DE2355348A1

DE2355348A1 - Antibiotische derivate und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2355348A1
Application number: DE19732355348
Authority: DE
Inventors: Yoshi Abe; Takayuki Naito; Susumu Nakagawa
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1972-11-06
Filing date: 1973-11-06
Publication date: 1974-05-22
Also published as: JPS49100053A; FR2205312A1; GB1444733A; FR2205312B1; US3796699A; JPS5643480B2

Description

PATENTAN WXLTE

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTFR DR.-ING. V/OL.FRAW BUNTE DR. KARL GEORG -.ÖSCH 2355348

D-8OOO MÜNCHEN 4O. BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF (OBO) 37 65 83 · TELEX B2132O8 ISAR D POSTANSCHRIFT: D-8O00 MÜNCHEN 43. POSTFACH 78O

M/12886 München, den 6. November 1973

Bristol-Myers Company

34-5 Park Avenue

New York, New York / USA

Antibiotische Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft neue Derivate von Gentamicin CL , die als antibakterielle Mittel brauchbar sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung halbsynthetische, in 1-Stellung substituierte Derivate von Gentamicin CL , wobei diese Deriva—' te durch Acylierung der 1-Aminofunktion von Gentamicin G^ mit einer γ-Amino-ct-hydroxybutyryleinheit hergestellt werden. ■

Beschreibung des Standes der Technik:

A. Gentamicin (;Gentamycin) und die Fermentation davon ist Gegenstand der US-Patentschriften 3 091 572 (erteilt am 28. Mai 1963) und 3 136 704 (erteilt am 9. Juni 1964). Die Patentschriften beschreiben die Fermentation von Gentamicinkomplexen aus Micromonospora purpurea, NNRL 2953 und Micromonospora echino'spora, NNRL 2985* Es wurden auch Varianten davon in der Stammkultursamralung des United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois-als M. echinospora

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var. ferruginea, NNRL 2995 und M, echinospora'var. pallida, NNBL 2996 hinterlegt.

B. Gentamicin wird weiterhin im Merck-Index, 8th Edition, Seite 4-85 beschrieben. Die zwei Hauptkomponenten, Gentamicin CL und Co werden darin beschrieben.

Gentamicin C wird als Komplex von drei nahe verwandten Komponenten, die als "C₁", "C2" und "C^_a" bezeichnet werden, fermentiert. Die vorliegende Anmeldung betrifft nur Gentamicin Gy. , das Ausgangsmaterial der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel:

Die Erfindung betrifft ein halbsynthetisches Derivat von Gentamicin 0_Λ , wobei diese Verbindung als 1-[L-(-)-7-aminooC-hydroxybutyryl] -gentamicin C. die J^ormel

1a

bekannt ist und

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besitzt, worin R die Bedeutung L-(-).-Ύ-amino-ot-hydroxybutyryl besitzt, oder ein nichttoxiscb.es, pharmazeutisch . verträgliches Säureadditionssalz davon.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "nichttoxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz¹¹ ein Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder Penta-Salz, das durch Einwirken eines Mols Verbindung IV auf 1 bis 5 Mol einer nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure entsteht. Unter diesen Säuren sind zu nennen Essigsäure, Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure, Maleinsäure,- Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure, Apfelsäure, Mandelsäure und Zitronensäure und all die anderen Säuren, die zur Herstellung von Salzen Amin enthaltender Pharmazeutika allgemein verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann gemäß dem folgenden typischen erläuternden Schema hergestellt v/erden: ■ '

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1.) Gentamicin C (D

la

N- (Benzyloxycarbonyloxy)-

„ ■ι , ^-

succinimid

CH₂-NH-C-O-CH₂-CeH₅ ■

NH₂

II

2.) Verbindung II N-Hydroxysuccinimidester

' . von L- (-^) -γ-Benzyloxycarbonyl

amino-a-hydroxybuttersäure

CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ .

CH^-NH-C-O-CH₂-C₆H

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M/12886 · - ' ' 5*

2 .)Verbindung ΠΙ H₂/Pd/C^

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die pharmazeutisch v/irksame Verbindung der Formel

CH₂-NH₂

NH-R

HO

worin R die Bedeutung L-(-)-J -amino- od-hydroxybutyryl besitzt · oder ein nichttoxisches, pharmazeutisch verträgliches Saureadditionssalz davon.

Andere bevorzugte Ausführungsformen, die als Zwischenpro—

dukte zur Herstellung der wirksamen, erfindungsgemäßen Ver-

— 5 —

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bindungen brauchbar sind, sind die Verbindungen der Formel

CH₂-NH-R¹

IiH,

HO

Il

■NH-R

worm R die Bedeutung CgHc-CHg-O-C- besitzt und R Wasserstoff oder L-(-)-^-benzyloxycarbonyl-amino-ot-hydroxybutyryl bedeutet.

Andere am meisten bevorzugte Ausführungsformen sind die Sulfat-, Hydrochlorid-, Acetat-, Maleat-, Citrat-, Ascorbat-, Nitrat- oder Phosphat-Salze der Verbindung IV.

Weitere, am meisten bevorzugte Ausführungsforcien sind die Mono- oder Polyhydrate der Verbindungen· der Formel IV, insbesondere die Mono- oder Polyhydrate der Monosulfat- oder Disulfatsalze der Verbindung.der Formel IV.

Die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgaben werden dadurch gelöst, daß man erfindungsgemäß das Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel

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CH₂-NH₂

NH-R

IV

schafft, worin R die Bedeutung L-(-)-Y-amino-o<—-hydroxybutyryl besitzt; oder eines nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen

A. die an dem 6'-Kohlenstoffatom von Gentamicin C^_a befindliche Aminogruppe mit einer gebräuchlichen Aminoschutzgruppe X blockiert, wobei eine Verbindung der Formel

CH₂-NK-Y

NH₂

HO

II

entsteht5

B. die an der "!-Position der Verbindung der Formel II befindliche Aminogruppe mit dem L-(-)-Isomeren eines Acylie-

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rungsmittels der Formel

d.

worin W eine gebräuchliche Aminoschutzgruppe darstellt, oder mit seinem funktioneilen Äquivalent als Acylierungsmittel füi ein primäres Arnin acyliert, wobei⁵ eine Verbindung der Formel

CH₂-NH-Y

III

entsteht, worin Y und V/ die obigen Bedeutungen besitzen; und

G. durch an sich bekannte Methoden die Aminoschutzgruppen "V/ und Y entfernt, wobei die Verbindung der Formel IV entsteht, und gegebenenfalls anschließend das obige Produkt durch an sich bekannte Methoden in ein nichttoxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon überführt.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist das Verfahren zur Herstel· lung einer Verbindung der Formel IV, worin R die Bedeutung Ii-(—)-γ —amino— oC-hydroxybutyryl besitzt oder eines nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes

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davon, dadurch gekennzeichnet,- daß man in aufeinanderfolgenden Stufen .

A. Gentamicin C- mit einem Acylierungsmittel, ausgewählt unter

Q 0

R-

CH₂-O-C-X

CH, 0

CHn-C-i

// \© a .</ ^NN-C-C

CE

CH

X-CH₂-C-OH ,- (oder einem Carbodiimid davon) oder

C-CH₂-CH₂-CO₂H (oder einem Carbodiimiddavon),

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4-- 5
'worin R und R , die gleich, oder verschieden sein können, H, F, Cl, Br, NO₂, OH, Niedrigalkyl oder Niedrigalkoxy, X Chlor, Brom oder Jod bedeuten, oder mit einem funktionellen Äquivalent als Äcylierungsmittel in einem Verhältnis von einem Mol oder weniger Äcylierungsmittel pro Mol Gentamicin C_-,. in einem Lösungsmittel, vorzugsweise ausgewählt unler Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyäthan, Methanol, Äthanol, Wasser, Aceton, Pyridin, N-Niedrigalkylpiperidin.oder Mischungen davon, jedoch vorzugsweise Dimethylformamid,bei einer Temperatur unterhalb 50°C^und vorzugsweise unterhalb 25°C,acyliert, wobei die Verbindung der Formel

CH₂-NH-Y " ·

II

worin Y einen Hest der Formeln

CH₂-O-C- , CH₅-C-O-C- ,

X-CH₂-C- , oder

CH₂-CH₂-C-;

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worin R und R^ die obigen Bedeutungen besitzen, bedeutet, entsteht;

B. Verbindung II mit einem Acylierungsmittel der Formel

OH 0 W-NH-CH₂-CH₂-GH-C-M

VII

worin W einen Rest, ausgewählt unter

O CH, O

CH₂-O-C- , CHg-C-O-C- , O₂

CH,

X-CH₂-C

jedoch vorzugsweise

CH₂

0 -0-C-

„/ ^

C-CH₂-CH₂-C-;

4-5
worin R und R-^ die obigen Bedeutungen besitzen, bedeutet,

und ,

M einen Rest, ausgewählt unter

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Vl

-O-N

*y—

-0-N
N

, jedoch, vorzugsweise

bedeutet, in einem Verhältnis von mindestens 0,5 Mol von Verbindung VII pro Mol Verbindung II, vorzugsweise in einem Verhältnis von etwa 0,5 bis etwa 1,4- und besonders bevorzugt in einem Verhältnis von etwa 0,8 bis etwa 1,1 in einem Lösungsmittel, das vorzugsweise ausgewählt ist, unter Mischungen von V/asser und Ithylenglycoldimethyläther, Dioxan, Dimethy!acetamid, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Propylenglycoldi—
methyläther ode-r dergleichen, jedoch bevorzugt 1:1 Wasser/
Äthylenßlycoldimethylüther, acyliort, wobei eine Verbindung
der Formol

CH-NH-Y

III

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entsteht, in der Y und W die obigen Bedeutungen besitzen; und

C. die Blockierungsgruppen Y und V/ von der Verbindung III durch an sich bekannte Methoden entfernt, und wenn W und Y Reste der Formel

' ^rVa 1

C. VcH₂-O-O- '

bedeuten, durch Hydrierung der Verbindung III mit Wasserstoff

vorzugsweise

in Gegenwart eines Metallkatalysators,νausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-ITickel, Rhodium, Ruthenium und Nickel, jedoch bevorzugt Palladium und besonders bevorzugt Palladium-auf-Aktivkohle, in einem aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bestehenden Lösungsmittelsystem, vorzugsweise ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglycoldimethyläther, Propylenglycoldimethyläther oder dergleichen, jedoch vorzugsweise 1r1 Wasser/Dioxan und vorzugsweise in Gegenwart einer katalytischen Menge Eisessig,'entfernt, wobei die Verbindung der Formel IV entsteht.

Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß man in dem obigen Verfahren zur Acylierung der Aminfunktionen der erfinduhgsgemäßen Zwischenyerbindungen andere Mittel verwenden kann. Diese Veröffentlichung schließt alle solcheAcylierungsmittel ein, die zu labilen amino-blockierenden Gruppen führen, wobei diese labilen Blοckierungsgruppen allgemein bei der Synthese von Peptiden eingesetzt v/erden. Die labilen Blockierungsgruppen müssen durch an sich bekannte Methoden leicht entfernbar sein. Beispiele für solche labilen Blockierungs-

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4»

gruppen und ihre Entfernung sind in der Übersicht von A. Kapoor, J. Pharm. Sciences _59, S. 1-27 (1970) au finden. Funktionelle Äquivalente als Acylierungsmittel für primäre Aminogruppen schließen die entsprechenden Garbonsäure— chloride, -bromide, Säureanhydride, einschließlich gemischter Anhydride und insbesondere der aus stärkeren Säuren, wie der niedrigaliphatischen Monoester der Kohlensäure, der Alkyl und Arylsulfonsäuren und der der sterisch gehinderteren Säuren, wie Diphenylessigsäure, hergestellten gemischten Anhydride ein. Außerdem kann ein Säureazid oder ein aktiver Ester oder Thioester (beispielsweise mit p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, Thiophenol, Thioessigsäure) verwendet v/erden oder die freie Säure selbst kann mit dem Gentamicin-C^Derivat nach zuerst erfolgter -Reaktion dieser freien Säure .mit NjN'-Dimethylchloroforminium-chlorid [vergl. GB-PS 1 008 und Novak und V/eichet, Experientia XXI/6, 360 (1965)] gekuppelt werden, oder das Derivat eines Alkinylamin-Eeagenzes {vergl. S. Buijile und H.G.Viehe, Angew.Chem., International Edition 3, 582 (1964)] oder eines Ketenirnin-Reagenzes [vergl. CL. Stevens und M.E. Munk, J. Ame.r. Chem. Soc. 80, 4065 (1958)J oder eines Isoxazoliumsalz-Reagenzes [vergl. R.B. Woodward, R.A. Olofson und H. Kayer, J. Aiuer. Chem. Soc, 83, 1010 (1961)3· Ein weiteres Äquivalent des Säurechlorids ist ein korrespondierendes Azolid, d.h. ein Amid der entsprechenden Säure, deren Amidstickstoff das Glied eines quasi-aromatisehen 5-Rings ist, der mindestens zwei Stickstoffatome enthält, d.h. Imidazol,«Pyrazol, die Triazole, Benzimidazole, Benzotriazole und ihre substituierten Derivate. Als Beispiel für die allgemeine Methode zur Herstellung eines Azolids wird Ν,Ν'-Carbonyldiimida'zol mit einer Garbonsäure in äquimolaren Verhältnissen bei Raumtemperatur in Tetrahydrofuran, Chloroform, Dimethylformamid oder

- 14 -

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einem ähnlichen inerten Lösungsmittel umgesetzt, wobei unter Freisetzung von Kohlendioxyd und einem Mol Imidazol das Carbons äureimidazolid in praktisch quantitativer Ausbeute anfällt. Dicarbonsäuren liefern Diimidazolide. Das Nebenprodukt Imidazol fällt aus und kann abgetrennt werden und das Imidazolid kann isoliert werden, je'doch ist dies nicht wesentlich. Diese Reaktionen sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt [vergl. US-PSen 3 079 314, 3 117 126 und 3 129 224 sowie die GB-PSen 932 644, 957 570 und 959 054].

Bei der Herstellung des Gentamicins G^ in Stufe A, dessen in 6'-Stellung befindliche Aminogruppe blockiert ist, werden bevorzugt die molaren Verhältnisse der Reaktionspartner so eingestellt, daß ein Mol oder weniger Acylierungsmittel pro Mol Gentamicin CL verwendet wird. Eine Erhöhung des

I 3.

Verhältnisses an Acylierungsmittel kann in geringeren Ausbeuten des gewünschten Zwischenprodukts resultieren, da konkurrierende Nebenreaktionen zunehmen, die zu Verunreinigungen durch PolyacylderivatCe) führen können./"

Wie bei den meisten chemischen Reaktionen können höhere oder niedrigere Temperaturen, als die, die hierin besonders beschrieben sind, verwendet werden. In Stufe A können jedoch Temperaturen, die wesentlich höher als die bevorzugte obere Grenze von 50° C liegen, zu verminderten Ausbeuten aufgrund eines größeren Ante'ils' an Nebenreaktionen führen.

Die Verbindung IV, 1-[L-(-)-T-amino- oC-hydroxybutyryl] Gentamicin C^, besitzt eine ausgezeichnete antibakterielle Aktivität. Im folgenden ist eine Tabelle aufgeführt, die die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von Gentamicin Gy, , Verbindung IV (BB-K92) und von zwei weiteren, verwandten mono— und diacylierten Derivaten von Gentamicin C₁ gegen

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eine Vielzahl grampositiver und gramnegativer Bakterien, bestimmt durch die zweifache Agarverdunnungsmethode, aufzeigt.

	TABELLE I	KM-R⁺	K-12	. aeruginosa D15	AI5II9	3^ _a-Derivaten	50	BB-K92	von	3	Genta
			coli K-12 KM-R⁺	H9 D-113 KM-R⁺	AI5I69		100	0,8		5	micin
	In vitro antimikrobiell Aktivität	KM-R⁺	¹¹ KM-R⁺		A2O363		100	0,4		5	⁰Ia
	Gentamicin (	W677		A9844	BB-K91	12,5	0,8			0,8
		JR/W677		A2O365	1,6	100	0,8			0,4
		pneumoniae D-11		A9632	1,6		0,4			0,8
E.	MIG (γ/ml)	Type 22		A20664	1,6		0,1		1	0,8
Il	coli NIHJ	Ser. marcescens		A2O665	0,8	0,4			0,4
Il	Juhl	Ps,		.A2Q684	1,6	0,2			0,2
Il		It	A20683	0,8	0,4	BB-K93		0,4
It	It		1,6	0,4	25		0,4
Il	η	A20680	1,6	0,2	25		0,4
It	Il	3,1	0,1	25		0,4
E.	3,1	. 0,4	25		6,3
Il	6,3	1,6	25		0,1
Il	0,2	6,3	6,		12,5
It	12,5	12,5	12,		1,6
K.	A 20019 3,1	12,5	12,	3,1
Il		0,4	25	12,5
		12,5	25	6,3
A9923		25	0,4
A993O	3,	12,5
AI5150	50
50
>1OO
>100
>100
25
>100

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TABELLE I (Forts.)

	MIC (γ/ml)	" KM⁺, SM-R⁺⁺ .:	BB-K91	BB-K92	>	0,4	BB-K93	Genta
	. aeruginosa A15194	phlei	100	6,3	50 ■	> 100	micin ^C1a
Ps.	GM-R⁺⁺⁺ A20717	ranae	>100	50	50	>100	6,3
Il	GM-R⁺⁺⁺ A20718		>100	50	0,4	> 100	100
«ι-	H6 D-114 HMrE⁺⁺⁺⁺	50	3,1	0,4	100	100
Il	. vulgaris A9436	0,4	0,4		12,5	6,3
Pr.	A9526	0,8	0,4	25	0,2
Il	. mirabilis A9554	3,1	3,1	50	0,2
Pr,	A99OO	3,1.	1,6	50	0,4
Il	, morganii A9553	0,8	0,8	50	0,4
Pr.	A20031	1,6	1,6	100	0,4
Il	. rettgeri A15167				0,8
Pr.	aureus Smith A15167	0,4	0,4	6,3
S.	209P SM-R⁺"¹"	6,3	1,6	50	0,2
Il	KM-R⁺ A20239	1,6	0,8	50 ·	0,8
Il	Subtilis PcI-219 -			0,8
B..	Mycob. 607	3,1	12,5
	Mycob. 607 KM-R⁺ :	^100	>100	0,8
Il	>100	> 100	100
ti	1,6	6,-3	100
It	3,1	12,5	0,4
	0,8

KI-I-R ist kanamycin-re si stent. SM-R⁺⁺ ist streptomycin-resistent. GM-R⁺⁺⁺ ist gentamicin-resistent. IiM-R⁺⁺⁺⁺ ist neomycin-»resistent. .

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Da Gentamicin C₁ eine in der 6* -Position an d-en Methylenkohlenstoff gebundene primäre Aminogruppe besitzt, v/ird das Blockieren der Aminogruppe mit einer Benzyloxycarbony!gruppe ausgeführt, bevor man L— (—)— Y-Aaiino— oo-hydroxybuttersäure (HABA) in die 1-Aminogruppe der Desoxystreptamineinheit gemäß dem folgenden gekürzten Schema einführt: »

Gentamicin (L·

Gbz-NOS vl/

Π5» -N-Cbz-Gentamicin C^ "Ί

ObZ-MCE₂CH₂(JHCO^-NOS OH

I H₂ (Pd/C)

iCG-50 Säulenchromatographie

BB-K91 + BB-K92 + BB-K93

(Monoacyl- (das gev/ünsch-. (Diacylderivat)

derivat)" jbe 1-Acylderi-

vat)

Es ist zu sehen, daß das obige Verfahren drei verschiedene HABA-substituierte Gentamicin C^_a~Derivate liefert, die hier als BB-K91, BB-K92 und BB-K93 bezeichnet werden. BB-K92 ist als 1 - [l-(-) - γ -amino- oc-hydroxybu-tyrylj -gentamicin O^ (Verbindung IV) identifiziert worden. Die Verbindung besitzt eine Aktivität, die mit der von Gentamicin C^, vergleichbar ist unä. ist als solche brauchbar als antibiotisches Mittel. ΕΒ-Κ9Ί ist ein monoacyliertes Derivat, dessen Acylierungsstelle noch- nicht herausgefunden vmrde. BB-K93 ist ein diacyliertes Derivat, dessen Acylierungsstellen noch nicht herausgefunden worden sind.

- 18 409821/1133

Durch Dünnschichtchromatographie (TLC) ist bestätigt worden, daß alle Produkte, BB-K91 bis BB-K93 durch einstündiges Erhitzen in. 0,5 N Natriumhydroxidlösung Gentamicin C₁ und oL-Hydroxy-γ-aminobuttersäure (HABA) wieder freisetzen. Diese Tatsache zeigt ebenso wie die Anwesenheit einer Amido carbonylbande in den Infrarotspektren, daß alle Produkte Gentamicin C₁ -Derivate sind,.die mit L-HABA acyliert sind.

Die Verbindung IV ist wertvoll als antibakterielles Mittel, als Beifuttermittel bei Tierfutter, als therapeutisches Mittel bei Geflügel und Tieren, sowie dem Menschen, und ist insbesondere wertvoll bei der Behandlung von durch grampositive und gramnegative Bakterien verursachten infektiösen Erkrankungen.

Die Verbindung IV ist-brauchbar als Zusatzbehandlung zur präoperativen Sterilisation des Darms, wenn sie oral verab—· reicht wird. Sowohl die aerobe als auch die anaerobe Flora, die gegenüber diesem Mittel empfindlich ist, wird im Dickdarm vermindert. In Verbindung mit angemessener mechanischer Reinigung ist sie bei der Vorbereitung von Darmoperationen wertvoll. ■

Die Verbindung IV ist bei der Behandlung bakterieller Systemerkrankungen bei einer parenteralen Verabreichung in einem Dosierungsbereich von etwa 250 mg. bis etwa 3000 mg pro Tag in aufgeteilten Dosen drei- oder viermal täglich wirksam.. Im allgemeinen ist die Verbindung wirksam, wenn sie in einer Dosierung von etwa 5>0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht, alle. 12 Stunden verabreicht wird.

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Gentamicin C ist ein Komplex von mindestens drei Hauptkomponenten, die sich nur durch den an der 5'—Position der Didesoxy-Zuckereinheit des Gentamicinkerns befindlichen Substituen-

■χ
ten Rr unterscheiden, wie im folgenden gezeigt wird.

CH^

CIL-NH

Gentamicin C₁ -CH-NH-CH3

Gentamicin C₂ ;. -CH-NH₂

Gentamicin C_la

Gentamicin G* wird aus dem Komplex durch das folgende Verfahren erhalten.

Auftrennung des Gentamicin-C-Komplexes

g des Gentamicin-C—Komplexes in Form, der freien Base wird unter Verwendung eines präparativen Gegenstromvertei— lungsapparates (CCD) (100 ml χ 50 Röhren) mit einem Lösungsmittelsystem von CHCl₅-Me0H-17 % wäßriges NH^OH (2:1:1) fraktioniert, wobei die unten aufgeführten Fraktionen erhalten werden.

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M/12386

Identifizierung Menge Dünnschicht-Fraktion Röhre Nr. wiedergewonnen Chromatographie (TLC )

I	25-33	1,46 g	C₁ haup tsächlich
II	32-42	0,72	C₁ * C₂
III	43-47	1,20	^C2^{+ C}1a
IV	48-50	. 0,87	C₁ hauptsächlich

⁺ Zellulose-Dünnschichtplatte, Lösungsmittelsystem: untere Schicht aus CHCl₅-MeOH-I7 % NH^OH (2:2:1), Rf: Gentamicin C₁ (0,69), C₂ (0,39), C₁Z₁ (0,23).

Die Fraktionen I und II werden vereinigt und durch dasselbe CCD-System wie oben wiederum verteilt, wobei 1,94 g der Gentami CXn-C₁—Komponente erhalten werden, die durch Dowex 1 X2— Säulenchromatographie weiter gereinigt wird, wobei 1,70 g im wesentlichen reines Gentamicin C₁ erhalten v/erden. eese ee« ■ee.. ko den in gleicher Vfeise durch CCD und Dowex 1 X2-Chromatographie gereinigt, wobei 1,13 g Gentamicin C₂ und 0,62 g Gentamicin C₁ anfallen...

Dowex 1-X2 ist ein Harz, das aus einem Polystyrol-"backbone" besteht, an das· Benzyltrimethylammoniumchlorid gebunden ist, sowie aus 2 %"Divinylbenzol, die wahrend der Polymerisation als Vernetzungsmittel zugesetzt sind. Es wird in Form von Kügelchen geliefert.

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BEISPIELE

Beispiel 1

Herstellung von L-(-)-y-Benzyloxycarbonylamino-o£-hydroxybuttersäure (VI)

7 ,4 S (0,062 Mol) L-(—)— γ -amino— oC-hydroxybuttersäure werden zu einer Lösung von 5,2 g (0,13 Mol) Natriumhydroxid in 50 ml Wasser zugegeben. Zu der gerührten Lösung v/erden bei 0 bis 5°C während 0,5 Stunden tropfenweise 11,7 S (0,068 Mol) Carbobenzoxychlorid zugegeben,und die Mischung wird bei derselben Temperatur noch 1 Stunde gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 50 ml Äther gewaschen, mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 eingestellt und mit vier 80 ml-Portionen Äther extrahiert. Die Ätherextrakte v/erden vereinigt, mit einer kleinen Menge gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Piltrat wird im Vakuum eingedampft,und der erhaltene Rückstand wird aus Benzol kristallisiert, wobei 11,6 g (74 <fi) farblose Platten vom Schmelzpunkt 78,5 bis 79.5⁰C erhalten werden, föcl ·* 4,5*|"(c = 2, CH₅OH). KBrJ: NJc=O 17²W, 1690 cm . Kernmagnetische Resonanz (KMR) (Aceton-d^) ζ (in ppm von TMS) 2,0 (2H,m), 3,29 (2H,d-d, J=6,7 und 12 Hz), 4,16 (1H,d-d, J=4,5 und 8 Hz), 4,99 (2H,s), 6,2'(2H, breit), 7,21 (5H,s).

Analyse C^^ cNO,-:

H N

ber.:	56	,91	5	,97	5	,53
gef.:	56	,66	5	,97	5	,4-7

- 22. -

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Beispiel 2 ,

N-Hydroxysuccinimidester von L-(-)-"y-Benzyloxycarbonyl- amiiio— oj— hydroxybuttersäure (VII)

Eine Lösung von 10,6 g (0,04-2 Mol) Verbindung VI und 4-,8 g

1
(0,042 Mol) N-Hydroxysuccinimid in 200 ml Äthylacetat wird auf 0°C gekühlt und anschließend werden 8,6 g (0,04-2 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Man laßt die Mischung über Nacht iii einem Kühlschrank stehen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingeengt, wobei farblose Kristalle von Verbindung VII erhalten v/erden, die man abfiltriert; 6,Ag, Schmelzpunkt 121 bis 122,5°C. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der kristalline Rückstand, \tfird mit 20 ml einer Benzol-n-Hexan— mischung gewaschen, wobei zusätzliche Verbindung VII erhalten wird. Die Gesämtausbeute beträgt 13*4- g (92 #). ΓοίΓ] -η 1,5° (c=2, CHOI,) IR (KBr) ^c=O 1810, 1755, 174-0, 1680 cm"'¹.' NMR (Aceton-d₆)S(in ppm von [I¹MS) 2,0, (2H, m), 2,83 $H, s), 3,37 (2H, d-d, J=6,5 und 12,5 Hz), 4-,56 (1H, m), 4-,99 (2H, s), 6,3 (2H, breit), 7,23 (5H, s).

Analyse C^ ^QN₂Qr₇: ■ :

" ... C HN

ber. r	54-	,85	5	,18	8	,00
gef.:	54-	,79/	5	,21/	8	,1V
	54-	,70	5	,20	8	,12

1. G.W. Anderson et al., J. Am. Chem. Soc, 86", 1839 (1964-)

- 23 -409821/1133

Beispiel

Herstellung von 1-[£-(-)-γ-amino-o£-hydroxybutyryIJ gentamicin C^ (IV)

Zu einer Lösung von 379 mg (0,84 Millimol) Gentamicin (L· in 20 ml Wasser-THF (Tetrahydrofuran) Ql :i] werden 210 mg (0,84- Millimol) N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid zugegeben, und die Mischung wird bei Raumtemperatur 4 Stunden gerührt. Man gibt zur Reaktionsmischung 87,3 mg (0,84 Millimol) Natriumcarbonat und 297 mg (0,84 Millimol) N-Hydroxysuccinimidester von L-(-)- ν-benzyloxycarbonylamino—o6-hydroxy— buttersäure. Fach vierstündigem Rühren wird die Mischung 15 Stunden in Gegenwart von 300 mg 10 % Palladium-auf-Aktivkohle hydriert. Der Katalysator v/ird abfiltriert und die.Lösung wird im Vakuum eingedampft, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Das erhaltene wäßrige Konzentrat wird auf eine Säule mit Amberlite—CG—50—Ionenaustauscher (KH^⁺ Form, 25 ml) aufgegeben, die mit 100 ml Wasser gewaschen und nacheinander mit 670 ml" 0,1 Ή HELOH, 610 ml 0,2 N RH₄OH, 640 ml 0,3 N MI^OH, 530 ml 0,5 N NH^OE und 300 ml 1 N ΝΗψΟΕ eluiert wird. Das Eluat wird in 10 ml Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen .werden durch den Ninhydrinspot-Test, den Scheiben-Test und Dünnschichtchromatographie (TLC) auf -Silicagelplatte überprüft.

Die Fraktionen 145 bis 195 werden vereint, im Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wobei 46| mg rohes BB-E91 erhalten werden, das auf einer Säule mit CG-50 (NH^⁺, 8 ml) nochmals Chromatograph!ert v/ird, wobei 32 mg BB-K91 erhalten v/erden.

Die Fraktionen 196 bis 220 werden wie oben beschrieben aufgearbeitet. Nochmaliges Chromatographieren mit CG-50 ergibt

- 24 -

40982 1/1133

33 mg BE-K92 (IV). Die Aufarbeitung der Fraktionen 287 bis 317 liefert 10 mg BB-K93.

Bezeich- Schmelz—

nung punkt (Zers.) Rf Bemerkungen

BB-K91 167-170 0,55 Monoacylderivat BB-K92 183-187 0,40 das erwünschte

1-Acylderivat

BB-K93 200-205 0,17 Diacylderivat

⁺ Dünnschichtchromatographie (TLC): Silicagelplatte, CHCl₅-Me0H-28 % M₄OH-H₂O (1:4:2:1).

Amberlite CG-50 ist der Handelsname für die chromatographische Qualität eines schwach sauren kationischen Austauscherharzes des Carbonsäure-Polymethacryltyps.

Beispiel 4·

Herstellung von L-(-)-y-amino-oL-xhydroxybuttersäure aus Ambutyrosin A oder B oder Mischungen davon

5,0 g Ambutyrosin Ä"jjJS-Patentschrift 3" 541 078, erteilt am 17. November 197O] werden mit 160 ml 0,5 N Natriumhydroxid 1 Stunde unter Rückfluß gehalten. Das Hydrolysat wird mit 6N HCl neutralisiert und über eine Säule mit CG-50 (HH₄ ⁺ Typ) chromatographiert. Die erwünschte L-(-)- γ-Amino- οί,-hydroxy-' buttersäure wird isoliert, indem man die Säule mit Wasser entwickelt und das Wasser durch Gefriertrocknung entfernt. Die L-(-)-y-Amino-oC-hydroxybuttersaure wird als kristallines Material mit einem Schmelzpunkt von 212,5 bis 214,5 C charakterisiert [Üs-Patentschrift 3 541 078, Spalte 2, Zeilen 31 bis 5Ö\ .

- 25 409821/1133

Beispiel 5

Herstellung von L-(-)-Y-Amino-oc-hydroxybuttersäure aus DL- cc -Hydroxy- y -phthalimidobuttersäure

A. Dehydroabietylammonium-L-oC-hydroxy- y-phthalimido— butyrat;

Zu einer Lösung von 25 g (0,1 Mol) 2-Hydroxy- γ-phthalimido-

1
buttersäure in 200 ml Äthanol wird eine Lösung von 29 g (0,1 Mol) Dehydroabietylamin in 130 ml Äthanol zugegeben. Die Lösung wird 1 Minute heftig geschüttelt und 5 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei feine Nadeln auskristallisieren. Die Kristalle werden abfiltriert, mit 50 ml Äthanol gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei 30,1 g (56 %)■ eines Diastereomeren des Dehydroabietylaminsalzes erhalten werden. Schmelzpunkt 93 bis 94⁰C. Gp^JtT" ⁺ (C. 2,5, MeOH). Umkristallisation aus 300 ml Äthanol liefert 23,2 g (43 /Q des reinen Produkts vom Schmelzpunkt 94 bis 95°C. GK] ]f* +10,8° (C. 2,5, MeOH). Weiteres Umkristallisieren ändert weder den Schmelzpunkt noch die spezifische Drehung.

C HN

ber.: 69,54 8,02 5,07 % gef.': " 69,58 8,03 5,07 %

1. Y. Saito et al., Tetrahedron Letters, 1970, 4863.

^B* Ii-(—) — V -Amino— o6 -hydr oxybutt er säure:

Zu einer Lösung von 1,5 S (0,014 Mol) Natriumcarbonat in 40 ril Wasser werden 5,3 g (0,01 Mol) Dehydroabietylamnioniuin-L— <X-hydroxy-γ-phthalijnidobutyrat und 60 ml· Äther gegeben.

- 26 409821/1133

Die Mischung wird heftig geschüttelt, bis sich der gesamte Feststoff gelöst hat. Die Ätherschicht wird abgetrennt. Man wäscht die wäßrige Lösung zweimal mit 20 ml Portionen Äther und dampft unter vermindertem Druck auf 15 ml ein. Zum Konzentrat werden 10 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zugesetzt und die Mischung wird anschließend 10 Stunden unter Rückfluß gehalten. Nach dem Abkühlen wird ausgefallene Phthalsäure abfiltriert. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung wird zur Trockne eingedampft. Diese Operation wird zweimal wiederholt, um überschüssige Chlorwasserstoff— säure zu entfernen. Der zurückgebliebene Sirup" wird in 10 ml Wasser gelöst und filtriert, um eine kleine Menge unlösliche Phthalsäure zu entfernen. Das Piltrat wird auf einer Säule mit IR-120 (H⁺, 1 cm χ 35 cm) adsorbiert, die Säule wird mit $00 ml V/asser gewaschen und mit 1 N Amraoniumhydroxxdlosung eluiert. Das Eluat wird in 15 ml Fraktionen aufgefangen. Die ninhyd'rinpositiven Fraktionen 10 bis 16 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein Sirup erhalten wird, der allmählich kristallisiert. Die Kristalle werden mit Äthanol verrieben, filtriert und in einem Vakuumexsikkator getrocknet, wobei 0,78 g (66 %) L-(*-)-γ -Amino-oL-hydroxybuttersäure vom Schmelzpunkt 206 bis 2O7°C erhalten werden. .

-29° (C. 2,5, H₂O). Das Infrarotspektrum ist mit dem einer aus Ambutyrosin.erhaltenen authentischen Probe identisch.

Amberlite IR-120 ist die Handelsbezeichnung für ein hochdichtes Kern-Sulfonsäure-Typ-Kationenaustauscherharz, das entweder in Wasserstoff- oder Natriumform in Form von Kü— gelchen mit 16 bis 50 Mesh ( 1,16 mm bis 0,29 mm Maschenweite) geliefert wird.

• - 27 -

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M/12886 235 53 A

Beispiel

Herstellung des Monosulfatsalzes von 1 — [L-(—)-γ hydroxybutyryl] -gentamicin £*

Ein Hol 1-£l-(-)-γ-Amino-öl-hydroxybutyryl]-gentamicin C^ (IV)'wird in 1 bis 3 Liter Wasser gelöst. Zu der gekühlten und gerührten Lösung wird ein Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml V/asser, zugegeben. Die Mischung wird 30 Minuten gerührt, worauf kaltes Äthanol zur Mischung zugegeben wird, bis ein Niederschlag auftritt. Die Feststoffe v/erden abfiltriert und als das gewünschte Monosulfat identifiziert.

Beispie]. 7

Herstellung des Disulfatsalzes von 1-|l-(~)—/ -Amino-oC-hydroxybutyryl]-gentamicin (L·

Ein Hol 1-[ΐ,-(-)-γ -Amino-oL-hydroxybutyry IJ-gentamicin C^_a wird in 1 bis 3 Liter Wasser gelöst. Die Lösung wird filtriert, um ungelöste Feststoffe zu entfernen. Zur gekühlten und gerührten Lösung werden 2»Mol Schwefelsäure, gelöst in 100 ml Wasser, zugesetzt. Man rührt die Mischung 30 Minuten und gibt anschließend kaltes Äthanol zur Mischung zu, bis ein Niederschlag auftritt. Die Feststoffe werden abfil— triert und als das gewünschte Disulfatsalz identifiziert.

- 28 409821/1133

Claims

Patentansprüche

1.] Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

CH₂-NH₂

.NH-R

IV

worin R die Bedeutung L-C-)-^-amino-oC-hydroxybutyryl besitzt oder eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen »

A. die an dem 6*-Kohlenstoffatom von Gentamicin CL- befindliche Aminogruppe mit einer gebräuchlichen Aminoschutzgruppe Υ blockiert, wobei"-eine Verbindung der Formel .

409 821/113 3

M/12886

CIU-NH-Y

■KK2

II ·

entsteht;

B. die an der 1-Position der Verbindung der Formel II be· findliche Aminogruppe mit dem L-(-)-Isomeren eines Acylierungsmittels der Formel

OH Ό
I \

W-IiH-CH₂-CH₂-CH-^-COOH

worin W eine gebräuchliche Aminoschutzgruppe darstellt, oder mit seinem funktioneilen Äquivalent als Acylierungsmittel für ein primäres Amin-acyliert, wobei eine Verbindung der Formel

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M/12886

GH₂-KH-Y

III

entsteht, worin Y und W die obigen Bedeutungen besitzen; und

C-. durch an sich bekannte Methoden die Amino schutz gruppe η W und X entfernt, wobei die Verbindung der Formel IV entsteht und gegebenenfalls anschließend das obige Produkt durch an sich bekannte Methoden in ein nichttoxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon überführt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von 1—[L-(—)— γ -Amino-cC-hydroxybutyryl]-gentamicin C^ oder eines.nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Saureadditionssalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen

A-. GentamicinC| mit einem Acylierungsmittel, ausgewählt unter

4 0 9 8 217113 3

M/12886

Q O

^CH₂-O-C-O-

CH, 0

CH^-C-O-C-N,

<r^H3

CH

CH₂-O-C-X

Vc-X , X-CH₂-C-X

J-

X-CH₀-C-OH , (oder einem Carbodiimid davon) oder

-CH-CH-CO₂H (oder einem Carbodiimid davon),

4- 5
worin R und R^ gleich oder verschieden sein können und H, i¹, Cl, Br, NO₂, OH, Niedrigalkyl oder Niedrigalkoxy, X Chlor, Brom oder Jod bedeuten, oder mit einem funktionellen Äquivalent als Acylierungsmittel in einem Verhältnis von einem Mol oder weniger Acylierungsmittel pro Mol Gentamicin C^ in einem Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb 50⁰C acyliert, wobei die Verbindung der Formel

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.M/12886

CH₂-NH-Y

II

entsteht, worin Y ein Rest der Formeln

O CH-*

» ι ·? Il

CH₂-O-C- , CH₅-C-O-C- , O₂N

Il X-CH₂-C-

oder

Il

-CH₂-CH₂-C-;

Zl 5

ist, worin R und R die obigen Bedeutun'gen besitzen;

B. Verbindung II mit dem L-(-)-Isomeren eines Acylierungs* mittels der Formel

-33 -

409821/1

M/12886

OH VZ-NH-CH₂-CH₂-CH-C-M

VII

worin. W ein Rest, ausgewählt unter

ί^Η3

CH₂-O-C- ,

Il

X-CH₂-C-

oder

TO-

ο ο

Il ■ Il

C-CH₂-CH₂-C-;

- 4- S
ist, worin E. und Ir die obigen Bedeutungen besitzen und

M einen Rest der Formeln

-O-N 0

■NO» , ·-

oder

^ ι - ^1M

bedeutet, "in einem Verhältnis von mindestens 0,5 KoI Verbindung VII pro Mol Verbindung II in. einem Lösungsmittel acyliert, wobei eine Verbindung der Formel

- 34. -

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M/12886

CH₂-NH-Y

III

entsteht, worin Y und W die obigen Bedeutungen besitzen; und-

C. die Blockierungsgruppen Y und V/ durch, an sich bekannte Methoden aus der Verbindung III entfernt, wobei die Verbindung der lOrmel IV entsteht und gegebenenfalls anschließend das Produkt durch an sich, bekannte Methoden in ein nichttoxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon überführt.

;>. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

(1) in Stufe A Gentamicin CL mit einem Acylierungsmittel der Formel

H₂-O-C-O-

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worin R und R^ die in Anspruch 2 aufgeführten Bedeutungen besitzen, in einem Lösungsmittel ausgewählt unter Dimethylformamid, Dirnethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2— Dimethoxyäthan, Methanol, Äthanol, Wasser, Aceton, Pyridin, N-Niedrigalkylpiperidin oder Mischungen davon umsetzt, und

(2) in Stufe B ein Acylierungsmittel der Formel

O OH η

'CH₂-O-A-NH-CH₂-CH₂-CH-C-O-N'

worin R und Ή? die in Anspruch 2 aufgezeigten Bedeutungen besitzen, mit Verbindung II in einem Verhältnis von etwa 0,5 bis etwa 1,4· Mol Acylierdungsmittel pro Mol Verbindung II in einem Lösungsmittel, ausgewählt unter Mischungen von Was-

ser und Äthylenglycoldimethyläther, Dioxan, Dimethylaeetamid, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Propylenglycoldimethyläther umsetzt.

4·. Verfahren gemäß Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß'

(1) Stufe A in Dimethylformamid als Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb 25°.Q durchgeführt wird, und

(2) die Acylierungsreaktion von Stufe B in 1:1 Wasser/Äthylenglycoldimethyläther als Lösungsmittel in einem Verhältnis von etwa 0,8 bis 1,1 Mol Acylierungsmittel pro Mol Verbindung II 'durchgeführt wird.

5. Verfahren gemäß Ansprüchen 3 oder 4, dadurch gekennzeictmet, daß die Blockierungsgruppen W und Y in Stufe C durch Hydrierung von Verbindung III mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators in einem aus Wasser und

- 36 409821/1133

M/12S86

einem pit Wasser mischbaren Losungsmittel "bestehenden Lösungsmittelsystem entfernt werden.

6:. Verfahren gemäß·Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß die BloelEierungsgruppen W und Y durch Hydrierung von Verbindung III mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium,, Platin, Raney-liieteel _f Bhodium_?: Buthenium oder Hickel in einem Lösungsmittel system,, ausgewählt UÄter Wasser und Dioxan, tetrahydro— furan_r Ithylenglycoldimethylather oder Propylenglycoldimethyläther entfernt werden. -

Verbindung der Formel

m.

worin K die Bedeutung L·-C^)~7^ί~9^ffl;:i·^1:ϊO"-^oέ_!,-hydroxybutyryl besitzt oder· ein nichttoxisehes^ phariaaaeutisch verträgliches Saureadditionssalz davon« . *

8-, las Eonosulfätsalz der Verbindung gemäß Anspruch 7· 9» Das Disiilfaftsalz der Verbindung gemäß Anspruch 7·

T/1133

M/12886

"10. Die Mono- oder Polyhydrate der Verbindung gemäß Anspruch 7.

11. Die Mono— oder Polyhydrate der Verbindung gemäß Anspruch 8.

12. Die Mono- oder Polyhydrate der Verbindung gemäß Anspruch 9.

13. Verbindung der Formel

CH₂-NH-R¹

-KH-R

HO

worin R die Bedeutung CgHrCH₂OC- besitzt und R Wasserstoff oder L-(— )-Y-benzyloxycarbonylamino— o(j-hydroxybutyicyl bedeutet.

- 38,-

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