DE2310462B2

DE2310462B2 - Phleomycine und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2310462B2
Application number: DE2310462A
Authority: DE
Inventors: Akio Fujii; Nobuyoshi Tokio Shimada; Tomohisa Asaka Takita; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1972-03-03
Filing date: 1973-03-02
Publication date: 1975-01-09
Also published as: DE2310462A1; GB1414398A; JPS4888287A; DK130249C; CA995609A; US3984390A; NL7303030A; NL154779B; FR2181785A1; DE2310462C3; JPS5739751B2; DK130249B; AU467991B2; FR2181785B1; AU5282573A; AR201483A1

Description

NH

Il

H₂N-C-NH-(CH₃J₂=S-

N—

HN N-

O N—

HN

IO

15

20

35

darstellt (worin R₂ eine niedrige Alkyl-, Methoxypropyl-, eine Halogenpropyl-, Allyl-, Cyclohexyl-, Benzyl- oder α-Methylbenzylgruppe und R₃ und R₄ niedrige Alkylgruppen darstellen und η 2 oder 3 bedeutet).

2. Verfahren zur Herstellung von Phleomycinen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Beimpfung eines Nährmediums mit Actinomycetalen, die zur Erzeugung von Antibiotika der Phleomycingruppc fähig sind, Aussetzung des beimpften Mediums in aerobe Kultivierungsbedingungen, und Gewinnung der erzeugten Antibiotika aus der Kuiturlösung in bekannter Weise, wobei man dem Kulturmedium ein Amin hinzufügt, das durch die allgemeine Formel

R-(CH₂J₁₁-N

R₁

besitzt, R, ein Wasserstoffatom oder die 3-Aminopropylgruppe darstellt und η = 2 oder 3 ist, um Antibiotika der Phleomycingruppe zu erzeugen, die eine Seitenkettenstruktur aufweisen, die dem

45 Die Erfindung bezieht sich auf Phleomycine und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie auf Antibiotika mit Antitumorwirkung.

Die Antibiotika der Phkomycingruppe umfassen elf Phleomycine, die durch Streptomyces verticillus (z. B. Streptomyces verticillus 843-1, ATCC Nr. 21 890) erzeugt werden (Maeda, Kosaka.Yagishita, Umezawa, Journal of Antibiotics, A 9, S. 82 (1956); Ikekawa, Iwami, Hiranaka, Umezawa, Journal of Antibiotics, A !7, S. 194 [1964]), Substanzen die durch Streptor /ces flavoviridis (z.B. Streptomyces flavoviridis MC-637 Y-I, ATCC Nr. 21 892) erzeugt werden (japanische Patentanmeldung 53 590/71, das Antibiotikum YA-56, hergestellt durch Streptomyces humidus (NRRL 3885) (I t o, O h a s h i. E6awa,Yamaguchi,Furumai,Enomoto, Okuda, Journal of Antibiotics, 24, S. 727 [1971]) und Zorbamycine, die durch Streptomyces bikiniensis var. zorbonensis (NRRL 3684) (Argoudelis, Bergy, Pyke, Journal of Antibiotics, 24. S. 543 [1971]) erzeugt werden.

Diese Antibiotika stellen aus Zuckern und Aminosäuren zusammengesetzte Glycopeptide dar, die eine starke Neigung zur Cheiatisierung eines Cu(ll)-Atoms besitzen. Sie haben die Eigenschaft, ein charkteristisches Ultraviolett - Absorptionsspektrum mit Maxima in der Nähe von 244 nw und 30 ηΐμ aufzuweisen. Es wurden nun Untersuchungen bezüglich der chemischen Struktur der Antibiotika der Phkomycingruppe durchgefiihrt, und als Ergebnis wurde gefunden, daß diese Antibiotika eine teilweise Endstruktur gemeinsam aufweisen, in welcher ein Amin durch eine Peptidbindung mit der Carboxylgruppe von 2-[2-(2-Aminoäthyl)- l²-thiazolin-4-yl]-thiazol-4-carbonsäure

H N

N-

6o

CO-Y

-NH-CH₂CH₂ S

in Verbindung steht. Ali Ergebnis weiterer Unter suchungen der chemischen Struktur der Phleomycin wurde nun ermittelt, daß die Phleomycine die fol gende Struktur, in der Y l-Amino-4-guanidinobutai Für Phleomycin D₁ und l-(4-Aminobutyl)-3-(4-guanidi nobutyl)-guanidin für Phleomycin E bedeutet, auf weisen:

Il c

NH,

H₂C N - CH₂ — CH — C — NH₂

Η,Ν

CH₃ H

Il Il

O HO CH N C

\ / \ / \ / \ O CH C CH NH

H₃C N C CH O CH CH₂

H CH N CH₃ O CH₃ CH₂ S H

H H

H O

CH

" V-ν

HO

/
CH₂

rt u H

j. i ^HA >^Η

O
OH

/Ι\
H-C H C

OH HH

O H

/ι\

COC

/I

CH₂OH

OH

H OH

NH₂

*oasptGs*	Y	NH ρ
Phleomycin D₁	-NH-(CH₂U-NH-C-NH₂
Phleomycin E	NH P -NH-(CH₂]U-NH-C-NH-
	NH Μ
	—(OH₂^ — NH — C — NH₂

Die Antibiotika der Phleoffiyeiflgroppe zeigen nicht ur breite and starke antmrikrobrelle Wirkungen ägen Bakterien tied Euroycetes, sondern auch eine Jli rkung, die zur Inhibierung des Wachsims koltmerter HeLa-ZeUeQ fuhren und auch gegen fiTlich-K.arcinome inhibierend wirken. Jedoch weisen diese Phleomycine einen Nachteil dahingehend

3» auf, daß sie bei fortgesetzter Verabreichung die Niere nachteilig beeinflussen.

Es wurde nun die Möglichkeit in Betracht gezogen. Antibiotika der Phleomycingruppe mit geringer Toxizität gegenüber der Niere of»oe Verminderung der

5$ Antitumorwirkung durch Einführung eines spezifischen Aminrests für Y in das Molekül zu entwickeln. Weiter werden die Antibiotika der PWeomycmgreppe bei Behandlung mit einem Oxidationsmittel leicht in Antibiotika der Bleomycingnippe übergeführt (bezüghch Antibiotika der BJeomycingruppe vgl. Jornal of Antibiotics, A 19, S. 200 [I96^|K die eine Antibiotücagruppe darstellen, die in dem Molekül 2'-(2-Aminoäthyl)-2,4'-bithiazol-4-carboiisäure anstatt der vorstehend angeführten 2-[2-(2-AminoäthyI)-

l²-thiazolin-4-yfj-thiazol-4-C!atboiBäure aufweisen. Dementsprechend besitzen die Antibiotika der Phleomycingruppe eine erhebliche industrielle Bedeutung, da sie ein wichtiges Ausgangsmaterial zar Hersteflune

der Antibiotika der Bleomycingruppe werden könnten, die gegenwärtig in der Therapie von schuppigen ZeIltürnofen verwendet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Phleomycine, ein Verfahren zu deren Herstellung und Antibiotika der Phleomycingruppe mit Antitumorwirkun£ zu schaffen.

Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden, daß spezifische Antibiotika der Phleomycingruppe künstlich durch biosynthetische Einführung eines spezifischen Amins in eine durch Y in der vorstehend angeführten allgemeinen Formel eingenommene Stellung erzeugt werden können. Hierauf baut die Erfindung auf.

Gegenstand der Erfindung sind daher Phleomycine einer Struktur der Formel O

Il

C NH_;!

H₂C' N-CH₂-CH-C-NH₂

\ / Il

CH O

CH₃ H O

NN I I Il

O HO CH N C

H,N T C O CH C CH NH \Λ

Il I Il I I N Y

N C CH O CH

H CH N CH₃ O CH₃ CH₂ S H

H O

HO

/
CH₂

OH

CH

I H

-N

H-C H C

OH HH

O H

CH₂OH

OH

	C /I H OH	-NH-(CH₂J_n-R	O C 1"	bedeutet, worin R	R₂-NH
	O	-NH-	I C NH₂		\
worin Y		(CH₂J₃- NH- (CH₂),- R			R4

oder

9 ^r10

) ==N phleomycinstruktur unter Bildung einer Restgruppe Y

^{3 3}JJ^j und darüber hinaus wird das eine derartige Struktu

l i

aufweisende Phleomycin überwiegend erzeugt. Somi

H jsj Q wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ein

⁴ S Kulturlösung erhalten, die ein einziges Phleomycin

NH spezies enthält, das dem Amin, das dem Kultur

Il medium hinzugefügt wurde, entspricht. Somit erlaub

H₂N C NH das Verfahren eine leichtere und wirtschaftlichen

ω Gewinnung des Produktes und ist somit wirtschaftlict

(CH₃J₂=S _Io gesehen Vorteilhafter im Vergleich zu dem Fall, be

C dem ein spezifisches Phleomycin aus einer üblichei

N— Kulturlösung, die verschiedene Phleomycintypen ent hält, gewonnen wird.

C Beispiele für das im Verfahren der Erfindung ange

N— 15 wandte Amin der Formel

_ H

O N— ²⁰ R₁

j· worin R und R, die angegebenen Bedeutungen be

sitzen, sind:

^HN N,N-Dimethyl-l,2-diaminoäthan

(CH₃J₂-N-(CH₂J₂-NH₂
N

Ν,Ν-Diäthyl-1.2-diaminoäthan
darstellt (worin R₂ eine niedrige Alkyl-, Methoxy-

propyl-, eine Halogenpropyl-, Allyl-, Cyclohexyl-, ₃o
Benzyl- oder «-Methylbenzylgruppe und R₃ und R_{4 xr} .. . , , , ,.
niedrige Alkylgruppen darstellen und η 2 oder 3 be- Methyl-1,3-diaminopropan

deutet). CH₃NH-(CHj)₃-NH₂

Die erfindungsgemäßen Phleomycine werden durch

ein Verfahren hergestellt, das gekennzeichnet ist durch 35 N,N-Dimethy]-I,3-diaminopropan

Beimpfung eines Nährmediums mit Actinomycetalen, .„„ . _N „„

die zur Erzeugung von Antibiotika der Phleomycin- ^"vz™ ^-"2)3 MH₂

gruppe fähig sind, Aussetzung des beimpften Mediums , . . . . , ,

in aerobe Kultivierungsbedingungen und Gewinnung ³-^Amin°P^r°Pyl-tnrnethylamrnoniumlnlogenid

der erzeugten Antibiotika aus der Kulturlösung in 40 (CH₃J₃N-(CH₂J₃—NH₂

bekannter Weise, wobei man dem Kulturmedium |

ein Amin hinzufügt, das durch die allgemeine Formel Χ^ρ

, N.N-Diäthyl-l,3-diaminopropan

R-(CH₂J_n-N ^4S (C₂H₅J₂-N-(CH₂)J-NH₂

R₁ N-n-Butyl-l,3-diaminopropan

dargestellt ist, worin R die vorstehende Bedeutung n-QH,—NH—(CH₂J₃—NH,

besitzt, R₁ ein Wasserstoffatom oder die 3-Aminopro- 50

pylgroppe darstellt und η = 2 oder 3 ist, um Antibio- N-tert.-ButyM^-dianiiriöpiOpan
Öia der Plieutnyemgroppe zu erzeugen, die eine
kk fi di d Ai

Öia der Plieutnyemgroppe zu erzeugen, die eine _{r M} „^jt,,,^, . _xt„

SerteakettenstruktnT aufweisen, die dem Amin ent- ¹^"^{9 NM}^*^fe—NH₂

Die erfindungsgemäß erzeugten Verbindungen sind, 55

gegebenenfalls unter Zusatz pharmazeutisch üblicher CH₂=CH—CH₂—NH(CH₂J₃—NH₂

Hilfsstoffe, als Antibiotika mit Antirumorwirkung _M,, „ , .....

verwendbar. ^N"³ '^fiy^dfoxyP^roPy^I-^|.3-diammopropan

Nachstehend wird die Erfindung ausführlich er- HOCH₂CH₂CH₂—NH—(CH₂J₃—NH

läutert. 60 23 2

WirdeinActrnoniycetratamni.derzurErzeugungvon NO^'-Dichlorpropyl-UHÜarmnopropan

Antibiotika der Pbleomydngruppe ßMg ist z. B. _n _rHrH -„ ^ _tr-, , _M„

Streptomyees verticaius 843-1 (Fermentatioo Research i-h^n^"2*~n₂—NH-(CH₂JIj-NH₂
Institute, Regstrier-Nr. 1350, ATCC 21890), unter

aeroben Bedingungen in einem Medium kultiviert, έ$ ^

das ein durch die nachstehende allgemeine Formel (CHj)₂S—(CH₂J₃—NH₂

dargestelltes Amin enthält, so kombiniert sich dieses |

Amin über die primäre Aminogruppe mit der Haupt- X

11

N-Cyclohexyl-1,3-diaminopropan -NH-(CH₂J₃- NH₂

N-Benzyl-1,3-diaminopropan /"V-CH₂-NH-(CH₂J₃-NH₂

N-u-Methylbenzyl-1,3-diaminopropan /"V-CH-NH-(CH₂J₃-NH₂

CH₃

N-(3-Aminopropyl)pyrrolidin [^N-(CH₂J₃-NH₂

N-(3-Amiiiopropyl)piperidin —(CH₂J₃-NH₂

N-(3-Aminopropyl)piperazin HN N-(CH₂J₃-NH₂

N-(3-Aminopropyl)morpholin O N-(CH₂J₃-NH₂

4-(2-Aminoäthyl)imidazol HN

CH₂CH₂-NH₂

3-Amidinopropylamin NH

Il

H₂N-C-(CH₂J₃-NH₂

3-Guanidinopropylamin NH

Il

H₂N-C-NH-(CH₁)J-NH₁

(CHj)₂- NH- (CHj)₃NH₂ N-{3'-DiäthylanräoäthyIH ,3-diaminopropan

N-(3 '-DSmethylafHinopropylV 1,3-diaminopTopan

H₃C

Ν—(CH₂J₃-NH-(CH₂)₃—NH₂

H₃C

N-(3'-Benzylaminoäthyl)-l,3-diaminoprcpaii

H,—NH-(CH₂)₂— NH-(CH₂J₁-NH₂

N-(3'-BenzylaminopropylJ-1,3-diar linopropan /"V-CH₂-NH-(CHj)₃-NH-(CHa)₃-NHj

N-(3'-a-Methylbenzylaminopropyl)-l,3-diamino' propan

/"V-CH-NH-(CHj)₃-NH-(CHa)₃-NH₂

>S CH₃

N-(2'- PiperazinoäthylJ-1,3-diaminopropan

HN N-(CH₂J₂-NH(CH₂J₃-NH₂

N-(2'-4"-Imidazoiyläthyl)-l,3-diaminopropan HN

N-(3'-Pyrrolidinopropyl)-l,3-diaminopropan Pn-(CH₂J₃NH-(CH₂J₃-NH₂

N-(3'- Piperidinopropy I)-1,3-diaminopropan —ICHj)₃NH -(CHj)₃ - NH₂

N-(3'-Morpholinopropyl)-l,3-diaminopropan

θ' N-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-NH₂

*° N-(3'-n-Butylaminopropyl)-l,3-diaminopropan ^C₄H₉NH-(CH₂)₃—NH—(CH₂J₃- -NH₂

Bei der Ausführung der Fermentierung ist kein Grundmedium einer speziellen Zusammensetzung erforderlich, es wird jedoch nur eine solche Zusammensetzung die von höchster Produktivität ersehnt, unter den gewöhnlich für die Erzeugung von !^ileomycinen angewandten Medien ausgewählt, die als Hauptbestandteile Kohlehydrate und stickstoffhaltige, organische Satötansett, wie beisötebweise Glukose Hirse-Gelee, Sförfce» Sefafcotaeim&l fffid Mais- bzw Kornstärkesaft und geringere Mettgen as

—(CH^—NH- (CHj)₃-NH₂ sehen Substanzen, wie beispielsweise Kaliumphosphat, Kupfersulfat, Zinksulfate Natriumchlorid and Natriumnitrate und oberflächnaktive Mitte! als Antischaummittel (Bg-FS 745926} enthaltea

Zu einem derarte GnmdmedrafB wird eine wäßrige Lösung eines Salzes der vorstehend erwähnter Amine hinzugefügt, welches einer SteriBsieningsbe handlung unterworfen worden war. Was die Zeit de Zusatzes eines Amins anbetrifft, fet es vorteithaftei — obwohl es entweder zu Beginn der Kulövienmj oder portionsweise während der Kultivierung hinzu gerügt werden kann — es bei einem relativ früher Stadium der Kultivierung und am wirksamsten inner halb 48 Standen vas Beginn der Kuttrnenxag as ze zusetzen. Obgleich es «ta so besser ist, je größer d»

zuzusetzende Aminmenge ist, wenn sieb nicht eine ToxizUät infolge des Amins entwickelt, liegt diese aus wirtschaftlichen Gründen geeignet innerhalb des Bereiches von 500 bis 2000 meg pro Milliliter des Mediums. Der Fortgang der Kultivierung unterscheidet sich nicht im geringsten von jedem der üblichen fermentativen Herstellung von Pbleomycinen. Bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 25 bis 35° C erreicht die Produktion ein Maxiraum in 8 bis i0 Tagen im Fall einer Schüttelkultur innerhalb eines Kolbens, und in 4 bis 7 Tagen im Fall einer belüfteten, in einem Fermentationstank untergetauchten Kultur. Das in dem Kulturmedium erzeugte Phleomycin wird durch ein bekanntes Verfahren wiedergewonnen (T. Takita: J. Antibiotics, Ser. A. 12 [6], S.285 [1959]). Die Kulturlösung wird über eine Säule mit saurem Kationenaustauscherharz, das Karbonsäuregruppen enthält, des Η-Typs, Na-Typs oder eines Gemisches hiervon oder mit Aktivkohle gefuhrt, um die Adsorption von Phleomycin zu erlauben und sodann mit destilliertem Wasser, wäßrigem Aceton und saurem wäßrigen Aceton in der angegebenen Reihenfolge eluiert. Fraktionen, die gegenüber einem Probeorganismus, Mycobakterium smegmatis 607 aktiv sind (nachstehend zur Vereinfachung als aktive Fraktionen bezeichnet), werden gesammelt und zur Trokkene unter Erhalt eines rohen Pulvers konzentriert. Das rohe Pulver wird in einer 80%igen, wäßrigen Methanollösung aufgelöst und an einer neutralen Aluminiumoxidsäule, die mit dem gleichen Lösungsmittel gefüllt ist, adsorbieren gelassen und sodann mit dem gleichen Lösungsmittel unter Erhalt blauer bis grüner Fraktionen, die Phleomycin enthalten, entwickelt. Nach erfolgter Konzentrierung zur Trockene werden diese Fraktionen in destilliertem Wasser aufgelöst und der Säulenchromatographie mit einem Gelfiltrationsmittel, das aus Dextranderivaten zusammensetzung, die sich jener einer aus einzigen blauen Fraktionen werden zur Trockene unter Erhalt eines blauen amorphen Phleomycinpulvers konzentriert. Das hierdurch erhaltene Pulver zeigt eine Zusammensetzimg, die sich jener aus einer einzigen Komponente bestehenden Substanz annähert, die die Wirkung der Addition eines Amins im Vergleich zu einer Zusammensetzung (20,7% Phleomycin D, 23,4% Phleomycin E; 6,9% Phleomycin G, 30,0% Phleomycin H, 19% andere) welche ein durch herkömmliche Fermentierung erhaltenes Pulver aufweist, klar anzeigt.

Die vorstehend erwähnte Reinigung scheint Tür die tatsächliche Chemotherapie ausreichend zu sein. Zur

weiteren Verbesserung der Reinheit zum Zweck der Aufklärung der physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften ist eine Säulenchromatograpbie unter Verwendung eines sauren Ionenaustauschers, der aus Carboxymethyl-Gruppen enthaltenden Dex-

tranderivaten zusammengesetzt ist, gut geeignet.

Diese Chromatographie wird dadurch durchgeführt, daß man zuerst die Säule mit Phleomycin belädt und sodann die Säule mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert, deren Konzentration allmählich von 0,05molar auf 1 molar erhöht wird. Blaue Phleomycine enthaltende Fraktionen werden gesammelt und durch ein bekanntes Verfahren, z. B. Chromatographie mit aktivierter Kohle, die als Adsorbient verwendet wird, unter Erhalt eines blaugefärbten amorphen Pulvers kupferhaltigen Phleomycins im reinen Zustand entsalzt.

Das derart erhaltene Phleomycin zeigt die gleichen Eigenschaften wie jene herkömmlicher Phleomycine, dahingehend, daß es sich allmählich bei einer Temperatur von 188° C oder höher zersetzt und sich gegenüber Biuret-, Molisch-, Fehling-, Tollens, Eisen(II)-chlorid- und Nini.ydrinreaktionen negativ und gegenüber Ehrlich-, Dragendorff- und Permanganatreaktionen positiv verhält. Die Reaktion nach S a k a -

g u c h i is^f nur dann positiv, wenn R in der vorstehend bezeichneten allgemeinen Formel eine Guanidingruppe darstellt. Wenn es einer zweidimensionaien Chromatographie (eindimensional: Hochspannungspapierelektrophorese unter Druck; Ameisensäure

Essigsäure—Wasser = 25:75:900; zweidimensional: Papierchromatographie; η - Propanol — Pyridin -Essigsäure—Wasser =15:10:3:12) nachdem es vollständig in on-Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert worden war, unterworfen wird, ergibt das vorliegende Phleomycin 8 Farbpunkte, die gegenüber Ninhydrin positiv sind, unter denen ein Punkt oder Fleck mit jenem des zugefügten Amins zusammentrifft und die anderen jene darstellen, die allen Phleomycinen einschließlich bekannter Phleomycine gemeinsam sind.

Die durch das vorliegende Verfahren erhaltenen Phleomycine und ihre Eigenschaften sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Bezeichnung des

Aus
beute
pro

C

F.lemcntaranalyse. °/

H

N

S

'»

Cl

Cu

Wir
kung¹)

TLC²)

E

Nr.

zugefügten Amins

neuen Phleomycins

Liter
Kultur

42,63

5,72

16,12

4,18

4,63

4,02

Ein
heit/mg

(244 ΓΠμ)
E

*

lösung

(Rt)

(300 ΓΠμ)

mg

0,35

1

N,N-Dimethyl*,

2-N,N-Dimethyi-

17

43,42

5,84

15,98

4,05

4,38

3,87

718

154

1,2-diaminoäthan

aminoäthylamino-

56

phleomycin

0,52

2

N.N-Diäthyl-

2-N.N-Diäthyl-

15

42,64

5,72

16,27

4,31

4,73

4,05

882

150

1,2-diaminoälhan

aminoäthylamino-

54

phleomycin

0,56

3

N-MethyM,3-di

3-N-Methylamino-

20

688

148

aminopropan

propylatninophleo-
mvcin

53

') Die anlimikrobiellc Wirkung wurde durch ein Zylinder-Agar-Plattenverfahren auf Basis >on Bleomycin A₂ (kupferfreie Base) angenommen als 1000 U/mg unter Verwendung von Mycobakterium smegmatis 607 als Versuchsorganismus geprüft.

²) Entwickelt unter Verwendung von Methanol-10%, Ammoniumacetut-10% wäßriger Ammoniak = 10:9 :1 und einem Adsorbens Tür die DUnnschichtchromatographie, das aus Silikagel und Oips zusammengesetzt ist.

^s) Oemeisen in destilliertem Wasser.

Bezeichnung des zugefügten Amins

N,N-Dimetbyl-1,3-diamtaopropaia

3-AmroopropyltrimethylammomiHHichlorid

N,N-Diäthyl-

! j-diaminopropaa

N-n-Butyl-l 3-diaminopropan

N-tert.-Butyl-

1,3-diaminopropan

aminopropan

N-3-Hydroxypropyl-1 ,3-diamimopropan

N-3\3'-Dichlorpropyl-1,3-diamiriopropan

3-Aminopropyldimethylsulfoniumbromid N-C'ydohexyl-1,3-diaminopropan

N- enzyl-l,3-diaminopropan

N-ei-Methylbenz-fl-1,3-diarainopropan

Hi 3-AminopropyI)-pytrolidin

N-I 3-Aminopropyl)-piperidin

N-(3-Aminopror.iyl)-piperazin N4[3-Aminopropyi)-momholin

4-(:2-Aminoäthyl)-imidazol

3-Amidinopropylamin

N-(3'-Dimethylaminopropyl)-1,3-diaminopropan

N-O'-Cyclohexyl

aminopropyl)-

!,iKliaminopropan

Fonsetzung

Bezeichnung des neuen Phleomycin*

3-N.N-Diroethyl-

aminopropylamino-

phleomycin

3-(N,N,N-Trimethylamino^propylaminophleomycinchlorid

3-N,N-Diäthyl-

aminopropylaraino-

phleomycin

3-N-n-Butylaminopropylaminophleomycin

3-N-iert-Butyl-

aminopropylamino-

phkomycin

3-N-Propenyl-

aminopropylamino-

phlcomycin

3-N-(3-Hydrojty-

propyl)-aminopro-

pylaminophieo-

mycin

3-N-(3,3-Dichlorpropyl)-aminopropylaminophleomycin

3-S,S-Dimethylmercaptopropylaminophleomycin

3-N-Cyclohexyl-

aminopropylamin o-

phleomycin

3-N-Benzylamino-

propylaminophleo-

mycin

3-N-{l-Phenyläthyl)-

aminopropylamino-

phleomycin

3-PyrrolidiBopro-

pylaminophleo-

mycin

3-Piperidin opropyl-

aminophleoraycin

3-Piperazinopropyl-

aminophleomycin

3-Morpholinopro-

pylaminophleo-

mycin

2-(lmidazol-4-yl}-

äthylaminophlco-

mycin

3-AmidinopropyI-

aminophleomycin

3-(3-N,N-Dimethylaminopropylamino)-propylaminophleomycin

3-(3-N-Cyclohexylaminopropylamino propylaminophleomycin

Ausbeute

pro

Citer

<ultur-

lösung

mg

23

19

25

12

IO

16

24

28

14 21

23 13

26

22 8

43,01 43,52

44,17 43,78 43,83 43,63 43,10

41,91

42,78 44,86 45,05 46,15 43,86

44,31 43,40 43,52

43,09

43,13 42,87

44,40

5,73 5,92

5,99 5,95 5,92 5,84 5,87

5,35

5,76 5,90 5,78 5,80 5,71

5,86 5,88 5,80

5,40

5,54 5,95

6,06

15,70 15,74 15,80 15,60 15,57

14,80 15,38 15,41 15,29 16,23

yse, % S	Cl	Cu	Wir kung¹) Ein- icit/mg	TLC^J) (Rf)	Pi.« I 244 ΙΤΙμ) 300 πψ)
4,37	4,83	3,89	648	0,35	149 53
4,30	4,75	4,08	506	0,43	150 53
4,38	4,25	4,04	829	0,43	158 58
4,00	4,78	3,95	3535	0,60	151 54
4,25	4,66	4,00	3520	0,62	151 54
4,10	4,80	3,65	2100	0,58	152 56
4,43	4,31	3,88	845	0,61	151 55
3,73	8.61	3,70	3120	0,72	155 56
6,04	4,77	3,75	865	0,43	158 55
4,01	4,58·	3,67	4284	0,62	147 53
3,87	4,32	3,85	3373	0,57	152 54
3,66	4,05	4,09	4030	0,76	150 53
4,02	4,41	3,96	853	0,39	156 55
4,15	4,55	3,76	1006	0,48	154 55
4,17	4,98	3,71	581	0,32	160 56
4,15	4,16	3,98	474	0,65	150 54
4,03	4,40	4,01	678	0,77	157 56
4,15	4,94	4,31	2500	0,66	153 55
4,19	6,89	3,71	1336	0,11	148 53
4,18	6,39	3,40	8570	0,31	147 52

') Die atilimikföbielle Wirkung wurde durch ein Zylinder-Agar-Platienverfahren auf Basis von Bleomycin A₂ (kupferfreie Base) angenommen als 1000 U/mg unter Verwendung von Mycobakterium smegmalis 607 als Versuchsorganismus geprüft.

') Entwkkeit unter Verwendung von Methanol-10%, Ammoniumacetat-10% wäßriger Ammoniak = 10:9:1 und einem Adsorbens für die Dünnschichtchromatographie, das aus Silikagel und Gips zusammengesetzt ist.

¹I Oemessen in destilliertem Wasser.

Fortsetzung

	Bezeichnung des	Bezeichnung des	Au*	C	5!emenwr8naly«, %	H	N	S	Cl
	zugefügten Amins	neuen Phleomyciris	bwie	44.85		5^3	15,41	4,21	6,11
			pro
Nr.			Liter Kultur*
	N-{3'-Benzylamino-	3-t3-N-Benzyl·	lösung	45,07	5,83	15,24	3,67	6.42
	propyl)-lß-diainino-	aminopropylamino)-	mg
24	propan	propylaminophleo- mvciii	13
	N-{3'-a-Methyl-	H3-N-(l-Pheoyl-
	benzylaminopropyl}	äthyQ-amwopropyl-		43,78	6.13	15,53	4,30	6.23
25	13-dlammopropan	amino]-propvl-	16
		aminophleoinycin
	N-{3'-PyrroIidino-	3-(3-PyiroBdino-
	propyf)-1,3-diamino-	propylamino)-		44J0	5,98	15.44	3,97	6,49
26	propan	propylaminophleo-	12
		raycin
	N-<3'-Piperidino-	3H3-Piperidino-
	propyl)-1,3-diamino-	propylamino)-		43.43	5,86	15.49	3,77	6.39
27	propan	propylaminophleo-	IO
		mycm
	N-(3'-Morpholino-	3-(3-Morpholino-
	propy I)-1,3-diamino-	propylamino)-		43.79	5,98	15.52	3,54	6.50
28	propan	propylam: lophleo-	8
		mycin
	N-(3'-n-Butylanimo-	3-<3-N-n-Butyl-
	propyl)-1,3-diamino-	aminopropylamino^-		41,94	5.61	17.70	4,10	4,58
29	propan	propylaminophleo-	26
		mycin
	3-Guanidinopropyl-	3-GuanidinopropyI-
	amin	ajiinoph! omydn
30		18

	Wir kung') Ein heit/mg	Tl-C')
Cu		(RiI
3,53	6710	0,48
3.57	7208	0.54
3,69	2051	0,11
3.66	2864	0,15
3.80	961	0,41
3.42	4672	0,25
4,18	2300	0,67

Eli.¹)

(244 rM E

') Die antimikrobiell Wirkung wurde durch em Zylinder-Agar-PIaUenvcnahren auf Basis von Bleomycin A₂ fkupferfreie Base) angenommen als 1000 U/mg unter Verwendung von Mycobaktenum smegmatis 607 als Versuchsorganismus geprüft.

²) Entwickelt unter Verwendung von Methanol-10%, Ammoniumacetat-10% wäßriger Ammoniak = 10:9:1 und einem Adsorbens für die Dünnschichtchromatographie, das aus Silikagel und Gips zusammengesetzt ist.

³) Gemessen in destilliertem Wasser

Weiter werden in den Fig. 1 bis 7 die UV-Absorptionsspektren, IR-Absorptionsspektren und ein NMR-Spektrum von einigen Beispielen der in Tabelle I angeführten Verbindungen gezeigt. Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen die UV-Absorptionsspektren, gemessen in destilliertem Wasser, von 3-Morpholinopropylaminophleomycin, 3-N-Cyclohexyl-aminopropylaminophieomycin und 3-(3-N-n-Butylaminopropylamino)-propylaminophleomycin. Erie F i g. 4,5 und 6 zeigen die IR-Absorptionsspektren, gemessen als Kaliumbromidtablette, von 3-MorphoIinopropylaminophleoniycin, 3 - N - Cyclohexylaminopropylaminophleomycin und 3-(3-N-n- Butylaminopropylamino) - propylaminophleomycin. Die F i g. 7 zeigt ein NMR-Speklrum von 3-MorpholinopropyIaminophleomycin, gemessen in schwerem Wasser bei 100 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerem Standard.

Die Prüfung der Antitumorwirkung der neuen Phleomycine, beispielsweise von 3-S,S-DimethyImercapto-propylaminophleomycin und 3-MorphoIinopropylaminophleomycin, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden, zeigten eine deutliche Verlängerungswirkung auf die Überlebenszeit der ICR-SLC-Maus, die mit Ehrlich-Asrites-Karcinomen beimpft wurde. Dies geht aus den Tabellen Il und III hervor. Bemerkenswerter noch ist die Tatsache, daß bei Vergleich der Antitumorwirkung des zuletzt erwähnten Phleomycins mit jener von 3-Morpholin.opropylaminobleomycin (Tabelle IV), das die gleiche Φ endständige Amingruppe, die durch Y in der vorstehenden Formel bezeichnet ist wie jene des Phleomycins aufweist, chemotherapeutische Indexe in praktisch gleicher Größenordnung erhalten wurden. Diese Tatsache scheint die Möglichkeit zu eröffnen, daß die neuen Phleomycine als Chemotherapeutika gegen Tumore, ähnlich wie Bleomycine verwendet werden könnten, welche, und darauf wird hingewiesen, wirksame Antitumordrogen, die gegenwärtig für die Therapie schuppenförmiger Zelltumore u.dgl. verwendet werden, darstellen (R. W. Sonntag: Cancer Chemotherapy Reports, part I, 66, S. 197 [1972]; A. Y agο d a et al.: Annals of Internal Medicine, 77, S. 861 [1972]).

Prüfverfahren der Antitumorwirkung

Das Phleomycin wurde an zehn aneinanderfolgen-

den Tagen in die Peritonealhöhle der ICR-SLC-Maus, in die Ehrlich-Ascites-Karcinome eingepflanzt worden waren, verabreicht. 50 Tage nach dem Beginn des Experimentes wurden Messungen zur Ermittlung

1. der Zahl toter Mäuse infolge der Toxizität,

2. der Zahl überlebender Mäuse,

6$ 3. der mittleren Überlebenszeit in 50 Tagen und
4. des Verhältnisses der mittleren Uberlebensdauer zu jener der Bezugsmaus multipliziert mal 100 durchgeführt.

Der chemotherapeutische Index wurde aus der Wfo (50%ige wirksame Dosis) und LD₅₀ (5Q%ige lethale Dosis) ermittelt, wie nachstehend angeführt ist,

ED_s,rWert: Die maximale Dosishöhe innerhalb des Bereiches des Lebensdauerverhöltnisses von S 100:200.

LD₅₀-Wert: Berechnet nach dem Behrens-Karber-Verfahren auf Basis der Meßergebnisse von (I) und (2).

Tabelle IV
Antitumorwirkung von 3-Morpholinopropylamino-

bleomycin

Tabelle II

Antitumorwirkung vor» 3-MorphoHnO'propylaminophleomycin

IO

	(I)	(2)	(3)	(4)
Dosis		ö berieben
«lg/kg/Tag	Toxizitäl	(nach	Durch	Lebens-
während	Anzahl	50 Tagen),	schnittliche
10 Tagen, i. p.	toter Tiere/ Gesamtzahl	Zahl der überlebenden Tiere/	Lebensdauer (Bereich)	dauer- verhältnis
		Gesamtzahl
25,0	5/5	0/5	26,2	215
12,5	2/5	3/5	39,2	321
6,25	0/5	5/5	50,0	410
3,12	0/5	4/5	49,2	403
1,56	0/5	2/5	35,0	287
0,78	0/5	0/5	22,8	187
0,39	0/5	0/5	16,2	133
0,19	0/5	0/5	20,6	167
0	0/5	0/5	12,2	100

20

35

LD,₍

Chemotherapeutischer Index = ^ft^ = tt^ö = 19,2

Tabelle III

Antitumorwirkung von 3-S,S-Dimethylmercaptopropylaminophleomycin

40

45

	(I)	(2)	(3)	(4)
Dosis		überleben
mg/kg/Tag während	Toxizilät Anzahl	(nach 50 Tagen),	Durch schnittliche	Lebens dauer
10 Tagen, i. p.	toter Tiere/ Gesamtzahl	Zahl der überlebenden Tiere/	Lebensdauer (Bereich)	verhältnis
		Gesamtzahl
25,0	5/5	0/5	8,6	59
12,5	5/5	0/5	13,0	89
6,25	3/5	1/5	33,8	232
3,12	0/5	4/5	44,0	301
1,56	0/5	3/5	36,8	252
0,78	0/5	2/5	29,0	199
0,39	0/5	0/5	21,0	144
0,19	0/5	0/5	18,0	123
0	0/15	0/15	14,6	100

55

to

	(I)	(2)	(3)	(4)
Dosis		Oberleben
mg/kg/Tng	Toxizität	(nach	Durch	Lebenv
während	Anzahl	50 Tagen),	schnittliche	dauer-
10 Tagen, i. p.	toter Tiere/ Gesamtzahl	Zahl 4er überlebenden Tiere/	Lebensdauer (Bereich)	verhältnis
		Gesamtzahl
25,0	5/5	0/5	12,4	102
12,5	4/5	1/5	30,4	249
6,25	2/5	3/5	34,2	280
3,12	0/5	4/5	45,2	370
1,56	0/5	3/5	36,6	300
0,78	0/5	2,5	33,0	270
0,39	05	0,5	Ii ,8	97
0,19	0,5	0,5	11,8	97
0	0/5	0,5	12,2	100

Chemotherapeutischer Index —

LD ED₅₁

52. —

⁶'⁶ 078 Chemotherapeutischer Index = _£~- = _Ä'₆ = 12,1

fcL/50 U,/ö

Die gemäß der Erfindung erhaltenen Antibiotika der Phleomycingruppe können in entsprechende Bleomycine durch Oxidation mit Oxidationsmitteln in folgender Weise umgewandelt werden.

Ein Phleomycin wird in einem Medium aufgelöst, in dem es löslich ist, z. B. Wasser, Methanol usw., und der Lösung ein mildes Oxidationsmittel hinzugefügt. Wird Mangandioxid als Oxidationsmittel verwendet, so wird es in dem Medium dispergiert und bei 0 bis 5O⁰C während 20 bis 240 Stunden umgesetzt.

Das Reaktionsgemisch enthält das gewünschte Oxidationsprodukt, das die teilweise Struktur von 2'-(2-Aminoäthyl)-2,4'-bithiazol-4-carbonsäure aufweist, und unumgesetztes Material. Um diese zu trennen, wird das Reaktionsgemisch z. B. in Wasser aufgelöst und durch eine mit saurem Kationenaustauscherhar7, das aus Carboxylmethylgruppen enthaltenden Dextranderivaten besteht, gefüllte Säule geführt, die mit Natriumchloridlösung zur Adsorption der Bestandteile vorbehandelt wurde. Die adsorbierten Bestandteile werden mit einem Natriurnchlorid-Elutionsmittel eluiert, wodurch das unumgesetzte Material zuerst und sodann die gewünschte Antibiotika der Bleomycingruppe eluiert werden. Die die Antibiotika der Bleomycingruppe enthaltende Lösung wird einer herkömmlichen Adsorplionsbehandlung durch beispielsweise Hindurchführung durch eine mit aktivierter Kohle gefüllte Säule unterworfen. Die Säule wird sodann mit Wasser zur Entfernung der anorganischen Salze gewascnen. Sodann wird ein verdünntes Chlorwasseistoffsäure-Acetongemisch durch die Säule zur Elution des gewünschten Produktes geführt. Dem Eluat wird ein basisches Anionenautftauscherharz zur Einstellung auf einen pH-Wert von 6,0 zugefügt und das Lösungsmittel durch Destillation unter Gewinnung des gewünschten Produktes in Form des Hydrochlorids entfernt.

Die antimikrobielle Wirkung und die chemotherapeutischen Indizes einer Zahl von Beispielen von in der vorstehend erwähnten Weise erhaltenen Bleomycinen sind in Tabelle V wiedergegeben.

Tabelle V

Antimikrobielle Wirkungen der von entsprechenden Phleomycinen abgeleiteten Bleomycine

	Name des Bleomycin*	Wirkung .inheit/mg	Chemo
Nr.			thera peutischer
	2-N,N-Dimethylamino-	897	Index
1	äthylaminobleomycin		7,8
	3-N,N-Dimethylamino-	806
2	propylaminobleomycin		20,4
	3-N,N-Diäthylamino-	1036
3	propyiaminobleomycin		34,5
	3-N-(3-Hydroxypropyl)-	1021
4	aminopropylamino-		29,6
	blcomycin
	3-S,S-Dimethylmercapto-	920
5	propylaminobleomycin		12,0
	3-N-Cyclohexylamino-	6560
6	propylaminobleomycin		16,3
	3-N-(t-Phenyläthyl)-	5320
7	aminopropylamino-		59,2
	blcomycin
	3-Pyrrolidinopropyl-	1066
8	aminobleomycin		19,2
	3-Piperidinopropyl-	1257
9	aminobleomycin		14,4
	3-Morpholinopropyl-	592
10	aminobleomycjn		21,7
	3-[3-N-(l-PhenyläthyI)-	9470
11	aminopropylamino]-		18.1
	propylaminobleomycin
	3-{3-Pyrrolidinopropyl-	3286
12	amino)-propylamino-		26,4
	bleomycin
	3-(3-Pipet idinopropyl-	3580
13	aminoVpropylamino-		16,8
	bleomycin
	3-{3-N-n Butylamino-	5840
14	propylamino)-propyl-		59,2
	aminobleomycin
	3-{3-N,N-Dimethyl-	1670
15	ammopropylamino)-		54
	3-(3-N-CycIohexylamino-	1235
16	propylamino)-propyl-		39,5
	aminobleomycin
	3-(3-N-BenzyIamino-	6000
17	propylamino)-propyl-		24,0
	aminobleomycin

(1) Bei Prüfung durch ein Zylinder-Agar-Platten-Verfahren unter Verwendung von Mycobakterhrm smegmatis 607 als VeT-ti worde die Wirkung von Bleomycin A₂ b Ebi

(fce Base) als 1000Embeil/rng eommen. ι Eis Bleoiuyciti wiude wälu eud 2ftftn anfeuuunJ« fönenden

war«, cad »Tage nach dem Begim» des Versuches wmtfe die Antiiu wg tesrimmt

Im vorstehenden wurde das neue Verfahren zur HersteTlung von Antibiotika der Phleomycmgruppe unter Bezugnahme auf Streptomyces verticillus als Beispiel von Actinomycetes erklärt. Es muß jedoch darauf hingewiesen werden, daß die vorliegende Erfindung in gleicher Weise auf die fermentative Herstellung von Antibiotika der Phkomycingruppe unter Verwendung der vorstehend erwähnten Actinornycetes wie Streplomyces flavoviridis, Streptomyces humidus und Streptomyces bikiniensis var. Zorbonensis angewandt werden kann.

Die Erfindung ist nachstehend iim Detail unter Bezugnahme auf die Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Zu 1001 eines sterilisierten flüssigen Mediums (pH 7.2). das 0.5% Glukose. 6.4% Hirsegelee, 3,5% Sojabohnenmehl. 0.75% Mais- bzw. Getreidestärke-

is saft. 0,2% NaNO,. 0.8% NaCI. 0,1% K₂HPO₄. 0,05% ZnSO₄ 7H₂O, 0.01% CuSO₄-5 H₂O und 0,01% eines oberflächenaktiven Mittels enthielt, wurde eine sterilisierte wäßrige Lösung, die 50 g N - (3 - Aminopropyl) - morpholindihydrochlorid (500mcg/tnl des Mediums) enthielt, zugefügt. Das resultierende Kultivierungsmedium wurde mit Streptomyces verticillus 843-1 (ATCX" 21 890) beimpft und einer belüfteten Kultivierung bei 27' C unterworfen. Die Erzeugung des Phleomycins erreichte das Maxi mum am 5. Tag.

Die Nährlösung wurde unter Eirhalt von 901 Kultivierungsfiltrat filtriert. Das Filtrat wurde durch eine mit 101 eines Carboxylgruppen enthaltenden sauren Kationenaustauscherharzes gefüllte Säule mit destilliertem Wasser und sodann mit 50%igem wäßrigen Aceton gewaschen und mit einem 1 n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton-( 1 :1 )-Gemisch eluiert. 7,81 einer aktiven Fraktion der ausgeströmten Lösung wurden unter vermindertem Druck destillativ von dem Aceton befreit und durch eine Säule zur Adsorption des Phleomycins geführt, die mit 1.01 Aktivkohle für die Chromatographie gefüllt war. Die Elution wurde mit destilliertem Wasser, 50%igem wäßrigen Aceton und einem O,02n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton-(1 :1)-Ge misch in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt. Die aktiven Fraktionen (3,71 hauptsächlich von dem 50%igen wäßrigen Acetoneluat, wurden zur Trockene unter verringertem Druck unter Erhalt von 9,6 g eines rohen, braungefärbten Pulvers konzentriert Das rohe Pulver wurde in 100 ml 80%igem wäßrigen Methanol aufgelöst, durch Filtration von unlöslicher Materialien abgetrennt und durch eine Säule, die mil 50 ml neutralem Aluminiumoxid (0,019 mm) gefülli war, zur Absorption der aktiven Kiirnte geführt Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmitte durchgeführt

Die blauen Fraktionen des Abflusses wurden ge sammelt und zur Trockene unter Erhalt von 4,73 { * eines rohen bläulichgrüngefärbten Pulvers zur Trok kene eingedampft Das rohe Pulver wurde erneut π destilliertem Wasser aufgelöst und durch eine mi 55OmI eines aus Dextranderivaten bestehenden Gel filtrationsmittels gefüllte Side geführt Sodann wurd die Säule mit destilliertem Wasser eluiert und di blauen Fraktionen des Ausflusses gmelt Bei de Gefriertrocknung ergaben die blauen Firaktionej 1,05 g eines blauen Pulvers, das 3-Morpholmopropyl ammophleomvctn (kuperhaltiges MydrocMoridsah - als Hauptbestandteil enthielt Das vorstellend angeführte blaue Pulver wurde i einer 0,1 molaren, wäßrigen Natrramchloridlösun aufgelöst und durch eine Säule, die mit 100 ml eine aus Dextranderivate! bestehenden Gelfiltrationsmii

tels (Na⁺Typ) gefüllt war, zur Adsorption der aktiven Komponente geführt. Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmittel bewirkt. Die blauen Fraktionen des Ausflusses wurden durch eine mit 35 ml einer aktivierten Kohle gefüllte Säule zur Adsorption des vor- s stehend erwähnten !»Neomycins geführt. Nach erfolgtem Waschen mit Wasser wurde die Säule mit Wasser, 50%igem wäßrigen Aceton und Ο,Οίη-Chlorwasserstoffsäure-Aceton-(1:1)-Oemisch in dei angegebenen Reihenfolge eluiert. Das Phleomycin wurde haupt- to sächlich in dem SOVoigen wäßrigen Acetoneluat aufgefunden, welches zur Trockene unter Erhalt von 46? mg eines blauen amorphen 3-Morpholino-propylaminophleomydnpiiilvers zur Trockene konzentriert

wurde. _ . .

Beispiel 2

Jeweils 100 ml au« den S1 des flüssigen, im Beispiel 1 erwähnten Medium» wurden in 50 500-ml-Erlenmeyerkolben eingegeben und sterilisiert. Zu jedem Kolben wurde eine sterilisierte wäßrige Lösung von 3-Aminopropyldimethylsulfoniumdihydrobromid derart zugegeben, daß dessen Konzentration in dem Kolben 2000 meg pro Milliliter Medium betrug. Jeder der Kolben wurde mit Streptomyces verticillus 843-1 beimpft und auf einem Drehschüttler bei 27° C während 8 Tagen inkubiert.

Die Kulturlösung in jedem Kolben wurde filtriert und 3,61 der kombinierten Filtrate durch eine mit 300 ml aktivierter Kohle gefüllte Säule zur Adsorption des Phleomycins, das erzeugt worden war, geführt. Sodann wurde die Säule mit destilliertem Wasser, 50%igem wäßrigen Aceton und einem 0,02n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton-( 1 : l-)-Gemisch in der angegebenen Reihenfolge eluiert. Das 50%ige wäßrige Acetoneluat (1650 ml), in der sich die aktive Komponente überwiegend angesammelt hatte, wurde zur Trockene unter Erhalt von 2,08 g eines braungefärbten rohen Pulvers konzentriert. Das rohe Pulver wurde sueezessive einer Aluminiumoxid- und einer Dextran-Gelfiltrationsmittel-Säulenchromatographie in ahnlicher Weise, wie im Beispiel 1, unter Erhalt von 183 mg eines blauen Pulvers unterworfen, das 3-S,S-Dimethyl-mercaptopropylaminophleomycin als Hauptbestandteil enthielt. Das Pulver wurde weiter einer Säulenchromatographie unter Verwendung eines Carboxymethylgruppen enthaltenden Dextrankationenaustauscherharzes (Na⁺-Typ) in zu Beispiel 1 ähnlicher Weise unter Erhalt von 120 mg eines blauen amorphen Pulvers von a-SiS-Dimethylmereapto-pfopylaöiino- ■ phleomycin (kiipferhaltiges Hydrocnlorid) unterwor- 5» fen.

Beispiel 3

Eine SchSttelkultiviereng wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 durchgeführt mit der Ausnähme, daß N-{3'-n-MethyIbenzylanrinopropyI)-l 3-diaminopropan derart hinzugefügt wurde, so daß dessen Konzentration in dem Medium lOOOmGg/ml betrug.

In einer zu Beispiel 1 ähnlichen Weise wurden 3,061 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 78 mg von 3-[3-N-(I - Phenyl-äthy!)-aminopropylamino]-propylaminophkomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 4

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 mit der Ausnahme durchgeführt, daß 3-Amidino-propylamindihydrochlorid derart zugefügt wurde, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 1 ähnlicher Weise wurden 4,21 des Nährlösungsfiltrates unter Erhalt von 110 mg eines blauen amorphen Pulvers von 3-Amidinopropylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) behandelt.

Beispiel 5

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß 3-Aminopropyltrimethylammoniumdihydrochiorid derart zugesetzt wurde, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 1 ähnlicher Weise wurden 3,41 des Kultivierlösungsfiltrates unter Erhalt von 95 mg 3 - Ν,Ν,Ν - Trimethylaminopropylaminophleomycinchlorid (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 6

Die Schüttelkultur bzw. -kultivierung wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß 3-N,N-Dimethylaminopropylamindihydrochlorid derart zugefügt wurde, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In einer zu Beispiel 2 ähnlichen Weise wurden 3,81 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 113 mg eines blauen Pulvers von 3-N,N-Dimethylaminopropylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) behandelt.

Beispiel 7

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durch|i*führt, daß 2 - Ν,Ν - Diäthylaminoäthylamin - dihydrochlorid zugefügt wurden, so daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 3.51 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 75 mg eines blauen amorphen 2-N,N-Diäthylaminoäthylaminophleomycinpulvers (kupferhaltiges Dihydrochlorid) behandelt.

Beispiel 8

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß 4-(2-AJninoätflyn-imida2®Idih3fa*roeM0fid derart zugefügt wurde, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 3,71 de Kulturlösungsfiltrats unter Erhalt von 127 mg vor 2-Imidazol-4-yl)-äthylaminophIeomycin (kupferhalti ges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorpher Pulvers behandelt.

Beispiel 9

Jeweils 100 ml von 51 des flüssigen Mediums, dai im Beispiel 1 erwähnt wurde, wurden in 50 500-mI Erlenmeyerkolben eingeführt und sterilisierL Jede Kolben wurde mit Streptomyces verticillus 843-behnpft und in einem Drehschüttler bei 2T C inku biert. Nach 48 Stunden von Beginn der Kultivieran; linopropylaminobleomycin geführt. Sodann ward wurde eine sterilisierte wäßrige Losung voi N - (3' - η - Butylaminopropyl) -1,3 - diaminopropantri

jno coo/,η

hydrochloric! jedem Kolben derart zugefügt, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 500 mcg/ml betrug. Die Kultivierung wurde für weitere 6 Tage fortgesetzt.

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 4,28 1 des KuI turlösungsfilt rates unter Erhalt von 130 mg 3 - (3 - N - η - Butylarnino - propylamino) - propylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Putvers behandelt.

IO

Beispiel 10

Die Schüttelkultur wurde in zu Beispiel 9 ähnlicher Weise unter Verwendung von 50 Kolben begonnen. Zu jedem Kolben wurde eine sterilisierte wäßrige Lösung von 50 mg N-(3-Amino-propyl)-piperazintrihydrochlorid portionsweise am Tag des Beginns des Experimentes und am 1., 2., 3. und 4. Tag hinzugegeben. Die Kultivierung wurde insgesamt während 8 Tagen durchgeführt. ao

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 3,91 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 65 mg 3 - Piperazinopropylamino - phleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt. *5

Bezugsbeispiei

Es wurde 3-Morpholinopropylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) mit einem Absorptionsmaximum von E₁ ¹It, 150 bei 244 ηΐμ und dem anderen Absorptionsmaximum von Ej^, 54 bei 300 ηΐμ und einer Endabsorption des ultravioletten Absorptionsspektrums in destilliertem Wasser verwendet. 20 mg pulverförmiges 3-Morpholinopropylaminophleomycin wurde in 1 ml Wasser aufgelöst, und in der Lösung wurden 20 mg Mangandioxid suspendiert und bei Raumtemperatur während 40 Stunden unter Rührung umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat durch eine Säule, die mit saurem, aus Carboxymethylgrup- 4· pen enthaltenden Dextranderivaten bestehendem Kationenaustauscherharz gefüllt und mit0,05-m Natriumchloridlösung vorbehandelt war, zur Adsorption des Reaktionsproduktes geführt. Sodann wurde die Konzentration der Natriumchloridlösung als eluierendes Medium linear von 0,05-m zu 1-m zur Elution des Reaktionsproduktes erhöht. Als Ergebnis wurde unumgesetztes 3-Morpholinopropylaminophleoiiiycin in der Fraktion des 0,30-m Natriumchloridlösungselutionsmittels und das Reaktionsprodukt 3-Morpholinopropylaminobleomycin in der Fraktion des 0,35-tn Natriumchloridelutionsmittels eluiert. Die zuletzt genannte Fraktion wurde durch eine Säule, die mit 1 ml Aktivkohle gefüllt war, zur Adsorption von 3-Morphodie Säule mit Wasser zur Entfernung der anorganischen Salze gewaschen und ein Eluiermittel aus 0,02 η-Chlorwasserstoffsäure* Aceton-(I : 1)-Gemisch wurde durch die Säule unter Elution einer blauen Lösung, die 3-Morpholinopropylaminobleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) enthielt, geführt.

Dem Eluat wurde ein Anionenaustauscherharz zugefügt, um auf einen pH-Wert 6,0 einzustellen, und das Elutionsmittel wurde filtriert und das Lösungsmittel verdampft, und es wurde unter Erhalt von 14 mg blauem 3-Morpholinopropylaminobleomycinpulver (kupferhaltiges Hydrochlorid) getrocknet.

Die resultierende Verbindung besitzt das spezifische ultraviolette Absorptionsspektrum, welches für Bleomycin charakteristisch ist und weist ein Absorptionsmaximum von Ej JJ, 159 bei 244 πΐμ und das weitere Adsorptionsmaximum von E₁ ¹I 128 bei 293 ηΐμ und eine Endabsorption in destilliertem Wasser auf.

Die resultierende Verbindung besitzt einen Rf-Wert von 0,65 bei Silikageldünnschichtchromatographie (CH₃OH :10% - CH₃COQNH₄ : 10% — NH₄OH = 10:9:1) und einen Rf-Wert von 0,53 bei Aviceldünnschichtchromatographie(n-C₃H₇OH: Pyridin zu CH₃COOH : H₂O = 15 :10:3 :12), welches die gleichen wie die von 3-Morpholinopropylaminophleomycin sind.

Die antimikrobielle Wirkung gegenüber Mycobakterium smegmatis 607 nach dem Zylinder-Agar-Platten-Verfahren (Standard kupferfreies Bleomycin A₂ freie Base, 1000 μ/mg) betrug 605 U mg.

Hierzu 7 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

J, Phleomycine einer Struktur der Formel

C NH-,

H₂C N-CH₂-CH-C-NH₂

\ / Il

CH

H₂N

NN I I Il

I O HO CH N C

C O CH C CH NH

H₃C N C CH Ö CH CH₂ j

H CH N CH₃ O CH₃ CH₂ S

CH

H O

HO €

CH₇

OH

H-C H C

OH HH

H OH

I c

COC H

CH₂OH

OH

y \

O NH₂

worin Y

bedeutet, worin R

-NH-(CH₂J₁₁-R

-NH-

60 R,—NH-

N—

-(CH₂)₃-NH-(CH₂)_n-R

NH
H₂N-C-

dargestellt ist worin R die vorstehende Bedeutung AmTn entspricht.

3, Antibiotika mit Antitumorwirkung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Verbindung nach Anspruch l, gegebenenfalls unter Zusatz, pharmazeutisch üblicher HilfsstofTe, bestehen.