som kanamycin B (silyl)1Q)•

B. Acylering

53,0 g av det i trinn A ovenfor fremstilte poly-(trimetylsilyl) -kanamycin B ble løst i 500 ml tørr aceton ved 0-5°C, 20,9 ml metanol ble tilsatt, og blandingen ble omrørt under vakuum i 30 minutter ved 0-5°C. En løsning av 18,1 g (51,67 mmol) SAE

i 200 ml aceton som var blitt avkjølt på forhånd, ble tilsatt i løpet av mindre enn 1 minutt, og blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 0-5°C. Blandingen ble opparbeidet i overensstemmelse med åen generelle fremgangsmåte i eksempel 22 og ble deretter fyllt i en kolonne av "CG-50" (NH4<+>) (8 x 120 cm). Den ble eluert med en NH^OH-gradient på fra 0,6N til 3N. Det ble oppnådd 38% BB-K26, 5% av det tilsvarende 6'-N-acylerte kanamycin B (BB-K22), 10% av det tilsvarende 3-N-acylerte kanamycin B (BB-K46),

14,63% kanamycin B samt et lite kvantum polyacylert kanamycin B.

Eksempel 26

Fremstilling av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A under anvendelse av HMDS med kanamycin A sulfat som katalysator. 19,5 g (4 0,24 6 mmol) kanamycin A og 0,5 g (0,8 58 mmol) kanamycin A sulfat (totalt = 20,0 g, 41,0 mmol) i 200 ml sikt-tørket acetonitril ble brakt til koking med tilbakekjøling. 60,3

ml (287,7 mmol, 7 mol pr. mol kanamycin A) HMDS ble langsomt tilsatt, og blandingen ble kokt med tilbakekjøling i 28 timer.

Den ble deretter inndampet til tørr tilstand i en rotasjonsfordamper og tørket under dampinjektorvakuum. Det ble oppnådd 47,5 g —poiy- (-trr-imetr<y>-l-s-i-l-<y>-l-)--kanamye-ln—A—som—en—blek<g>ul—oLj e—(-95-,-82% utbytte regnet som kanamycin A (silyl)1Q)•

Eksempel 27

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -kanamycin A med N-trifluoracetylblokkert AHBA-N-hydroksysucc inimidester.

A. Fremstilling av N-trifluoracetyl-AHBA og omdannelse til

dens N- hydroksysuccinimidester.

Til en suspensjon av 5,0 g (42 mmol) AHBA i 100 ml THF ble det tilsatt 40 g (191 mmol) trifluoreddiksyreanhydrid under om-røring i løpet av 10 minutter. Løsningen ble omrørt i 18 timer ved 23°C og deretter konsentrert til tørr tilstand under vakuum ved 50°C. Resten ble løst i 100 ml vandig metanol (1:1) og-om-

rørt i 1 time. Den ble deretter konsentrert til tørr tilstand under vakuum og gjenoppløst i 50 ml H2O. Den vandige løsning ble ekstrahert med 3 x 50 ml porsjoner MIBK, og ekstrakten ble etter tørking over Na2S04 konsentrert til en olje. Spor av løs-ningsmiddel ble fjernet ved tilsetning og avdestillering av 4 ml vann. Ved oppbevaring forandret oljen seg til et voksaktig, krystallinsk fast stoff (2,5 g, 28% utbytte).

2,4 g (11,3 mmol) N-trifluoracetyl-AHBA ble løst i 50 ml

tørr aceton, og 1,30 g (11,31 mmol) N-hydroksysuccinimid ble tilsatt til løsningen. En løsning av 2,33 g dicykloheksylkarbodiimid i 20 ml tørr aceton ble langsomt tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer ved 23°C, og det utfelte dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og vasket med litt aceton. Kombinert filtrat og vaskevæsker (en løsning av N-hydroksysuccinimidesteren av N-trifluoracetyl-AHBA) ble anvendt i det neste trinn uten isolering.

B. Acylering

Til en løsning av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A fremstilt som i eksempel 26 (11,31 mmol) i 54 ml aceton ble det tilsatt 2,0 ml (113,4 mmol) vann, og blandingen ble omrørt under vakuum ved 0-5°C i 30 minutter. N-hydroksysuccinimidesteren av N-trifluoracetyl-AHBA fremstilt i trinn A ovenfor (11,31 mmol) ble tilsatt til blandingen som deretter ble holdt på 5°C i 1 time. Deretter ble pH-verdien innstilt på ca. 2,0 med 20 prosentig I^SO^, blandingen omrørt i 3 0 minutter og pH-verdien deretter hevet til ca. 6,0 med NH^OH. Blandingen ble deretter inndampet i til tørr tilstand i en rotasjonsfordamper, hvorved det ble oppnådd 14,4 g av et klebrig, ikke helt hvitt, fast stoff. Det faste stoff ble løst i 100 ml vann, pH-verdien ble hevet fra 5,5 til 11,0 med ION NH^OH, og løsningen ble oppvarmet i et olje-bad ved 70°C i 1 time. pH (9,5) ble senket til 7,0 med HCl hvoretter løsningen ble finfiltrert for fjerning av et lite kvantum uløselige bestanddeler, og filtratet ble vasket med vann. Kombinert filtrat og vaskevæsker (188 ml) ble tilført til en "CG-50" (NH4<+>) kolonne (8 x 90 cm), vasket med 2 liter vann og eluert med en NH4OH-gradient (0,6N-1,ON-konsentrert). Det ble oppnådd 28,9% amikacin, 5,0% BB-K6, 5,7% BB-K29, 43,8% kanamycin A, 3,25% polyacylforbindelser samt 14,3% av et ukjent materiale som var i den første fraksjon fra kolonnen.

Eksempel 28

Fremstilling av amikacin ved acylering av poly-(trimetylsilyl) -kanamycin A med tert-butyloksykarbonyl-blokkert AHBA- N- hydroksysuccinimidester.

A. Fremstilling av tert-BOC-AHBA og omdannelse til dens N-hydroksysuccinimidester

En løsning av 5,0 g (4 2 mmol) AHBA i 100 ml vann og 20 ml aceton ble innstilt på pH 10 med 10N NaOH. I løpet av 3-4 minutter ble det tilsatt 11,6 g (53 mmol) di-tert-butyldikarbonat, og løsningen ble omrørt i 35 minutter, idet pH-verdien ble holdt på 10 ved periodisk tilsetning av 10N NaOH. Acetonen ble fjernet under vakuum, og den vandige fase ble vasket med 4 0 ml etylacetat. pH-verdien til den vandige løsning ble senket til 2,0 med 3N HCl, og løsningen ble deretter ekstrahert med 3 x 3 0 ml MIBK. De kombinerte MIBK-ekstraker ble tørket over Na2S04 og konsentrert til en klar, oljeaktig rest (8,2 g, 89%).

4,25 g (19,4 mmol) tert-BOC-AHBA ble løst i 50 ml aceton,

og det ble tilsatt 2,23 g (19,4 mmol) N-hydroksysuccinimid. En løsning av 4,00 g (19,4 mmol) dicykloheksylkarbodiimid i 20 ml aceton ble langsomt tilsatt, og blandingen ble omrørt i 2 timer ved 23°C. Det utfelte dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og vasket med et lite kvantum aceton. Kombinert filtrat og vaskevæsker (en løsning av N-hydroksysuccinimidesteren av tert-BOC-AHBA) ble anvendt i neste trinn uten isolering.

B. Acylering

Til en løsning av poly-(trimetylsilyl)-kanamycin A fremstilt som i eksempel 26 (41,28 mmol) i 94 ml aceton ble det tilsatt 3,5 ml (194 mmol) vann, og blandingen ble omrørt under vakuum ved 0-5°C i 3 0 minutter. N-hydroksysuccinimidesteren av tert-BOC-AHBA fremstilt i trinn A ovenfor (19,4 mmol) ble tilsatt, og blandingen ble hensatt ved 5°C i 1 time. Det ble tilsatt 2 00 ml vann og pH senket fra 7,0 til 2,0 med 2 0 prosentig H^ SO^. Etter 30 minutters omrøring ble pH hevet til ca. 6,0 med NH^OH, og blandingen ble inndampet til tørr tilstand under vakuum, hvorved det ble frembrakt 36,3 g av en gylden olje. Oljen ble løst i 200 ml trifluoreddiksyre, hensatt i 15 minutter og inndampet til tørr tilstand i en rotasjonsfordamper. Oljen ble vasket med vann, og vannet ble hurtigavdampet. Konsentrert NH^OH ble tilsatt til pH 6,0 og hurtigavdampet. Det resulterende faste stoff ble løst i vann og filtrert, og filteret ble vasket med vann. Kombinert filtrat og vaskevæsker (259 ml) ble fyllt i en "CG-50" (NH4<+>) kolonne (8 x 92 cm), vasket med 4 liter vann og eluert med en NH4OH-gradient (0", 6N-1, ON-konsentrert) . Det ble oppnådd 40,32% amikacin, 4,58% BB-K6, 8,32% BB-K29, 30,50% kanamycin A og 7,43% polyacylforbindelser.

Eksempel 29

Den generelle fremgangsmåte fra eksempel 1 ble gjentatt, bortsett fra at det der anvendte 6<1->N-karbobenzyloksykanamycin A ble erstattet med en ekvimolar vektmengde 6'-N-karbobenzyloksykanamycin B, og det ble derved fremstilt et 1-N-[l-(-)-y-amino-a-hydroksybutyryl] -kanamycin B.

Eksempel 3 0

Den generelle fremgangsmåte fra eksempel 1 ble gjentatt, bortsett fra at det istedenfor den der anvendte L-(-)-y-benzyl-oksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre-N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimidester ble erstattet med henholdsvis L-(-)-3-benzyl-oksykarbonylamino-a-hydroksypropionsyre-N-hydroksy-5-norbornen-2 , 3-dikarboksimidester og L- (-) -6 -benzy lok sy karbonyl arnino-a - hydroksyvaleriansyre-N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimidester, og det ble derved fremstilt henholdsvis l-N-[L-(-)-B-amino-a-hydroksypropiony1]-kanamycin A og l-N-[L-(-)-5-amino-a-hydroksyvaleryl]-kanamycin A.

Eksempel 31

Den generelle fremgangsmåte fra eksempel 25 ble gjentatt, bortsett fra at det istedenfor den der anvendte L-(-)-Y-benzyl-oksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre-N-hydroksyester ble anvendt henholdsvis L-(-)-ø-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksypropionsyre-N-hydroksysuccinimidester og L-(-)-6-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksyvaleriansyre-N-hydroksysuccinimidester, og det ble derved fremstilt henholdsvis

l-N-[L-(-)-B-amino-a-hydroksypropionyl]-kanamycin B og

l-N-(L-(-)-if-amino-a-hydroksyvaleryl]-kanamycin B.

Eksempel 32

Fremstilling av BB-K8 ved acylering av poly-(trimetylsilyl)-3^ 6'- di- N- karbobenzyloksykanamycin A i vannfri dietylketon.

A./ 3, 6'- di- N- karbobenzyloksykanamycin A.

En suspensjon av 7,26 g (15 mmol) kanamycin A (fri base) og 18,6 g (75 mmol) nikkelacetattetrahydrat i 300 ml dimetylsulf-Qksyd (DMSO) ble holdt oppvarmet ved 100°C i ca. 30 minutter under omrøring, inntil det var oppnådd en klar, grønn løsning. Etter avkjøling ble det tilsatt en løsning av 11,8 g (37,6 mmol) N-karbobenzyloksy-5-norbornen-2,3-dikarboksimid i 50 ml DMSO

til løsningen. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over, behandlet med 100 ml kons. ammoniakkvann og 1 liter vann, omrørt ved romtemperatur i 1 time og overført til toppen av en "Diaion HP-10"-søyle (300 ml). Søylen ble underkastet trinnvis eluering, først med 7 n NH^OH, deretter med metanol-vann (1:1) og endelig med metanol-vann (10:1) under oppsamling av 20 ml fraksjoner og overvåkning ved hjelp av tynnsjiktskromatografi på "Merck-Silica Gel 60 F-254"-plater under anvendelse av kloroform-etanol-28% ammoniumhydroksyd (1:2:1). En porsjon av det ønskete produkt, som krystalliserte som fine. nåler fra fraksjoner som

inneholdt produktet i høye konsentrasjoner, ble frafiltrert, hvorved man fikk en analytisk prøve. Filtratet og de andre fraksjoner som inneholdt det ønskete produkt (RF 0,42) ble kombinert, og løsningen ble inndampet under vakuum. Resten ble blandet grundig med dietyleter, hvormed man fikk totalt 9,7 g (86%) av det i overskriften anførte produkt. Smp. 300°C. IR(KBr): uc=o 1690 cm"<1>. NMR (DMSO-dg) + DC1, pD ca. 3): 6 4,76-5,26 (6^1^*1^ , 11^' og CO-OCH2-CgH5 x 2), 7,26 (10H, s, CO-OCH2-CfiH5 x 2).

Analyse: Beregnet for <C>34<H>48<N>4°15'H20: C: 52'98' H: 6»54» N: 7 >21

Funnet: C: 53,20, H: 6,42, *N: 7,04.

B. Poly-( trimetylsilyl)- 3, 6'- di- N- karbobenzyloksykanamycin A

En blanding av 1,5 g (2 mmol) 3,6'-di-N-karbobenzyloksykanamycin A fra trinn A ovenfor og 1,29 g (8 mmol) heksametyldisilazan i 15 ml tørr acetonitril ble kokt med tilbakekjøling i 16 timer. Den klare løsning ble konsentrert til tørr tilstand under vakuum, og resten ble løst i 20 ml tørr dietylketon. Løs-ningen ble anvendt direkte i det neste trinn.

C. Acylering av poly-( trimetylsilyl)- 3, 6'- di- N- karbobenzyloksykanamycin A under anvendelse av en ekvimolar mengde acyleringsmiddel

Til løsningen fra trinn B ovenfor ble det under omrøring tilsatt 700 mg (2 mmol) L-(-)-a-karbobenzyloksyamino-a-hydroksy-smørsyre-N-hydroksysuccinimidester (SAE). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 19 timer, deretter behandlet med 8 ml vann og 35 ml tetrahydrofuran (THF), innstilt på pH 3 med vandig saltsyre, omrørt i 30 minutter og konsentrert til tørr tilstand under vakuum. Resten ble løst i en blanding av 300 ml vann, 40 ml metanol, 10 ml n-butanol og 40 ml THF og hydrogenert natten over 1 nærvær av 500 mg 10% palladium-på-karbon. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble inndampet under vakuum og lyofilisert, hvorved man fikk 1,7 g rå BB-K8. Det amorfe pulver ble gjenoppløst i vann, og løsningen ble innstilt på pH

4 med vandig saltsyre og ble kromatografert i en søyle av

"Amberlite CG-50" i NH4<+->syklusen. Søylen ble underkastet trinnvis elusring med vann, 0,1 n NH^OH, 0,3 n NH^OH, 0,5 n NH^OH og 2 n NH^OH, under oppsamling av 10 ml fraksjoner og overvåkning ved hjelp av tynnsjiktskromatografi under anvendelse av "Merck

Silica Gel 60 F-254"-plater under anvendelse av kloroform-metanol-28% ammoniumhydroksyd-vann (1:4:2:1). De homogene fraksjoner ble kombinert, inndampet og til slutt lyofilisert. Fraksjoner som inneholdt BB-K8 og fraksjoner som inneholdt gjenvunnet kanamycin A ble analysert under anvendelse av henholdsvis K. pneumonia A20680 og B. subtilis PCI 129.

Hydrogenolyse av det delvis avblokkerte produkt med Pd-c etterfulgt av isolering i en "CG-50"-søyle ga ytterligere 30 mg (2%) BB-K8. Det totale utbytte av BB-K8 ble 846 mg (69%).

D. Acylering av poly-( trimetylsilyl- 3, 6'- di- N- karbobenzyloksykanamycin A under anvendelse av 1, 2 ekvivalenter acyleringsmidde1

Trinn c ovenfor ble gjentatt, bortsett fra at det ble anvendt et 20% overskudd av acyleringsmiddel. Det ble oppnådd følgende resultater:

Hydrogenolyse av det delvis avblokkerte produkt med Pd-C etterfulgt av isolering i en "CG-50"-søyle ga ytterligere 21 mg (2%) BB-K8. Det totale utbytte av BB-K8 ble 771 mg (62%).

E. Acylering av poly-( trimetylsilyl- 3, 6'- di- N- karbobenzyloksykanamycin A under anvendelse av 1, 5 ekvivalenter acyleringsmiddel

Trinn C ovenfor ble gjentatt, bortsett fra at det ble anvendt et 50% overskudd av acyleringsmiddel. det ble oppnådd følgende resultater:

Claims (4)

1. Derivat av kanamycin A eller kanamycin B til anvendelse ved fremstilling av 1-N-£w-amino-a-hydroksyalkanoyl]-kanamycin A eller B som har den generelle formel (I) hvor R er OH eller NH2 og n er et helt tall fra 0 til 2, eller et ikke toksisk, farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved at derivatet har den generelle formel (I'). —hvor Z er---0-- eller _-NH^,__Rl er H eller__en _s i ly_l grupp e med formelen Si (lavere alkylminst to og høyst ti R'-grupper er Si (lavere alkyl)3, og R" er R' eller en annen blokkerende gruppe enn en silylgruppe, og valgt blandt grupper med formlene hvor R 1 og R 2 er like eller forskjellige, og hver er H, F, Cl, Br, N02, OH, lavere alkyl eller lavere alkoksy, X er Cl, Br, F eller 1, og Y er H, Cl, Br, F eller I.

2. Derivat i samsvar med krav 1, karakterisert ved at Si (lavere alkyl)3 er Si(CH3)3.

3. Derivat i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at antall silylgrupper er fra 4 til 8, eller fra 3 til 7 når R'' er en annen blokkerende gruppe enn nevnte silylgruppe.

4. Derivat i samsvar med et av kravene 1-3, karakterisert ved at den blokkerende gruppe som er forskjellig fra nevnte silylgruppe er en karbobenzyloksygruppe.