Verfahren zur Herstellung von Coprogen und Desferricoprogen Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung des eisenhalti gen Wuchsstoffes Coprogen und der entsprechenden eisenfreien Verbindung des Desferricoprogens.
Der Wuchsstoff Coprogen wurde zuerst von Hessel- tine et a1. aus einem Stamm der Gattung Penicillium iso liert. Seine Struktur ist noch unb-.kannt.
Die rotbraune, amorphe Verbindung hat die Ele- mentarzusammensetzung C = 50,18 %; H = 6,72 0/0; N = 9,36 %: Fe = 6,64 %;
O = 27,10 0/0 (her.).
Das UV-Spektrum in Äthanol zeigt Maxima bei <I>213</I> mg (log<B>EI'/"</B> = 2,72),<I>254</I> mg (log E = 2,34) und 450 mg (log E i <B>%</B>m = 1,56). In wässeriger Lösung ist das Spektrum nicht signifikant verändert.
Das IR-Spektrum in Kaliumbromid weist u. a. Ban den auf bei 3415, 2922, 1730, 1724, 1660, 1539, 1457, <B>1377,1330,1279,1236,1223,11.43,1110,1023,945,</B> 922, 839 cm-', vgl. Fig. 1.
Das papierchromatographische Verhalten von Co- progen ist im Vergleich zu dem anderer Pilz-Sideramine in der Tabelle 1 zusammengestellt:
EMI0001.0045
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> <U>Sideramin</U> <SEP> Rf <SEP> (I) <SEP> Rf <SEP> (II)
<tb> Ferrichrom <SEP> 0,28 <SEP> 0,30
<tb> Ferrichrysin <SEP> 0,26 <SEP> 0,34
<tb> Ferricrocin <SEP> 0,29 <SEP> 0,28
<tb> Ferrirhodin <SEP> 0,43 <SEP> 0,88
<tb> Coprogen <SEP> 0,43 <SEP> 0,55
<tb> Ferrirubin <SEP> 0,42 <SEP> 0,73 System I: n-Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:1.
System 1I: tert.-Butanol-Wasser-gesätt. Natriumchlorid- lösung-0,1-n. Salzsäure 50:25:25:1. Papier imprägniert mit Aceton-Wasser-gesätt. Natriumchlorid 6:5:1 (v/v/g) und an der Luft 15 Min. getrocknet.
Bei der Behandlung von Coprogen mit Basen oder Säuren oder mit Eisenkomplex-bildenden Stoffen wird das Eisen aus dem Molekül entfernt, wobei das Desfer- ricoprogen als blass-bräunliches Pulver erhalten wird. Das NMR.-Spektrum dieser Verbindung ist in Fig. 2 dargestellt.
Es unterscheidet sich wesentlich von dem des eisen freien Ferrichroms und des eisenfreien Ferrichrysins. Insbesondere fällt das Fehlen eines Singletts bei 2,1 ppm (Angaben in ö-Werten) auf, das sowohl beim eisenfreien Ferrichrom wie auch beim eisenfreien Ferrichrysin auf tritt und für die hydroxamsäur-eartig gebundene N-Ace- tylgruppe charakteristisch ist.
Die Carbonylkomponen- ten der Hydroxamsäure-Gruppierungen werden dem nach nicht wie bei jenen durch Essigsäure gebildet.
Wird .das eisenfreie Coprogen mit konzentrierten Mineralsäuren hydrolysiert und das Hydrolysegemisch katalytisch hydriert um Hydroxylaminogruppen zu Ami- nogruppen zu reduzieren, so weist das Reaktionsprodukt als einzigen ninhydrinpositiven Bestandteil Ornithin auf.
Bei den bisher bekannt gewordenen Sideraminen aus Pilzen wurde neben Ornithin noch eine zweite Amin säure aufgefunden, nämlich Glycin beim Ferrichrom und Serin beim Ferrichrysin.
Dass Ornithin (bzw. ein N-Hydroxyderivat des Ornithins) der einzige (dreimal vorkommende) stick stoffhaltige Baustein des Coprogens ist, lässt sich - im Zusammenhang mit den Hydrolyse-Ergebnissen - auch aus der Elementaranalyse (s. oben) vermuten, da auf ein Eisenatom nur 6 Stickstoffatome entfallen, während es beim Ferrichrom und beim Ferrichrysin deren neun sind.
Aus Desferri-Co.progen kann bei Zusatz von Eisenchlorid bei neutralem pH das Coprogen zurücker halten werden.
Wie bereits erwähnt, ist Coprogen als Wuchsstoff bekannt und kann als solcher verwendet werden. Des ferricoprogen besitzt wertvolle pharmakologische Eigenschaften und kann als Heilmittel benützt werden. Es ist geeignet, aus dem Organismus Eisen auszuschei den, indem es dieses in Form des Eisenkomplexes, des Coprogens, bindet. So dient es zur Ausscheidung von Eisen bei der Ablagerung eisenhaltiger Pigmente im Organismus, z. B. bei Hämochromatose und Hämoside- rose, sowie Lebercirrhose.
Die pharmazeutischen Präparate enthalten Desferri- coprogen in Mischung mit einem organischen oder an organischen pharmazeutischen Träger, der für die en- terale oder parenterale Anwendung geeignet ist. Die Präparate können aus dem Ausgangsmaterial nach den üblichen Methoden hergestellt werden.
Es wurde nun gefunden, dass Coprogen sowie Des- ferricoprogen gleichzeitig gebildet werden, wenn man Penicillium citrinum M 3614 züchtet. Je nach dem Eisengehalt des Nährmediums ist in dem erhaltenen Gemisch von Coprogen und Desferricoprogen mehr oder weniger Coprogen enthalten.
Der Stamm Penicillium citrinum M 3614 wurde aus einer Bodenprobe von Münster, Westfalen, isoliert. Er wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Techni schen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung M 3614 aufbewahrt. Der Stamm bildet ein reichliches, septiertes und verzweigtes Sub- stratmycel, von dem als Seitenzweige die Konidienträger ausgehen. Der Konidienapparat ist in Form eines typi schen Penicillus ausgebildet.
Dadurch ist der Stamm als Glied der Gattung Penicillium Link 1809 (Link, H. F.: Obs. ord. plant. nat. in Ges. naturf. Freunde Berlin 3 1809]) gekennzeichnet.
Innerhalb der Gattung Penicillium kann eine Be stimmung der Art am besten nach dem Einteilungs schema von Raper u. Thom (Raper, K. B., and Ch. Thom: A Manual of the Penicillia. The Williams & Wil- kins Co., Baltimore 1949, 875 S.) vorgenommen wer den.
Nach der Ausbildung der Konidienapparates fällt der Stamm M 3614 in die Sektion ASXMMETRICA, Subsektion VELUTINA, Serie Penicillium citrinum. Der Stamm M 3614 weist im Durchschnitt 3 Verzwei gungen der Metulae auf.
Für die Züchtung von Penicillium citrinum M 3614 kommen als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Be tracht: Kohlenhydrate, z. B. Glucose, Saccharose, Lac- tose, Stärke, Alkohole, wie Mannit und Glycerin, Ami nosäuren, z.
B. Ornithin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, Fleischex trakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkohol herstellung, Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Soyapflanze, der Baumwollpflanze, Ammoniumsalze, Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Nitrate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Zink und Mangan sowie Spuren von Eisen enthalten.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 C, vorzugsweise 27 C. Eine wesentliche Sider- amin-Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemei nen nach 6-10 Tagen.
Die Coprogen-Aktivität kann mikrobiologisch mit tels des abgewandelten Bonifas-Testes (vgl. Zähner et a1., Arch. Mikrobiol. 36, 325 ff. 1960) bestimmt wer den. Als Testlösung verwendet man eine Ferrimycinlö- sung von 0,01 mg/ml Gehalt, als Teststamm Staphylo- coccus aureus.
Man kann auch optisch die Coprogen-Konzentration der Kulturlösung feststellen. Zu diesem Zweck werden 5 ml Kulturflüssigkeit mit 1,5g Natriumchlorid, 1 ml 0,1 o/oiger Ferrisulfatlösung und 5 ml Benzylalkohol 5 Minuten geschüttelt, abzentrifugiert, die organische Phase filtriert und die Extinktion der organischen Pzase bei 410 mss bestimmt. Als Vergleichsprobe dient ein auf gleiche Weise hergestellter Extrakt aus unbeimpfter Nährlösung.
Bei Beendigung der Züchtung kann man pro Liter 1 g Ferrichlorid zur Nährlösung zugeben, wobei das vorliegende Desferricoprogen in Coprogen übergeführt wird. Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, vor zugsweise in Gegenwart eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo-Supercel, wonach die Hauptmenge des Sideramins im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel haften. Es ist daher vorteilhaft, dieses gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beispielsweise Wasser oder wässerige Alkohole, wie wässeriges Methanol.
Für die Isolierung von Coprogen aus dem Kulturfil trat kann man nach an sich bekannten Methoden vorge hen und z. B. eine der nachfolgend angegebenen Arbeitsweisen oder Kombinationen davon anwenden.
1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B. Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Frankonit, Fullererde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution .der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Ge mischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser, z.
B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pydrin-, verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol-EisessigButanol-Gemischen. Als be sonders vorteilhaft für die Elution eines Frankonit- oder Noritadsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Volumteile) und Pyridin (1 Volumteil) erwiesen.
2. Weiter kann Coprogen einer wässrigen Lösung mittels organischen Lösungsmitteln entzogen werden. Für diese Extraktionsverfahren haben sich höhere orga nische Alkohole, z. B. Benzylalkohol oder Isopropylal- kohol, besonders bewährt. Zweckmäss?gerweise wird dabei der wässrig.n Phase ein anorganisches Salz, z. B. Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, zugesetzt. Aus den erhaltenen organischen Extrakten kann Coprogen entweder durch Abdampfen des Lösungsmittels oder durch Ausfällung mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z.
B. Äther, Petroläther oder Äthylace- tat, in angereicherter Form erhalten werden.
3. Eine weitere Methode der Anreicherung von Co- progen besteht darin, dass man es zwischen einer wässe rigen Lösung und einer Lösung von Phenol in Chloro form verteilt, wobei der Phenolgehalt der Chloroformlö- sung variiert werden kann.
4. Eine andere Methode zur Anreicherung und/oder Auftrennung von Coprog-.n stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z.
B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesi- umsilikaten, Silicagel, Calciumsulfat, sowie Verteilungs- chromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel, Celite u. dgl. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatogra- phie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex-50, Amberlite IRC-50 u. dgl.
5. Weiter kann Coprogen durch Gegenstromvertei lung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgendes Lösungsmittelsystem hat sich dabei besonders bewährt: n-Butanol-Benzylalkohol-0,001-n. Salzsäure-wässrige, bei 19 gesättigte Natriumchloridlösung (9:9:15:5).
Desferricoprogen wird neben Coprogen von Penicil- lium citrinum M 3614 gebildet und kann daher auch direkt aus dem Kulturfiltrat isoliert werden, wenn man nach Beendigung der Fermentation keine Eisensalze zu gibt. Vorteilhaft entfernt man sogar bei der Isolierung im Kulturfiltrat vorhandenes Eisen, beispielsweise durch Zusatz Eisenkomplex-bildender Stoffe, z. B. 8-Oxy-chi- nolin.
Man kann die Eisenkomplex-bildenden Stoffe direkt nach Beendigung der Fermentation der Kulturbrühe zu setzen. Vorteilhaft erfolgt der Zusatz in einem späteren Stadium der Aufarbeitung um allfällige durch die be nützten Agenzien eingeschleppte Eisen-(111)-ionen eben falls zu entfernen.
Die Isolierung des Desferricoprogens aus der Kul turlösung erfolgt nach den für die Isolierung von Copro- gen erwähnten Methoden.
In den folgenden Beispielen ,sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben. <I>Beispiel 1</I> Der Stamm Penicillium citrinum M 3614 wird in gut belüfteter Submerskultur bei 27 gezüchtet. Man ver wendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Glucose, 5 g L-Asparagin, 1 g sek.-Kaliumphos- phat, 1 g krist. Magnesiumphosphat (MgSO4, 7 11,0) und 0,5 g Calciumchlorid enthält.
Der Gehalt des Lei tungswassers an Eisen beträgt 20-30 y/Liter. Die Nähr lösung wird 20 Minuten bei l20 sterilisiert. Geimpft wird mit einer Sporensuspension, die 150-180 Millio nen Sporen pro Liter enthält.
Nach 6-10 Tagen wird den Kulturen 1 g Ferrichlo- rid pro Liter zugesetzt und unter Zusatz von 2 % Hyflo Supercel filtriert. Dem Kulturfiltrat werden nun pro Liter 10 g Natriumchlorid zugefügt, dann wird es mit 1/8 Volumen Chloroform-Phenol (1 Vol.-Teil: 1 Gew.-Teil) extrahiert.
Die organischen Phasen werden vereinigt, durch Celit filtriert, mit 4 Volumen Äther versetzt und 4-5 mal mit destilliertem Wasser ausgezogen (bis zur vollständigen Entfärbung der organischen Phase). Die wässrigen Auszüge werden mit Äther von Resten an Phenol befreit und lyophilisiert. Aus 10 Liter Kultur werden 2,48 g rohes Lyophilisat erhalten.
2,48 g Rohextrakt werden einer Craig-Verteilung über 50 Stufen unterzogen. Als Verteilungssystem ver wendet man ein Gemisch aus 1,8 Liter n-Butanol, 1,8 Liter Benzylalkohol, 3 Liter 0,001-n. Salzsäure und 1 Liter gesättigte wässerige Kochsazlösung. Eine tief braune Verbindung sammelt sich dabei in den Fraktio nen 2-8 an, eine rotbraune Substanz in den Fraktionen <B>25-38.</B>
Die Fraktionen 25-38 werden vereinigt, mit dem gleichen Volumen Äther versetzt, die wässerige Phase abgetrennt und die Ätherschicht noch dreimal mit Was ser ausgezogen. Der Farbstoff geht dabei vollständig in die wässerige Phase. Diese wird mit 10 % Natriumchlo- rid versetzt und mehrmals mit Phenol-Chloroform (1 kg auf 1 Liter) ausgeschüttelt.
Die tief braunroten trüben Auszüge werdn an einer Celitsäure geklärt, mit dem doppelten Volumen Äther versetzt und das Coprogen wieder in Wasser aufgenommen. Die mit Äther gewa schenen wässerigen Auszüge dampft man im Vakuum ein. Es bleiben 600 mg eines etwas schmierigen braun roten Rückstandes zurück. Zur weiteren Reinigung wird eine zweite Craig-Verteilung im gleichen Lösungsmittel system über 160 Stufen durchgeführt. Aus den Fraktio nen 100-119 gewinnt man das Coprogen wie oben be- schrieben.
Durch Umfällen aus Methanol-Äther erhält man 400 mg eines feinen rotbraunen amorphen Pulvers, das papierchromatographisch einheitlich ist.
Aus den Fraktionen 2-8 der ersten Verteilung iso liert man in gleicher Weise 355 mg von wenig aktiven Nebenkomponenten als braunschwarzes amorphes Pul ver, das gemäss Papierchromatographie nicht einheitlich ist.
Das Coprogen der Fraktionen 100-119 zeigt fol gende Eigenschaften: Elementaranalyse: C = 50,18 %, H = 6,72 0/a, N = 9,36 %, Fe = 6,64 %;
O (her.) = 27,10 0/0. Absorptionsspektrum im UV und im Sichtbaren in Feinsprit:
EMI0003.0098
Das IR-Spektrum zeigt u. a. Banden bei 3415, 2922, 1730, 1724, 1660, 1539, 1457, 1377, 1330, 1279, 1236, <B>1</B>223, 1143, 1110, 1023, 945, 922, 839 cm-', vgl. Fig. 1.
Das papierchromatographische Verhalten von Co- progen ist im Vergleich zu dem anderer Pilz-Sideramine in der obigen Tabelle 1 zusammengestellt.
<I>Beispiel 2</I> 69 mg Coprogen werden in 5 ml Wasser gelöst und <B>100</B> mg 8-Hydroxychinolin in ca. 1 ml Methanol zuge fügt. Unter stetem Rühren wird das Gemisch 16 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Darauf wird vom schwarzen Niederschlag (Hydroxychinolin-Eisen- komplex) mit Hilfe von Celit abfiltriert und die, klare, blass-bräunliche Lösung mehrmals mit Chloroform aus geschüttelt um das überflüssige Reagens zu ent fernen.
Die wässerige Lösung wird unter vermin dertem Druck eingedampft und der Rückstand aus Methanol mit viel Äther umgefällt. Das Reaktionspro dukt fällt als blass@bräunliches Pulver an. Das NMR- Spektrum dieser Verbindung ist in Fig. 2 wiedergegeben.