DE2006446C3

DE2006446C3 - Verfahren zur Herstellung von Bleomycin-Antibiotika sowie Bleomycine mit strukturell abgewandelter Seitenkette

Info

Publication number: DE2006446C3
Application number: DE2006446A
Authority: DE
Inventors: Hideo Chimura; Akio Fujii; Kenji Maeda; Yuya Yono Nakayama; Nobuyoshi Shimada; Tomohisa Asaka Takita; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1969-02-15
Filing date: 1970-02-12
Publication date: 1978-08-31
Also published as: CH545343A; FI46178C; NO132875B; BG17632A3; USRE30451E; FR2034552B1; FR2034552A1; DE2006446B2; AT295743B; IL33879A0; BE745926A; IL33879A; PL80837B1; GB1292081A; ES376555A1; DK123605B; DE2006446A1; NL147187B; CA923055A; YU35870A

Description

(0 —NH-(CH-,)₃ —NH-CH-\

I '

CH₃

(g) -NH-(CH₂J₃-N-(CH₂J₃-NH₂ CH₃

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bleomycin-Antibiotika sowie Bleomycine mit strukturell abgewandelter Seitenkette.

Die Bleomycine sind Antitumor-Antibiotika, die durch U m e ζ a w a et al. entdeckt wurden. Sie werden durch Züchten eines Bleomycin-erzeugenden, zu den Actinomyces gehörenden Stammes von Streptomyces verticillus (z. B. ATCC 15003) unter aerobischen Bedingungen und unter Rühren in einem Nährmedium, das Hirse-Gallerte (Hauptkomponente Maltose), Glucose, Sojabohnenpulver, Korn-Ein weich wasser. Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Zinksulfat, Kupfersulfat, etc., enthält und Isolieren des gebildeten Bleomycins aus der Kulturflüssigkeit in Form des Hydrochloride oder des Sulfates mit Hilfe von Ionenaustausch-Harzen gewonnen. Man erhält so Produkte, die Ai-, A2-, A₂'-, A₃-, A₄-, A₅-, A₆-, B:-, Br, B₃-, B₄-, B₅-, Be-Komponenten und dergleichen (nachstehend als Bleomycin-Komponenten bezeichnet) enthalten. Diese Bleomycin-Komponenten sind weiße Pulver, wenn man sie ferner noch zur <'.· —NH-(CH₂)₃—NH-(CH₂J₃-N

CH₃

(i) — NH-(CH,)₃—NH- (CH₂J₃

(j) —NH-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-N

C₄H₉

(k) -NH-(CH₂I₃-NH-(CH₂J₃-NHX^)

Entfernung des Kupfers einer weiteren Behandlung unterzieht Bleomycin ist als allgemeine Bezeichnung für Antibiotika, welche diese Komponenten enthalten, bekanntgeworden (GB-PS 10 38 242).

Wenn die Züchtung unter üblichen Bedingungen durchgeführt wird, werden diese Bleomycin-Komponenten gleichzeitig gebildet, jedoch ist das Verhältnis der einzelnen Komponenten zueinander unbestimmt In den meisten Fällen werden hauptsächlich nur die Bleomycin-Komponenten Ajund B₂ erzeugt

Es wurden nun mit dem Ziel, ein Verfahren aufzufinden, durch welches man erwünschte Bleomycin-Komponenten der obengenannten Art selektiv mit günstigen Ausbeuten erzeugen kann, Untersuchungen über die Strukturen der Bleomycine durchgeführt und festgestellt, daß die Bleomycin-Komponenten eine Teilstruktur der nachstehenden allgemeinen Formel I enthalten, und daß der Rest R in der Formel je nach der Art der Bleomycin-Komponente variiert

N-

-CO-R

— NH- CH-CO—NH-(CH₂J₂ -CHOH

CH₃

Bleomycin A₂: R = — NH-(CII₂).,-S

CH₃

Bleomycin A₂: R = -NH-(CH₂J₄-NH₂ Bleomycin A₅: R = -NH-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₄-NH₂ Bleomycin A„: R = —NH—(CH₂)₃—NH—(CH₂)₄—NH—(CH₂)₃ — NH₂ Bleomycin B₂: R = -NH-(CH₂J₄-NH-C-NH₂

NH Bleomycin B₄: R = -NH -(CH₂J₄-NH-C-NH — (CH₂J₄-NH-C NH₂

NH NH

X =

Basierend auf der vorerwähnten Erkenntnis wurde nun festgestellt, daß bei Zugabe von verschiedenartigen, der Seitenkette R in der erwähnten Formel I entsprechenden Aminoverbindungen, oder von solchen Aminoverbindungen, welche bei der Züchtung in der Seitenkette R entsprechende Amine umgewandeil werden, zu den Kulturmedien von Bleomycin-erzcugenden Stämmen, sowohl bekannte aus auch neue Bleomycin-Komponenten in ausgezeichneten Ausbeuten erhalten werden können. ι ο

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur X = -(CH₂Jj-NH-(CH₂I₃-Herstellung von Bleomycin-Antibiotika durch Beimpfen eines Nährmediums mit einem Bleomycin-erzeugenden Stamm von Streptomyces verticillus und Züchten dieses Stammes unter aeroben Bedingungen, bei welchem man 15 dem Nährmedium ein Amin der allgemeinen Formel

R¹ ■-CH —

CH,

R¹ = R² = H

X = — CH₂-CHj-CH₂-R¹ = R² = H

R¹ = R² = CH,

R¹ = H, R² = C₄H₉, C-QH₁,

H₂N-CH₂-X-N CH₃

R² X =

in der X, R¹, R² folgende Bedeutung haben:

X = -CH₂-

R¹ = R² = H, CH₃, C₂H₅ R' = H, R² = -CH₂-CH-CH,

OH

R¹ + R² = -(CH₂I₂-NH-(CH₂I₂-X = -CH₂-CH₂-

R' = R² = H, CH₃, C₂H₅ R> = H, R² = CH₃. -CH₂-CH₂-CH₂OH -CH₂-CH₂-CH₂-OCH, C₄H₉, C-QH₁₁ (CH₂I₂-N-(CH₂I₃-

CH₃

R¹ = R² = H X = -(CH₂I₂-NH-CH-(CH₂I₂-

CH₃

R" = R² = H X = -(CH₂I₂-NH-(CH₂J₄-

R¹ = H, R² = H, -(CH₂J₃-NH₂

CH2

4° X=^

R> = R² = H

45

CH₃ (CH₂I₃-

(CH₂I₃- -(CH₂I₃-N / V

R¹ + R² =

-(CH₂I₄- -(CH₂I₅- -(CH₂J₂-O-(CH₂J₂-

(CH₂J₂-NH-(CH₂J₂- -(CH₂J₂-N-(CH₂J₂-

(CH₂J₃ NH₂

Λ/

R' = R² = H

50 oder

4-Aminomethylpiperidin, 4-(2-AminoäthyI)-imidazol, S-Aminopropyltrimethylammoniumchlorid, N-{4-Aminobutyl)-guanidin,

3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromid oder S-Amino-S-carboxypropyldimethylsulfoniumchlorid

zugibt und aus der Kulturflüssigkeit das aus der zugegebenen Aminoverbindung gebildete Bleomycin durch Chromatographieren an Kationenaustauscherharz, Aktivkohle oder Aluminiumoxid und vernetzten! Dextran und Eluieren in an sich bekannter Weise isoliert

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Aminoverbindungen sind in der nachfolgenden Tabelle I, zusammen mit den Schmelz- bzw. Siedepunkten, niedergelegt

Ί;ι belle

Nr. Aminincrbindunü

lormcl

Physikalische I igcnschaflcn

1.2-Diaminoälhan

H₂N (CM₂), NH₂

CH,

Kp.:

116 117 C

1	N.N-Dimelhyl- 1.2-diaminoäthan	H₂N(CH₂I₂N \ CH,	Kp.: 105 108 C
		C₂H₅
3	Ν,Ν-Diäthyl- 1,2-diaminoäthan	H₂N(CHj)₂N' C₂H₅	Kp.: 147- 15 Γ C
4	N -(2- H yd roxypropy 1 )- 1,2-diaminoäthan	H₂N(CH₂J₂-NH-CH₂-CH CH₃ OH	Kp.: 123—126"Q 12 mm Hg
5	N-(2-Aminoäthyl)- pipcrazin	H₂N-(CH₂J₂-N NH	Kp.: 280— 28 Γ C
6	1,3-Diaminopropan	H₂N-(CH₂J₃-NH₂	Kp.:
7	Ν,Ν-Dimcthyl- 1,3-diaminopropan	O₄ H₂N-(CH₂J₃-N CH₃	Kp.: 132—135,5 °(
		C₂H₅
8	N,N-Diäthyl- 1,3-diaminopropan	H₂N-(CH₂J₃-N C₂H₅	Kp.: 166—172"C
9	N-Mcthyl- 1,3-diaminopropan	H₂N-(CH₂J₃-NH-CH₃	Kp.: 138—142° C
IO	N-(3-HydroxypropylJ- ! ,3- diaminoprooan	H₂N-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-OH	Fp.: 119—120°C

11 N-(3-MethoxypropylJ-1,3-diaminopropan

12 N-Butyl-

1,3-diaminopropan

13 N-Cyclohexyl-

13-diaminopropan

H₂N-(CH₂J₃ - N H - (CH₂J₃ ~ OCH₃

H₂N-(CHz)₃-NH-C₄H₉

H₂N-(CH₂J₃-NH

Fp.:
225° C

Kp.:

114—116°Q

20 mm Hg

Kp.:

124—125°Q

21 mm Hg

14 N-Benzyl-

1,3-diaminopropan

H₂N-(CH₂J₃-NH-CH₂-

Kp.:

150—155°C/ 25 nun Hg

15 N-0-Phenyläthyl)-13-diaminopropan

H₂N-(CH₂J₃-NH-CH CH₃

Kp.:

148—150⁰C/ 24 mm Hg

809635/104

Fortsetzung

ίο

Nr Aminmirrhiruhinü

f 'ormel Physikalische (■men schäften

16 N-(3-PyrrolidinopropyD- H₂N (CiI₂). Nil (CM.)., N 1.3-diaminopropan Kp.:

159 I (.2 C 22 mm He

17 N-(3-Piperii.liniipropyl)-1,3-diaminopropan

H₂N (CU,), Nil (CII;), N Kp: 164 167 C 21 mm Hu

18 N-(3-Morpholinopropyl)- H₂N (CH₂)., Nil [CM₂I, N O 1.3-diaminopropan

Kp.:

176 ISO C 20 mm Hü

19 N-(2-Furfuiyl)-1.3-diaminopropan

H₂N (C H₂), Nil CH₂ <'·;

Kp.:

105 KN C 3 mm Ha

20 N-(3-Aminopropyl)-pyrrolidin

H₂N (CH₂), N Kp.:

185 189 C

21 N-(3-Aminopropyl)-piperidin

H₂N iClUh N Kp.: HX) C 20n-.m Hü

22 N-(3-Aminopropyl)-morpholip

H₂N---(CH,)., N Kp: 219 C 733 mm Hü

23 N-(3-Aminopropyl>piperazin

H₂N (CH₂), N NH Kp: 80 81 C 2 mm Ha

24 N,N'-Bis(3-aminopropyl)- H₂N (CH₂), N N (CH₂),- NH, piperazin ^v

25 1,2-Diaminopropan

26 1.4-Diaminobutan

H₂N CII, ν Il NII, i CH,

H,N (CH₂I, NH, Kp.:

188 202 C 21 mm Hg

Kp.:

118 119 C

Kp.: 158-160 C

CH,

27 N-(3-Dimelhylamino- H₂N-(CH₂)₃—NH-(CH₂J₃-N propyl>-13-diaininopropan \

28 N-Butyl-N-(3-amino- H₂N- (CH₂)₃— NH- (CH₂),- NH- C₄H₉ propyl)-13-diaminopropan

29 N-a-Cyelohexylamino- H₂N- (CH₂)!,- NH- (CH₂)₃—NH

propyl)-!.3-diaminopropan Kp.: 125 C/ 23 mm Hg

Kp.:

125—126 C/ 3 mm Hg

Kp.: 180° C/ 21 mm He

Il

12

Kortsetzunü

Sr \ΐτρ:ι· 'v-.-rbin-J

I*h\sikalischc liucns«. hallen

.'(I N-(!-Phcn\Iiith\lH
N -ι 3-jmiiK>prop\ I l·
1.3-duiminoprop.m

N.N-Bis*V_;1mtiH>prup>l)-tnethyhimin

N-l3-.\mmo-l-nKth\l-

N-i.V-Sminoprop)!)-1.4-diaminobuuin
(Sperm idin)

N.N"-Bis(3-aminopropyD-

1.4-diuminobuUin

(Spermin)

m-X\h ltndiamin

p-Xylylcndiamin

IKN n M₂), NH (CII,), NH C\i

(H,

H₂N (CM₂)., N (CH,), NM₂
CM,

H₂N (CU,)., ^NM C M (ClK)₂ NH, Ci I₁

H₂N ((H₂K NH (CIK)₄ NH₂

IKN Kll.i, NH (CH₂U Nil (CM,), NM₂

CH,- NM, H₇N-CM, <'

Η,Ν CH. -<' '>- ah NM,

Kp.:

150 153 C

mm My

Kp.:

97 HX) C

2 mm Μ»

Kp.:

!23 125 C

Kp.: 115 C 3 mm Mt:

Kp.:

150 1«) C

3 mm Hn

Kp.:

138 !39 C/

9 mm Ha

Fp.: 35 C

4-Aminomethylpiperidin M₂N-CH,-< NH

4-i2-Airanoäthyl)-

iiuidazot-hy drochlorid

3-AminopropyltrimethyI-

<f

NH

N-H-Ammobutyl)-guanidin suifal (Agmatinsulfal)

Η,Ν—(CH,>,—<( I ■ hydrochlorid

Ν—¹

/H₃

H₂N-(CH₂J₃-N-CH₃ Cl CH₃

H,N-(CH,)₄—NH-C-NH₂ sulfat NH

Kp.:

78 C/ 5 mm Hg

Fp.:

247 250 C

Fp.: 20O--2O1 C

Fp.: 231C

3-Aminopropyl-dimethyl- H₂N—(CH₂)₃—S - hydrobromid snifbtihim-bromid- [ \

hydrobroniid Br CH₃

Fp.:

87—88 C

S-Ainina-J-carboxyTMropyl- H₂N-CH-(CH₂J₂-S

dnnetiiylsoifbnium-chlorid j [ \

COOH Π CH₃

Fp.:

139-140 C iZers.»

Wenn beispielsweise 3-Aminopropyl-dimethyIsiiIfoniumbromid oder 3-Amino-3-carboxypropyl-dimethylsulfoniumchlorid als Aminoverbindu"g zu einem Nährrnedium zugegeben und ein Bleomycin-erzeugender Stamm, wie Streptomyces vTticillus, in dem erwähnten s Medium gezüchtet wird, erhöht sich der gebildete Anteil an Bleomycin A₂ auf Kosten der gesamten anderen, in dem Kulturmedium vorhandenen Bleomycine. Desgleichen erhöht die Zugabe von Agmatinhydrochlorid den Prozentgehalt an Bleomycin B?, die Zugabe von ι ο 1,4-Diaminobutan den Prozentgehalt an Bleomycin A2' und die Zugabe von Spermidin den Prozentgehalt an Bleomycin A5. Jedoch führt die Zugabe von Spermin nicht nur zu einer Bildung von Bleomycin Ae mit der entsprechenden Seitenkette, sondern auch zu einer Produktion von Bleomycin As mit dem Spermidinrest in der Seitenkette, der während der Züchtung aus dem Spermin entstand. Im Falle eines Stammes, der eine hohe Fähigkeit zur Umwandlung von Spermin in Spermidin besaß, führte die Zugabe von Spermin hauptsächlich nur zur Bildung von Bleomycin A₅. Ebenso führte die Zugabe von beispielsweise 1,2-Diaminoäthan oder 1,3-Diaminopropan zur Produktion von neuem 2-Aminoäthylamino-bleomycin oder 3-Aminopropylamino-bleomycin. Ferner lieferte eine Verbin- 2s dung mit einer Polyamin-Kette, wie N,N-Bis(3-aminopropylj-methylamin, hauptsächlich das neue 3-(N-Methyl-N-3-aminopropyl)-aminopropylamino-bleomycin, das die der zugegebenen Verbindung entsprechende Seitenkette besitzt. Außerdem entsteht jedoch aus einem Amin mit niedrigerem Molekulargewicht, welches sich aus dem erwähnten Additiv während der Züchtung gebildet hatte. 3-N-Methylaminopropylamino-bleomycin als Nebenprodukt

Daß Mikroorganismen unter Umständen die Fähigkeiten der Esterspaltung, der Dealkylierung und der Decarboxylierung besitzen, ist bekannt Es sind daher auch Aminoverbindungen, welche sich während des Kulturverfahrens, in die Amine der Bleomycin-Seitenkette umwandeln, in die vorliegende Erfindung cinbezo- gen, wie die Aminoverbindungen, in welchen Wasserstoff der Methylengruppe in der 2-Stellung von -NH₂ durch eine Carboxylgruppe oder eine Säureamidgruppe ersetzt worden ist, und welche im Stoffwechsel leicht zu Aminen umgesetzt werden. 4 s

Im allgemeinen werden die Aminoverbindungen als solche, oder in Form ihrer anorganischen Salze verwendet, jedoch variieren die Konzentrationen derselben in dem Kulturmedium in Abhängigkeit von ihrer Konstitution. Beispielsweise wird im Fall von 3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromid, Spermin und Spermidin eine Konzentration von zumindest 0,2 bis 9,4 mg/ml benötigt, wohingegen im Fall von 3-Amino-3-carboxypropyl-dimethylsulfoniumchlorid eine Konzentration in Höhe von zumindest 40 mg/ml erforderlich ist Ferner ist im Fall von N-(3 Aminopropyl)-morpholin und N-{3-Morpholinopropyl)-13-diaminopropan eine Konzentration von etwa 0,1 bis 0,5 mg/ml ausreichend, wohingegen im Fall von N-(2-Aminoäthyl)-piperazin und N-(3-Methoxypropyl)-I3-diaminopropan eine Konzentration von etwa 2 mg/ml notwendig ist Im allgemeinen jedoch ist eine Konzentration von etwa 4 mg/ml adäquat

Bei der praktischen Ausführung des vorliegenden Verfahrens wird es bevorzugt, ein Medium zu f>.s verwenden, welches hauptsächlich aus Kohlenhydrate- und Stickstoff-enthaltenden organischen Substanzen, wie z. B. Hirse-Gallerte, Glucose. Stärke, Sojabohnenpulver, Korn-Einweichwasser, besteht, und das geringe Mengen an anorganischen Substanzen, wie beispielsweise Kaliumphosphat Kupfersulfat. ZmksuHat, Natriumchlorid. Nitrate, enthält In diesem Medium wird Streptomyces verticillus oder ein Bleomycin-erzeugender Stamm von im Wachstum abweichenden Tochterkolonien aerohisch gemäß den üblichen Arbeitsverfahren gezüchtet Danach wird die Kuiturfiüssigkeit filtriert und das Filtrat an beispielsweise einem Kationenaustauscher-Harz mit reaktiven Carboxylgruppen adsorbiert und anschließend mit wäßriger Salzsäure-Lösung eluiert Nachfolgend wird das Eluat hintereinander den Stufen der Adsorption an Aktivkohle, Ehition mit wäßriger Aceton/Chlorwasserstoflsäure-Lösung, Tonerde-Adsorption, Methanol-Elution. Adsorption (beispielsweise an im Handel befindliche, vernetzte Polysaccharide auf Dextran-Basis) und Elution mit destilliertem Wasser unterworfen, wodurch man ein Bleomydnhydrochlorid-Pulver erhält Für eine weitere Reinigung des so erhaltenen Pulvers wird eine chromatographische Elution mit Ammoniumchlorid- oder wässeriger Ammoniumformiat-Lösung. unter Verwendung eines vernetzten Polysaccharids mit Carboxymethylgruppen als Träger bevorzugt angewandt Schließlich wird das Eluat an Aktivkohle adsorbiert und den Stufen der Was erwäsche und der Elution mit wässeriger Aceton/Chlorwasscrstoffsäure-Lösung unterworfen, wodurch man eine reine Bleomydn-Komponente erhalten kann.

Wenn gemäß der vorliegenden Erfindung eine Bleomycin-Komponente in ausreichendem Maße selektiv in dem Kulturmedium erzeugt wurde, kann die Stufe der Abtrennung unter Verwendung eines vernetzten Polysaccharids mit Carboxymethylgruppcn auch wegfallen.

Bleomycine haben die Eigenschaft, mit Kupfer Chelate zu bilden und werden aus der Kuiturfiüssigkeit als blaues Pulver erhalten, jedoch kann das Kupfer mittels Durchführung einer Behandlung zur Kupferentfernung in irgendeiner der Extraktions- oder Reinigungsstufen entfernt werden.

Von den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Bleomycinen haben sich diejenigen als besonders wirksam herausgestellt, die gekennzeichnet sind durch UV-Absorptionsmaxima bei 244 nm und bei 290 bis 295 nm und durch eine Partialstruktur gemäß folgender allgemeiner Formel

NHCH CO-NH-(CH₂)₂4

CHOH

CH₃

in der R bedeutet:

(a) -NH-(CH₂)J-NH-CH,

(b) -NH-(CHj)₂-NH-CH₂-CH-CH,

OH

(C) NH --(CH₂I₃-l/J

(d) -NH-(CH₂), — NH-(CH₂),- CXH₃

15 16

O dung erhaltenen Bleomycine werden in der Tabelle Il

gezeigt. Alle in der Tabelle II aufgeführten Verfahrensprodukte (Bleomycine) wurden als Cu-Chelate erhalten

^₁₁₁ /^/==N"\ und weisen Ultraviolett-Absorptionsmaxima hei 243 bis

(0 — NH-<CH₂)₃—NH-CH-\_^ ₅ 244 und bei 293 bis 294 nm auf.

I Das Infrarot-Absorptionsspektrum und das Ultravio-

^"3 lett-Absorptionsspektrum von mehreren Verbindungen

„.. .,,, in Tabelle Il werden in den Fig. 1 bis Fi g.6 wie folgt

(g) -NH-(CH₂)₃ — N-(CH₂)₃-NH_{2 gezeigt}.

^l0

Tabelle II

Zuge setzte Amino- vcrb. *Nr.)**	Vcrfahrcnsprodukl b/w. Strukturformel des eingerührten Restes R	<_CH₂)₂	NH₂	\	\	C₂IU	N⁷ NH	CH.,	N
I	NH		CII,	\ CH,	Nil CH₂-CH--CH,	NH₂	-N ill
		(CHj)₂N	C₂IU	OH	(MU
2	NII

		KII₂I₂N
3	NII
		KHj)₂
4	NH
		(CH₂)₂
S	NII	(CH₂).,
6	NH
		(CH₂),
7	NH
		ICH,!,
S	NII

Hergc- I'igcnschaftcn der Verfahrensprodukte

stellt

nach i:iemcnlaranalysc(%) Wirk- Chromato-

Hci-

spiel

Nr.

³ _ru Fig. Spek- Name der Verbindung Verbdg.

χ* trum Nr.

(h) — NH-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-N

\ _1S 1 IR 3-[3-(N-Butyl)-aminopropyl]- 28

CH₃ ^- aminopropylamino-bleomycin

G 2 UV 3-[3-(N-Butyl)-aminopropyl]- 28

aminopropylamino-bleomycin

3 IR S-d-Methyl-S-aminopropyl)- 32 P j, ²⁰ aminopropylamino-bleomycin

/ ⁴ 4 UV 3-(l-Methyl-3-aminopropyl)- 32

φ -NH-(CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-N aminopropylamino-bleomycin

\ 5 IR 3-(3-Cyclohexylaminopropyl)- 29 |

H ₂₅ aminopropylamino-bleomycin |

—. 6 UV 3-(3-Cyclohexylaminopropyl)- 29

(k) -NH (CH₂J₃-NH-(CH₂J₃-NH-/ \ aminopropylamino-bleomycin |

Die Verbindungen 1, 6, 24 bis 26 und 31 bis 36 der %

Mehrere Eigenschaften sowie die Ergebnisse der -J₀ Tabelle II geben eine positive Ninhydrirc-Reaktion, und (

Elementaranalyse der gemäß der vorliegenden Erfin- die Verbindung 40 eine positive Sakaguchi-Reaktion. |

	H	N	S	sam- kcil")	graphic *(R₁-WcN)")**	Papier	g
C	6,15	16,60	4.21	(meg/mg)	Dünn schicht	0,80	I
4X12	6,25	16.48	4.13	1700	0.62	0,86	I
4X20	6,35	16.14	X9I	897	0,46	0,89	I r-
45,01	6,45	16,38	4,35	1102	0.48	0,84
43,50	6.30	16,78	3.95	1020	0,65	0,85
44.38	6.20	16.51	4,18	799	0,36	0,81
43,15	6.35	16,30	4,09	1934	0,60	0,83
44.16			869	0,28

43.91 6.30 15.96 4.(Kl 1036 O.40 0.X7

17

Fortsetzung

Zuge- Verfahrensprodukl bzw. Slruklurformel des

selzte eingeführten Restes R

Amino-

verb.

Nr.*)

9 -NH-(CH,)., NH-CHj

10 -NH-(CH₂I₃-NH -(CH₂I₃-OH

11 -NH-KH₂),- NH-(CH₂)., -OCH₃

12 NH ((H₂)J-NH-C₄H₉

13 - NH-(CH₂)., NII < >

14 - NH (CH₂),- NH -CH₂ >

15 NH ICH,), -NH -CH ■'! >

(H,

16 Nil (CH₂I₃ Nil (CII,), Nj

17 NH (Cl!,), NH K H,|, N

IX Nil ((.U₂), NH (CH₂), N

19	NH	(CH₂I,	Bleomycin A₂	NH	( Η_:
20	NH		•ν'
21	NII	(CII₂),	N	/
22	NH	(CH..).,	N	O /
23	NH	(CH₂).,	-ν'	NII
24	- NH	(CH₂).,	N	N . /
25	- NH	CH₂ ( ι	Il	NH₂
		I C	Ή,
26

27

28
29

30

NH -(CH₂)., NlI-(CH₂I, N

(H,

CH,

Nil (CH₂)., Nil (CH₂)., NH C₄H, -NH-(CH₂)J-NH (CH₂),- Nil j ^

NH-(CH₂I₁-NH !'H₂I₁-NH -CH-

CH, -NH-(CH₂I₅-N-(CHj), -NH,

(H, NH IC 11,1, Nil ClI ι(ΊΙ,), ΝΗ_:

I lerne- lüuenschafien der Vcrfahrensprodukle

stell!

nach tlementaranalyse (%) Wirk-

Bei- sam-

spiel keil**)

Il

S (mci· mgl

2 43,97 6,24 16,42 4, IS 860

2 43,76 6.40 I6.3X 4,22 1300

2 43,91 6.35 16,21 4.10 1335

2 43,30 6.31 16.20 4.32 17(XJ

2 44,91 6.60 15,27 4,03 5355

2 45.40 6,41 15,30 4,(X) I9S6

2 45.39 6.42 15.13 4,13 24(X)

2 44.20 6,41 16.X0 3.9X 2564

2 44.30 6,51 16.62 4.IK) 35X0

2 44,52 6,30 16.20 3.X9 1201

2 46.39 6,37 I6.4X 4.35 1450

2 44,90 6,22 16,20 4.12 1066

2 44.71 6..¹Ii 16,17 4.21 1257

2 44,36 6.25 16,15 4,03 592

2 44,91 6,21 16,50 3,91 726

2 44.01 6.14 17.52 3,90 1130

2 43,XO 6,04 16.60 4.31 2173

Chromatographie

Dünn- Papier schicht

0,51 0.X3

0.63 0.X6

0,54 0.K7

0.70 0.X3

0,57 0,79

0,53 0,70

0,62 Ü.X5

0,1 O.XX

0.14 O.XX

0.3X 0,X7

0,67 0.X3

0.36 0,XX

0.14 0.X6

0,65 0.X3

0.30 0.X4

0.25 0.X6

O.(i6 0.Xl

3 43,93 6.02 I6.7X 4,25 1232 0.66 0.Xl

2 43.X0 6.35 16.91 4.05 12(X) 0,14 0.X3

2 43,(X) 6.62 16.40 3,78 5X40 0.23 0.X4

2 44,02 6.63 I6.4X 4,02 11215 0.24 0.XO

2 45.51 6.42 16.45 3.20 25(X) ,0.46 0,75

2 43.20 6,20 17.00 4.09 1671 0.23 0.33

43.42

Ih.XO 4.1 ! lX2(i

0.32 0.K4

-ortsetzunn

'mix- Verfahrensprodukl bzw. Strukturformel des

ei 'lc eingeführten Restes R

\mino-

33	Bleomycin A₅	CH, Nil, Ö
34	Bleomycin A₅	<f y- cn, ν
35	-NH-CH₂	·( Nil
36	-NH-CH₂	. ■ <f I ■ hyd.-och N=-^J
37	-NH-CH₂	VW,
3X	Nil (CH₂I,	, n'- cn, i \ (Ί (H,

39	Nil (CH₂I
40	Bleomycin B₂
41	Bleomycin A₂
42	Bleomycin A₂

llerue- l.ip/nschaitcn der Verfahrensprodukte

steill

nach l-.l. ..iilaranalyse("i.| Wirk- (hromalo-

Bei- sam- uraphic

spiel keil"! ÖVWert)·"!

Nr. Dünn- Papier H N S Imeämgl schicht

4 43,81 6.34 16.39 4,05 2700 0.16 0.88

43.X! 6,34 16,39 4.05 2700 0,16 0,XS

44.89 6.28 15.98 4,19 2546 0,61 0.66 44.S0 6.30 15.70 4.18 2350 Ο.ίΧ 0.64 44.60 6,43 16.20 4.25 1394 0.41 0.72

43.85 6.25 16.X0 4.28 847 0.40 0.70

44.71

Ml 16.21 4.(K) 633

43.92 6.31 17.4! 3.34 3094 44.13 6.14 15.51· 6.43 941 44.13 6.14 15.51 6.43 941

0.38

0.89

0.72	0.66
0.39	0.85
0.39	0.85

Anmerkungen zu Tabelle II:

*) Die Bezifferung entspricht derjenigen von Tabelle I.

♦·) Die Wirksamkeit wurde gemäU der biologischen Prüfung unter Verwendung von kupferfreicm Bleomycin A₂-I lydrochlorid (Wirksamkeil 940mcg/mgl als Standard-Substanz und M. tuberculosis 607 als Test-Mikroorganismus gemessen. Die Prürmcthodik ist in US-Pharmacopeia. 19. Ausgabe. Seiten 596 bis 6(K) (1975) beschrieben.
***) Dünnschicht-Chromatographie:
Adsorbierendes Mittel = Silicagcl
Lösungsmittel = 10:9: I-Mischung von Methanol-10%

Ammoniumacclat-10% wasserige Ammoniaklosung. Papierchromalographie:
Lösungsmittel = IO%ige wässerige Ammoniumchlorid-Lösung.

Wie aus derTabe'.le Il klar hervorgeht, sind die neuen gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Bleomycine den bekannten Bleomycin-Komponenten im Aussehen und in der UV-Absorptionskurve ähnlich, jedoch unterscheiden sie sich offensichtlich von diesen in der Wirksamkeit (mcg/mg) und den Rr-Werten. Ferner muß noch erwähnt werden, daß man nach Hydrolyse der neuen Verbindungen mit starken Säuren die Amino-Verbindungen, welche als Additive für die Kultur verwendet wurden, oder die Aminoverbindungen, welche während des Kulturverfahrens gebildet wurden, bei der gaschromatographischen Untersuchung der Hydrolysate findet. Auch dies beweist, daß die neuen Bleomycine Seitenketten besitzen, welche den zugesetzten Aminoverbindungen oder den während des Kulturverfahrens gebildeten Verbindungen entsprechen.

Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde es erstmals möglich, diejenigen Bleomycin-Komso ponenten, welche für individuelle therapeutische Zwekke geeignet sind, selektiv in hohen Ausbeuten und in reiner Form zu gewinnen. Beispielsweise können die Bleomycine A₂ und A₅, welche in ihren Antitumor-Eigenschaften von starker Wirkung sind und eine

geringe Toxizität aufweisen, selektiv erhalten werden. Ferner wurde es möglich, als neues Bleomycin 3-Aminopropylamino-bleomycin (Tabelle II, Verbindung Nr. 6) zu erhalten, das ausgezeichnet in seiner Wirkung ist und eine niedrige Toxizität aufweist.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. In den Beispielen 1 bis 4 wurde jeweils das in der nachstehenden Tabelle III beschriebene Nährmedium verwendet. Dem Nährmedium wurden, sofern anderslautende Angaben nicht gemacht werden, die jeweiligen, dem Resi R entsprechenden Aminoverbindungen mit endständiger H^N-Gruppe zugegeben.

60

Tabelle III

Zusammensetzung des Nähi mediums

Komponente	Heispiel 1	15	-	0,5	-	-	2,0	6,5	(%)	Beispiel 2	15	-	0,5	-	10	-	6,5	(%)	Beispiel 3	-	1,2	-	6,5	(%)	Beispiel A
	(5 I)*)	5	10	6,4	(5 I)*)	5	0,5	10	6,4	(12 1/*)	24	6,4
		2,5	0,5	0,5		2,5	0,5		2,4	0,5
		3,5		3,5		1,2	3,5
llirsc-Gallerte	Gesamtmenge	-	Gesamtmenge	-	Gesamtmenge	24	-	_
Ciluco.se	<SI	0,75	Ig)	0.75	(μ)	0,75	-
Sojabohnenpulver	320	-	320	-	768	-	4,0
Sojabohnenöl	25	0,3	25	0,3	60	0,3	1,0
Korri-FJnwcichwasscr	175	0,1	175	0,1	420	0,1	-
Hefecxtrakt	-	0,05	-	0,05	-	0,05	1,0
NaCI	37,5	-	37.5	-	90	-	0,3
K₂HPO₄	-	0,01	-	0,0!	-	0,01	-
ZnSO₄ · 7H₂O	-	-	36	-	0,0002
FeSO₄ ■ 7H₂O	0,2	0.2	12	0,2	0,0001
CuSO₄ · 5 H₂O	0,01	0,01	6	0,02	0,0007
MnCl: · 4H₂O	-	-	0,01	0,0008
NaNO₃	0.4 mg/ml	2 mg/ml	2 mg/ml	-
Oberflächenaktives Mittel				-
Silicon	-
Amin	0,5 mg/ml
pH-Wert	7,0

*) Gesamtmenge des Nährmediums.

Beispiel 1

Zu einem Medium mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurde 3-Aminopropyl-dimethylsulfoniumbromid-hydrobromid (Tabelle I, Aminoverbindung Nr. 41) in einer Menge von 0,4 mg/ml zugegeben und der pH-Wert des Mediums so auf 6,5 eingestellt. Jeweils 100 ml des so behandelten Mediums wurden für sich in eine Sakaguchi-Flasche eingefüllt und dann sterilisiert Anschließend wurde Streptomyces verticillus ATCC 15003 in das Medium geimpft und bei 27° C 8 Tage lang unter Rühren mit 130UpM gezüchtet. Danach wurden die Kulturflüssigkeiten (4,51) gesammelt und filtriert, wobei man 3,0 1 Filtrat (Wirksamkeit 138,8 mg/ml, Gesamtwirksamkeit 416,4 mg) erhielt. Dieses Kulturfiltrat wurde auf eine, mit 200 ml eines Ionenaustauscher-Harzes (Η-Typ) beschickte Säule aufgegeben und adsorbiert, mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n-Chiorwasserstoffsäure eluiert 1,0 1 des Eluates wurden neutralisiert, auf eine mit 100 ml Aktivkohle beschickte Säule aufgegeben und adsorbiert, mit Wasser gewaschen und anschließend unter Verwendung einer 1 :1 (Volum-Anteile)-Mischung von Aceton/0,02 η-wässeriger Chlorwasserstoffsäure-Lösung eluiert und die gegenüber Mycobakterium tuberculosis 607 aktiven Fraktionen gesammelt und zur Trockene eingeengt Der erhaltene Rückstand wurde in 5 ml einer 80%igen, wässerigen Methanol-Lösung gelöst und auf eine mit 30 mi neutralem Aluminiumoxid beschickte Säule aufgegeben, und anschließend mit einer 8O°/oigen, wässerigen methanolischen Lösung eluiert Anschließend wurden die Bleomycin-enthaltenden Fraktionen gesammelt und zur Trockene eingeengt, wobei man 195 mg Bleomycin-hydrochlorid (Wirksamkeit 650,7 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 127 mg) erhielt. Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 30,5%.

Das so erhaltene Produkt wurde mit wässeriger Ammoniumformiat-Lösung an einer Säule, die mit einem vernetzten Polysaccharid mit Carboxymethylgruppen beschickt war, in die einzelnen Bleomycin-Komponenten aufgetrennt Es wurde festgestellt, daß das Produkt 72,2% Bleomycin A₂ enthielt Dieses Trennverfahren wird in den folgenden Beispielen als Polysaccharid-Verfahren bezeichnet

In der gleichen Weise wie oben wurden weitere Versuche durchgeführt, wobei die in der Tabelle IV genannten Aminoverbindungen verwendet wurden. Die angewandten Bedingungen und die erhaltenen Resultate sind ebenfalls aus Tabelle IV zu ersehen.

Beispiel 2

Zu einem Medium mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurde 1,2-Diaminopropan (Tabelle 1, Verbindung 25) in einer Menge von 2 mg/ml zugegeben, und der pH-Wert des Mediums so auf 6,5 eingestellt Jeweils 100 ml des so behandelten Mediums wurden für sich in eine Sakaguchi-Flasche eingefüllt und anschließend sterilisiert Danach wurde Streptomyces vertirillus ATCC 15003 in das Medium eingeimpft unc bei 27°C 192 Stunden unter Rühren bei 130UpM kultiviert Danach wurden die Kulturflüssigkeiten (4,51 gesammelt und filtriert, wobei man 3,561 eines Filtrat: (Wirksamkeit 190mcg/ml, Gesamtwirksamkei 676,4 mg) erhielt Dieses Kulturfiltrat wurde auf eine mit 200 ml eines Ionenaustauscher-Harzes (H-Form beschickte Säule aufgegeben und adsorbiert, mit Wassei gewaschen und anschließend unter Verwendung einei 1 : l(Volum-Teile)-Mischung von Aceton/0,02 n-wässe

riger Chlorwassersloffsäure-Lösung eluiert und die gegen Mycobakterium tuberculosis 607 aktiven Fraktionen gesammelt und zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde in 4 ml einer 80%igen wäßrigen Methanol-Lösung gelöst und auf eine mit 70 ml neutralem Aluminiumoxid beschickte Säule aufgegeben, gefolgt von einer Elulion mit 80%iger wäßriger methanolischer Lösung. Anschließend wurden die Bleomycin-enthaltenden Fraktionen gesammelt und zur Trockene eingeengt, der Rückstand in 2 ml Wasser gelöst, auf eine mit 20 ml eines dreidimensional vernetzten Polysaccharide beschickte Säule aufgegeben und anschließend unter Verwendung von destilliertem Wasser eluiert.

Die erhaltene bläulichgrüne Bleomycin-enthaltende Fraktion wurde in einer 0,02 η-wäßrigen Ammoniumchiorid-Lösung suspendiert, auf eine mit 20 ml eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids mit Carl:- oxymethylgruppen beschickte Säule aufgegeben und anschließend mit einer 0,1 molaren wässerigen Ammoniumchlorid-Lösung eluiert.

Danach wurde die erhaltene Fraktion, welche die gewünschte Substanz enthielt, aufgenommen und auf eine mit 5 ml Aktivkohle beschickte Säule zur Adsorption der gewünschten Substanz aufgegeben, welche dann mit einer 1 :1-Mischung von Aceton/wässeriger 0,02 n-Chlorwasserstoff-Lösung eluiert wurde. Anschließend wurde das Eluat zur Trockene eingeengt und man erhielt 35 mg 2-Aminopropylamino-bleomycin (Wirksamkeit 2173mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 76,1 mg). Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 11.25%.

25 mg der so erhaltenen Substanz wurde in 1 ml Methanol gelöst und 10 Minuten lang Schwefelwasserstoffgas in die Lösung eingeleitet. Danach wurde die Lösung filtriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt, wobei man 20 mg eines kupferfreien 2-Aminopropylamino-bleomycin-hydrochlorids (Wirksamkeit

2000 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 40 mg) erhielt. Dieses kupferfreie Produkt wurde mit einer 6 n-wässerigen Chlorwasserstoff säure-Lösung hydrolysiert und anschließend bei einem pH-Wert von 1,9 und einer Spannung von 3000 Volt der Papierelektrophorese unterworfen, wobei 1,2-Diaminopropan gefunden wurde.

In der gleichen Weise wie oben wurden weitere Versuche durchgeführt, wobei die in der Tabelle IV aufgeführten Aminoverbindungen verwendet wurden. Die angewandten Bedingungen und die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls aus Tabelle IV zu ersehen.

Beispiel 3

Zu einem Medium mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurde 1.3-Diaminopropan (Tabelle I, Verbindung Nr. 6) in einer Menge von 2 mg/ml zugegeben und der pH-Wert des Mediums so auf 6,5 eingestellt 121 des so behandelten Mediums wurden in einen 20-1-Glas-Fermentor eingefüllt und sterilisiert In dieses Medium wurden 800 ml einer Kulturflüssigkeit von Streptomyces vertidllus ATCC 15003 eingeimpft, welche 48 Stunden einer Schüttelkultivierung in einem Medium der gleichen Zusammensetzung, wie oben erwähnt, unterworfen gewesen war. Es wurde bei 27° C unter Rühren mit 350 bis 370 UpM 120 Stunden lang kultiviert, wobei pro Minute ein dem Volumen des Mediums gleiches Volumen Luft eingerührt wurde. 7,71 der Kulturflüssigkeit wurden filtriert und das Filtrat (5,6 L Wirksamkeit 148,5 mcg/mL Gesamtwirksamkeit 831,6 mg) extrahiert und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 230 mg Bleornycin-hydrochlorid (Wirksamkeit 734,8 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 169 mg) erhielt. Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat betrug 20,3%. Dieses Hydrochlorid wurde nach dem Polysaccharid-Verfahren analysiert und gefunden, daß es 84,5% 3-Aminopropylamino-bleomycin enthielt. 200 mg des Hydrochlorids wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, die Lösung auf eine mit

ίο einem vernetzten Polysaccharid mit Carbojtymethylgruppen, suspendiert in 0,02 η-wässerigem Ammoniumformiat, beschickte Säule von 50 ml Volumen aufgegeben, entwickelt und mit 0,1 η-wässeriger Ammoniumformiat-Lösung eluiert, wobei man eine Fraktion erhielt, welche 3-Amino-propylamino-bleomycin enthielt. Diese Fraktion wurde auf eine, mit 10ml Aktivkohle beschickte Säule aufgegeben und adsorbiert, mit Wasser gewaschen und anschließend mittels Aceton/0,02 n-wässeriger Salzsäure-Lösung (1:1 im Volumen) eluiert.

Anschließend wurde die erhaltene aktive Eluat-Fraktion zur Trockene eingeengt und man erhielit 50 mg 3-Aminopropylamino-bleoniycin-hydrochlorid (Wirksamkeit 1934 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 96,7 mg). Die Ausbeute aus dem vorerwähnten Hyclirochlorid betrug 65,8%. Diese Substanz wurde mit 6 n-Chlorwasserstoffsäure hydrolysiert, zu einer 10%igen alkalischen Lösung umgesetzt und anschließend der Gaschromatographie unterworfen, wobei ein Maximum von 1,3-Diaminopropan gefunden wurde.

30 mg des so erhaltenen 3-Aminopropylamiino-bleomycin-hydrochlorids (Wirksamkeit 1934 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 58,02 mg) wurde in 5 ml Methanol gelöst und Schwefelwasserstoffgas 30 Minuten lang in die Lösung eingeleitet, wobei ein Niederschlag von Kupfersulfid ausfiel. Dieser Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und mit Methanol gewaschen. Danach wurde die Waschflüssigkeit und das Filtrat vereinigt und die Mischung zur Trockene eingeengt, wobei man 25 mg eines kupferfreien 3-Aminopropyl-

amino-bleomycin-hydrochlorids (Wirksamkeit

1850 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 46,35 mg) erhielt. Die Ausbeute aus der kupferenthaltenden Substanz betrug 79,7%.

20 mg dieses kupferfreien 3-Aminopropylaminobleomycin-hydrochlorids (Wirksamkeit 1850 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 37 mg) wurden in 2 ml destilliertem Wasser gelöst, auf eine mit 5 ml eines Aniopcnaustauscher-Harzes beschickte Säule aufgegeben, anschließend mit destilliertem Wasser eluiert und das Eluat zur Trockene eingeengt wobei man 15,5 mg eines kupferfreien 3-Aminopropylamino-bleomycin-sulfats (Wirksamkeit 1850 mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 28,68 mg) erhielt Die Ausbeute aus dem kupferfreien Hydrochlorid betrug 77,5%.

In gleicher Weise wie vorstehend wurden weitere Versuche in einem Glas-Fermentor unter Verwendung der in Tabelle IV angegebenen Aminoverbindungen durchgeführt Die angewandten Bedingungen und die erzielten Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle IV niedergelegt

Beispiel 4 Ein Medium mit der oben angegebenen Zusammen-

setzung wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt

Jeweils 120 ml dieses Mediums wurden getrennt in eine

500-ml-Sakaguchi-Flasche eingefüllt und anschließend sterilisiert In das Medium wurde ein MA 267-Ar

809 635/104

Stamm, isoliert im Jahre 1965 aus dem Boden von Musashino-cho, Saitama-ken, Japan, eingeimpft, welcher als eine Variante von Streptomyces verticillus ATCC 21678 identifiziert worden war und der spezifisch Bleomycin A5 erzeugt. Ferner wurde Spermidin (Tabelle I, Verbindung Nr. 33, als Phosphat), welches einer sterilisierenden Behandlung mit einem dünnen, hochporösen Membranfilter unterworfen worden war, in einer Menge von 0,5 mg/ml zugegeben, und der Stamm 7 Tage lang bei 27°C unter Rühren bei 130UpM kultiviert. 5,2 I der Kulti'rflüssigkeit wurden gesammelt, filtriert, das Filtrat (4,5 1, Wirksamkeit 196 mcg/ml, Gesamtwirksamkeit 253 mg) extrahiert und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 137 mg eines rohen Pulvers von Bleomycin As-hydrochlorid (Wirksamkeit 1846mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 253 mg) erhielt. Die Ausbeute aus der Kulturflüssigkeit betrug 28,8%. Dieses rohe Pulver wurde der Chromatographie unter Verwendung einer mit 25 ml eines dreidimensional vernetzten Polysaccharids beschickten Säule unterworfen und mit destilliertem Wasser eluiert. Die erhaltenen, blaugefärbten, aktiven Fraktionen wurden gesammelt und zur Trockene eingeengt, wobei 53,5 mg eines blauen Pulvers (Wirksamkeit 2613mcg/mg, Gesamtwirksamkeit 140 mg) erhalten und nur Bleomycin A, allein erzeugt wurde. Die Ausbeute aus dem rohen Pulver betrug 55,4%. Die Extinktion (E ','"'„, ) bei 293 nm des so erhaltenen Produktes betrug 116. Das Spermidin der Seitenkette wurde gefunden, wenn ein Hydrolysat des Produktes mit 6 n-Chlorwasserstoffsäure gaschromatographisch untersucht wurde.

Tabelle	IV	Züch	Filtrat-	Wirksam	Gesamt	Gehalt an	Ge	Wirksam	Gesamt	Ausbeute	Her
Zuge	Konzen	tungs-	menge	keit	wirksam	isolierter	wicht	keit	wirksam	aus	gestellt
setzte	tration	zeit			keil	Bleomycin-			keit	Kultur-	nach
Amino-	an					Haupt-				filtrat	Beispiel
vcrbin-	Amino					konipo-					Nr.
dung	verbin					nente^J)
Nr.')	dung	(Std.)	(Liter)	(mcg/nig)	(mg)	(%)	(mg)	(mcg/mg)	(mg)	(%)
	(mg/ml)	192	3,0	150,0	450,0	80	28,7	1700	488	10,8	2
1	4,0	240	2,98	154,0	458,9	91	140	897	125.6	27,4	2
2	3,0	240	2,98	154,0	458,9	84	140	1102	154,3	33,6	2
3	2,0	240	3 00	140,0	420,0	95	88	1020	898,0	21,4	2
4	0,6	288	3,12	111,0	346,0	87	75,0	799	59,9	17,3	2
5	2,0	120	5,6	148,5	831,6	85	230	73	169	20,3	3
6	2,0	240	3,04	154,8	470,6	95	127.0	S 6	110,4	23,5	2
7	2,0	240	2,84	181,3	514,9	95	230	1036	238,3	46,3	2
8	2,0	264	3,10	129,8	402,4	81	119,0	860	102,3	25,4	2
9	1,5	264	3,02	227,4	186,7	85	166,1	1300	215,9	31,4	2
10²)	0,7	288	3,10	282,5	875,8	88	336,0	1335	448,6	51,2	2
II²)	1,35	264	3,40	525,0	1785,0	85	214,7	1700	365,0	20,4	2
12	4,0	264	3,38	1354,0	4576,5	89	330,0	5355	1767,2	38,6	-)
13	0,5	264	3,00	334,0	1182,0	70	40,0	1986	79,4	7,9	2
14	0,5	288	3,39	606,0	2054,3	89	96,3	2400	231	11,2	2
15	0,5	264	3,08	465,6	1434,0	76	105,0	2564	269,2	18,8	2
16	1,0	264	3,10	543,5	1684,9	89	140,0	3580	501,2	29,7	2
17	0,5	264	2,94	139,0	408.7	79	70,0	1201	84,1	20,6	2
18	0,5	240	3,00	380,0	1140	42	86	1450	124,7	10,9	2
19	3,0	288	3,30	281,0	927,3	95	355,0	1066	378,4	40,8	2
20	1,0	288	3,00	317,0	931,0	98	320,0	1257	402,2	42,3	2
21	1,0	240	2,94	145,8	428,7	100	175,0	5922	103,6	24,2	2
22	0,1	240	2,98	123,1	366,8	80	103	726	74,8	20,4	2
23	0,6	240	3,69	225,0	860,3	95	210,6	1180	248,5	29,9	2
24	0,5	192	3,56	190	676,4	90	35	2173	76,1	11,25	2
25	2,0	120	4,9	140,0	6X6,0	85	71,8	1232	88,5	12,9	3
26	2,0	264	3,34	253,9	848,0	85	162,5	1280	195	23,0	2
27	1,0	240	3,12	113,4	353,8	96	150	5840	876,0	24,8	2
28	2,0	264	3,10	1600,0	4960,0	90	178,01	1215	1996,3	40,3	2
29	0,5	240	3,05	1020	3111	72	240	2500	600,0	19,3	2
30	3,0	264	3,54	133,7	473,3	72⁵)	32,0	1671	53,5	11,4	2
31	0,5						24.0	860	20.6	4.4

lortscl/miu	Kon/en-	/.iich-	l-iltral-	Wirksam	(iesii Un	C j ehalt an	Ge	Wirksam	Ciesaml-	Ausbeute	Her
Zuge	lration	lungs-	menge	keit	wirksam	isolierter	wicht	keit	wirksam-	aus	gestellt
setzte	an	zeil			keit	Hleomycin-			keit	Kultur-	nach
Amino-	A m i no-					llaupt-				llltrat	Beispiel
\erhin-	verhin-					konipo-					Nr.
dung	dung					nenic')
Nr.¹)	(nig/ml)	(Si(J.)	(liter)	(mcg/mg)	(mg)	("''il)	(mg)	(incg/nig)	(mg)	(%)
	1,0	264	3.20	331.0	1059,2	70	112,6	1820	205	19,4	Ί
32	0,4	163	-\ü	122.2	611,0	»0	44,7	2543	113,7	18,6	3
33	0,5	168	4,5	196	253	>90	137	1846	253	28,8	4
33⁴>	0,2	264	1,1	150,0	165,0	90.8	62	1200	74,4	45,1	1
34	2,0	288	2,77	292,4	809,9	56	10,8	2546	27,5	3,4	2
35	2.0	264	3,05	320,4	977,2	68	33,3	2670	89,0	9,1	2
36	2,0	240	3,08	170,9	526,4	73	130	1394	181,2	34,4	1
37	1,0	240	2,88	189,6	493,0	93	74	847	62,7	12,7	2
38²)	1,0	288	3,20	118,0	377,6	95	124,0	633	78,5	20,8	2
39	2,0	240	2,0	200,0	400,0	76,2	164	800,0	131.2	32,8	1
40²)	0,4	192	3,0	138,8	416,4	72,2	195	650,7	127,0	30,5	1
41	40,0	192	1.65	100,0	165,0	87,2	140	300,0	42,0	25 5	1
42

Anmerkung zu Tabelle IV:

') Die Bezifferung entspricht derjenigen von Tabelle 1 und II. Hs werden die gleichen Verfahrensprodukte wie in Tabelle Il erhalten.

^:) Als Ilydrochlorid zugegeben.

') Der Gehalt an hauptsächlich erhaltener Bleomycin-Komponentc wurde in der Weise gemessen, daß das durch Züchtung und Reinigung, wie in jedem der Beispiele gezeigt, erhaltene Bleomycin (Gemisch der einzelnen Komponenten) vorher unter Verwendung eines vernetzten Polysaccharids mit Carboxymethylgruppcn getrennt und anschließend das UV-Absorptionsspektrum photometrisch bestimmt wurde.

⁴) Als Phosphat zugegeben.

⁵) Hier wurde ferner noch 3-N-Melhylaminopropylamino-bleomycin gebildet.

Die folgenden Vergleichsversuche dienten zur Feststellung der Wirksamkeit sowohl der erfindungsgemäßen Bleomycine als auch von handelsüblichem Bleomycin, d. h. einem Komplex aus im wesentlichen Bleomycin A2 als Hauptkomponente und Bleomycin A2', As, B2 usw. Für die Feststellung der Wirksamkeit der Bleomycine gegen Tumore in bestimmten Organen des menschlichen Körpers wurde die Aktivität der Bleomycine unter Verwendung der Biotest-Methode (beschrieben in »The Journal of Antibiotics«, Ser. A, Vol. XX, Seiten 15 bis 24 [1967]) sowie die Bestimmung der Anlitumor-Wirksamkeit der einzelnen Bleomycine bei Mäusen und die Verteilungsspezifität in dem jeweiligen Rogan festgestellt

Bei der angewandten Versuchsmethode wurden 6 Wochen alten Mäusen (Stamm ICR) 100 mg/kg Bleomycin subkutan injiziert und die Tiere eine Stunde später durch Blutentnahme getötet Die einzelnen Organe wurden entnommen und unter Verwendung einer bei einem pH-Wert von 7,2 gepufferten physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert Unter Kühlung wurden von jedem Gewebe Homogenate hergestellt, deren Volumen das dreifache des Gewebevolumens betrug. Die einzelnen Homogenate wurden unter Kühlung mit Hilfe einer Zentrifuge (10 000 U/Min.) während 10 Minuten bei 5° C zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit für den Biotest verwendet Der Biotest von Bleomycin wurde unter Verwendung der Dünnschicht-Scheibenmethode durchgeführt, bei der als Testorganismus Bacillus subtilis PCI-219 verwendet wird. Nach 2stündiger Vorkultur wurde 18 Stunden lang bei 37° C kultiviert und die jeweils festgestellte Fläche der beobachteten Wachstumshemmung gemessen.

Die erhaltenen Versuchsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle V aufgeführt In dieser Tabelle sind für die erfindungsgemäßen Bleomycinverbindungen 4,9,! 1,13,15,16,20,27 bis 29 und 31 (vgl.Tabellen II und IV) die in mcg/g erhaltenen Konzentrationen im jeweiligen Organgewebe angegeben. Als Vergleich sind in der ersten Zeile die mit Bleomycin A2 erhaltenen Werte zu finden. Wie aus der Tabelle V entnommen werden kann, ist die Konzentration im Gewebe bei der Vergleichsverbindung sehr niedrig. Demgegenüber zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Teil erheblich höhere Konzentrationen (die jeweiligen besseren Ergebnisse sind durch Unterstreichung hervorgehoben).

Die Verbindung 27 ist zwar nach diesem Versuch nicht als überlegen zu werten, jedoch hat diese Verbindung andererseits einen hohen therapeutischen Index (LDso/EDso) gegenüber Ehrlich-Ascites-Carcinomzellen, wie dies aus der US-Patentschrift 38 46 400, Spalte 25, Tabelle 2, zu entnehmen ist Während nach dieser Tabelle der therapeutische Index von Bleomycin A₂ (Verbindung Nr. 1 der US-Patentschrift), welches die Hauptkomponente des käuflichen Bleomycins darstellt den Wert 12 aufweist und Bleomycin B₂ (Verbindung Nr. 3 der US-Patentschrift) nur einen Wert von 10 erreicht hat die erfindungsgemäße Verbindung 27 (die der Verbindung Nr. 21 in der US-Patentschrift entspricht) einen therapeutischen Index von 54, d. h. einen ca. 5mal so hohen therapeutischen Index.

29

Tabelle V Ver- Stoff- Eingcführtei Rest R

fahrens- an-

produkt spruch

Tabellen

bzw. IV

Wirksam- Konzentration im Gewebe (mcg/g)

gemäß Lunae Niere Haut Magen Leber Milz Gehirn

Tabelle Il

(mcg'rng)

9 (41)

4 (b)

(C)

(d)

(C)

If)

Bleomycin A₂ -NH-(CHj)₃-NH-CH,

-NH-(CH₂)J-NH-CH₂-CH-CHj 1020

OH

1066

-NH-(CHj)₃-NH-(CHj)₃-OCHj 1335 — NH-(CH₂I₃-NH-<^> 5355

-NH-(CH₂)J-NH-CH-/ % CH₃

-NH-(CH₂)J-N-(CHj)₁-NHj

3
17

15

0
24

14

IO

4.2 0

15

40 111 60

108

25

40
4,6
7.0

3,1

0,3 0

0 0

6,3 0

2,6 0

2Λ 0

10,4 0

5,0 0

0 0 1_£

111 0

3,8

1,2

(h)

16 (H

28 Ol

29 (k)

CH₃

-NH-(CHj)J-NH-(CH₂)J-N

— NH - (CHj), — NH —(CHj)j — Nl 2564 -NH-(CHj)₃-NH-(CH₂)J-NH-C; H, 5840

11215 5,6

0,35	0,3	0	0	0	0	0
0,3	0,4	0,1	0,5		0	0,9
0,1	24	8,4	0	0,3	0
5,6	30	9.6	3,2	1,7	1,0

Ausgehend von dem Erfahrungswissen, daß je höher lassen die Versuchsergebnisse erkennen, daß die mit

die Konzentration des aktiven Bleomycins in einem Hilfe des anmeldungsgemäßen Verfahrens erhaltenen

Organ ist, eine um so höhere therapeutische Wirksam- 45 Bleomycine im Vergleich zu handelsüblichem Bleomy-

keit gegen ein Tumorwachstum in einem Organ vorliegt, ein eine überraschend verbesserte Wirksamkeit zeigen.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Bleornyein-Antibiotika durch Beimpfen eines Nährmediums mit einem Bleomycin-erzeugenden Stamm von Streptomyces verticillus und Züchten dieses Stammes unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium ein Amin der allgemeinen Formel ι ο

R¹

H₂N-CH₂-X-N

\² in der X, R¹, R² folgende Bedeutung haben: X = -CH₂-

R¹= R² = H, CH₃, C₂H₅

R> = H, R² = -CH₂-CH-CH₃

OH r> + R² = -(CH₂J₂-NH-(CH₂J₂-

R¹ = R² = H, CH₃, C₂H₅

R¹ - H. R² = CH₃,-CH₂ -CH₂ CH₂OH

-CH₂-CH₂-CH₂-OCH₃

C₄H₉, C-QH₁₁

—CH,-V~%

CH₃

-(CH₂),- -(CH₂J₃-N^O

R' + R* = -(CH₂U-, -(CH₂),-

—(CH₂J₂-O-(CH₂J₂-

-(CH₂J₂-NH-(CH₂J₂-

-(CH₂J₂-N-(CH₂J₂-

(CH₂J₃ NH₂ X = —CH-

CH₃ R¹ = R² = H

.JO

45

5°

55

6o

X = -CH₂-CH₂-CH₂-

R¹ = R² = H X = -(CH₂J₂-NH-(CH₂J₃

R¹ = R² = CH₃ CH₃ = H R² = H, -(CH₂J₁-NH₁ R¹ = H, R = C4.H9, C-CT₆Hj ι = -(CH₂J₂-NH-(CH₂J₄- R¹ == H, CH₃ X = -(CH₂ J₂-N-(CH₂J₃- CH₃ R¹ =R² = H X = -(CH₂J₂-NH -CH-(CH₂J₂- R¹ = R² X

X = CFl,

R¹ = R² = H

4-Aininomethylpiperidin,

4-{2 Aminoäthyl)-imidazol,

3-Aminopropyltrimethylammoniumchlorid,

N-('l-Aminobutyl)-guanidin,

3- A minopropyl-dimethylsulfoniumbromid oder

S-Amino-S-carboxypropyl-

dimethylsulfoniumchlorid

zugibt und aus der Kulturflüssigkeit das aus der zugegebenen Aminoverbindung gebildete Bleomycin durch Chromatographieren an Kationenaustauscherharz, Aktivkohle oder Aluminiumoxid und vernetztem Dextran und Eluieren in an sich bekannter Weise isoliert

2. Bleomycine, gekennzeichnet durch UV-Absorptionsmaxima bei 244 nm und bei 290 bis 295 nm und durch eine Partialstruktur gemäß folgender allgemeiner Formel

-NH-CH-CO-NH-

1 " -¹

CHOH

in der R bedeutel: (a) NH-(CH₁J₃-NH-CH₃

CO-R

(b) -NH-(CH₂J₂-NH-CH₂-CH-Ch₃

OH

ic) — NH-(CH₂J₃-nQ

(d) -NH-(CHj)₃-NH-(CH₂J₃-OCH₃

(e) — NH-(CH₂J₃-N

■ CH₃