DE2310462C3 - Phleomycine und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

NH

Il

H₂N-C-NH-(CH₃J₂=S-

"n—

HN N —

O N —

HN

darstellt (worin R₂ eine niedrige Alkyl-, Methoxypropyl-, eine Halogenpropyl-, Allyl-, Cyclohexyl-, Benzyl- oder «-Methylbenzylgruppe und R₃ und R₄ niedrige Alkylgruppen darstellen und η 2 oder 3 bedeutet).

2. Verfahren zur Herstellung von Phleomycinen nach Anspruch !,gekennzeichnet durch Beimpfung eines Nährmediums mit Actinomycetalen, die zur Erzeugung von Antibiotika der Phleomycingruppe fähig sind, Aussetzung des beimpften Mediums in aerobe Kultivierungsbedingungen, und Gewinnung der erzeugten Antibiotika aus der Kulturlösung in bekannter Weise, wobei man dem Kulturmedium ein Amin hinzufügt, das durch die allgemeine Formel

Die Erfindung bezieht sich auf Phleomycine und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie auf Antibiotika mit Antitumorwirkung.

Die Antibiotika der Phleomycingruppe umfassen elf Phleomycine, die durch Streptomyces verticillus {z. B. Streptomyces verticillus 843-1, ATCC Nr. 21 890) erzeugt werden (Maeda, Kosaka,Yagishita, Umezawa, Journal of Antibiotics, A 9, S. 82 (1956); Ikekawa, Iwami, Hiranaka, Umezawa, Journal of Antibiotics, A 17, S. 194 [1964]), Substanzen die durch Streptomyces flavoviridis (z. B. Streptomyces flavoviridis MC-637 Y-I, ATCC Nr. 21 892) erzeugt werden (japanische Patentanmeldung 53 590/71, das Antibiotikum YA-56, hergestellt durch Streptomyces humidus (NRRL 3885) (I t o, O ha sh i, Egawa,Yamaguchi,Furumai,Enomoto, Okuda, Journal of Antibiotics, 24, S. 727 [1971]) und Zorbamycine, die durch Streptomyces bikiniensis var. zorbonensis (NRRL 3684) (Argoudelis, Bergy, Pyke, Journal of Antibiotics, 24, S. 543 [1971]) erzeugt werden.

Diese Antibiotika stellen aus Zuckern und Aminosäuren zusammengesetzte Glycopeptide dar, die eine starke Neigung zur Chelatisierung eines Cu(ll)-Atoms besitzen. Sie haben die Eigenschaft, ein charkteristisches Ultraviolett - Absorptionsspektrum mit Maxima in der Nähe von 244 πΐμ und 30 ηΐμ aufzuweisen. Es wurden nun Untersuchungen bezüglich der chemischen Struktur der Antibiotika der Phleomycingruppe durchgeführt, und als Ergebnis wurde gefunden, daß diese Antibiotika eine teilweise Endstruktur gemeinsam aufweisen, in welcher ein Amin durch eine Peptidbindung mit der Carboxylgruppe von 2-[2-(2-Aminoäthyl)- l²-thiazolin-4-yl]-thiazol-4-carbonsäure

R-(CH₂)„-N

besitzt, R| ein Wasserstofiatom oder die 3-Aminopropylgruppe darstellt und /i = 2 oder 3 ist, um Antibiotika der Phleomycingruppe zu erzeugen, die eine Seitenkettenstruktur aufweisen, die dem H N

NI

-NH-CH₂CH₂ S

—Y

in Verbindung steht. Als Ergebnis weiterer Untersuchungen der chemischen Struktur der Phleomycine wurde nun ermitteil, daß die Phleomycine die folgende Struktur, in der Y l-Amino-4-guanidinobutan tür Phleomycin D₁ und l-(4-Aminobutyl)-3-(4-guanidinobutyl)-guanidin für Phleomycin E bedeutet, aufweisen :

HO

Η,Ν

H

O Il

j

N —

\

H

CH,

—

NH2

-NH2

C

H

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O I

CH

O

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N- /

Il C - \

I

CH-

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N

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CH

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CH, S

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C

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C

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N

C

CH3

CH

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CH,

M I

I H

CH

Γ

\

— N Il

H-

y

-c- H

Il O

CH

CH

/ \

-H

CH,

OH

/1 \

H-C H C

OH HH

O
H

I c

/ I \ ι .

COC

/ j

CH,OH

H OH

/■ \
O NH,

Beispiel

Phleomycin
D₁

Phleomycin
L

NH

- NH — (CH₂U — NH - C NH_:

NH

-NH -(CH₂U-NH C NH

NH
i¹
-(OH₂I₄ — NH — C — NH,

Die Aatöaouka der ^Dhlcomycingruppe zeigen nicht nor breite aod starke antimikrobielle Wirkungen Bakterien end Eumycetes, sondern auch eine g die zur laaibjerung des WachsHeLa-Zelien führea rad auch gegen inhibierend wirken. Jedoch wei

sen diese Phleomycine einen Nachteil dahingehend

auf. daß sie bei fortgesetzter Verabreichung die Niere nachteilig beeinflussen.

Es wurde nun die Möglichkeit in Betracht gezogen. Antibiotika der Phlcomycingruppe mit geringer Toxizität gegenüber der Niere ohne Verminderung der Antitumorwirkung durch Einführung eines spezifischen Aminrests für Y ia das Molekül zu entwickeln Weiter werden die Antibiotika der PWeomycingruppe bei Behandlung mit einem Oxidationsmittel leicht in Antibiotika der Bleomycingruppe übergeführt (bezüglich Antibiotika der Bleomycingruppe vgl. Jornal of Antibiotics. A 19, S. 200 [1966]V die eine Antibiotikagruppe darstellen, die in dem Molekül 2-(2-Aminoäthyl)-2.4'-bithiazol-4-carbonsäure anstatt der vorstehend angefahrten 2-[2-(2-Aminoäthyl)-

6s l^:-thiazoiin-4-yl]-thia7ol-4-carbonsäure aufweisen. Dementsprechend besitzen die Antibiotika der Phleomydngruppe eine erhebliche industrielle Bedeutung, da sie ein wichtiges Ausgangsmatenal zur Herstellung

der Antibiotikader Bleomycingruppe werden könnten, die gegenwärtig in der Therapie von schuppigen Zelltumoren verwendet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Phleomycine, ein Verfahren zu deren Herstellung und Antibiotika der Phleomycingruppe mit Antitumorwirkung zu schaffen.

Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden, daß spezifische Antibiotika der Phleomycingruppe künstlich durch biosynthetische Einführung eines spezifischen Amins in eine durch Y in der vorstehend angeführten allgemeinen Formel eingenommene Stellung erzeugt werden können. Hierauf baut die Erfindung auf.

Gegenstand der Erfindung sind daher Phleomycine einer Struktur der Formel

NH

N-CH₁-CH-C-NH

O HO CH N

C O CH C CH NH

H₃C N C CH O CH CH₂ |

H CH N CH₃ O CH₃ CH₂ S

HO

CH

worin Y
oder

CH,

OH

H-C H C

O H

c c

OH HH

O H

I c

l\i

COC

CH₂OH

OH

H OH

y \

O NH₂

bedeutet, worin R

-NH-HCH₂J_n-R

-NH-(CH₂)J-NH-(CH₂J₁₁-R

R₂-NH-R

«5

N—

509634/287

9 10

(CH)=N phleomycinstruktur unter Bildung einer Restgruppe Y,

^{3 3} und darüber hinaus wird das eine derartige Struktur

aufweisende Phleomycin überwiegend erzeugt. Somit wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine 5 Kulturlösung erhalten, die ein einziges Phleomycinspezies enthält, das dem Amin, das dem Kultur-Il medium hinzugefügt wurde, entspricht. Somit erlaubt

I₂N C NH das Verfahren eine leichtere und wirtschaftlichere

Gewinnung des Produktes und ist somit wirtschaftlich (CH₃J₂=S _I0 gesehen vorteilhafter im Vergleich zu dem Fall, bei

C dem ein spezifisches Phleomycin aus einer üblichen

N — Kulturlösung, die verschiedene Phleomycintypen ent

hält, gewonnen wird.

Beispiele für das im Verfahren der Erfindung ange-N— 15 wandte Amin der Formel

HN N —

O N— ²⁰ R₁

j worin R und R₁ die angegebenen Bedeutungen besitzen, sind:

N,N-Dimethyl-l,2-diaminoäthan

²⁵ (CH₃J₂-N-(CH₂J₂-NH₂ N-

N,N-Diäthyl-1,2-diaminoäthan

darstellt (worin R₂ eine niedrige Alkyl-, Methoxy- ,~ „ . », ,p„ . »,,,

propyl-, eine Halogenpropyl-, Allyl-, Cyclohexyl-, 30 ^{2 2}

Benzyl- oder «-Methylbenzylgruppe und R₃ und R_{4 N}._Methvl-1 3-diaminooronan

niedrige Alkylgruppen darstellen und η 2 oder 3 be- ^J ' ^{p l}

deutet). CH₃NH-(CH₂J₃-NH₂

Die erfindungsgemäßen Phleomycine werden durch

ein Verfahren hergestellt, das gekennzeichnet ist durch 35 N,N-Dimethyl-l,3-diaminopropan

Beimpfung eines Nährmediums mit Actinomycetalen, ,„„ . _Ν ,_pH . _ΝΗ

die zur Erzeugung von Antibiotika der Phleomycin- v-ⁿ3>m ^«2)3 ""2

gruppe fähig sind, Aussetzung des beimpften Mediums 3._AminOp_rOp_yl._trimethyIammoniumhalogenid

in aerobe Kultivierungsbedingungen und Gewinnung „ r rj j e

der erzeugten Antibiotika aus der Kulturlösung in 40 (CH₃J₃N-(CH₂J₃—NH₂

bekannter Weise, wobei man dem Kulturmedium |

ein Amin hinzufügt, das durch die allgemeine Formel X

χ N,N-Diäthyl-l,3-diaminopropan

R-(CH₂J_n-N ⁴⁵ (C₂HO₂-N-(CH₂J₃-NH₂

R₁ N-n-ButyI-l,3-diaminopropan

dargestellt ist, worin R die vorstehende Bedeutung n-QH,—NH—(CH₂J₃—NH₂

besitzt, R, ein Wasserstoffatom oder die 3-Aminopro- 50

pylgruppe darstellt und u = 2 oder 3 ist, um Antibio- N-tert.-Butyl-l,3-diaminopropan

tika der Phleomycingruppe zu erzeugen, die eine _r „ wutru \ _mh

Seitenkettenstruktur aufweisen, die dem Amin ent- ^l ^^⁹ NH(I-H₂J₃ ^«2

^SPEHe erfindungsgemäß erzeugten Verbindungen sind. _ss N-AHyI-1,3-diaminopropan

gegebenenfalls unter Zusatz pharmazeutisch üblicher CH₂=CH -CH₂—NH(CH₂J₃—NH₂

Hilfestoffe als Antibiotika mit Antitumorwirkung _N.₃ .Hydroxypropyl-LJ-diaminopropan verwendbar.

Nachstehend wird die Erfindung ausführlich er- HOCH₂CH₂CH₂-NH-(CH₂Jj-NH₂ läutert. 60

WirdeinActiBomycetestamm,der zor Erzeugung von N-3 .3-Dichlorpropvl-1,3-diaminopropan

gS

das ein durcb Se nadistdiaode aflgemeine Formel (CHj)₂S—(CH₂>₃—NH₂ daigestetees Amin enthalt, so feösnWeö sich dieses |

11

N-Cyclohexyl-1,3-diaminopropan

—(CH₂J₃-NH₂

N-Benzyl-1,3-diaminopropan /~\-CH₂—NH-(CH₂J₃-NH₂

N-u-Methylbenzyl-1,3-diaminopropan /"^-CH-NH-(CH₂J₃-NH₂

CH₃
N-(3-Aminopropyl)pyrrolidin

[^N-(CH₂J₃-NH₂

N-(3-Aminopropyl)piperidin —(CHj)₃-NH₂

N-(3-Aminopropyl)piperazin HN N-(CH₂J₃-NH₂

N-(3-Aminopropyl)morpholin O N-(CH₂J₃-NH₂

4-(2-Aminoäthyl)imidazol HN

CH₂CH₂-NH₂

3-Amidinopropylamin NH

H₂N-C-(CH₂J₃-NH₂

3-Guanidinopropylamin NH

It

H₂N-C-NH-(CH₂J₃-NH₂

N-(3'-Dimethylaminoäthyl)-1,3-diaminopropan (CH₃J₂N-(CH₂J₂-NH-(CH₂J₃NH₂

N-(3'-DiäthylaminoäthyI)-l, 3-diaminopropan IC₂Hs)₂N-(CH₂J₂-NH-(CHJ₃-NH₂

N-i3'-DimerJij1annnopropyl)-13-diaminopropan H₃C

N-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-NH₂

H,C

N-<3'-Cyclohexylainiaopropyf)-i3-diajmiiopropaB H >-NH—(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-NH₂

N-(3'-Benzylaminoäthyl)-l,3-diaminopropan

-CH₂-NH-(CH₂J₂-NH-(CH₂J₃-Nh₂

N-(3'-Benzylaminopropyl)-l,3-diaminopropan

-CH₂-NH-(CH₂)₃—NH-(CH₂J₃-NH₂

ίο N-(3'-a-Methylbenzylaminopropyl)-l,3-diaminopropan

/~V-CH— NH-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-NH₂

>5 CH₃

N-(2'-Piperazinoäthyl)-l,3-diaminopropan

^^ 1-(CH₂J₂-NH(CH₂J₃-NH₂

N-(2'-4"-ImidazolyläthylJ-1,3-diaminopropan

-(CH₂J₂-NH-(CH₂J₃-NH₂ N-(3'-Pyrrolidinopropyl)-l,3-diaminopropan

[^N-(CH₂J₃NH-(CH₂J₃-NH₂

N-(3'-Piperidinopropyl)-l,3-diaminopropan J -(CH₂J₃NH - (CH₂J₃ — NH₂

N-(3'-Morpholinopropyl)-l,3-diaminopropan

O^/~^XN—(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-NH₂

N-(3'-n-ButylaminopropylJ-1,3-diaminopropan n-C₄H,NH- (CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-NH₂

Bei der Ausführung der Fermentierung ist kein Grundmedium einer speziellen Zusammensetzung erforderlich, es wird jedoch nur eine solche Zusammen Setzung die von höchster Produktivität erschein unter den gewöhnlich für die Erzeugung von Phleo mycinen angewandten Medien ausgewählt, die ah Hauptbestandteile Kohlehydrate und stickstoffhaltige organische Substanzen, wie beispielsweise Glukose Hirse-Gelee, Stärke, Sojabohnenmehl und Mais- bzw Kornstärkesaft und geringere Mengen an anorgani sehen Substanzen, wie beispielsweise Kaliumphos phat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Natriumchlorid un Natriumnitrate und oberflächenaktive Mittel ate Anti schaummittel (BE-PS 745 926) enthalten.

Zu einem derartigen Grundmedium wird eine wäß rige Lösung eines Salzes der vorstehend erwähntei Amine hinzugefügt, welches einer Sterilisierungsbe handhmg unterworfen worden war. Was die Zeit de Zusatzes eines Amins anbetrifft, ist es vorteilhafte — obwohl es entweder zu Beginn der Kultivierun oder portionsweise während der Kultivierung hinzu

6s genigt werden kann — es bei einem relativ früh« Stadium der Kultivierung and am wirksamsten mnei halb 48 Stunden von Beginn der Kultivierung an zu zusetzen. Obgleich es um so besser ist, je größer di

zuzusetzende Aminmenge ist, wenn sich nicht eine Toxizität infolge des Amins entwickelt, liegt diese aus wirtschaftlichen Gründen geeignet innerhalb des Bereiches von SOO bis 2000 meg pro Milliliter des Mediums. Der Fortgang der Kultivierung unterscheidet sich nicht im geringsten von jedem der üblichen ftrmentativen Herstellung von Phleomycinen. Bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 25 bis 35° C erreicht die Produktion ein Maximum in 8 bis 10 Tagen im FaS! einer Schüttelkultur innerhalb eines Kolbens, und in 4 bis 7 Tagen im Fall einer belüfteten, in einem Fermentationstank untergetauchten Kultur. Da« in dem Kulturmedium erzeugte Phleomycin wird ti arch ein bekanntes Verfahren wiedergewonnen (T. Takita: J. Antibiotics, Ser. A. 12 [6], S.285 [1959"]). Die Kulturlösung wird über eine Säule mit saurem Kationenaustauscherharz, das Karbonsäuregruppen enthält, des Η-Typs, Na-Typs oder eines Gemisches hiervon oder mit Aktivkohle geführt, um die Adsorption von Phleomycin zu erlauben und sodann mit destilliertem Wasser, wäßrigem Aceton und saurem wäßrigen Aceton in der angegebenen Reihenfolge eluiert. Fraktionen, die gegenüber einem Probeorganismus, Mycobakterium smegmatis 607 aktiv sind (nachstehend zur Vereinfachung als aktive Fraktionen bezeichnet), werden gesammelt und zur Trokkene unter Erhalt eines rohen Pulvers konzentriert. Das rohe Pulver wird in einer 80%igen, wäßrigen Methanollösung aufgelöst und an einer neutralen Aluminiumoxidsäule, die mit dem gleichen Lösungsmittel gefüllt ist, adsorbieren gelassen und sodann mit dem gleichen Lösungsmittel unter Erhalt blauer bis grüner Fraktionen, die Phleomycin enthalten, entwickelt. Mach erfolgter Konzentrierung zur Trockene werden diese Fraktionen in destilliertem Wasser aufgelöst und der Säulenchromatographie mit einem Gelfiltrationsmittel, das aus Dextranderivaten zusammensetzung, die sich jener einer aus einzigen blauen Fraktionen werden zur Trockene unter Erhalt eines blauen amorphen Phleomycinpulvers konzentriert. Das hierdurch erhaltene Pulver zeigt eine Zusammensetzung, die sich jener aus einer einzigen Komponente bestehenden Substanz annähert, die die Wirkung der Addition eines Amins im Vergleich zu einer Zusammensetzung (20,7% Phleomycin D, 23,4% Phleomycin E, 6,9% Phleomycin G, 30,0% Phleomycin H, 19% andere) welche ein durch hf.r-

Bezeichnung des zugefügten Amins

Bezeichnung des neuen Hhleomycins

kömmliche Fermentierung erhaltenes Pulver aufweist, klar anzeigt

Die vorstehend erwähnte Reinigung scheint für die tatsächliche Chemotherapie ausreichend zu sein. Zur weiteren Verbesserung der Reinheit zum Zweck der Aufklärung der physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften ist eine Säulenchromatographie unter Verwendung eines sauren Ionenaustauschers, der aus Carboxymethyl-Gruppen enthaltenden Dex-

tranderivaten zusammengesetzt ist, gut geeignet

Diese Chromatographie wird dadurch durchgeführt, daß man zuerst die Säule mit Phleomycin belädt und sodann die Säule mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert, deren Konzentration allmählich νβη 0,05molar auf hnolar erhöht wird Blaue Phleomycine enthaltende Fraktionen werden gesammelt und durch ein bekanntes Verfahren, ζ. Β Chromatographie mit aktivierter Kohle, die als Adsorbient verwendet wird, unter Erhal? eines blaugefärbten amorphen Pulvers kupferhaltigen Phleomycins im reinen Zustand entsalzt.

Das derari erhaltene Phleomycin zeigt die gleichen Eigenschaften wie jene herkömmlicher Phleomycine, dahingehend, daß es sich aU.jnähiich bei einer Temperatur von 188° C oder höher zersetzt und sich gegenüber Biuret-, Molisch-, Fehling-, Tollens, Eisen(II)-chlorid- und Ninhydrinreaktionen negativ und gegenüber Ehrlich-, Dragendorff- und Permanganatreaktionen positiv verhält. Die Reaktion nach Sakag u c h i ist nur dann positiv, wenn R in der vorstehend bezeichneten allgemeinen Formel eine Guanidingruppe darstellt. Wenn es einer zweidimensionalen Chromatographie (eindimensional: Hochspannungspapierelektrophorese unter Druck; Ameisensäure

Essigsäure—Wasser = 25:75:900; zweidimensional: Papierchromatographie; n- Propanol—Pyridin
Essigsäure -Wasser = 15:10:3:12) nachdem es vollständig in 6n-Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert worden war. unterworfen wird, ergibt das vorliegende Phleomycin 8 Farbpunkte, die gegenüber Ninhydrin positiv sind, unter denen ein Punkt oder Fleck mit jenem des zugefügten Amins zusammentrifft und die anderen jene darstellen, die allen Phieomycinen einschließlich bekannter Phleomycine gemeinsam sind.

Die durch das vorliegende Verfahren erhaltenen Phleomycine und ihre Eigenschaften sind in Tabelle I zusammengefaßt.

(244 m μ) I

'300[Πμ)

	Tabelle 1	Klemcntaranalyse. "/	C	H	N	S	η	Cl	Cu	Wir kung')	TLC2I
Aus			42,63	5.72	16.12	4.18		4,63	4,02	Ein
beute pro			43.42	5,84	15.98	4,05		4,38	3,87	heit'mg	(R,)
Liter		42,64	5,72	16,27	4.31	4,73	4,05		0.35
Kultur lösung								718	0.52
mg							882	0.M,
17		688
15
20

Ν,Ν-Dimethyl- 2-N,N-Dimethyl- 17 42,63 5.72 16.12 4.18 4,63 4,02 718 0.35 154

1,2-diaminoäthan aminoäthylamino- 56

phleomycin

N,N-Diäthyl- 2-N,N-Diälhyl- 15 43.42 5,84 15.98 4,05 4,38 3,87 882 0.52 150

1,2-diaminoäthan aminoäthylamino- 54

phleomycin

N-Methyl-U-di- 3-N-Mcthylamino- 20 42,64 5,72 16,27 4.31 4,73 4,05 688 Om, 148

aminopropan propylaminophleo- 53

mycin

') Die antimikrobielle Wirkung wurde durch ein Zylinder-Agar-Plattcnvcrfahrcn auf Basis von Bleomycin A₂ (kupferfreie Basel auge nommen als 1000 U/mg unter Verwendung von Mycobakterium smegmatis 607 als Versuchsorganismus geprüft

²) Entwickelt unter Verwendung von Methanol-10%, Ammoniumacetat-10% wäßriger Ammoniak - 10:9 : 1 und einem Adsorbens fii! die Dünnschichtchromatographie, das aus Silikagcl und Gips zusammengesetzt ist.

¹I Gemessen in destilliertem Wasser.

15

^r *** 16

Bezeichnung des
zugefügten Amins

Ν,Ν-Dimethyl-1,3-diammopropan

3-Aminopropyltrimethylammoniumchlorid

Ν,Ν-Diäthyl-

1,3-diaminopropan

N-n-Butyl-l,3-diaminopropan

N-tert.-Butyl-

1,3-diaminopropan

N-AUyl-l,3-diaminopropan

N-3-Hydroxypropyl-1.3-diaminopropan

H-3',3-Dichlorpropyl-1,3-diaminopropan

3-Aminopropyldi-

methylsulfonium-

bromid

N-Cyclohexyl-

1,3-diaminopropan

N- enzyl-1,3-diaminopropan

N-a-Methylbenzyl-1,3-diammopropart

N-< 3-Aminopropyl)-pyrrolidin

N-(3-Aminopropyl)-

piperidin

N-(3-Aminopropyl)-

piperazin

N-{3-Aminopropy1)-

morpholin

4-(2-Aminoä".hyl)-imidazol

3-Amidinopropylamin

N-(3'-Dimethylaminopropyl)-1,3-diaminopropan

N-(3'-Cyc1ohexylaminopropyl)-1,3-diaminopropan

Fortsetzung

Bezeichnung des neuen Phleomycin^

3-NJM-Dimethyl-

aminopropylamino-

phleomycin

3-(N,N,N-Trimethyl-

amino)-propyl-

aminophleomydn-

chlorid

3-N,N-Diathyl-

aminopropylamino-

phleomycin

3-N-n-Butylamino-

propylaminophleo-

mycin

3-N-tert.-Butyl-

aminopropylamino-

phleomycin

3-N-Propenyl-

aminopropylamino-

phleomycin

3-N-(3-Hydroxy-

propyl)-aminopro-

pylaminophieo-

mycin

propyD-amino-

propylaminophleo-

mycm

3-S.S-Dimethylmer-

captopropylamino-

phlcomycin

3-N-Cyclohexyl-

aminopropylamino-

phleomydn

3-N-Benzylamino-

propylammophieo-

mycin

3-N-(l-Phenylathyl)-

aminopropylamino-

phleomycin

3-Pyrrolidinopro-

pylammophleo-

mycin

3- Piperidinopropyl-

aminophleomycin

3- Piperazinopropyl-

aminophleomycin

3-Morpholinopro-

pylaminophieo-

mycm

2-(lmidazol-4-yl)-

äthylaminophleo-

mycin

3-Amidinopropyl-

aminophleomycin

3-(3-N.N-Dimethyl-

aminopropyl-

ammoi-propyl-

aminophleomycin

3-13-N-Cyclohexylamincpropylamino)-propylaminophleomycin

Ausbeute

pro Liter Kulturlösung

	Elemcntaranalyse, %	H	N	S	Cl	Cu	Wir kung1)	TLC2)	E
		5,73	16,11	4,37	4,83	3,89	Ein	(Rr)	(244 ιπμΙ
C	5,92	15,82	4,30	4,75	4,08	heit mg	0,35	E (30θΓΠμ)
43,01	5,99	15,70	4,38	4,25	4,04	648	0,«	149 53
43,52	5,95	15,74	4,00	4,78	3,95	506	0,43	150 53
44,17	5,92	15,80	4,25	4,66	4,00	829	0,60	158 58
43,78	5,84	15,60	4,10	4,80	3,65	3535	0,62	151 54
43,83	5,87	15,57	4,43	4,31	3,88	3520	0,58	151 54
43,£2	5,35	15,09	3,73	8,61	3,70	2100	0,61	152 56
43,10	5,76	14,80	6,04	4,77	3,75	845	0,72	151 55
41,91	5,90	15,38	4,01	4,58	3,67	3120	0,43	155 56
42,78	5,78	15,41	3,87	4,32	3,85	865	0,62	158 55
44,86	5,80	15,29	3,66	4,05	4,09	4284	0,57	147 53
45,05	5,71	16,23	4,02	4,41	3,96	3373	0,76	152 54
46,15	5,86	15,47	4,15	4,55	3,76	4030	0,39	150 53
43,86	5,88	16,47	4,17	4,98	3,71	853	0,48	156 55
44,31	5,80	15,36	4,15	4,16	3,98	1006	0,32	154 55
43,40	5,40	16,89	4,03	4,40	4,01	581	0,65	160 56
43,52	5,54	16,91	4,15	4,94	4,31	474	0,77	150 54
43,09	5,95	15,87	4,19	6,89	3,71	678	0,66	157 56
43,13	6,06	15,41	4,18	6,39	3,40	2500	0,11	153 55
42,87					1336	0,31	148 53
44.40		8570	147 52

') Die antimikrobielle Wirkung wurde durch ein Zylinder-Agar-Plattenverfahren auf Basis von Bleomycin A₂ (kupferfreie Base) angenommen als 1000 U/mg unter Verwendung von Mycobakterium smegmatis 607 als Versuchsorganismus geprüft.

²) Entwickelt unter Verwendung von Methanol-10%. Ammoniumacetat-10% wäßriger Ammoniak = 10:9: 1 und einem Adsorbens für die Dünnschichtchromatographie, das aus Silikagcl und Gips zusammengesetzt ist.

Ί Gemessen in destilliertem Wasser

Ϊ7

462 A A

Fortsetzung

	>	Bezeichnung des zngefogien Amms	Bczeicimiiiig des neuen Pfuconiycius	Ans- beate	C	FIr	H	I	5,61	N	raryse,1	Y.	α	I	Cu	Wir	TLT1)	(244 mri
Nr.				pro Liter	4435		553	]		15,41			6.11		333	kung1) Em-		L
			Kultur-												hett/mg		(300 mn)
			losung
	N-(3-Benzyiainino-	3-(3-N-BaKyI-	mg	45.07	5.83		15.24	S	6,42		3,57		0.48	145
24	pfopvi)-13-diamuK>	aminopropylaminoh	13								6710		52
	propan	propylamiDophleo-
	N-13-a-Meihyl-	3-£3-N-(l-Phenyl-									OM	146
25	benzylaminopropyl>	ätbyl)-ammopropyl-	16	43.78	6.13	15.53	3,67	6,23	3.69	7208		52
	1.3-diaminopropan	annnoj-propyl-
		ammophleomyan
	N-(3'-Pyrrclidiiio-	3-(3-PvrroLTJino-									0,11	145
26	POpvl)-l 3-diamino-	propytasinio)-	12	44,30	5,98	15,44	4JO	6,49	3.66	2051		52
	propan	propylaminophleo-
		mycin
	N-<3-Pipcrkiino-	3-<3-Pipendino-									015	148
27	propyl)-1,3-diamino-	propylamino)-	10	43,43	5,86	15,49	3,97	6.39	3,80	2864		53
	propan	propylammophleo-
		mycin
	N-O -Morpholmo-	3-{3-Moφholino-									0,41	143
28	propyl)-13-diamino-	propylaminoy-	8	43.79	5.98	15,j2	3,77	6,50	3.42	961		51
	propan	propylaminophleo
		mycin
	N-(J -n-Bulylamino-	3^-N-n-Butyl-								0.25	155
29	propylH.3-<liamino-	aminopropylaminoH	26	41,94	17.70	3,54	4,58	4,18	4672		55
	propan	propylaminophleo-
		mycm
	3-( iuanidmopropyl-	3-Cjuanidinopropyl-				0.67	149
30	amm	ammophleomycin	18	4,10	2300		53

¹I Die antimikrobielle Wirkung wurde durch ein Zylinder-Agar-Plattenverfahren auf Basis von Bleomycin A₂ (kupferfroie Base) ange-

nornmen als 1000 U mg unter Verwendung von Mycobakterium smegmatis 607 als Versuchsorganismus geprüft. ) Entwickelt unter Verwendung von Methanol-10"/., Ammoniumacetat-10% wäßriger Ammoniak = 10:9 : I und einem Adsorbens Tür

die Dunnschichtchromatographie. das aus Silikagel und Gips zusammengesetzt ist I Gemessen in destilliertem Wasser

Weiter werden in den Fig. 1 bis 7 die UV-Absorptionsspektren, IR-Absorptionsspektren und ein NMR-Spektrum von einigen Beispielen der in Tabelle I angeführten Verbindungen gezeigt. Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen die UV-Absorptionsspektren, gemessen in destilliertem Wasser, von 3-Morpholinopropylaminophleomycin, 3-N-Cyclohexyl-aminopropylaminophieomycin und 3-<3-N-n-Butylaminopropylamino)-propylaminophleomvcin. Die F i g. 4.5 und 6 zeigen die IR-Absorptionsspektren, gemessen als Kaliumbromidtablette, von 3-Morpholinopropylaminophleomycin, 3 - N - Cyclohexylaminopropylaminophleomycin und 3 - (3 - N - η - Butylaminopropylamino) - propylaminophleomycin. Die F i g. 7 zeigt ein NMR-Spektrum von 3-Moφholinopropylamjnophleomycin, gemessen in schwerem Wasser bei 100 MHz unter Verwendung von TetramethySsilan als äußerem Standard.

Die Prüfung der Antitumorwirkung der neuen Phleomycine, beispielsweise von 3-S.S-Dimethylmercapto-propylaminophleomycin und 3-MorphoIinopropylaminophleomycin, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden, zeigten eine deutliche Verlängerungswirkung auf die Überlebenszeit der ICR-SLC-Maus, die mit Ehrlich-Ascites-Karcinomen beimpft wurde. Dies geht aus den Tabellen Il und III hervor. Bemerkenswerter noch ist die Tatsache, daß "bei Vergleich der Antitumorwirkung des zuletzt erwähnten phleomycins mit jener von 3-Morpholinopropylaminobleomycin (Tabelle IV), das die gleiche endständige Amingruppe, die durch Y in der vorstehenden Formel bezeichnet ist wie jene des Phleomycins aufweist, chemotherapeutische Indexe in praktisch gleicher Größenordnung erhalten wurden. Diese Tatsache scheint die Möglichkeit zu eröffnen, daß die neuen Phleomycine als Chemotherapeutika gegen Turn ore, ähnlich wie Bleomycine verwendet werden könnten, welche, und darauf wird hingewiesen, wirksame Antitumordrogen, die gegenwärtig Für die Therapie schuppenförmiger Zelltumore u. dgl. verwendet werden, darstellen (R. W. Sonntag: Cancer Chemotherapy Reports, part I, 66, S. 197 [1972]; A. Yagoda et al.: Annals of Internal Medicine, 77, S. 861 [1972]).

Prüfverfahren der Antitumorwirkung

Das Phleomycin wurde an zehn ancinanderfolgen-

den Tagen in die Pcritoncalhöhle der ICR-SLC-Maus.

in die Ehrlich-Asciles-Karcinome eingepflanzt wor-

den waren, verabreicht. 50 Tage nach dem Beginn des

Hxperimentes wurden Messungen zur Ermittlung

1. der Zahl toter Mäusu infolge der Toxizitiit,

2. der Zahl überlebender Mause.

3. der mittleren öbcrlebens/cil in 50 Tagen und
4. des Verhältnisses der mittleren öbcrlebensdaucr zu jener der Bezugsmaus multipliziert mal 10(1 durchgeführt.

19

Der chemotherapeutische Index wurde aus der zDso (50%ige wirksame Dosis) und LD₅₀ (50%ige ethale Dosis) ermittelt, wie nachstehend angeführt ist.

ED_S0-Wert: Die maximale Dosishöhe innerhalb ies Bereiches des Lebensdauerverhältnisses von 100:200.

LD₅₀-Wert: Berechnet nach dem Behrens-Kärber-Verfahren auf Basis der Meßergebnisse von (1) und (2).

Tabellen

Antitumorwirkung von 3-Morpholino-propylaminophleomycin

Dosis

mg/kg/Tag während Tagen, 'P-

25,0 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 0,19 0

(D

Toxizilät

Anzahl

totei Tiere/

Gesaratzahl

(2)

O berieben

(Dach

50 Tagen),

Zahl der

überlebenden

Tiere/ Gesamtzahl

5/5 2/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

0/5

3/5 5/5 4/5 2/5 0/5 0/5 0/5 0/5

13)

Durchschnittliche Lebensdauer (Bereich)

26,2 392 50,0 49,2 35,0 22,8 16,2 20,6 12,2

(4)

Lebens-' dauerverbältnis

215 321 410 403 287 187 133 167 100

Chemotherapeutischer Index =

LD₅₁ ED„

0,78

Tabelle III

Antitumorwirkung von 3-S,S-Dimethylmercaptopropylaminophleomycin

(1)	(2)
	überleben
Toxizität	(nach
Anzahl	50 Tagen),
toter Tiere/	Zahl der
Gesamtzahl	überlebenden Tiere/
	Gesamtzahl
5/5	0/5
5/5	0 5
3/5	1,5
0/5	4/5
0/5	3/5
0/5	2/5
0/5	0/5
0/5	0/5
0/15	0/15

Dosis

mg/kg/Tag wahrend Tagen. ι p.

25,0 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 0,19 0

Chemotherapeutischer Index =

13)	(4)
Durch schnittliche ..ebensdauer (Bereich)	Leben s- daucr- verhallnis
8,6	59
13,0	89
33,8	232
44,0	301
36,8	252
29.0	199
21,0	144
18,0	123
14.6	KX)

Tabelle IV

Antitumorwirkung von 3-MorphGlinopropyläHiiaobieomycin

5	Dosis	(D	(2)	(3)	(4)
mg/kg/Tag während		überleben
10 Tagen, 10 i. p.	Toxizität Anzahl	(nach 50 Tagen),	Durch schnittliche	Lebens- daüer-
	toter Tiere/ Gesamtzahl	Zahl der überlebenden Tiere/	Lebensdauer (Bereich)	verhältnis
25,0		Gesamtzahl
•5 12,5	5/5	0/5	12,4	102
6,25	4/5	1/5	30,4	249
3,12	2/5	3/5	34,2	280
1,56	0/5	4/5	45,2	370
ίο 0,78	0/5	3/5	36,6	300
0,39	0/5	2/5	33,0	270
0,19	0/5	0/5	11,8	97
0	0/5	0/5	11,8	97
0/5	0/5	12.2	100

° = ^p₇ = 12.1

KIX,,

6.6 0,78

= Chemotherapeutischer Index = p_Ty° =

Die gemäß der Erfindung erhaltenen Antibiotika der Phleomycingruppe können in entsprechende Bleo-

mycine durch Oxidation mit Oxidationsmitteln in folgender Weise umgewandelt werden.

Ein Phleomycin wird in einem Medium aufgelöst, in dem es löslich ist, z. B. Wasser. Methanol usw., und der Lösung ein mildes Oxidationsmittel hinzugefügt. Wird Mangandioxid als Oxidationsmittel verwendet, so wird es in dem Medium dispergiert und bei 0 bis 50⁰C während 20 bis ?40 Stunden umgesetzt.

Das Reaktionsgemisch enthält das gewünschte Oxidationsprodukt, das die teilweise Struktur von 2' -(2-Aminoäthyl) - 2,4' - bithiazol - 4-carbonsäure aufweist, und unumgesetztes Material. Um diese zu trennen, wird das Reaktionsgemisch z. B. in Wasser aufgelöst und durch eine mit saurem Kationenaustauscherharz, das aus Carboxylmethylgruppen enthaltenden Dextranderivaten besteht, gefüllte Säule geführt, die mit Natriumchloridlösung zur Adsorption der Bestandteile vorbehandelt wurde. Die adsorbierten Bestandteile werden mit einem Natriumchlorid-Elutionsmittel eluiert, wodurch das unumgesetzte Material zuerst und sodann die gewünschte Antibiotika der Bleomycingruppe eluiert werden. Die die Antibiotika der Bleomycingruppe enthaltende Lösung wird einer herkömmlichen Adsorptionsbchandlung durch beispielsweise Hindurchführung durch eine mit aktivierter Kohle gefüllte Säule unterworfen. Die Säule wiiu sodann mit Wasser zur Entfernung der anorganischen Salze gewaschen. Sodann wird ein verdünntes Chlorwasserstoffsäure-Acetongemisch durch die Säule zur Elution des gewünschten Produktes geführt. Dem I-.luat wird ein basisches Anionenaustauscherharz zur Einstellung auf einen pH-Wert von 6,0 zugefugl und das Lösungsmittel durch Destillation unter Gewinnung des gewünschten Produktes in Form des Hydrochlorids entfernt.

Die antimikrobielle Wirkung und die chemotherapeutischen Indizes einer Zahl von Beispielen von ir der vorstehend erwähnten Weise erhaltenen Bleo· mycinen sind in Tabelle V wiedergegeben.

Tabelle V

Antimikrobielle Wirkungen der von entsprechenden Phleomycinen abgeleiteten Bleomycine

Name des Blcomycins

2-N,N-Dimelhylamino-

äthylaTiinobleomycin

3-N,N-Dimethylamino-

propylaminobleomycin

3-N,N-Diäthylamino-

propylaminobleomycin

3-N-(3-Hydroxypropyl)-

aminopropylamino-

bleomycin

3-S,S-Dimethylmercapto

propylaminobleomycin

3-N-Cyclohexylamino-

propylaminobleomycin

3-N-(l-Phenylälhyl)-

aminopropylamino-

bleomycin

3-Pyrrolidinopropyl-

aminobleomycin

3-Piperidinopropyl-

aminobleomycin

3-Morpholinopropyl-

aminobleomycjn

3-[3-N-(l-Phenyläthyl)-

aminopropylamino]-

propylaminobleomycin

3-(3-Pyrrolidinopropyl-

amino)-propy lam ι η o-

bleomycin

3-(3-Piperidinopropyl-

amino)-propylamino-

bleomycin

3-(3-N-n-Butylamino-

propylaminoi-propyl-

aminobleomycin

3-(3-N.N-Dimethyl-

aminopropylamino)-

propylaminophleomycin

3-(3-N-Cyclohexylamino propylamino)-propyl-

aminobleomycin

propylamino)-propylaminobleomycin

Wirkung inhcit/mg

Chemothera peutischer Index

897 806

1036

1021

920 6560 5320

1066

1257

592

9470

3286 3580 5840 1670 12.335 6000

7,8 20,4 34,5 29,6

12,0 16,3 59,2

19,2 14,4 21,7 18,1

26,4

16,8

59,2

54

39.5

24.0

(1) Bei Prüfung durch ein /\linder Agar Platten \ ei I.ihren unter Verwendung von M\cobakterium vmegm.u ·.«" ,iK Ver- suebsofganismus wurde die Wirkung von Blcumvcin A. (kupferfreie Base) als 1000 Einheit mg angenommen

(2) Ein Bleomycin wurde wahrend zehn aufcin.inderloliicrklen Tagen in die Pentooealhöhle einer ICR Sl CMjus verahrcp-fet. in die Etefica-Ascms-Karzmorae etngepftan/i worden waren, and SO Tage nach dem Begiaa des Versuches wurde «e Anmwnonwrkung besten«

das aewe Verfahrt« zur Ajatibwtä» der PMeoaycägrapfK auf ycgs verttaUvs als Es rmB jodoeb darauf hingewiesen werden, daß die vorliegende Erfindung in gleicher Weise auf die fermentative Herstellung von Antibiotika der Phleomycingruppe unter Verwendung der vorstehend erwähnten Actinomycetcs wie Streptomyces flavoviridis, Streptomyces humidus und Streptomyces bikiniensis var. zorbonensis angewandt werden kann.

Die Erfindung ist nachstehend im Detail unter Bezugnahme auf die Beispiele erläutert.

R e i s ρ i e 1 1

Zu 1001 eines sterilisierten flüssigen Mediums (pH 7,2), das 0,5% Glukose, 6,4% Hirsegelee. 3,5% Sojabohnenmehl. 0.75% Mais- bzw. Getreidestä.kesaft. 0.2% NaNO.,. 0.8% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% ZnSO₄ 7H₂O, 0.01% CuSO₄-5H₂O und 0,01% eines oberflächenaktiven Mittels enthielt, wurde eine sterilisierte wäßrige Lösung, die 50 g N - (3 - Aminopropyl) - morpholindihydrochlorid (5GOmCgZmI des Mediums) enthielt, zugefügt. Das resultierende Kultivierungsmedium wurde mit Streptomyces verticillus 843-1 (ATCC 21 890) beimpft und einer belüfteten Kultivierung bei 27"C unterworfen. Die Erzeugung des Phleomycins erreichte das Maximum am 5. Tag.

Die Nährlösung wurde unter Erhalt von 9Oi Kultivierungsfilirat filtriert. Das Filtrat wurde durch eine mit 101 eines Carboxylgruppen enthaltenden sauren Kationenaustauscherharzes gefüllte Säule mit destilliertem Wasser und sodann mit 50%igem wäßrigen Aceton gewaschen und mit einem 1 n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton-( 1 :1 !-Gemisch eluiert. 7,81 einer aktiven Fraktion der ausgeströmten Lösung wurden unter vermindertem Druck destillativ von dem Aceton befreit und durch eine Säule zur Adsorption des Phleomycins geführt, die mit 1,01 Aktivkohle für die Chromatographie gefüllt war. Die Elution wurde mit destilliertem Wasser, 50%igem wäßrigen Aceton und einem O^n-Chlorwasscrstoffsäure-Aceton-U : I)-Gemisch in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt. Die aktiven Fraktionen (3,71 hauptsächlich von dem 50%igen wäßrigen Acetoneluat. wurden zur Trockene unter verringertem Druck unter Erhalt von 9.6 g eines rohen, braungefärbten Pulvers konzentriert. Das rohe Pulver wurde in 100 ml 80%igem wäßrigen Methanol aufgelöst, durch Filtration von unlöslichen Materialien abgetrennt und durch eine Säule, die mit 50 ml neutralem Aluminiumoxid (0,019 mm) gefüllt war, zur Absorption der aktiven Komponente geführt, so Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt.

Die blauen Fraktionen des Abflusses wurden gesammelt und zur Trockene unter Erhalt von 4.73 g eines rohen bläulichgrüngefärbten Pulvers air Trokkenc eingedampft. Das lohe Pulver wurde erneut in dcstillicn cm Wasser aufgelöst und durch eine mit 550 ml eines aus Dextranderivate« bestehenden GeI-nltrationsmittels gefüllte Säule geführt. Sodann wurde die Säule mit destilliertem Wasser eluiert und die blauen Fraktionen des Ausflusses gesammelt. Bei der Gefriertrocknung ergaben die bläuen Fraktionen LOS g eines blauen Pulvers, das 3-Morphdinoprapylaminophleomycin (kuperhahiges Hydrcchloridsaiz) ab Hauptbestandteil enthielt. Das vorstehend angefahrte Wauc Paiver werde in

eincT (Xleotaraa, w£8rigea NatrieracfaloridiosBng aufgelöst «hI dorch «nc Säule, dre ad 100 sal eines aas Dextrandematea bestebeadea Geffikrafioaaatt-

tels (Na⁺Typ) gefüllt war, zur Adsorption der aktiven Komponente geführt. Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmittel bewirkt. Die blauen Fraktionen des Ausflusses wurden durch eine mit 35 ml einer aktivierten Kohle gelullte Säule zur Adsorption des vorstehend erwähnten Phleomycins geführt. Nach erfolgtem Waschen mit Wasser wurde die Säule mit Wasser, 50%igem wäßrigen Aceton und 0,02n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton-(l: 1)-Gemisch in der angegebenen Reihenfolge eluiert. Das Phleomycin wurde hauptsächlich in dem 50%igen wäßrigen Acetoneluat aufgefunden, welches zur Trockene unter Erhalt von 467 mg eines blauen amorphen 3-Morpholino-propylaminophleorr.ycinpulvers zur Trockene konzentriert

wurde. «5

Beispiel 2

Jeweils 100 ml au« den 51 des flüssigen, im Beispiel 1 erwähnten Mediums wurden in 50 500-mi-Erlenmeyerkolben eingegeben und sterilisiert. Zu jedem Kolben wurde eine sterilisierte wäßrige Lösung von 3-Amino- w> propyldimethylsulfoniumdihydrobromid derart zugegeben, daß dessen Konzentration in dem Kolben 2000 meg pro Milliliter Medium betrug. Jeder der Kolben wurde mit Streptomyces verticillus 843-1 beimpft und auf einem Drehschüttler bei 27° C während 8 Tagen inkubiert.

Die Kulturlösung in jedem Kolben wurde filtriert und 3,61 der kombinierten Filtrate durch eine mit 300 ml aktivierter Kohle gefüllte Säule zur Adsorption des Phleomycins, das erzeugt worden war, geführt. Sodann wurde die Säule mit destilliertem Wasser, 50%igem wäßrigen Aceton und einem 0,02n-Chlorwassjrstoffsäure-Aceton-(l : Η-Gemisch in der angegebenen Reihenfolge eluiert. Das 50%ige wäßrige Acetoneluat (1650 ml), in der sich die aktive Komponente überwiegend angesammelt hatte, wurde zur Trockene unter Erhalt von 2.08 g eines braungefärbten rohen Pulvers konzentriert. Das rohe Pulver wurde sueezessive einer Aluminiumoxid- und einer Dextran-Gelfiltrationsmittel-Säulenchromatographie in ahnlicher Weise, wie im Beispiel 1, unter Erhalt von 183 mg eines blauen Pulvers unterworfen, das 3-S,S-Dimethyl-mercaptopropylaminophleomycin als Hauptbestandteil enthielt. Das Pulver wurde weiter einer Säulenchromatographie unter Verwendung eines Carboxymethylgruppen enthaltenden Dextrankationenaustauscherharzes (Na ⁺-Typ) in zu Beispiel 1 ähnlicher Weise unter Erhalt von 120 mg eines blauen amorphen Pulvers von 3-S.S-Dimetriylmercapto-propylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlondl unterworfen.

Beispiel 3

Eine Schüttelkultivierung wurde in der gleichen Weise wie im Beispiet 2 durchgeführt, mit der Aus- SS nähme, daß N-p'-n-Methylbenzylaminopropyl)-1,3-diaminopropan derart hinzugefügt wurde, so daß dessen Konzentration in dem Medium 1000 mcg/ml betrug.

In einer zu Beispiel 1 ähnlichen Weise wurden 3.061 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 78 mg So von 3-[3-N-(I-Phenyl-äthyl)-ainhiopropylamino]-propylaminopbleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 4 **

Die Schüttelkultur werde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 mit der Ausnahme durchgeführt, daß 3-Amidino-propylamindihydrochlorid derart zugefügt wurde, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 1 ähnlicher Weise wurden 4,21 des Nährlösungsfiltrates unter Erhalt von 110 mg eines blauen amorphen Pulvers von 3-Amidinopropylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) behandelt.

Beispiel 5

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß 3-Aminopropyltrimethylammoniumdihydrochlorid derart zugesetzt wurde, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 1 ähnlicher Weise wurden 3,41 des Kultivierlösungsfiltrates unter Erhalt von 95 mg 3 - Ν,Ν,Ν - Trimethylaminopropylaminophleomycinchlorid (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 6

Die Schüttelkultur bzw. -kultivierung wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß 3-N.N-Dimethylaminopropylamindihydrochlorid derart zugefügt wurde, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In einer zu Beispiel 2 ähnlichen Weise wurden 3,81 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 113 mg eines blauen Pulvers von 3-N,N-Dimethylaminopropylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) behandelt.

Beispiel 7

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß 2 - Ν,Ν - Diäthylaminoäthylamin - dihydrochlorid zugefügt wurden, so daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 3,51 des Kulturlösungsfiltrates unter Erhalt von 75 mg eines blauen amorphen 2-N,N-Diäthylaminoäthylaminophleomycinpulvers (kupferhaltiges Dihydrochlorid) behandelt.

Beispiel 8

Die Schüttelkultur wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2, jedoch mit der Ausnahme durchgeführt, daß 4-(2-Aminoäthyl)-imidazoldihydrochlorid derart zugefügt wurde, daß dessen Konzentration in dem Kulturmedium 2000 mcg/ml betrug.

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 3.71 des. Kulturlösungsfiltrats unter Erhalt von 127 mg von 2-Imtdazol-4-ylVäthy!aminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 9

Jeweils 100 ml von 51 des flüssigen Mediums, das im Beispiel 1 erwähnt wurde, wurden in 50 500-ml-Erlenmeyerkolben eingeführt und sterilisiert. Jeder Kolben wurde mit Streptomyces verticillus 843-1 beimpft und in einem Drehschüttler bei 27 C inkubiert. Nach 48 Stunden von Beginn der Kultivierung linopropylaminobleomycin geführt. Sodann wurde wurde eine sterilisierte wäßrige Lösung von N - (3' - η - Butylaminopropyl)-1,3 - diammopropantri-

hydrochlorid jedem Kolben derart zugefügt, daß des- ien Konzentration in dem Kulturmedium 500 mcg/ml betrug. Die Kultivierung wurde für weitere 6 Tage fortgesetzt.

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 4,281 des Kulturiösungsfiltrates unter Erhalt von 130 mg 3-(3-NUn- Butylamino - propylamino) - propylaminophieomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines bläuen amorphen Pulvers behandelt.

Beispiel 10

Die Schüttelkultur wurde in zu Beispiel 9 ähnlicher Weise unter Verwendung von 50 Kolben begonnen. Zu jedem Kolben wurde eine sterilisierte wäßrige Lösung von 50 mg N-(3-Amino-propyl)-piperazintrihydrochlorid portionsweise am Tag des Beginns des Experimentes und am 1., 2., 3. und 4. Tag hinzugegeben. Die Kultivierung wurde insgesamt während 8 Tagen durchgeführt.

In zu Beispiel 2 ähnlicher Weise wurden 3.9 1 des Kulturiösungsfiltrates unter Erhalt von 65 mg 3 - Piperazinopropylamino - phleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) in Form eines blauen amorphen Pulvers behandelt.

Bezugsbeispiel

Es wurde 3-Morpholinopropylaminophleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) mit einem Absorptionsnvaximum von EJ*„ 150 bei 244 m\i. und dem anderen Absorptionsmaximum von Ej'°„ 54 bei 300 ηΐμ und einer Endabsorption des ultravioletten Absorptionsspektrums in destilliertem Wasser verwendet. 20 mg pulverförmiges 3-Morpholinopropylaminophleomycin wurde in 1 ml Wasser aufgelöst, und in der Lösung wurden 20 mg Mangandioxid suspendiert und bei Raumtemperatur während 40 Stunden unter Rührung umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgernisch filtriert und das Filtrat durch eine Säule, die mil saurem, aus Carboxymethylgruppen enthaltenden Dextranderivaten bestehendem K.ationenaustauscherharz gefüllt und mit0,05-m Natriumchloridlösung vorbehandelt war, zur Adsorption des Reaktionsproduktes geführt. Sodann wurde die Konzentration der Natriumchloridlösuiig als eluierendes Medium linear von 0,05-m zu 1-m zur Elution des Reaktionsproduktes erhöht. Als Ergebnis wurde unumgesetztes 3-Morpholinopropylaminophleomycin in der Fraktion des 0,30-m Natriumchloridlösungselutionsmittels und das Reaktionsprodukt 3-Morpholinopropylaminobleomycin in der Fraktion des 0,35-m Natriumchloridelutionsmittels eluiert. Die zuletzt genannte Fraktion wurde durch eine Säule, die mit 1 ml Aktivkohle gefüllt war, zur Adsorption von 3-Morphodic Säule mit Wasser zur Entfernung der anorganischen Salze gewaschen und ein Eluiermittel aus 0,02n-Chlorwasserstoffsäure-Aceton-(I : 1)-Gemisch wurde durch die Säule unter Eluiion einer blauen Lösung, die 3-Morpholinopropylaminobleomycin (kupferhaltiges Hydrochlorid) enthielt, geführt.

Dem Eluat wurde ein Anionenauslauscherharz zugefügt, um auf einen pH-Wert 6,0 einzustellen, und das Elutionsmittel wurde filtriert und das Lösungsmittel verdampft, und es wurde unter Erhall von 14 mg blauem 3-Morpholinopropylaminobleomycinpulver (kupferhaltiges Hydrochlorid) getrocknet.

Die resultierende Verbindung besitzt das spezifische ultraviolette Absorptionsspektrum, welches für Bleomycin charakteristisch ist und weist ein Absorptionsmaximum von EJJ_n 159 bei 244 ηΐμ und das weitere Adsorptionsmaximum von EJ*_m 128 bei 293 ηΐμ und eine Endabsorption in destilliertem Wasser auf.

Die resultierende Verbindung besitzt einen Rf-Wert von 0,65 bei Silikageldünnschichtchromatographie (CH₃OH :10% -CH₃COONH₄ : 10% — NH₄OH = 10:9: 1) und einen Rf-Wert von 0,53 bei Avieeldiinnsehichtchromatographie(n-C,H₇OH : Pyridin zu CHjCOOH : H₂O = 15 : 10: 3 :12), welches die gleichen wie die von 3-Morpholinopropylaminophleomycin sind.

Die antimikrobiell Wirkung gegenüber Mycobaklerium smegmatis 607 nach dem Zylinder-Agar-Platten-Verfahren (Standard kupferfreies Bleomycin A₂ freie Base, 1000 μ/mg) betrug 605 LJ mg.

Hierzu 7 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. Phleomycine einer Struktur der Formel

   Il c

   NK₂

   H,C N — CH₂ — CH — C — NH,

   \ / CH

   N N

   H₂N T C

   CH₃ H

   I I

   O HO CH N

   O CH C CH NH

   Il I Ii i I ν

   C CH O CH CH₂

   ^/ S

   H₃C N

   H CH N CH₃ O CH₃ CH₂ S H

   A^H

   CH

   ^H ? H-Tt-H

   HO C C ^- '

   /
   CH,

   O OH

   /l\

   H-C H C

   OH HH

   c /

   COC

   CH₂OH

   OH

   H OH

   // \ O NH₂

   th-orin Y

   bedeutet, worin R

   -NH- (CH₂J₁₁-R

   — NH-

   6o R, —NH-

   N -

   -(CH₂J₃-NH-(CH₂J_n-R

   (CH₃J₃=N-

   NH
   H₁N-C-

   dargestellt ist, worin R die vorstehende Bedeutung Amin entspricht

   3. Antibiotika mit Antilumorwirkung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfalls unter Zusatz pharmazeutisch üblicher Hilfsstofle, bestehen.