DE2307976B2

DE2307976B2 - 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure, Verfahren zu dessen Herstellung und Verfahren zur Herstellung von Bleomycinsäure

Info

Publication number: DE2307976B2
Application number: DE2307976A
Authority: DE
Inventors: Akio Tokio Fujii; Takeyo Omiya Saitama Fukuoka; Tomohisa Asaka Saitama Takita; Hamao Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1972-02-17
Filing date: 1973-02-17
Publication date: 1979-12-06
Also published as: JPS5547039B2; CA971165A; JPS4885580A; US3886133A; DE2307976C3; AU5231173A; NL170961C; DK149200C; AR195903A1; FR2181741B1; DE2307976A1; AU466969B2; NL170961B; NL7301942A; FR2181741A1; DK149200B; GB1364036A

Description

Bleomycine sind Antitumor-Antibiotika. Es handelt sich um wasserlösliche basische Glycopeptide, welche mit zweiwertigem Kupfer chelatisiert sind. Sie verden durch Streptomyces verticillus erzeugt, und sie wurden erstmals durch Hamao Umezawa, et al, im Jahr 1966 gefunden (Journal of Antibiotics 19A, Seite 200, (1966)).

Es sind sechzehn verschiedene Bleomycine bekannt, von denen Bleomycin Ai, A₂, A5 und B₂ besonderes

NH₂ NH₂

C=O

Interesse haben. Die Isolierung wurde nach herkömmlichen Methoden durchgeführt Sie werden in Form ihrer Komplexe zur Behandlung von Plattenzellcarzinomen oder Schuppenzellcarzinomen, bösartigen Lymphomen und cerebralen Tumoren verwendet Sie zeigen Antitumoreffekte und eine breite Krebsindikation.
Bleomycine haben die folgende allgemeine Formel

CH₂ NH CH₂ C

O OH CH N

CH O CH CH

H CH N CHj O CH₃ CH

Verschiedene Gruppen (R) und die zugehörigen Bezeichnungen sind nachstehend zusammengestellt:

R-Gruppe

-NH-CH₂-CH₂-CH₂-S-CH₃

CH₃
-OH
— 0-CH₂-CH₅-CH₁-NH,

Verbindung S-Methylmercaptopropylaminobleomycin (Desmetfciylbleomycin A₂)

S-iS.S-DimethylmercaptoJ-propylamino-bleomycin

Bleomycinsäure

3-Aminopropylester der Bleomycinsäure.

Es ist bekannt, daß beim Impfen und Kultivieren von Streptomyces verticillus in einem Nähnrmdium Bleomycine hergestellt werden können. Wenn ein Amin entsprechend dem Seitenkettenamin des angestrebten Bleomycins als Precursor zugesetzt wird, so bildet der Mikroorganismus jeweils ein neuartiges Bleomycin mit einer Peptidbindung des entsprechenden Amins gemäß der Gruppe R, und dieses Antibiotikum kann isoliert werden (BE-PS 7 45 926).

Bei diesem Fermentierverfahren ist die Zahl der verschiedenen endständigen Amingruppen jedoch beschränkt. JO

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, den 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure zu schaffen, sowie dessen Säureadditionssalze und Kupferkomplex sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Gegenstand der Erfindung ist somit außer den im vorstehenden Anspruch 1 gekennzeichneten Stoffen ein Verfahren zur Herstellung des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure oder der Säureadditionssalze oder des Kupferkomplexes derselben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man 3-Methylmercaptopropylaminobleomycin, dessen Säureadditionssalze oder Kupfer-Komplex in einer angesäuerten wäßrigen Lösung mit der 1- bis 50fachen molaren Menge an

a) Halogencyan oder

b) Halogenessigsäure oder deren niederen Alkylestern oder deren Amid, ggfs. nach Zugabe eines organischen Lösungsmittels, bei 0 bis 9O⁰C umsetzt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das 3-Methylmercaptopropylaminobleomycin in einer angesäuerten wäßrigen Lösung, welche Mineralsäure, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure oder eine organische Säure, wie Ameisensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Weinsäure enthält, aufgelöst, worauf die Lösung mit dem erwähnten Halogenid, wie Bromcyan, Jodessigsäure, Äthylbromacetat, Jodacetamid in der 1 - bis 50fachen molaren Menge, vorzugsweise in der 3- bis 30fachen molaren Menge bezogen auf das 3-Methyl-mercaptopropylamino-bleomycin vermischt und vorzugsweise während 14 h bis 48 h bei 0 bis 90° C umgesetzt wird. Zur Erhöhung der Löslichkeit der Halogenverbindung ist es möglich, ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Methylglykol zuzusetzen.

Bei dieser Reaktion wird die Halogenverbindung an das S-Atom der 3-Methylmercaptopropylgruppe (I) addiert, wobei eine Gruppe der Formeln

CN -CH₂COOH
CH₂COOR₁

-CH₂CONH₂

eingeführt wird.

Auf diese Weise wird eine Sulfoniumsalzstruktur (II) gebildet. Sodann wird diese Gruppe wieder zusammen mit der Methylmercaptogruppe entfernt, wobei sich eine Iminolactonstruktur (III) ausbildet. Sodann wird die Iminobindung unter Ausbildung einer Esterbindung hydrolysiert, wobei der 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure (IV) erzeugt wird.

Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich bei Zimmertemperatur. In einigen Fällen wird jedoch die Umwandlung der Struktur (II) in die Struktur (IV) durch Erhitzen der Reaktionsmischung auf 80 bis 90⁰C während 30 bis 40 min beschleunigt, wenn bestimmte Halogenverbindungen wie Jodacetamid eingesetzt werden.

Wenn der pH der wäßrigen Lösung unterhalb 1,0 liegt, so ist es bevorzugt, auf etwa 0⁰C abzukühlen, um Nebenreaktionen des Bleomycins zu vermeiden. Die Reaktion wird im folgenden anhand eines Formelschemas veranschaulicht, welches nur die Endgruppe —COR des Bleomycins zeigt.

L C-NH Il	I 1 , H₂ I	\² CH₂	RX	—C — Il	/ NH	CH₂-CH₂ Ζ⁰"²
Il ο	ι	/		Il O		R— S- X ι
	(	H,				CH₃

(I)

(11)

5	// — C \	23	07	976	O Il —c	6
(R-S-CH₃)		-CH,	CH₂	H₃O		H₃N-CH₂
		-CH₂
	N ί		\ / O CH₂
	\ O

(III)

Im folgenden seien die bei der Aufarbeitung verwendeten Ionenaustauschharze, Gelfiltrationsmittel, Adsorptionsmittel und dünnschichtchromatographischen Mittel kurz charakterisiert (® = geschützte Bezeichnung).

CM-Sephadex® C-25:

Trockenes unlösliches Pulver aus mikroskopischen Körnchen aus Polysaccharid Dextran mit Carboxymethylgruppen;

Amberlite® CG-50:

schwachsaures Ionenaustauscherharz;

Amberlite® IR-45:

schwach basisches Anionenaustauscherharz vom Polyamintyp auf Basis eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren;

Dowex®(OH--Typ):

Ionenaustauscherharz, welches dem Amberlite IR-45 entspricht;

Sephadex® G-25:

Gelfiltrationsmittel, bestehend aus Dextran-Derivaten;

Siiicagel G:

Adsorptionsmittel für die Dünnschichtchromatographie, bestehend aus Siiicagel und Gips;

Avicel® SF:

Dünnschichtchromatographie-Platte bestehend aus kristalliner Cellulose;

Amberlist® 15:

stark saures Kationenaustauscherharz vom Macroreticular-Typ mit Sulfonsäuregruppen auf Basis eines Styroi-Divinylbenzol-Copolymeren;

Amberlite® XAD-2:

Adsoprtionsharz aus einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren.

Nach der Reaktion w^;rd die überschüssige Halogenverbindung entfernt Zum Beispiel wird eine flüchtige Verbindung, wie Bromcyan unter vermindertem Druck abgezogen.

Es ist bevorzugt, die Jodessigsäure oder dgl. durch

CH,

(IV)

Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wif

ίο Äther, zu entfernen. Dann wird die Reaktionslösunj mit Natriumhydroxid in wäßriger Lösung bis zu einen pH von 4,5 bis 5,0 neutralisiert. Nach der Neutralisatior werden das Produkt und das nicht umgesetzte Bleo mycin an einem schwach sauren lonenaustauscherhar; (Amberläte® CC-50) (H+ -Typ) adsorbiert, indem mar die Lösung durch eine mit dem Ionenaustauscherhan gepackte Säule, welche mit destilliertem Wasser gefüll ist, laufen läßt.

Die Säule wird mit Wasser gewaschen und danacl mit einer 0,1 bis l,O°/oigen wäßrigen Essiglösung gewä sehen, worauf manjnit einer sauren Methanol/Wasser Mischung, z. B. einer Mischung von 50% Methanol unc 0,02 n-HCl eluiert, wobei eine Fraktion mit einem Ab sorptionsmaximum bsi 290 ΐημ abgetrennt wird. Di< Fraktion wird mit Pyridin vermischt, wobei der pH au 4,5—5,0 eingestellt wird. Die Lösung wird konzentrier und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei mai ein rohes Pulver erhält. Das Produkt wird mit 0,05 M Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung bei pH 4,5 gepuffer und auf eine mit CM-Sephadex® C-25 gepackte Säul< gegeben.

Das Reaktionsprodukt und das nicht umgesetzt! Bleomycin können in zwei Fraktionen aufgetrennt wer den, wenn man mit der Pufferlösung bei dem gleichet pH eluiert, wobei jedoch die Konzentration der Pyridin Essigsäure-Pufferlösung allmählich von 0,05 M au 0,5 M erhöht wird. Das nicht umgesetzte Bleomycii wird mit einer 0,3 M-Pyridin-Essigsäure-Pufferlösun| eluiert, während der 3-Aminopropylester der Bleo myeinsäure mit einer 0,5 M-Pyridin-Essigsäure-Puffer lösung eluiert wird. Demgemäß wird das Eluat de 0,5 M-Lösung abgetrennt und getrocknet und danacl aus Methanol/Äther umgefüllt, wobei man ein amor phes Pulver des Diacetats · des 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure erhält. Dieses läßt man über Am berlite® IR-45 (Cl--Typ) laufen, so daß das Dihydro chlorid des 3-Aminopropy!esters der Bleomycinsäun (Cu-Komplex) erhalten wird. Die Eigenschaften de Dihydrochlorids des 3-Aminopropylester der Bleo myeinsäure (Cu-Komplex) sind in Tabelle I zusammen gestellt.

Tabelle I

Aussehen
Löslichkeit

Reaktionen

blaues amorphes Pulver

löslich in Wasser, Methanol, Essigsäure, schwach löslich in Dimethylsulfoxid und unlöslich in Äthanol, Aceton, Äther, Benzol
Ninhydrinreaktion (+)
Dragendorfreaktion (+)
Pauly- und Ehrlich-Reaktion (+)
Tollens-Reaktion (—)
Eisenchloridreaktion (—)
Fehling- und Molisch-Reaktion (—)
Sakaguchi-Reaktion (—)

Fortsetzung

Schmelzpunkt
spezifische Drehung

Dünnschicht-Chromatographie (Rr-Wert)
Papier-Chromatographie (R_f-Wert)

(Zersetzung) bei 201 -203⁰C
[λ] & = -78,6° (c=0,l destilliertes Wasser)
*) (a) 0,74 (b) 0,50

0,80 (Toyo-Filterpapier Nr. 51: 10% Ammoniumchlorid)

0,815 (bei 3000 V während 40 min) (25 : 75 : 900 Ameisensäure : Essigsäure : Wasser)
290 ιτιμ (131)
246 mu. (147)
in destilliertem Wasser

bei 3400, 1720, 1660, 1640, 1575, 1460, 1220, 1050, 765(CiTi-¹)

Elementar-Analyse (%), berechnet als C₅₃H₇₆Ni₆O₂2S₂Cu · 2 HCl · H₂O: Berechnet: C 42,21, H 5,35, N 14,87, 0 24,40, S 4,25, Cl 4,70, Cu 4,21; gefunden: C 41,82, H 5,41, N 15,31, 0 24,52, S 4,19, Cl 4,46, Cu 4,22.

Papierelektrophorese (Rm-Wert Alanin: 1,0)

Ultra violett-Absorptions-Maximum
ηιμ(Ε!^)

Infrarot-Absorptions-Spektrum (KBr-Methode)

*) (a) Silicagel G, Methanol: 10% Ammoniumacetat= 1 :1.

(b) Avicel® SF, n-Propanol : Pyridin : Essigsäure : Wasser= 15:10:3:12.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Produkts ist in F i g. 1 dargestellt, und das Infrarotspektrum des Produkts (als KBr-Preßling) ist in F i g. 2 dargestellt.

Der erhaltene 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure kann leicht in die Bleomycinsäure umgewandelt werden. Hierzu wird das Hydrochloridsalz oder das Essigsäuresalz des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure in destilliertem Wasser aufgelöst, und die Lösung wird durch Zugabe von Salzsäure auf pH 2,0 bis 5,5 eingestellt Die Lösung wird in einem Autoklaven oder in einem offenen Reaktionsgefäß auf 40 bis 120⁰C erhitzt, wobei die endständige 3-AminopropyIgruppe selektiv in Form von 3-Aminopropanol entfernt wird und die Bleomycinsäure gebildet wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher das im vorstehenden Anspruch 5 aufgezeigte Verfahren zur Herstellung von Bleomycinsäure. Bei dieser Reaktion ist der pH-Bereich wichtig. Bei einem pH oberhalb 5,5 überwiegt die Nebenreaktion unter Erzeugung von 3-Hydroxy-propylamino-bleomycin durch N,O-AcyI-umlagerung, wodurch die Ausbeute an Bleomycinsäure stark herabgesetzt wird. Bei einem pH unterhalb 5,5 wird die Geschwindigkeit der Hydrolyse der Esterbindung mit abnehmendem pH-Wert erhöht. Wenn jedoch der pH zu niedrig ist, so kommt es leicht zu einer Nebenreaktion aufgrund einer Zersetzung der glycosidischen Bindung. Demgemäß beträgt der optimale pH-Bereich 2,0 bis 5,5. Die Reaktionsdauer beträgt je nach dem pH-Wert und je nach der Reaktionstemperatur 1—24 h.

Zur Isolierung des Reaktionsproduktes wird die Reaktionslösung mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid neutralisiert, so daß der pH auf 6 bis 7 steigt, worauf die Lösung mit Wasser verdünnt wird, so daß die Konzentration des anorganischen Salzes bei weniger als 0,05 M liegt, und die verdünnte Lösung wird sodann über eine mit CM-Sephadex® C-25 (Na+-Typ) oder mit Amberlite® CG-50 (Na+-Typ) gefüllte Säule geschickt, um das Produkt zu isolieren. Das Produkt wird mit destilliertem Wasser eluiert, wobei Bleomycinsäure eluiert wird, während der nicht umgesetzte 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure adsorbiert bleibt. Demgemäß wird die Fraktion der Bleomycinsäure, welche ein Absorptionsmaximum bei 292 ΐημ hat, abgetrennt. Ferner wird das Eluat mit Amberlit XAD-2 oder mit Aktivkohle durch Säulenchromatographie-Adsorption und skuzessive Elution zur Entsalzung behandelt, und das Eluat wird neutralisiert, wobei der pH-Wert auf 6 bis 7 eingestellt wird. Sodann wird die Lösung konzentriert und zu einem amorphen Pulver getrocknet. Insbesondere aus saurer Lösung bei einem pH unterhalb 4,5 wird Bleomycinsäure in Form eines amorphen Pulvers als Monohydrochlorid isoliert Die Eigenschaften der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) sind in der Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

(1) Aussehen:

(2) Löslichkeit:

(3) Reaktionen:

(4) Schmelzpunkt (Zersetzung):

blaues amorphes Pulver

löslich in Wasser;

schwach löslich in Methanol, Essigsäure, Di methylsulfoxjd;

unlöslich in Äthanol, Aceton, Äther, Benzol

Pauly- und Ehrlich-Reaktion (+) Dragendorf-Reaktion (—) Ninhydrin-Reaktion (—) Tollens-Reaktion (—) Eisen(in)-chlorid-Reaktion (-) Fehling- und Molisch-Reaktion (—) Sakuguchi-Reaktion (—)

224-227°C

228-250⁰C (Hydrochlorid)

Fortsetzung

spezifische Drehung:

Dünnschicht-Chromatographie (Rf-Wert)
Papier-Chromatographie (Rf-Wert)

Papierelektrophorese
(Rm-Wert... Alanin: 1,0)

Ultraviolettabsorptions-Maximum

infrarot-Absorptions-Spektrum

(KBr-Methode)

Elementaranalyse (%) als C60H69N55O22S2C11:

Berechnet: C 44,16, H 5,11, N 15,45, 0 25,88, S 4,72, Cu 4,57; gefunden: C 43,56, H 5,27, N 16,25, 0 25,60, S 4,68, Cu 4,51.

(al Silicagel G Methanol: 10% Ammoniumacetat: 10% Ammoniakwasser= 10:9: (b) Avicel® SF n-Propanol: Pyridin : Essigsäure : Wasser= 15 :10 :3 :12.

[λ]/I₆ -81,5° (Hydrochlorid) (c= 0,1 destilliertes Wasser)
*)(a) 0,78
(b) 0,46

0,86 (Toyo-Filterpapier Nr. 51; 10% Ammoniumchlorid)

0,65 (bei 3000 V während 40 min; 25 :75 :900 Ameisensäure : Essigsäure : Wasser) 292 πιμ (145)

246 m^ (148)

in destilliertem Wasser

bei 3350 , 1720, 1670,1640,1580,1460,1365,1050, 770 (cm-¹)

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Produktes ist in F i g. 3 gezeigt, und das Infrarotspektrum des Produktes gemessen mit der KBr-Tablettenmethode ist in F i g. 4 gezeigt.

Das Dihydrochlorid des 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure (Kupfer-Komplex) hat die folgenden biologischen Aktivitäten:

(1) Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität

Die antimikrobielle Aktivität wurde mit der Zylinder-Agar-Plattenmethode gemessen, und zwar im Vergleich mit Bleomycin A₂ (Kupfer entfernt) als Standard (1000 μ/mg). Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Getesteter Mikroorganismus

Antimikrobielle

Aktivität

u/mg

Mycobacterium smegmatis 607 1335
Bacillus subtilis PCI-219 1150

Tabelle IV

Dosis (mg/kg) 8,1 2,7

Hemmwirkung (%) 69,9 69,9

(2) Antitumor-Effekte

Hemmwirkung gegenüber Ehrlich's solidem Tumor und Bestimmung von ED50

2 χ 10⁶/Maus Ehrlichs ascites Carcinomzellen wurden in das Hypoderm von ICR-S LC-Mäusen (männlich) in der Leistengegend transplantiert, und nach 24 h wurde das Produkt mit einer physiologischen Salzlösung nach der 3fachen Verdünnungsmethode verdünnt, worauf eine physiologische Salzlösung, welche das Dihydro-Chlorid des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure enthielt, den Mäusen dirch intraperitoneale Injektion in einer Menge von 8,1 mg/kg—0,03 mg/kg täglich während 10 aufeinander folgender Tage verabreicht. Die Mäuse wurden 14 Tage nach der ersten Verabreichung gehalten und dann getötet. Der Tumor wurde entfernt und gewogen. Die Hemmwirkung (%) wurde im Vergleich zu den Ergebnissen bei Kontrollversuchen, bei denen physiologische Salzlösung verabreicht wurde, berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusam-

45 mengestellt.

0,9 68,7

0,1
6,5

0,03 0

Berechnungen des ED50-Wertes aus den Ergebnissen gemäß Tabelle IV zeigen, daß der EDw-Wert 0,4 mg/kg/Tag betrug (1Ofache Verabreichung).

Es ist möglich, beliebige Arten von Aminen an die endständige Carboxylgruppe durch chemische Reaktion anzuknüpfen, ohne daß diese Reaktion wie bei herkömmlichen Fermentaüonsverfahreh zur Herstellung von Bleomycinen irgendwelchen Beschränkungen unterliegt Somit ist die Bleomycinsäure eine recht eo wichtige Schlüsselverbindung.

Bevorzugt wendet man den Cu-Komplex des 3-Methylmercaptopropylamino-bleomycins oder des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure an. Dabei handelt es sich um eine Chelatverbindung mit einem Cu++. Bei der Chelatisierung von Cu++ werden die Seitenreaktionen gehemmt, und die Stelle des Bleomycins wird bei der Säulenchromatographie sichtbar, da der erhaltene Cu-Chelat-Komplex eine blaue Färbung hat Es ist jedoch möglich, ein Produkt zu verwenden, bei dem das Cu entfernt wurde, und zwar mit herkömmlichen Cu-Entfernungsmethoden.

Wie bereits erwähnt dient die erfindungsgemäß hergestellte Bleomycinsäure als Ausgangsmaterial für die Herstellung spezifischer bekannter Bleomycine und neuartiger Bleomycine. Der 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure bildet ein Zwischenprodukt bei der Herstellung der BJeomycinsäüre.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert

Beispiel 1

1,0 g des Hydrochloride des 3-Methylmercaptopropylaminbleomycins (Cu-Komplex, erhalten gemäß

US-PS 39 60834) wurde in 20 ml 1% Trifluoressigsäure in wäßriger Lösung aufgelöst und 2,0 g Bromcyan wurden unter Rühren hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde bei pH 0,7 gehalten. Das Reaktionsgefäß wurde dicht verschlossen, und der Inhalt wurde bei 27⁰C während 18 h gerührt, worauf der Überschuß des Bromcyans unter vermindertem Druck abgezogen wurde. Sodann wurde eine 2 N-Natriumhydroxydlösung in Wasser hinzugegeben, wobei heftig umgerührt wurde, und die Lösung erhielt einen pH von 5,1.

Diese Lösung wurde auf eine mit Amberlite® CG-50 (H+-Typ) gepackte 150-ml-SäuIe gegeben, welche mit Wasser gefüllt war, und danach wurde mit 400 ml einer wäßrigen 0,3%igen Essigsäurelösung und mit 200 ml destilliertem Wasser fortschreitend ausgewaschen. Nach dem Waschen wurde die blau gefärbte Fraktion, welche das Bleomycin enthielt, durch 0,02 N-HCI Methanol (1:1) eluiert und abgetrennt, worauf das Methanol unter vermindertem Druck abgezogen wurde. Die restliche Lösung wurde auf pH 4,5 durch Zugabe von Pyridin eingestellt, worauf diese auf eine mit CM-Sephadex® C-25 gepackte 100-ml-Säule gegeben wurde, welche mit 0,05 N-Pyridin-Essi,?säure-Pufferlösung auf pH 4,5 gepuffert war, wobei das Bleomycin adsorbiert wurde.

Ferner wurden 100 ml 0,2 N-Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung mit dem gleichen pH durch die Säule geschickt, worauf 100 ml einer O,3N-Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung mit dem gleichen pH hindurchgeschickt wurden, worauf das nicht umgesetzte Bleomycin zu eluieren begann. Demgemäß wurden 100 ml der ersten Fraktion abgetrennt, wobei 254 mg des Ausgangsmaterials (Bleomycin) gewonnen wurden. Nach dem Eluieren einer weiteren 80-ml-Fraktion wurden 115 ml 0,5 N-Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung aufgegeben, worauf der 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure zu eluieren begann. Danach wurden 200 ml einer blau gefärbten Fraktion abgetrennt und unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet

Das Produkt wurde in Methanol/Äther aufgelöst und ausgefällt, wobei 528 mg eines blau gefärbten amorphen Pulvers des Essigsäuresalzes des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Kupfer-Komplex) erhalten wurden. Dieses Pulver wurde auf eine mit einem schwach basischen Ionenaustauscherharz (Amberlite® IR-45; Cl--Typ) gepackte 20-ml-Säule gegeben. Der Durchlauf wurde konzentriert und getrocknet, wobei 497 mg eines blau gefärbten amorphen Pulvers des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) erhalten wurden.

Beispiel 2

100 mg des Hydrochloride des 3-Methylmercaptopropylamino-bleomycins (Cu-Komplex) wurden in einer Mischung von 1 ml 0,2 N-HCI und 1 ml Methanol aufgelöst und 523 mg Jodacetamid wurden unter Rühren hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 27° C während 20 h in einem verschlossenen Rohr gerührt, das überschüssige Jodacetamid wurde mit Äther zur Entfernung desselben extrahiert Die verbleibende Lösung wurde auf 85° C während 35 min erhitzt, und danach wurde der pH durch Zugabe von 2 N-Natriumhydroxyd in wäßriger Lösung auf 5,0 eingestellt Gemäß Beispiel 1 wurde das Produkt isoliert, wobei 29,5 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) erhalten wurden.

Beispiel 3

100 mg des Hydrochloride des 3-Methylmercaptopropylamino-bleomycins (Cu-Komplex) wurden in 2 ml 95% Essigsäure aufgelöst, und 240 mg Bromcyan wurden unter Rühren hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 27°C während 24 h in einem verschlossenen Rohr gerührt. Das überschüssige Bromcyan wurde unter vermindertem Druck abgezogen, und die Reaktionslösung wurde durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von 2 N-Natriumhydroxyd auf pH 5,1 eingestellt. Gemäß Verfahren des Beispiels 1 wurde das Produkt isoliert, und man erhielt 17,9 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex).

Beispiel 4

100 mg des Hydrochloride des 3-Methylmercaptopropylaminobleomycins (Cu-Komplex) wurden in 2 ml 0,13 N-Bromwasserstoffsäure aufgelöst und 100 mg Bromcyan wurden unter Rühren hinzugegeben. Gemäß Beispiel 3 wurde die Reaktionsmischung behandelt, wobei man 29,6 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) erhielt.

Beispiel 5

100 mg des Hydrochlorids des 3-Methylmercaptopropylaminobleomycins (Cu-Komplex) wurden in einer Mischung von 1 ml 0,2 N-HCl und 1 ml Äthanol aufgelöst, und 47,74 mg Äthylbromacetat wurden unter Rühren hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 27°C während 20 h in einem verschlossenen Rohr gerührt Der Überschuß an Äthylbromacetat wurde mit Äther extrahiert, und die restliche Lösung wurde auf pH 5,0 durch Zugabe von 2 N-Natriumhydroxyd eingestellt. Gemäß Beispiel 1 wurde das Produkt isoliert, und man erhielt 92 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex).

Beispiel 6

100 mg des Hydrochlorids des 3-Methylmercaptopropylaminobleomycins (Cu-Komplex) wurden in 4 ml einer wäßrigen Lösung von 1 % Trifluoressigsäure aufgelöst und 36,06 mg Jodessigsäure unter Rühren hinzugegeben. Die Mischung wurde 24 h bei 27°C im verschlossenen Rohr gerührt Gemäß Beispiel 1 wurde das Produkt behandelt, wobei 14 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) erhalten wurden.

Beispiel 7

100 mg des Hydrochlorids des 3-Methylmercaptopropylaminobleomycins (Cu-Komplex) wurden in 2 ml 1 N-H2SO4 aufgelöst und 100 mg Bromcyan wurden unter Rühren hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 0⁰C während 48 h im verschlossenen Rohr gerührt Das überschüssige Bromcyan wurde unter vermindertem Druck abgezogen, und die Reaktionslösung wurde durch Zugabe von 2 N-Natriumhydroxydl auf pH 5,0 eingestellt Gemäß Beispiel 1 wunde das Produkt isoliert, und man erhielt 26 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex).

_g5 Beispiele

100 mg des Hydrochlorids des 3-MethyImercaptopropylaminobleomycins (Cu entfernt) wurden in 2 ml 0,1 N-HQ aufgelöst und 200 me Bnomcvan wurden hin-

zugegeben. Die Mischung wurde bei 27° C während 24 h im verschlossenen Rohr gerührt. Gemäß Beispiel 1 wurde das Produkt isoliert, und man erhielt 24 mg eines blaßgelben Pulvers des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu entfernt). Das s Produkt wurde in Wasser aufgelöst, und 10 mg basisches Kupfercarboriat wurden darin suspendiert und 30 min umgerührt Das überschüssige basische Kupfercarbonat wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde durch Säulenchromatographie behandelt, indem man es ;o auf eine mit Sephadex G-25 gepackte Säule gab. Man erhielt 25 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex).

Bei spiel 9 _|5

1,0 g des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde auf pH 4,0 durch Zugabe von 0,1 N-HCl eingestellt Die Mischung wurde auf 105⁰C während 6 h in einem verschlossenen Rohr erhitzt. Die Reaktionslösung wurde auf pH 6,5 durch Zugabe von 0,1 N-Natriumhydroxyd eingestellt und durch eine mit 20 ml CM-Sephadex® C-25 (Na⁺-Typ) gepackte Säule laufen gelassen. Nach Entfernung von 10 ml des ersten Durchlaufs wurden 50 ml destilliertes Wasser durch die Säule geschickt wobei die gesamte entstandene Bleomycinsäure abgetrennt wurde. Die Lösung wurde auf eine 100-ml-Säule, welche mit einem nicht-ionischen Harz Amberlite XAD-2 gepackt war und mit destilliertem Wasser gefüllt war, gegeben, so daß die Bleomycinsäure adsorbiert wurde. Nach dem Auswaschen der Säule mit 200 ml destilliertem Wasser wurde das Produkt mit 200 ml einer Mischung von 0,0025 N-HCl und Methanol (1 :1) cluiert Die Bleomycinsäure wurde in 70 ml der letzten Fraktion eluiert. Der Durchlauf wurde unter Verwendung von Dowex"44 (OH--Typ) auf pH 6,5 eingestellt, und die Lösung wurde eingeengt und zur Trockene gebracht, und das Produkt wurde aus Aceton, welches Wasser enthielt umgefällt, wobei 780 mg eines blau gefärbten amorphen Pulvers der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) erhalten wurden. Wenn die mit CM-Sephadex C-25 gepackte Säule mit 0,5 M-NaCl behandelt wurde, wurden 185 mg nicht umgesetzten Bleomycins zurückgewonnen.

Beispiel 10

1,0 g des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) wurden in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst, und die Lösung werde durch Zugabe von 0,1 N-IiCl auf pH 2,5 eingestellt. Die Mischung wurde während 1 h auf 100° C erhitzt, und die Reaktionslösung wurde durch Zugabe von 0,1 N-Natriumhydroxyd auf pH 6,5 eingestellt. Danach wurde die Lösung auf eine mit Amberlite* CG-50 (Na+-Typ) gepackte 50-ml-Säule, welche mit destilliertem Wasser gefüllt war, gegeben. Nach Entfernung von 20 ml des ersten Durchlaufs wurden 150 ml destilliertes Wasser durch die Säule geschickt, und die gesamte Bleomycinsäure wurde abgetrennt. Die Lösung wurde durch eine mit Aktivkohle (zur Chromatographie geeignete Aktivkohle der Wako Junyaku K.K.) gepackte 50-ml-Säule, welche mit destilliertem Wasser gefüllt war, geschickt, um die Bleomycinsäure zu adsorbieren. Nach dem Auswaschen mit 200 mh destilliertem Wasser wurde das Produkt mit 150 ml einer Mischung von 0,1 N-HCl und Aceton (1 :1) eluiert, wobei die Bleomycinsäure in 100 ml der letzten Fraktion eluiert wurde. Gemäß Beispiel 10 wurde das Produkt weiter behandelt wobei 420 mg der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) erhalten wurden. 415 mg des nicht umgesetzten Bleomycins wurden zurückgewonnnen.

Beispiel 11

100 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) wurden in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst, und die Lösung wurde durch Zugabe von 0,1 N-HCl auf pH 3,0 eingestellt Die Mischung wurde während 6 h in einem verschlossenen Raum auf 105⁰C erhitzt Gemäß Beispiel 10 wurde das Produkt isoliert, und man erhielt 83 mg Bleomycinsäure (Cu-Komplex).

Beispiel 12

100 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleo.Tiycinsäure (Cu-Komplex) wurden in 2 ml destillierte· τ Wasser .aufgelöst und durch Zugabe von 0,1 N-HCl wurde der pH auf 5,5 eingestellt. Die Mischung wurde 24 h im verschlossenen Rohr auf 120° C erhitzt. Gemäß Beispiel 10 wurde das Produkt isoliert, und man erhielt 68 mg Bleomycinsäure (Cu-Komplex).

Beispiel 13

100 mg des Diessigsäuresalzes des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) wurden in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst, und der pH wurde durch Zugabe einer wäßrigen 0,1 n-HCl-Lösung auf 2,0 eingestellt, worauf die Mischung 6 h auf 80°C erhitzt wurde. Gemäß Beispiel 10 wurde das Produkt isoliert, und man erhielt 72 mg Bleomycinsäure (Cu-Komplex).

Beispiel 14

100 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu entfernt) wurden in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst, und der pH wurde durch Zugabe von 0,1 N-HCI auf 4,5 eingestellt Die Mischung wurde auf 105° C während 6 h im verschlossenen Rohr erhitzt, und danach wurde das Produkt gemäß Beispiel 10 isoliert, wobei 43 mg eines farblosen amorphen Pulvers der Bleomycinsäure (Cu entfernt) erhalten wurden. Das Produkt wurde zur Herstellung des Kupferkomplexes gemäß Beispiel 9 weiter verarbeitet, wobei 45 mg der Bleomycinsäure (Cu-Komplex) erhalten wurden.

Beispiel 15

100 mg des Dihydrochlorids des 3-Aminopropylesters der Bleomycinsäure (Cu entfernt) wurden in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst, und der pH wurde durch 0,1 N-HCl auf 5,0 eingestellt Die Mischung wurde während 24 h im verschlossenen Rohr auf 120° C erhitzt. Gemäß Beispiel 10 wurde das Produkt isoliert, und man erhielt 45 mg der Bleomycinsäure (Cu entfernt). Das Produkt wurde gemäß Beispiel 9 zur Herstellung des Kupferkomplexes weiter bearbeitet, und man erhielt 42 mg der Bleomycinsäure (Cu-Komplex).

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. 3-Aminopropylester der Bleomycinsäure, dessen Säureadditionssalze und Kupfer-Komplex.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Methylrnercaptopropylamino-bleomycin, dessen Säureadditionssalze oder Kupfer-Komplex in einer angesäuerten wäßrigen Lösung mit der 1- bis 50fachen molaren Menge an

a) Halogencyan oder

b) Halogenessigsäure oder deren niederen Alkylestern oder deren Amid, ggfs. nach Zugabe eines organischen Lösungsmittels, bei 0 bis

90⁰C umsetzt

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einer mit Salzsäure oder Trifluoressigsäure angesäuerten Lösung durchführt

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung nach Zugabe von Methanol oder Äthanol durchführt

5. Verfahren zur Herstellung von Bleomycinsäure oder deren Kupfer-Komplex, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung nach Anspruch 1 bei 40 bis 120⁰C während 1 bis 24 h in saurem Medium bei pH 2,0 bis 5,5 hydrolysiert