Sposób wytwarzania antybiotyków z grupy bleomycyn Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antybiotyków z grupy bleomycyn, oparty na szcze¬ pieniu i aerobowej hodowli Streptomyces verti- cillus ATCC 15003 lub jego wariantu ATCC 21678 w pozywce hodowlanej. Hodowle prowadzi sie w obecnosci aminozwiazku posiadajacego przynaj- i mniej jedna grupe -C-CH2-NH2 i przynajmniej jed¬ na zasadowa grupe taka, jak grupa aminowa, iminowa, guanidynowa, amidynowa, sulfoniowa oraz zwiazków cyklicznych, zawierajacych azot, lub zwiazku, który w procesie fermentacji moze byc przeksztalcony w wyzej zdefiniowany aminozwiazek.W wyniku otrzymuje sie selektywnie w pozywce znane i nowe bleomycyny, które wyodrebnia sie z pozywki znanymi metodami.Bleomycyny sa antybiotykami przeciw tumorowi.Odkryl je Umezawa i wspólpracownicy. Otrzymuje sie je przez aerobowe zaszczepienie odpowiednim szczepem nalezacym do grupy actinomycos Strepto¬ myces verticillus ATCC 15003 lub jego wariantu ATCC 21678 mechanicznie mieszanej pozywki za¬ wierajacej papke z prosa (skladnik glówny — maltoza), glukoze, maczke sojowa, wyciag z ku¬ kurydzy, chlorek sodowy, fosforan potasowy, siar¬ czan cynku, siarczan miedzi i tym podobne. Otrzy¬ mane bleomycyny wyodrebnia sie w postaci chloro¬ wodorków lub siarczanów przy uzyciu wymieniaczy jonowych.Wyodrebnione bleomycyny stanowia grupy: Alt 15 20 30 A2, A2', A8, A4, A5, A6, B1? B2, B8, B4, B5, Bfl i ich pochodne. Nazwa bleomycyny zastrzezona jest dla tych grup antybiotyków (brytyjski opis patentowy nr 1038 242).W warunkach normalnych otrzymuje sie miesza¬ nine bleomycyn o róznym skladzie, z przewaga bleomycyny A2 i B2.W celu umozliwienia selektywnego otrzymania poszczególnych antybiotyków z grupy bleomycyn z dobrymi wydajnosciami, wynalazcy ustalili struk¬ ture bleomycyn, reprezentowana przez ogólny wzór 1, w którym R oznacza grupe o wzorze: dla bleomycyn A2-R oznacza grupe o wzorze 2, dla bleomycyny A'2-R oznacza grupe o wzorze -NH-(CH)4-NH2, dla bleomycyny A5-R oznacza grupe o wzorze -NH-(CH2)8-NH-(CH2)4-NH2, dla bleomycyny A6-R oznacza grupe o wzorze -NH-(CH2)8-NH- (CH2)4-NH-(CH2)8-NH2, dla bleomycyny B2-R oznacza grupe o wzorze 3, dla bleomycyny B4-R oznacza grupe o wzorze 4.Stwierdzono, ze wprowadzenie do pozywki amino¬ zwiazku, odpowiadajacego grupie R lancucha bocz¬ nego bleomycyny, lub zwiazku, z którego taki aminozwiazek moze powstac w procesie fermen¬ tacji prowadzi do selektywnego otrzymania okreslo¬ nej bleomycyny z dobra wydajnoscia. Dodatek pewnych aminozwiazków prowadzi do otrzymania nowych bleomycyn, które mozna wyodrebnic z wy¬ soka wydajnoscia. 80 83780 837 3 Wyzej wymienione aminozwiazki stosowane w sposobie wedlug wynalazku mozna podzielic na 5 grup zwiazków o wzorach 5—9, w których X oznacza grupy o wzorach 10—14; R1 i R2 oznaczaja atom wodoru, grupe alkilowa lub grupy o wzorach 15—20, a R3, R4 i R5 oznaczaja grupe alkilowa; grupa o wzorze 21 oznacza grupy o wzorach 22—26, zas grupa o wzorze'27 oznacza grupy o wzorach 28—30. We wzorach 10—30, n, n2, n3, n4, n4', n4", n" oznaczaja liczbe calkowita mieszczaca sie w prze¬ dziale 1—8, n1 oznacza liczbe calkowita mieszczaca sie w przedziale 0—8, R6, R6', R6", R7, R7', Rfl, R«', R*", R'", R», R»', Rio, Rio', Rio", oznaczaja atom wodoru lub grupy alkilowe. Linia kreskowana we wzorze, na przyklad wzorze 31, oznacza, ze kazdy atom wodoru przy atomie wegla w lancuchu moze byc zastapiony grupa alkilowa.Szczepienie i hodowle Streptomyces verticillus ATCC 15003 lub jego wariantu ATCC 21678 w po¬ zywce hodowlanej prowadzi sie, dodajac amino- zwiazek o wzorze ogólnym 90, w którym A oznacza grupe o wzorze 91, w którym R1 i R2 oznaczaja grupy alkilowe, grupe -NH2, grupe o wzorze 92, grupe -NH-(CH2)nl-NH2, gdzie nt oznacza liczbe calkowita zawarta w granicach 1—6, grupe -NH- -(CH2)ni-NH-(CH2)n2-NH2, gdzie n± ma wyzej po¬ dane znaczenie, a n2 oznacza liczbe calkowita za¬ warta w granicach 1—5, Y oznacza atom wodoru, grupe -COOH, grupe -CONH2, Z oznacza atom wodoru, grupe -COR3, gdzie R3 oznacza grupe alkilowa, zas n oznacza liczbe calkowita zawarta w granicach 1—5, który powoduje selektywne powstawanie znanej lub nowej bleomycyny, posia¬ dajacej lancuch boczny, odpowiadajacy dodanemu aminozwiazkowi lub aminozwiazkowi, powstajace¬ mu z dodanego aminozwiazku w czasie hodowli, a nastepnie bleomycyne wyodrebnia sie z pozywki znanymi metodami.Szczepienie i hodowle Streptomyces verticillus ATCC 15003 lub jego wariantu ATCC 21678 w po¬ zywce hodowlanej prowadzi sie, dodajac amino¬ zwiazki o wzorze ogólnym 93, w którym R oznacza grupy o wzorach 94—101, grupe o wzorze 21, w któ¬ rych to wzorach R1 oznacza atom wodoru z wy¬ jatkiem przypadku, gdy Y oznacza atom wodoru, grupe -COOH lub grupe -CONHj, lecz nie jest wykluczone, gdy Y1 oznacza grupe alkilowa, grupe alkilowa o wzorze 102 i 103, w których R6 oznacza atom wodoru lub grupe alkilowa, Y2 oznacza atom wodoru lub nizsza grupe alkilowa, n2 oznacza liczbe calkowita zawarta w granicach 1—8, lub grupe cykloheksylowa, R2, R3 i R4 oznaczaja grupe alki¬ lowa, grupe o wzorze 104 i 105, w których R6, Y2 i n2 maja wyzej podane znaczenie, lub grupe cyklo¬ heksylowa, R5 i Y1 oznaczaja atom wodoru lub nizsza grupe alkilowa, nx oznacza liczbe calkowita zawarta w granicach 1—8, zas grupa o wzorze 21 grupy o wzorach 22, 23, 24, 106, 26, w których R6 i Y2 maja wyzej podane znaczenie, Y oznacza atom wodoru, nizsza grupe alkilowa, grupe -COOH lub -CONH2, Z oznacza atom wodoru lub grupe acy- lowa, a n oznacza liczbe calkowita zawarta w gra¬ nicach 1—8, przy czym Y, Y1 i Y2 moga byc pod¬ stawione w kazdym miejscu prostego lancucha weglowego z wyjatkiem przypadku, gdy oznaczaja 10 15 20 35 40 atom wodoru, a dwupodstawiony pierscien benze¬ nowy moze byc kazdym z o-, m- i p-izomerów, który to dodatek aminozwiazku powoduje selek-^ tywne powstawanie nowej bleomycyny, posiadaja¬ cej lancuch boczny odpowiadajacy dodanemu aminozwiazkowi lub aminozwiazkowi powstajace¬ mu z dodanego aminozwiazku w czasie procesu hodowli, a nastepnie bleomycyne wyodrebnia s:e z pozywki znanymi metodami.Ponizej przedstawione aminozwiazki lub produk¬ ty, z których powstaja aminozwiazki stanowiace grupy R w zwiazkach o ogólnym wzorze 5, 6, 7, 8 i 9. 60 65 1,2-dwuaminoetan 1,3-dwuaminopropan 1,4-dwuaminobutan 1,5-dwuaminopentan 1,6-dwuaminoheksan N-(2-aminoetylo)-1,2- -dwuaminoetan N-(3-aminopropylo)-l,3- -dwuaminopropan N- (3-aminopropylo) -1,4- -dwuaminobutan (sper- midyna) N-(5-aminopentylo)-l,5- -dwuaminopentan N,N'-dwu-(2-aminoetylo) - -dwuaminometan N,N'-dwu-(2-aminoetylo)- -1,2-dwuaminoetan N,N'-dwu-(3raminopropy- lo)-1,6-dwuaminoheksan N,N-dwu- (5-aminopenty- lo)-1,5-dwuaminopentan 2,4,4-trójmetylopiecio- -metylenodwuamina 1,2-dwuaminopropan N,N'-dwu-(3-aminopropy¬ lo)-1,4-dwuaminobutan (spermina) N-metylo-1,3-dwuamino¬ propan N-butylo-l,3-dwuamino- propan N-oktylo-l,3-dwuamino- propan N-N-dwumetylo-l,2-dwu- aminoetan N,N-dwuetylo-l,2-dwu- aminoetan N,N-dwumetylo- 1,3-dwu¬ aminopropan N,N-dwuetylo-l,3-dwu- aminopropan Chlorek 3-aminopropylo- trójmetyloamoniowy Bromek-3-aminopropylo- trójmetyloamoniowy N-(3-dwumetyloaminopro- pylo)-l,3-dwuaminopropan N-(3-metyloaminopropy- lo)-1,2-dwuaminoetan N-(3-metyloaminopropy- lo)-1,4-dwuaminobutan NH2-(CH2)2-NH2 NH2-(CH2)3-NH2 NH2-(CH2)4-NH2 NH2-(CH2)5-NH2 NH2-(CH2)6-NH2 NH2-(CH2)2-NH- -(CH2)2-NH2 NH2-(CTTo)r^H- -(CH2)3-NH2 NH2-(CH2)3-NH- -(CH2)4-NH2 -(CH2)5-NH2 NH2-(CH2)2-NH-CH2- -NH-(CH2)2-NH2 NH2-(CH2)2-NH-(CH2)2- -NH-(CH2)2-NH2 NH2-(CH2)3-NH-(CH2)6- -NH-(CH2)3-NH2 NH2-(CH2)5-NH-(CH2)5- -NH-(CH2)5-NH2 wzór 32 wzór 33 NH2-(CH2)3-NH-(CH2)4- -NH-(CH2)3-NH2 NH2-(CH2)3-NHCH3 NH2-CH2/3-NHC4H9 NH2-(CH2)3-NH- -(CH2)7-CH3 wzór 34 wzór 35 wzór 36 wzór 37 wzór 38 wzór 39 wzór 40 NH2(CH2)2-NH- -(CH^j-NHCHs NH2(CH2)4-NH- -(CH2)8-NHCH35 80 837 6 N-(3-metyloaminopropy- NH2- (CH2)6-NH- lo)-l,6-dwuaminoheksan -(CH2)8-NHCH3 N-(3-metyloaminopropy- NH2-(CH2)8-NH- lo)-1,8-dwuaminooktari -(CH2)3-NHCH3 N-butylo-N'-3raminopro- NH2-(CH2)3-NH- pylo)-l,3-dwuaminopropan -(CH2)3-NH-C4H9 N- (2-dwumetyloaminoety- lo)-1,3-dwuaminopropan wzór 41 N-(4-dwumetyloaminobu- tylo)-l,3-dwuaminopropan wzór 42 N- (6-dwumetyloaminohek- sylo)-l,3-dwuaminopropan wzór 43 N- (8-dwumetyloaminookty- lo)-l,3-dwuaminopropan wzór 44 N-(3-hydroksypropylo)- NH2-(CH2)8-NH- -1,3-dwuaminopropan -(CH2)8-OH N-(2-hydroksypropylo)- -1,2-dwuaminoetan wzór 45 N- (2-hydroksyetylo)- NH2- (CH2) 3(NH- -1,3-dwuaminopropan -(CH2)2-OH N-(3-metoksypropylo)- NH2- (CH2)8-NH- -1,3-dwuaminopropan -(CH2)3-OCH3 N-(3-oktyloksypropylo)- NH2-(CH2)3-NH- -l,3i-dwuaminopropan - (CH2)3OCcH17 N-(3-amino-1-metylopro- pylo)-l,3-dwuaminopropan wzór 46 N-(3-amino-l-etylopropy- lo)-l,3-dwuaminopropan wzór 47 N,N-dwu- (3-aminopropy- lo)-metyloamina wzór 48 N,N-dwu-(aminopropylo) - -etyloamina wzór 49 N,N-dwu- (3-dwuaminopro- pylo)-n-butyloamina wzór 50 bromek 3-aminopropylo- dwumetylosulfoniowy wzór 51 chlorek 3-aminopropylo- dwumetylosulfoniowy wzór 52 bromek 3-acetamidopropy- lodwumetylosulfoniowy wzór 53 chlorek 3rkarboksypropylo- dwumetylosulfoniowy wzór 54 chlorek 3-karbonoilopropy- lo-dwumetylosulfoniowy wzór 55 4-(aminobutylo)-guanidyna (agmatyna) wzór 56 3-amidynopropyloamina wzór 57 N-(-3-aminopropylo)-pyro- lidyna wzór 58 N-(3-aminoprbpylo)-pipe¬ rydyna wzór 59 N-(2-aminoetylo)-piperazy¬ na wzór 60 N-(3-aminopropylo)-pipe¬ razyna wzór 61 N-(3-aminopropylo)-mor- folina wzór 62 N-(3-aminopropylo)-N'- -metylopiperazyna wzór 63 N-(3-aminopropylo)-N'- -etylopiperazyna wzór 64 N,N'-dwu-(3-aminopropy¬ lo)-piperazyna wzór 65 N-(3-pirolidynopropylo)- -1,3-dwuaminopropan wzór 66 N- (3h-piperyd3niopropylo)- -1,3-dwuaminopropan wzór 67 N- (3-piperazynopropylo)- -1,3-dwuaminopropan wzór 68 5 N-(3-morfolinopropylo)- -1,3-dwuaminopropan wzór 69 N-benzylo-l,3-dwuamino- propan wzór 70 N,N-dwubenzylo-l,3-dwua- 10 lnino-propan wzór 71 N-(1-fenyloetylo)-1,3-dwu¬ aminopropan wzór 72 N- (p-metylobenzylo)-1,3- -dwuaminopropan wzór 73 15 m-ksylilenódwuamina wzór 74 p-ksylilenodwuamina wzór 75 N-cykloheksylo-l,3-dwu- aminopropan wzór 76 N-(2-fenyloetylo)-l,3-dwu- 20 aminopropan wzór 77 N-(2-p-toluiloetylo)-l,3- -dwuaminopropan wzór 78 N-benzylo-N-(3-aminopro¬ pylo)-1,3-dwuaminopropan wzór 79 25 N-(1-fenyloetylo)-N'-(3h aminopropylo)-1,3-dwu- aminopropan wzór 80 N-(2-furfurylo)-l,3-dwu- aminopropan Wzór 81 30 N-(5-metylo-2-furfurylo)- -1,3-dwuaminopropan wzór 82 N-N-dwumetylo-1,3-dwu¬ aminopropan CH3-NH- (CH2)8-NH-CH8 4-piperydylometyloamina wzór 83 35 2-(4-imidazoilo)-etyloamina (histamina) wzór 84 N,N-dwumetylo-N-acetylo- -1,3-dwuaminopropan wzór 85 N,N-dwumetylo-N'-pro- 40 pionylo-l,3-dwuaminopro- pan wzór 86 1-karboksy-4-dwumetylo- aminobutyloamina wzór 87 l-karbamoilo-4-dwumety- 45 lo-aminobutyloamina wzór 88 N,N-dwumetylo-N'-ben- zoilo-l,3-dwuaminopropan wzór 89 Jesli do hodowli, zawierajacej szczep produku¬ jacy bleomycyny, na przyklad Streptomyces verti- cillus ATCC 15003} doda sie aminozwiazku na przy¬ klad bromku 3-aminopropylodwumetylosulfoniowe- go lub chlorku 3-amino-3-karboksypropylodwume- tylosulfoniowego, to wzrasta wydajnosc bleomycyny A* Podobnie dodatek 1,4-dwuaminobutanu powo- 55 duje wzrost wydajnosci bleomycyny A2, a dodatek chlorowodorku agmetyny powoduje wzrost wydaj¬ nosci bleomycyny Bt. Dodatek spermidyny wzmaga wydajnosc bleomycyny A5. Spermina powoduje powstawanie nie tylko bleomycyny A$, posiadajacej 60 lancuch boczny sperminy, lecz takze bleomycyny A6, posiadajacej lancuch boczny spermidyny. Sper- midyna powstaje ze sperminy w procesie fermen¬ tacji.W obecnosci szczepów, majacych duza zdolnosc «5 do przeksztalcania sperminy w spermidyne, dodatek 5080 837 sperminy powoduje powstawanie glównie bleomy- cyny A5. Podobnie dodatek na przyklad 1,2-dwu- aminoetanu lub 1,3-dwuaminopropanu powoduje powstawanie nieopisanej 2-aminoetylobleomycyny lub 3-aminopropylobleomycyny. Dodatek N,N-dwu- -(3-aminopropylo)-metyloaminy powoduje glównie powstawanie nieopisanej 3-(N-metylo-N-3-amino- propyloamino) -propyloaminobleomycyny posiadaj a- cej lancuch boczny o tej samej budowie, jak wyjs¬ ciowy zwiazek aminowy. Ubocznie powstaje jeszcze jednak 3-N-metyloaminopropyloaminobleomycyna z produktu rozpadu wyjsciowego zwiazku amino¬ wego.Mikroorganizmy powoduja takie reakcje, jak: rozpad estrów, odalkilowanie i dekarboksylacja.Aminozwiazki dodawane w sposobie wedlug wy¬ nalazku sa przetwarzane w procesie fermentacji w zwiazki, wprowadzajace lancuch boczny bleomy- cyn. Na przyklad zwiazki, w których grupa -NH2 w produktach wyjsciowych o ogólnym wzorze: 5, 6, 7, 8 i 9 zostala zacylowana, zalkilowana wzglednie, jesli atom wodoru lub grupa metyle¬ nowa sasiadujaca z grupa NH2 zostala podstawiona grupa karboksylowa lub amidowa, które latwo mozna przeksztalcic w aminy, mozna uzyc podobne zwiazki aminowe o wzorach 5, 6, 7, 8 i 9.Aminozwiazki, dodawane do hodowli, dozuje sie na ogól w postaci soli kwasów nieorganicznych; stezenie zalezy od rodzaju dodawanego skladnika.Na przyklad dla bromku 3-aminopropylodwumetylo- sulfoniowego, sperminy i spermidyny optymalne jest stezenie przynajmniej 0,2—9,4 mg/ml, natomiast dla chlorku 3-amino-3-karboksypropylodwumetylosulfo- niowego optymalne jest znaczenie wyzsze stezenie — przynajmniej 40 mg ml. W przypadku N-(3-aminopro- pylo)-morfoliny i N-(3-morfolino-propylo)-1,3-dwu¬ aminopropanu wystarcza stezenie 0,1—0,5 mg/ml, natomiast w przypadku N-(2-aminoetylo)-pipera¬ zyny i N-(3-metoksypropylo)- 1,3-dwuaminopropanu optymalne jest stezenie okolo 2 mg/ml. Na ogól stosuje sie stezenie okolo 4 mg/ml. 35 Proces, sposobem wedlug wynalazku, prowadzi sie nastepujaco: Srodowiskiem reakcji sa na ogól weglowodany i organiczne zwiazki azotu na przyklad papka z prosa, skrobia, maczka sojowa, wyciag z kukury¬ dzy i tym podobne, do których dodaje sie niewielkie ilosci zwiazków nieorganicznych, na przyklad fosfo¬ ranu potasu, siarczanu miedzi, siarczanu cynku, chlorku sodu, azotanów i tym podobnych. Do tej pozywki dodaje sie szczep Streptomyces verticillus ATCC 15033 lub jego wariant ATCC 21678. Fermen¬ tacje prowadzi sie aerobowo w zwykle stosowanych warunkach. Nastepnie roztwór saczy sie, a przesacz poddaje sie adsorpcji na kationowych wymienia¬ czach jonowych o grupie reaktywnej, na przyklad karboksylowej i wymywa wodnym roztworem kwasu solnego. Nastepne procesy to adsorpcja na weglu aktywnym, wymywanie mieszanina wodnego roztworu acetonu i kwasu solnego, adsorpcja na tlenku glinu, wymywanie metanolem, adsorpcja na „Sephadex" (nazwa handlowa organicznego adsor¬ bentu), pochodnej dekstranu, wytwarzanego przez Pharmacia Fine Chemicals Inc. i wymywanie woda destylowana, po czym otrzymuje sie chlorowodorek bleomycyny jako proszek. W celu oczyszczenia pod¬ daje sie chromatografii, uzywajac jako nosnika „CM Sephadex" a jako roztworu do elucji wodnego roztworu chlorku amonu lub mrówczanu amonu.Nastepnie eluat adsorbuje sie na weglu aktywnym przemywa dwukrotnie woda i eluuje mieszanina wodnego roztworu acetonu i kwasu solnego. W ten sposób otrzymuje sie czysta bleomycyne.Jesli odpowiednia bleomycyna jest produkowana sposobem wedlug wynalazku dostatecznie selektyw¬ nie, oczyszczanie na „CM Sephadex" jest niepo¬ trzebne.Bleomycyny tworza chelaty ze zwiazkami miedzi i sa wyodrebniane z pozywki jako niebieskie proszki; miedz mozna usunac zwyklymi, znanymi metodami.Pewne wlasnosci bleomycyn otrzymanych sposo¬ bem wedlug wynalazku podano w tablicy 1.Tablica 1 Nr 1 1 Nazwa i wlasnosci fizyczne aminozwiazku 2 Bromowodorek bromku 3-amino- propylodwumetylo- sulfoniowego temperatura topnienia 87—88° Zawartosc nowego (glównego) skladnika w surowej bleomycy- nie uzyskanej przez ekstrakcje w o/o 3 72 Nazwa i struktura lancucha bocznego nowej (glównej) bleomycyny 4 Bleomycyna A280 837 10 Chlorek 3-amino- -3-karboksypro- pylodwumetylo- sulfoniowy temperatura topnienia 130—140° (rozklad) 87 Blfiomycyna A2 Siarczan agmatyny temperatura topnienia 231° 76 Bleomycyna Bt 1,2-dwuaminoetan temperatura topnienia 116—177° 80 2-aminoetyloamino- bLeomycyna NH2(CHt)2-NH- 1,3-dwuaminopro- pan temperatura wrzenia 135—136° 85 3-ammapropyl:o- aminobleomycyna NH2(CHf)s-NH- 1,4-dwuaminobutan temperatura wrzenia 158—160° 85 Bleomycyna A't Spermidyna temperatura wrze¬ nia 115°/3 mm Hg 90 Bleomycyna A5 Spermina temperatura wrze¬ nia 150—160°/3 mm Hg 91 Bleomycyna A5 N,N-dwumetylo- -1,2-dwuaminoetan temperatura wrze¬ nia 105—108° 91 3-N,N-dwumetylo- aminoetyloamino- bleomycyna 10 N,N-dwuetylo- -1,2-dwuaminoetan temperatura wrze¬ nia 147—151° 84 3-N,N-dwuetylo- aminoetyloamino- bleomycyna 11 N,N-dwuetylo- -l,3rdwuamino- propan temperatura wrze¬ nia 166—172° 95 3-N,N-dwuetylo- aminopropylo- aminobleo- mycyna N-butylo-N'-(3- -aminopropylo)- 12 | -1,3-dwuaminopro- pan temperatura wrzenia 125—126°/3 mm Hg 96 3-[-3-(N-butylo)- -aminopropylo]- aminopropylo- aminobleomycyna N- (2-hydroksypro- pylo)-l,2-dwu- 13 i aminoetan temperatura wrze¬ nia 123—126°/12 mm Hg 95 2- (2-hydroksypro- pylo)-aminoetylo- aminobleomycyna80 837 11 12 1 14' 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2 N-(3-aminopro- pylo) -piperazyna temperatura wrze¬ nia 80—81°/2 mm Hg N-(l-fenyloetylo)- -N-(3-aminopro- pylo)-l,3-dwu- aminopropan temperatura wrze¬ nia 150—153° 1,2-dwuaminopro- pan temperatura wrze¬ nia 118—119° N-metylo-l,3-dwu- aminopropan temepratura wrze¬ nia 138—142° N-butylo-l,3-dwu- aminopropan temperatura wrze¬ nia 114—116°/20 mm Hg N,N-dwuetylo-l,3^ -dwuaminopropan temperatura wrze¬ nia 132—135,5° chlorek-3-amino- propylotrójmetylo- amoniowy temperatura top¬ nienia 200—204° N-[3-(N,N-dwu- metylo)-aminopro- pylo]-l,3-dwu- aminopropan temperatura wrze¬ nia 125°/23 mm Hg N,N-dwu(3-amino- propylo)-metylo¬ amina temperatura wrze¬ nia 97—100°/2 mm Hg N-(3-amino-l-me- tylopropylo)-l,3- -dwuaminopropan temperatura wrze¬ nia 123—125°/21 mm Hg 3 80 72 90 81 85 95 95 85 72 70 4 1 3-piperazynopro- pyloaminobleomy- cyna 3-[3-(N-l-fenyloety- lo) -aminopropylo]- -aminopropylo- aminobleomycyna 2-aminopropylo- amino-bleomycyna 3-N-metyloamino- propyloaminobleo- mycyna CH3NH(CH2)8NH- 3-N-butyloamino- propyloamino- bleomycyna CH3-(CH2)3-NH- -(CHt)8-NH- 3-(N,N-dwumetylo)- aminopropylo- aminobleomycyna 3-(N,N-trójmetylo- aminopropylo- aminobleomycyna 3-[3-(N,N-dwume- tylo)-ammopro- pylo]-aminopro- pyloaminobleomy- cyna 3-(N-metylo)-N-3- -aminopropylo)- -aminopropylo- -aminobleomycyna 3-(-l-metylo-3- aminopropylo)- -aminopropylo- aminobleomycyna80 837 13 14 1 1 1 2 1 3 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 N-3-aminopropylo- pirolidyna temperatura wrze- | nia 185—189° N-3i-aminopropylo- piperydyna temperatura wrze- | nia 100°/20 mm Hg N-3-aminopropylo- morfolina temperatura wrze- | nia 219°/733 mm Hg N-2-aminoetylopi- perazyna temperatura wrze- | nia 280—281° N,N-dwu-3-amino- propylopiperazyna temperatura wrze¬ nia 188—202°/21 mm Hg N-[3-(pirolidyno)- propylo]-1,3-dwu- aminopropan temperatura wrze¬ nia 159—162°/22 mm Hg N-{3-(piperydylo)- -propylo]-1,3-dwu- aminopropan temperatura wrze¬ nia 164—167°/21 mm Hg N-[3-(morfolino)- -propylo]-l,3-dwu- -aminopropan temperatura wrze¬ nia 176—180°/20 mm Hg N-(3-hydroksypro- pylo)-l,3-dwu- aminopropan (chlorowodorek) temperatura top¬ nienia 119—120° | N- (3-metyloksypro- pylo)-l,3-dwu- aminopropan (chlorowodorek) temperatura top¬ nienia 225° 95 98 100 87 95 76 89 79 85 88 1 4 3-(pirolidyna)-pro- pyloaminobleomy- cyna 3-(piperydylo)-pro- pyloaminobleomy- eyna 3-(morfolino) -pro- pyloaminobleomy- cyna 2- (piperazyno)- -etyloaminobleomy- cyna 3-[-(4-(3-aminopro- pylo))-piperazyno] - propyloaminobleo- mycyna 3-[-3-(pirolidyno)- -propylo]-amino- propyloaminobleo- mycyna 3-[3-(piperydylo)- -propylo]-amino- propyloaminobleo- mycyna 3-[3-(morfolino)- propylo]-aminopro- pyloaminobleomy- cyna 3-(3-hydroksypro- pylo)-aminopro- pylobleomycyna NO-(CH2)8-NH- (CH2)3-NH- 3-(3rmetoksypro- pylo)-aminopro- pyloaminobleomy- cyna CHsO-(CH2)3- -NH(CH2)8-NH-80 837 15 16 [ 1 34 35 36 37 38 39 40 41 42 2 N-benzylo-l,3-dwu- aminopropan temperatura wrze¬ nia 150—155°/25 mm Hg N-(l-fenyloetylo)- -1,3-dwuamino- propan temperatura wrze¬ nia 148—150°/24 mm Hg m-ksyleno- dwuamina temperatura wrze¬ nia 138—139°/9 mm Hg p-ksylenodwuamina temperatura top¬ nienia 35° N-cykloheksylo- -1,3-dwuaminopro- ' pan temperatura wrze¬ nia 124—125°/21 mm Hg N- (3-cykloheksylo- -aminopropylo)- -1,3-dwuaminopro- pan temperatura wrze¬ nia 180°/21 mm Hg N-(2-furfurylo)- 1,3i-dwuaminopro- pan temperatura wrze¬ nia 105—109°/3 mm Hg 4-piperydylometylo- amina temperatura wrze¬ nia 78°/5 mm Hg 2-(4-imidazoilo- etyloamina (chlorowodorek) temperatura top¬ nienia 247—250° 3 70 89 56 68 89 90 42 73 93 4 3-benzyloaminopro- pyloaminobleomy- cyna 3-(l-fenyloetylo)- aminobleomycyna m-aminometylo- benzyloaminobleo- mycyna p-aminometyloben- zyloaminobleomy- cyna 3-cykloheksylo- aminopropylo- aminobleomycyna 3-(3-cykloheksylo- aminopropylo)- -aminopropylo- aminobleomycyna 3-[N-(2-furfurylo)]- -aminopropylo- -aminobleomycyna 4-piperydylome- tyloaminobleomy- cyna 2-(4-imidazoilo)- etyloaminobleo- mycyna80 837 17 18 Wlasnosci nowych (glównych) chlorowodorków bleomycyn Tablica 1 (ciag dalszy) Nr 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Analiza elementarna (%) C 1 2 44,13 44,13 43,92 43,12 43,15 43,93 43,81 43,81 43,20 45,01 43s91 43,00 43,50 44,91 45,51 43,80 43,97 43,30 44,16 44,71 43,80 43,20 H 1 3 6,14 6,14 6,31 6,15 6,20 6,02 6,34 N 4 15,51 15,51 1 17,41 16,60 16,51 16,78 16,38 6,34 i 16,39 6,25 6,35 6,30 6,62 6,45 6,21 6,42 6,04 6,24 6,31 6,35 6,41 6,35 6,20 16,48 16,14 15,96 16,40 16,38 16,50 16,45 16,60 16,42 16,20 16,30 S 5 6,43 6,43 Moc (mcg/ mg) 6 941 941 3,34 | 3094 4,21 4,18 4,25 4,05 4,05 4,13 1700 1934 1232 2700 2700 897 3,91 1102 4,00 3,78 4,35 3,91 3,20 4,31 4,18 4,32 4,09 16,21 4,00 16,91 17,00 4,05 4,09 1036 5840 1020 726 2500 2173 860 1700 869 633 1200 1671 Chromatografia (Rf) Cienko¬ warst¬ wowa 1 7 0,39 0,39 0,72 0,62 0,60 0,66 0,16 0,16 0,46 0,48 0,40 0,23 0,65 0,30 0,46 0,66 0,51 0,70 0,28 0,33 0,14 0,23 Bibu¬ lowa 1 8 0,85 0,85 Reakcje N 9 — — 1 1 0,66 1 — 0,80 0,81 0,81 0,88 0,88 0,66 0,89 0,87 0,84 0,84 0,84 0,75 0,61 0,83 0,63 0,83 0,89 0,83 0,33 + + + + ¦ + — — — — — — — + — — — — — + S 1 io — — + Postac 1 11 niebieski proszek niebieski | proszek niebieski 1 proszek _ r niebieski | : proszek — — — . — — — — — niebieski | proszek niebieski | proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski 1 proszek — — — — — — — — — niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek | niebieski proszek | niebieski proszek | niebieski proszek | niebieski proszek | niebieski proszek | niebieski proszek Maksi¬ mum absorpcji w UV (mM) 1 12 293 243 [ 1 293 1 243 1 293 1 244 1 1 293 1 244 1 293 1 244 1 1 293 244 | 293 1 244 1 293 1 244 1 294 244 | 294 244 | 294 244 | 294 244 | 294 244 | 294 244 | 294 244 1 294 244 1 294 244 | 294 244 | 294 244 | 294 244 | 294 244 2*4 ~ 244 180 837 19 20 Tablica 1 (ciag Salszy) 1 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 2 43,42 44,90 ¦ 44,71 44,3.6 44,38 44,01 44,20 44,30 44,52 43,76 43,91 45,40 35 45,39 36 44,89 37 i 44,80 38 39 44,91 44,02 40 46,39 41 42 44,60 43,85 3 6,25 6,22 6,38 6,25 6,30 6,14 6,41 6,51 6,30 6,40 6,35 6,41 6,42 6,28 6,30 6,60 6,63 6,37 6,43 6,25 4 16,80 16,20 16,17 16,15 16,78 17,52 16,80 16,62 16,20 16,38 16,21 15,30 15,13 15,98 15,70 15,27 16,48 16,48 16,20 16,80 5. 4,11 4,12 4,21 4,03 3,95 3,90 3,98 4,00 3,89 4,22 4,10 4,00 4,13 4,19 4,18 4,03 4,02 4,35 4,25 4,28 6 1820 1066 1257 592 799 1130 2564 3580 1201 1300 7 0,32 0,36 0,14 1 0,63 0,36 0,25 0,1 0,14 0,38 0,63 1335 0,54 1986 2400 2546 2350 5335 11215 1450 1394 847 0,53 0,62 0,61 0,58 8 0,84 0,88 0,86 0,83 0,85 0,86 0,88 0,88 0,87 0,86 0,87 0,70 0,85 0,66 0,64 0,57 ! 0,79 0,24 0,67 0,41 0,40 0,80 0,83 0,72 0,70 9 + — " — - — + — — — — — — — — — — — — — — 10 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 11 niebieski proszek 12 294 244 niebieski 294 proszek i 244 niebieski proszek niebieski | proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek niebieski proszek 294 1 244 294 244 294 244 294 244 294 244 | 294 244 294 244 | 294 244 | 294 244 294 244 | 294 244 294 244 | 294 244 | 294 244 | 294 244 | 294 244 1 294 244 | 294 244 |80*837 21 Widma w podczerwieni i w nadfiolecie pewnych, zwiazków z tablicy 1 uwidoczniono w zalaczonych wykresach przedstawionych na fig. 1—6. 22 Wykres fig. 1 fig. 2 fig. 3 fig. 4 fig. 5 fig. 6 Wid¬ mo IR UV IR uv IR uv Nazwa zwiazku 3-[-3-(N-butylo)-ami- no-propylo]-aminopro- pyloaminobleomycyna 3-[-3-(N-butylo)-ami- no-propylo]-aminopro- pyloaminobleomycyna 3- (l-metylo-3-amino- propylo)-aminopro- pyloaminobleomycyna 3-(l-metylo-3-amino- propylo)-aminopro- pyloaminobleomycyna 3-(3-cykloheksyloami- nopropylo)-aminopro- pyloaminobleomycyna 3-(3-cykloheksyloami- nopropylo)-aminopro- pyloaminobleomycyna Nr zwiazku z tablicy 1 12 12 23 23 39 39 Uwagi do tablicy 1: Zawartosc nowej, czyli glównej bleomycyny ozna¬ czono w nastepujacy sposób: bleomycyne (miesza¬ nine skladników) otrzymana z hodowli rozdzielono na „CM Sephadex" i mierzono absorbcje w nad¬ fiolecie.Moc oznaczono stosujac test biologiczny, uzywa¬ jac chlorowodorku bleomycyny A2 (wolnej od miedzi) jako substancji porównawczej i M. tuber* culosis 607 jako mikroorganizmu porównawczego.Chromatografia cienkowarstwowa: adsorbent — zel krzemionkowy rozpuszczalnik — mieszanina metanolu, 10% octanu i 10% wodnego roztworu amoniaku w sto¬ sunku 10 : 9 :1.Chromatografia bibulowa: rozpuszczalnik — 10% wodny roztwór chlorku amonu N = reakcja ninhydrynowa S = reakcja Sakaguchi.Jak wynika z tablicy 1 nowe bleomycyny, otrzy¬ mane sposobem wedlug wynalazku, sa zblizone do znanych bleomycyn wygladem i absorbcja w nad¬ fiolecie, lecz na ogól róznia sie moca i wartoscia Rf. Jezeli otrzymane bleomycyny hydrolizuje sie silnym kwasem i hydrolizaty podda sie chromato¬ grafii gazowej, to mozna wykryc aminozwiazki do¬ dawane do hodowli, lub powstale z nich w procesie fermentacji. W ten sposób potwierdzono budowe 30 35 40 45 50 lancucha bocznego odpowiadajacego budowie doda¬ nych aminozwiazków lub zwiazków z nich powsta¬ jacych.Stosujac sposób wedlug wynalazku mozna wy¬ dzielic w stanie czystym, z duzymi wydajnosciami bleomycyny przydatne do indywidualnych celów terepautycznych. Mozna na przyklad otrzymac blieomycyny A2 i A5 odznaczajace sie silnymi wlas¬ nosciami antytumorowymi i o malej toksycznosci.Mozna otrzymac nieznana 3-aminopropyloamino- bleomycyne o doskonalym dzialaniu i znikomej to¬ ksycznosci.Ponizsze przyklady ilustruja sposób wedlug wy¬ nalazku.Przyklad I. Do pozywki stanowiacej miesza¬ nine 6,4% papki z prosa, 0,5% glukozy, 3»,5% maczki sojowej, 0,75% wyciagu z kukurydzy, 0,3% chlorku sodu, 0,1% drugorzedowego fosforanu potasu, 0,05% siarczanu cynku, 0,2% azotanu sodu, 0,1% siarczanu miedziowego i 0,01% o nazwie handlowej „Tono" srodka powierzchniowo czynnego, czyli eteru polio- ksyetyleno-polioksypropylenowego dodano bromku 3-aminopropylodwumetylosulfonowego w ilosci 0,4 mg/ml tak, aby wartosc pH pozywki wyno¬ sila 6,5.Kazde 100 ml pozywki umieszczono oddzielnie w kolbie Sakaguchi i sterylizowano. Zaszczepiono szczepem Streptomyces verticillus ATTC 15003 i poddano fermentacji w temperaturze 27°C w ciagu 8 dni mieszajac z szybkoscia 130 obrotów/minute.Po uplywie tego czasu hodowle (lacznie 4,5 IJ prze¬ saczono otrzymujac 3,0 1 przesaczu (moc 138,8 mg/ml, moc calkowita 416,4 mg). Otrzymany przesacz adsorbowano w kolumnie wypelnionej 200 ml Amberlitu IRC-50 (nazwa handlowa wymieniacza jonowego: typ N), przemyto woda i eluowano 0,5 n kwasem solnym. 1 1 eluatu zobojetniono, adsorbo¬ wano w kolumnie Wypelnionej 100 ml wegla aktyw¬ nego, przemyto woda i eluowano mieszanina aceto¬ nu i 0,02 kwasu solnego. Frakcje czynne wobec Mycobacterium 607 polaczono i odparowano do sucha.Pozostalosc rozpuszczono w 5 ml 80% wodnego metanolu, wprowadzono do kolumny zawierajacej 30 ml obojetnego tlenku glinu i eluowano 80% wodnym roztworem metanolu. Frakcje zawierajace bleomycyne odparowano do sucha, otrzymujac 195 mg chlorowodorku bleomycyny (moc 650,7 mcg/mg, moc calkowita 127 mg). Wydajnosc (z przesaczu) wynosila 30,5%. Tak otrzymany pro¬ dukt rozdzielono na poszczególne bleomycyny w kolumnie z CM Sephadexem wymywajac wod¬ nym roztworem mrówczynu amonu i stwierdzono, ze zawiera on 72,2% bleomycyny A& Te metode rozdzielania oznacza sie w dalszym ciagu opisu jako metode CM Sephadex.W analogiczny sposób postepowano stosujac inne aminozwiazki, wymienione w tablicy 2. Opisano tam takze stosowane warunki i uzyskane wyniki.23 80 837 Tablica 2 24 Ste- Nazwa zenie aminozwiazku (mg/ : ml) 1 bromowodo- rek bromku 3-aminopro- pylodwume- tylosulfonio- wego Chlorek 3-amino- 3-karboksy- propylodwu- metylosulfo- niowy . chlorowodo¬ rek agmatyny speramina 2 0,4 40,0 2,0 0,2 Czas Il0SC 1 u Iv Prze_ Moc (S1!^11 (mg/ml) 3 i 4 ! 5 192 192 240 264 3,0 1,65 2,0 1,1 138,8 100,0 200,0 150,0 Moc ogólna (mg) 6 416,4 165,0 400,0 150,0 Nazwa bleo- mycyny wy¬ dzielonej CM Sephadexem 7 Bleomycyna (zawartosc A2 72,2%) Bleomycyna (zawartosc A2 87,2%) Bleomycyna (zawartosc B2 76,2%) Bleomycyna (zawartosc A5 90,8%) Ilosc (mg) 8 195 140 164 62 Moc (mcg/ mg) 9 650,7 300,0 800,0 1200,0 1 Moc calko¬ wita (mg) 10 127,0 42,0 131,2 74,4 Wydaj¬ nosc z prze¬ saczu (%) 11 30,5 25,5 32,8 45,1 Przyklad II. Do pozywki stanowiacej miesza¬ nine 6,4% papki z prosa, 0,5% glukozy, 3,5% maczki rsojowej, 0,7% wyciagu z kukurydzy, 0,3% chlorku sodu, 0,1% drugorzedowego fosforanu potasu, 0,05% siarczanu cynku, 0,01% siarczanu miedziowego, 0,2% azotanu sodu i 0,01% „Tono" czyli eteru polio- ksyetylenopolioksypropylenowego dodano 1,2-dwu- aminopropanu w ilosci 2 mg/ml, tak by wartosc pH pozywki wynosila 6,5. Kazde 100 ml pozywki umieszczono w kolbie Sakaguchi i sterylizowano.Zaszczepiono szczepem Streptomyces verticillus ATTC 15003 i poddane fermentacji w temperaturze 27°C w ciagu 192 godzin, mieszajac z szybkoscia 130 obr/min. Po uplywie tego czasu hodowle (lacz¬ nie 4,5 1) przesaczono uzyskujac 3i;5 1 przesaczu (moc 190 mcg/ml, moc calkowita 676,4 mg).Otrzymany przesacz adsorbowano na kolumnie wypelnionej 200 ml Amberlitu IRC-50, przemyto woda i eluowano mieszanina acetonu i 0,02 n kwasu solnego (1:1). Frakcje czynne wobec Mycobacterium 607 zebrano i odparowano do sucha. Pozostalosc rozpuszczono w 4 ml 80% metanolu i wprowadzono do kolumny wypelnionej 70 ml obojetnego tlenku glinu. Eluowano 80% wodnym roztworem meta¬ nolu. Frakcje zawierajace bleomycyne zebrano, od¬ parowano do sucha, pozostalosc rozpuszczono w 2 ml wody, wprowadzono do kolumny wypelnio¬ nej 20 ml Sephadexu G-25 i eluowano woda desty¬ lowana.Otrzymane niebiesko-zielone frakcje zawierajace bleomycyne odparowano do sucha, pozostalosc za¬ wieszono w 0,02 n roztworze chlorku amonu, wpro¬ wadzono do kolumny wypelnionej 20 ml CH-Sepha- 40 dexu i eluowano 0,1 m roztworem chlorku amonu.Frakcje, zawierajace oczekiwane substancje wpro¬ wadzono do kolumny, zawierajacej 5 ml wegla aktywnego, i eluowano mieszanina acetonu i 0,02 n 45 kwasu solnego (1:1). Eluat odparowano do sucha otrzymujac 35 mg 2-aminopropyloaminobleomycyny (moc 2,173 mcg/mg, moc calkowita 76,1 mg). Wy¬ dajnosc z przesaczu wynosila 11,25%. 5o 25 mg tak otrzymanej substancji rozpuszczono w 1 ml metanolu i w ciagu 10 minut wprowadzono do roztworu gazowy siarkowodór. Roztwór prze¬ saczono i odparowano do sucha otrzymujac 20 mg chlorowodorku 2-aminopropylodwuaminobleomy- 55 cyny nie zawierajacego miedzi (moc 2,000 mcg/mg, moc calkowita 40 mg). Ten produkt hydrolizowano 6 n kwasem solnym, otrzymany roztwór poddano elektroforezie na bibule pod napieciem 3000 V, przy wartosci pH = 1,9 i stwierdzono obecnosc 1,2-dwu- 60 aminopropanu.W analogiczny sposób postepowano stosujac inne aminozwiazki, wymienione w tablicy 3. Opisano tam takze stosowane warunki i uzyskane wyniki.25 Tablica 3 26 Nazwa aminozwiazku 1 1,2-dwuami- noetan N,N-dwume- tylo-l,2-dwu- aminoetan N,N-dwuety- lo-l,2-dwu- aminoetan N,N-dwuety- lo-l,3-dwu- aminopropan N-butylo-N'- -(3-aminopro- pylo)-l,3- -dwuamino- -propan N-(2-hydrok- sypropylo)- -1,2-dwuami- noetan N-(3-amino- propylo)- -piperazyna N-(l-fenylo- etylo)-N'- -aminopro- pylo)-l,3- -dwuamino- propan N-(2-furfury- lo)-l,3- dwuamino- propan 4-piperydylo- metyloamina chlorowodo¬ rek 2-(4-imi- dazoilo)- -etyloaminy •St«.- Czas S3? •*» 2 1 4,0 3,0 2,0 2,0 2,0 0,6 0,6 3,0 3,0 2,0 1,0 1 3 1 192 240 240 240 240 240 240 240 240 240 240 prze- Moc ^oc L saczu (mcg/ml) °P"Ja w 1. (mg) 1 4 1 3,0 2,98 2,98 2,84 3,12 3,0 2,98 3,05 3,00 3,08 2,88 1 5 150,0 154,0 154,0 181,3 113,4 140,0 123,1 1020,0 380,0 170,9 189,6 Nazwa Meomycyny wydzielonej CM Sephadexem 1 6 | 7 [' 450,0 458,9 458,9 514,9 353,8 420,0 366,8 3111,0 1140 526,4 493,0 2-aminoety- loamino- bleomycyna 2-N,N-dwu- metyloamino- bleomycyna 2-N,N-dwu- etyloamino- etyloaminó- bleomycyna 3-N,N-dwu- etyloamino- propyloami- nobleomy- cyna 3-[3-(N-bu- tylo)-amino- propylo]- f -aminobleo- mycyna 2-{2-hydrok- sypropylo)- -aminoetylo- aminobleo- mycyna 3-piperazy- nopropylo- aminobleo- mycyna 3-[3-(N-l- 1 fenyloetylo)- -aminopro- pylo]-amino- propylo- amino- bleomycyna 3-[N-(2-fur- furylo)]- -aminopro- pyloamino- bleomycyna 4-piperydylo- metyloamino- bleomycyna 2-(4-imidazo- ilo)-etylo- aminobleo- mycyna Ilosc (mg) 1 8 I 28,7 140,0 140,0 230,0 150,0 88,0 103,0 240,0 86 130 74 Moc Moc calko- (mcg/mg) wita (mg) 9 1700 897 1102 1036 5840 1020 726 2500 1450 1394 847 1 10 1 488,0 125,6 154,3 236,3 876,0 898,0 74,8 600,0 124,7 181,2 62,7 1 Wydaj¬ nosc z prze¬ saczu 1 (•/•) 1 11 1 10,8 27,4 33,6 46,3 24,8 2h* 20,4 19,3 10,9 34,4 12,780 837 27 28 [ 1 1 2 N-metylo- -1,3-dwu- aminopropan N-butylo- -1,3-dwu- aminopropan N,N-dwume- tylo-l,3-dwu- aminopropan chlorek 3-aminopro- pylotrójme- tyloaminowy 1 N-[3-(N,N- -dwumetylo)- -aminopro- pylo]-l,3- -dwuamino- propan N,N-dwu- -(3-amino- propylo)-me¬ tyloamina N-(3-amino- -1-metylo- propylo)-l,3- -dwuamino- propan N-3-amino- propylopiro- lidyna N-3-amino- propylopipe- rydyna N-3-amino- propylomor- folina 1,5 4,0 2,0 1,0 1,0 0,5 0,1 0,1 0,1 0,1 3 264 264 240 288 264 264 264 288 288 240 4 5 3,10 3,40 3,04 3,20 3,34 3,54 3,20 3,30 3,00 2,94 129,8 525,0 164,8 118,0 253,9 133,7 331,0 281,0 317,0 145,8 6 | 7 | 8 402,4 1785,0 470,6 3-77,6 848,0 473,3 1059,2 927,3 931,0 428,7 3-N-metylo- aminopropy- loamino- bleomycyna 3-N-butylo- aminopropy- loamino- bleomycyna 3-(N,N-dwu- metylo)- -aminopropy- -loamino- bleomycyna 3-(N,N,N- trójmetylo)- -aminopro- pyloamino- bleomycyna 3-[3-(N,N- dwumetylo)- -aminopro- pylo-amino- propylo]- aminobleo- mycyna 3-(N-metylo- -N-3-amino- propylo)- -aminopro- pyloamino- bleomycyna 3-N-metylo- propyloami- nobleomy- cyna 3-(l-metylo- -3-aminopro- pylo)-amino- propyloami- nobleomy- cyna 3-(propyli- dyno)-pro- pyloamino- bleomycyna 3-(pipery- dylo)-pro- pyloamino- bleomy- cyna 3-(morfoli- no)-propylo- aminobleo- mycyna 119,0 214,7 127,0 124,0 162,5 32,0 112,6 355,0 320,0 175,0 9 860 1700 869 633 1280 1671 1820 1066 1257 5922 10 1 11 102,3 365,0 110,4 78,5 195,0 53,5 205,0 378,4 402,20 103,6 25,4 ¦ ¦ 20,4 23,5 20,8 23,0 11,4 19,4 40,8 42,3 24,280 837 29 30 1 1 | 2 |; 3 1 4 f 5 . [ 6 | 7 | 8 | 9 [ 10 | 11 N-2-amino- etylopipera- zyna N,N-dwu- -3-aminopro- pylopipera- zyna N-(3-piroli- dynopropylo)- -1,3-dwu- aminopropan N-(3-pipery- dynopro- pylo)-l,3r -dwuamino- propan N-(3-morfo- linopropylo)- -1,3-dwu- aminopropan N-(3-hydro- ksypropylo)- -1,3-dwu- aminopro- pan (chloro¬ wodorek) i N-(3-meto- ksypropylo)- -1,3-dwu- aminopropan (chlorowo¬ dorek) N-benzylo- -1,3-dwu- aminopro- pan N-(l-fenylo- etylo-1,3- -dwuamino- propan m-ksyleno- dwuamino 1 1 2,0 0,5 1,0 0,5 0,5 0,7 1,35 0,5 0,5 2,0 1 288 240 3,08 264 264 264 288 264 288 288 1 3,12 3.,69 1 465,6 3,10 2,94 3,02 3,10 3,00 3,39 2,77 1 iii,o- 225,0 1434,0 543,5 139,0 227,4 282,5 i 334,0 606,0 292,4 [ 346,0 860,3 1434,0 1684,9 408,7 186,7 875,8 182,0 2054,3 809,9 2-(piperazy¬ no)-etylo- aminobleo- mycyna 3-[-{-4-(3- -aminopro- pylo)}-pipe- razyno]-pro- pyloamino- bleomycyna 3-[-3-(piro- lidyno)-pro- pylo]-amino- propylo- amino-bleo- mycyna 3-[-3(pipe- rydylo)-pro- pylo]-amino- propylo- aminobleo- mycyna 3-[3-(morfo- lino)-propy- lo]-aminopro- paloamino- bleomycyna 3-(3-hydro- ksypropylo)- -aminopro- pyloamino- bleomycyna 3-(3-metoksy- propylo)- -aminopro- pyloamino- bleomycyna 3-benzylo- aminopro- pyloamino- bleomycyna 3-(l-fenylo- etylo)-ami- nopropylo- aminobleo- mycyna m-amino- metyloben- zyloamino- bleomycyna I 75,0 210,6 105,0 140,0 70,0 168,1 336,0 40,0 96,3 10,8 1 799 1180 2564 3580 1201 1300 1335 1986 2400 2546 1 59,9 248,5 269,2 501,2 84,1 215,9 448,6 79,4 231 27,5 1 17,3 29,9 18,8 29,7 20,6 31,4 51,2 7,9 1 11,2 3,4 131 80 837 32 1 1 | 2 | . 3* Pfksyleno- dwuamino N-cyklohek- sylo-1,3- dwuamino- propan N-(3-cyklo- heksyloami- nopropylo)- -1,3-dwuami- nopropan 2,0 0,5 0,5 264 264 264 1 4 | 5""" 3,05 3,38 3,10 1 320,4 1354,0 1600,0 6 | 7 1 8 | 9 977,2 4576,5 4960,0 p-aminome- tylobenzylo- aminobleo- mycyna 3-cyklohek- syloamino- propyloami- nobleomy- cyna 3-(3-cyklo- heksyloami- nopropylo)- propyloami- nobleomy- cyna 33,3 330,0 178,0 2670 5355 11215 1 10 89,0 1767,2 1996,3 11 1 ¦ 9,1- 38,6 40,3 Przyklad III. Do pozywki stanowiacej miesza¬ nine 6,4°/o papki prosa, 0,5% glukozy, 3»,5% maczki sojowej, 0,75% wyciagu z kukurydzy, 0,3% chlorku sodu, 0,1% drugorzedowego fosforanu potasu, 0,05% siarczanu cynku, 0,01% siarczanu miedziowego, 0,2% azotanu sodu, 0,01% krzemionki i 0,01% „Tono", czyli eteru poliksyetylenopolioksypropylenowego do¬ dano 1,3-dwuaminopropanu w ilosci 2 mg/ml tak, by wartosc pH pozywki wynosila 6,5. 12 1 tak przy¬ gotowanej pozywki umieszczono w szklanym tanku fermentacyjnym o pojemnosci 20 1 i sterylizowano.Zaszczepiono 800 ml pozywki o tym samym skla¬ dzie, w której znajdowal sie szczep Streptomyces verticillus ATTC 15003.Dodawanie pozywki trwalo 48 godzin przy wstrza¬ saniu. Fermentacje w temperaturze 27°C prowadzo¬ no w ciagu 120 godzin, mieszajac z szybkoscia 350—370 obrotów/minute i wprowadzajac do po¬ zywki powietrze w ilosci równej objetosci pozywki, na minute. Po uplywie tego czasu hodowle (lacznie 7,7 1) przesaczono i przesacz (5,6 1, moc 148,5 mcg/ml), moc calkowita 831,6 mg ekstrahowano i oczyszczano jak podano w przykladzie I, otrzy¬ mujac 230 mg chlorowodorku bleomycyriy (moc 734,8 mcg/mg, moc calkowita 169 mg). Wydajnosc przesaczu wynosila 20,3%. Chlorowodorek analizo¬ wano metoda CM Sephadex i ustalono, ze zawiera 84,5% 3-aminopropyloaminobleomycyny. 200 mg chlorowodorku rozpuszczono w 10 ml wody .desty¬ lowanej i roztwór wprowadzono do 50 ml kolumny zawierajacej CM Sephadex zawieszony wr.0r02-n roztworze mrówczanu amonu i eluowano 0,1 n wodnym roztworem mrówczanu amonu otrzymujac frakcje, zawierajaca 3t-aminopropyloaminobleomy- cyne. Wprowadzono ja do kolumny zawierajacej 10 ml wegla aktywnego, przemyto woda i .eluowano mieszanina acetonu i 0,02 n kwasu solnego (1:1).Aktywna frakcje eluatu odparowano do sucha, otrzymujac 50 mg chlorowodorku 3-aminopropylo- 30 35 40 55 60 aminobleomycyny (moc 1,934 mcg/mg, moc calko¬ wita 96,7 mg). Wydajnosc surowego chlorowodorku wynosila 65,8%.Substancje hydrolizowano 6 n kwasem solnym.Wprowadzono do 10% roztworu wodorotlenku sodu i poddano chromatografii gazowej w kolumnie wy¬ pelnionej „Fluropac 80" (nazwa handlowa spolime- ryzowanego fluorku etylenu wytwarzanego przez Fluoro-Carbon Co.) pokrytego „Silicone SF 96" (nazwa handlowa polimeru tlenku krzemoorganicz- nego wytwarzanego przez General Electric CO.) i zidentyfikowano maksimum 1,3-dwuaminopro¬ panu. 30 mg oczyszczonego chlorowodorku 3-aminopro¬ pyloaminobleomycyny (moc 1,934 mcg/mg, moc calkowita 58,02 mg) rozpuszczono w 5 ml metanolu i do roztworu wprowadzono w ciagu 30 minut ga¬ zowy siarkowodór. Utworzony osad siarczanu mie¬ dziowego odsaczono i przemyto metanolem. Przesacz i metanol z przemycia polaczono i odparowano do sucha otrzymujac 25 mg chlorowodorku 3-amino¬ propyloaminobleomycyny nie zawierajacej miedzi (moc 1,850 mcg/mg, moc calkowita 46,35 mg). Wy¬ dajnosc w stosunku do produktu zawierajacego miedz wynosila 79,7%. 20 mg tak oczyszczonego produktu (moc 1850 mcg/mg, moc calkowita 37 mg) rozpuszczono w 2 ml wody destylowanej i wprowadzono do kolumny za¬ wierajacej 5 ml anionowego wymieniacza jonowe¬ go „Amberlite IRA 400" (nazwa handlowa) i eluo¬ wano woda destylowana. Eluat odparowano do sucha otrzymujac 15,5 mg siarczanu 3-aminopro¬ pyloaminobleomycyny, pozbawionej miedzi (moc 1,850 mcg/mg, moc calkowita 28,68 mg). Wydajnosc 77,5%.W ten sposób przeprowadzono eksperymenty w szklanym tanku fermentacyjnym, stosujac amino- zwiazki wymienione w tablicy 4. Opisano tam takze stosowane warunki i zestawiono wyniki.33 80 837 Tablica 4 34 Naizwa amino- zwiazku 1 1 1,4-dwuami- nobutan Spermidyna Ste- 1 zenie (mg/ ml) 2 2,0 1 0,4 Czas hodowli (godiz.) 3 120 163 Ilosc ' prze¬ saczu wl. 4 4,9 1 5,0 Moc (-m-og/inl) 5 140,0 122,2 Moc og61na Omg) 6 686,0 611,0 Nazwa bleomy- cytny wydzie¬ lonej CM Sep- hadexeim 7 Bleomycyny A2 Bleomycyna Si Ilosc (mg) 8 71,8 44,7 Moc (mcg/mg) 9 1232 2543 Moc calko¬ wita (mg) 10 88,5 113,7 - ¦ 1 Wydaj¬ nosc z 1 prze¬ saczu 11 12,9 18,6 Przyklad IV. Pozywke zawierajaca 4,0°/o maczki sojowej, 1,0% ekstraktu drozdzowego, 0,3 chlorku sodu, 100% oleju sojowego, 0,0007% uwodnionego siarczanu miedziowego, 0,0001% uwod¬ nionego siarczanu zelazowego, 0,0008% uwodnionego siarczanu manganowego i 0,0002% uwodnionego siarczanu cynku doprowadzono do wartosci pH = 7,0. Kazde 120 ml pozywki umieszczono w kolbie Sakaguchi o pojemnosci 500 ml i sterylizo¬ wano. Pozywke zaszczepiono szczepem MA 261-A1 wyodrebnionym w 1965 r. ze scieków Musashino- cho, Saitama-Ken, Japonia, zidentyfikowanego jako wariant Streptomyces verticillus ATCC 21678, pro¬ dukujacym specyficznie bleomycyne A5.Dodano fosforan spermidyny, wysterylizowany za pomoca Millipore (nazwa handlowa) w ilosci 0,5 mg/ml i poddano fermentacji w temperaturze 27°C w ciagu 7 dni, przy mieszaniu z szybkoscia 130 obrotów/minute. Po uplywie tego czasu hodowle (5,2 1) przesaczono i przesacz (4,5 1, moc 196 mcg/ml, moc calkowita 253 mg) ekstrahowano i oczyszczano jak w przykladzie I, otrzymujac 137 mg surowego, sproszkowanego chlorowodorku bleomycyny A5 (moc 1,846 mcg/ml, moc calkowita 253 mg). Wydajnosc 28,8%.Surowy produkt chromatografowano w kolumnie wypelnionej Sephadexem G-50 i eluowano woda destylowana. Otrzymano niebieskie, aktywne frak¬ cje odparowane do sucha otrzymujac 53,5 mg nie¬ bieskiego proszku (moc 2,613 mcg/mg, moc calko¬ wita 140 mg) skladajacego sie wylacznie z bleomy¬ cyny A5. Wydajnosc surowego proszku — 55,4%.Wartosc ekstynkcji (E,* ) przy 293 m wynosila 116. Spermidyne w lancuchu bocznym oznaczono po hydrolizie 6 n kwasem solnym i po poddaniu hydrolizatu chromatografii gazowej. PL PL PL