DE1184040B - Verfahren zur Herstellung der Wuchsstoffe Coprogen und Desferricoprogen - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Internat. Kl.: CI2d

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1184 040

Aktenzeichen: C 29575IV a/30 h

Anmeldetag: 5. April 1963

Auslegetag: 23. Dezember 1964

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist- ein neues Verfahren zur Herstellung des eisenhaltigen Wuchsstoffes Coprogen und der entsprechenden eisenfreien Verbindung, des Desferricoprogens, ihrer Derivate und Salze.

Der Wuchsstoff Coprogen wurde zuerst von Hesseltine et al. aus einem Stamm der Gattung Penicillium isoliert. Seine Struktur ist noch unbekannt.

Die rotbraune, amorphe Verbindung hat die EIementarzusammensetzung C = 50,18%, H = 6,72%, N = 9,36%, Fe = 6,64%, O = 27,10% (berechnet).

Das UV-Spektrum in Äthanol zeigt Maxima bei 213 ΐημ (log Ε}* = 2,72), 254 ηΐμ (log E₁ ¹I = 2,34) und 450 ηΐμ (log EJ *_m = 1,56). In wäßriger Lösung ist das Spektrum nicht signifikant verändert.

Das IR-Spektrum in Kaliumbromid weist unter anderem Banden auf bei 3415, 2922,1730, 1724, 1660, 1539, 1457, 1377, 1330, 1279, 1236, 1223, 1143, 1110, 1023, 945, 922, 839 cm¹ (vgl. F i g. 1).

Das papierchromatographische Verhalten von Coprogen ist im Vergleich zu dem anderer PiIz-Sideramine in der Tabelle zusammengestellt:

Tabelle

Sideramin	Rf(D	Rf (II)
Ferrichrom Ferrichrysin Ferricrocin Ferrirhodin Coprogen Ferrirubin	0,28 0,26 0,29 0,43 0,43 0,42	0,30 0,34 0,28 0,88 0,55 0,73

System I

n-Butanol—Eisessig—Wasser 4:1:1. System II

tert. -Butanol—Wasser—gesättigte Natriumchloridlösung—0,1 n-Salzsäure 50 : 25 : 25 : 1. Papier imprägniert mit Aceton — Wasser — gesättigtes Natriumchlorid 6:5:1 (V/V/g) und an der Luft 15 Minuten getrocknet.

Bei der Behandlung von Coprogen mit Basen oder Säuren oder mit eisenkomplexbildenden Stoffen wird das Eisen aus dem Molekül entfernt, wobei das Desferricoprogen als blaßbräunliches Pulver Verfahren zur Herstellung der Wuchsstoffe
Coprogen und Desferricoprogen

Anmelder:

CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dr.-Ing. Dr. jur. F. Redies,

Dr. rer. nat. B. Redies und Dr. rer. nat. D. Türk, Patentanwälte, Opladen, Rennbaumstr. 27

Als Erfinder benannt:

Dr. Ernst Gäumann, Zürich;

Dr. Ernst Vischer, Basel (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 5. April 1962 (4188),

vom 19. November 1962 (13 547)

erhalten wird. Das NMR-Spektrum dieserVerbindung ist in F i g. 2 dargestellt.

Aus Desferricoprogen wird bei Zusatz von Eisenchlorid bei neutralem pH das Coprogen zurückerhalten.

Es wurde nun gefunden, daß Coprogen sowie Desferricoprogen aus weiteren Stämmen der Gattung Penicillium produziert werden, nämlich von Penicillium citrinum" M 3614, Penicillium camemberti M 98, Penicillium urticae 4277, Penicillium notatum 1613 und Penicillium chrysogenum 4360. Diese Stämme werden in der Eidg. Techn. Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, sowie in den Laboratorien des Erfinders unter der angegebenen Bezeichnung aufbewahrt. Die Stämme bilden ein reichliches, septiertes und verzweigtes Substratmycel. von dem als Seitenzweige die Konidienträger ausgehen. Der Konidienapparat ist in Form eines typischen Penicillus ausgebildet. Dadurch sind die Stämme als Glieder der Gattung Penicillium Link 1809 (H. F. L i η k, Obs.ord.plant.nat. in Ges.naturf. Freunde Berlin, 3 [1809]) gekennzeichnet.

Innerhalb der Gattung Penicillium kann eine Bestimmung der Art am besten nach dem Einteilungsschema von R a ρ e r und Thorn (K. B.

R aper und Ch. Thorn, A Manual of the Penicillia, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1949) vorgenommen werden.

409 759/361

Penicillium citrinum M 3614 ist 1957 aus einem Rieselboden aus Münster, Westfalen, isoliert worden. Er gehört in die Sektion Asymmetrica, Sub-Sektion Velutina, P citrinum-Series. Die weitere Differenzierung erfolgt nach R a ρ e r und T h ο m, a. a. O., S. 338 ff., nach der quantitativen Verzweigung der Metulae. Der Stamm M 3614 weist im Durchschnitt drei Verzweigungen der Metulae auf.

Penicillium camembert! M 98 wurde 1953 vom Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn (CBS), als P. camemberti Thorn 1906 erhalten. Er ist nach R aper und Thorn, a.a.O., S. 427, identisch mit dem Typusstamm P. camemberti NRRL 877. Penicillium urticae 4277 ist 1945 vom CBS unter der Bezeichnung Penicillium urticae Bainier 1906 erhalten worden. Er gehört in die Sektion Asymmetrica, Sub-Sektion Fasciculata, P. urticae-Series. Er ist nach R a ρ e r und Thorn identisch mit dem Stamm NRRL 992, auf welchen die von R a ρ e r und T h ο m, a. a. O., S. 536 ff., gegebene Beschreibung von P. urticae paßt.

Penicillium notatum 1613 ist 1945 als Penicillium notatum Westling 1911, Stamm ATCC 9171, erhalten worden. Er gehört in die Sektion Asymmetrica, Sub-Sektion Velutina, P. chrysogenum-Series. Er entspricht der Beschreibung von P. notatum bei R a ρ e r und Thorn, a. a. Ο., S. 367 ff.

Penicillium chrysogenum 4360 ist identisch mit Penicillium chrysogenum Thorn 1910, Stamm ATCC 10003 oder NRRL 2000. Er gehört in die Sektion Asymmetrica, Sub-Sektion Velutina, P. chrysogenum-Series. Er ist beschrieben bei R a ρ e r und Thorn, a.a.O., S. 359 ff.

Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme Penicillium citrinum M 3614, Penicillium camemberti M 98, Penicillium urticae 4277, Penicillium notatum 1613 und/oder Penicillium chrysogenum 4360 unter aeroben Bedingungen in einer wäßrigen Nährlösung, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthält, züchtet und aus dem Kulturfiltrat Coprogen und/oder Desferricoprogen isoliert und, wenn erwünscht, Coprogen in die eisenfreie Verbindung überfuhrt und/oder Derivate oder Salze dieser Verbindungen herstellt.

Die Bildung des Coprogens und/oder Desferricoprogens wird durch ein eisenarmes Nährmedium begünstigt, und es ist daher zweckmäßig, die Züchtung unter Eisenmangel, vorzugsweise bei einem Eisengehalt von höchstens 10 ⁷ Mol je Liter, vorzunehmen.

Für die Züchtung der Stämme kommen als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Betracht: Kohlenhydrate, z. B. Glukose, Saccharose, Laktose, Stärke, Alkohole, wie Mannit und Glyzerin, Aminosäuren, z. B. Ornithin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Sojapflanze, der Baumwollpflanze, Ammoniumsalze, Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Nitrate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Zink und Mangan sowie Spuren von Eisen enthalten.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 4O⁰C, vorzugsweise 27°C. Eine wesentliche Wuchsstoffwirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 6 bis 12 Tagen.
Die Coprogenaktivität kann mikrobiologisch

ίο mittels des abgewandelten Bonifas-Testes (vgl. Z ä h η e r et al., Arch. Mikrobiol., 36, S. 325 ff. [I960]) bestimmt werden. Als Testlösung verwendet man eine Ferrimycinlösung von 0,01 mg/ml Gehalt, als Teststamm Staphylococcus aureus.

Man kann auch optisch die Coprogenkonzentration der Kulturlösung feststellen. Zu diesem Zweck werden 5 ml Kulturflüssigkeit mit 1,5 g Natriumchlorid, 1 ml 0,l%iger Ferrisulfatlösung und 5 ml Benzylalkohol 5 Minuten geschüttelt, abzentrifugiert, die organische Phase filtriert und die Extinktion der organischen Phase bei 410 ΐημ bestimmt. Als Vergleichsprobe dient ein auf gleiche Weise hergestellter Extrakt aus unbeimpfter Nährlösung.

Bei Beendigung der Züchtung kann man pro Liter 1 g Ferrichlorid zur Nährlösung zugeben, wobei das vorliegende Desferricoprogen in Coprogen übergeführt wird. Der Eisenzusatz kann auch zu einem beliebigen anderen Zeitpunkt der Fermentation oder auch gestaffelt erfolgen. Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, vorzugsweise in Gegenwart eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo-Supercel, wonach die Hauptmenge des Coprogens im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel haften. Es ist daher vorteilhaft, dieses gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beispielsweise Wasser oder wäßrige Alkohole, wie wäßriges Methanol.

Für die Isolierung von Coprogen aus dem Kulturfiltrat kann man nach an sich bekannten Methoden vorgehen und z. B. eine der nachfolgend angegebenen Arbeitsweisen oder Kombinationen davon anwenden.

1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B. Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Frankonit, Fullererde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmäßig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser,

z. B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol-Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Frankonit- oder Noritadsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Volumteile) und Pyridin (1 Volumteil) erwiesen.

2. Weiter kann das Coprogen einer wäßrigen Lösung mittels organischer Lösungsmittel entzogen werden. Für diese Extraktionsverfahren haben sich höhere organische Alkohole, z. B. Benzylalkohol oder Isopropylalkohol, besonders bewährt. Zweckmäßigerweise wird dabei der wäßrigen Phase ein anorganisches Salz, z. B. Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, zugesetzt. Aus den erhaltenen organischen Extrakten kann das Coprogen entweder durch Abdampfen des Lösungsmittels oder durch Ausfällung mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z. B. Äther, Petroläther oder Äthylacetat, in angereicherter Form erhalten werden.

3. Eine weitere Methode der Anreicherung des Coprogens besteht darin, daß man es zwischen einer wäßrigen Lösung und einer Lösung von Phenol in Chloroform verteilt, wobei der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden kann.

4. Eine andere Methode zur Anreicherung und/oder Auftrennung des Coprogens stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z. B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silicagel, Calciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel, Celite u. dgl. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex-50, Amberlite IRC-50 u. dgl.

5. Weiter kann das Coprogen durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgendes Lösungsmittelsystem hat sich dabei besonders bewährt: n-Butanol—Benzylalkohol— 0,001 η-Salzsäure—wäßrige, bei 19°C gesättigte Natriumchloridlösung (9 : 9 : 15 : 5).

Desferricoprogen wird neben Coprogen gebildet und kann daher auch direkt aus dem Kulturnitrat isoliert werden, wenn man nach Beendigung der Fermentation keine Eisensalze zugibt. Vorteilhaft entfernt man sogar bei der Isolierung im Kulturfiltrat vorhandenes Eisen, beispielsweise durch Zusatz eisenkomplexbildender Stoffe, z. B. 8-Oxychinolin.

Man kann die eisenkomplexbildenden Stoffe direkt nach Beendigung der Fermentation der Kulturbrühe zusetzen. Vorteilhaft erfolgt der Zusatz in einem späteren Stadium der Aufarbeitung, um allfällige, durch die benutzten Agenzien eingeschleppte Eisen(III)-ionen ebenfalls zu entfernen.

Die Isolierung des Desferricoprogens aus der Kulturlösung erfolgt nach den für die Isolierung von Coprogen erwähnten Methoden.

Wie bereits erwähnt, ist Coprogen als Wuchsstoff bekannt und kann als solcher verwendet werden. Desferricoprogen besitzt wertvolle pharmakologische Eigenschaften und kann als Heilmittel benutzt werden. Es ist geeignet, aus dem Organismus Eisen auszuscheiden, indem es dieses in Form des Eisenkomplexes, des Coprogens, bindet. So dient es zur Ausscheidung von Eisen bei der Ablagerung eisenhaltiger Pigmente im Organismus, z. B. bei Hämochromatose und Hämosiderose, sowie Lebercirrhose.

Die pharmazeutischen Präparate enthalten Desferricopro'gen in Mischung mit einem organischen oder anorganischen pharmazeutischen Träger, der für die enterale oder parenterale Anwendung geeignet ist. Die Präparate werden aus dem Ausgangsmaterial nach den üblichen Methoden hergestellt. Geeignete Träger sind Substanzen, die mit Desferricoprogen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Laktose, Glukose, Natriumchlorid, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Cholesterin und andere bekannte medizinische Träger.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Der Stamm Penicillium citrinum M 3614 wird in gut belüfteter Submerskultur bei 27° gezüchtet.

Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Glukose, 5 g L-Asparagin, 1 g sek.-Kaliumphosphat, I g krist. Magnesiumsulfat (MgSO4, 7 H2O) und 0,5 g Calciumchlorid enthält. Der Gehalt des Leitungswassers an Eisen beträgt 20 bis 30 y/1. Die Nährlösung wird 20 Minuten bei 120° sterilisiert. Geimpft wird mit einer Sporensuspension, die 150 bis 180 Millionen Sporen pro Liter enthält.

Nach 6 bis 10 Tagen wird den Kulturen 1 g Ferrichlorid pro Liter zugesetzt und unter Zusatz von 2% Hyflo Supercel filtriert. Dem Kulturfiltrat werden nun pro Liter 10 g Natriumchlorid zugefügt, dann wird es mit Vs Volumen Chloroform—Phenol (1 Volumteil : 1 Gewichtsteil) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, durch Celit filtriert, mit 4 Volumen Äther versetzt und 4- bis 5mal mit destilliertem Wasser ausgezogen (bis zur vollständigen Entfärbung der organischen Phase). Die wäßrigen Auszüge werden mit Äther von Resten an Phenol befreit und lyophilisiert. Aus 10 1 Kultur werden 2,48 g rohes Lyophilisat erhalten.

2,48 g Rohextrakt werden einer Craig-Verteilung über 50 Stufen unterzogen. Als Verteilungssystem verwendet man ein Gemisch aus 1,8 1 n-Butanol, 1,8 1 Benzylalkohol, 3 1 0,001 η-Salzsäure und 11 gesättigter wäßriger Kochsalzlösung. Eine tiefbraune Verbindung sammelt sich dabei in den Fraktionen 2 bis 8 an, eine rotbraune Substanz in den Fraktionen 25 bis 38 (K = 1,32).

Die Fraktionen 25 bis 38 werden vereinigt, mit dem gleichen Volumen Äther versetzt, die wäßrige Phase abgetrennt und die Ätherschicht noch dreimal mit Wasser ausgezogen. Der Farbstoff geht dabei vollständig in die wäßrige Phase. Diese wird mit 10% Natriumchlorid versetzt und mehrmals mit Phenol—Chloroform (1 kg auf 11) ausgeschüttelt. Die tiefbraunroten trüben Auszüge werden an einer Celitsäure geklärt, mit dem doppelten Volumen Äther versetzt und das Sideramin wieder in Wasser aufgenommen. Die mit Äther gewaschenen wäßrigen Auszüge dampft man im Vakuum ein. Es bleiben 600 mg eines etwas schmierigen braunroten Rückstandes zurück. Zur weiteren Reinigung wird eine zweite Craig-Verteilung im gleichen Lösungsmittelsystem über 160 Stufen durchgeführt. Aus den Fraktionen 100 bis 119 gewinnt man das Coprogen, wie oben beschrieben. Durch Umfallen aus Methanol—Äther erhält man 400 mg eines feinen rotbraunen amorphen Pulvers, das papierchromatographisch einheitlich ist.

Aus den Fraktionen 2 bis 8 der ersten Verteilung isoliert man in gleicher Weise 355 mg von wenig aktiven Nebenkomponenten als braunschwarzes amorphes Pulver, das gemäß Papierchromatographie nicht einheitlich ist.

Die Coprogen der Fraktionen 100 bis 119 zeigt folgende Eigenschaften:

Elementaranalyse: C = 50,18%, H = 6,72%, N = 9,36%, Fe = 6,64%; O (berechnet) = 27,10%.

Absorptionsspektrum im UV und im Sichtbaren in Feinsprit:

m	1	m
213	254	450 ηΐμ
2,72	2,34	1,50

log Eil

Das IR-Spektrum zeigt unter anderem Banden bei 3415, 2922, 1730, 1724, 1660, 1539, 1457, 1377,

1330, 1279, 1236, 1223, 1143, 1110, 1023, 945, 922, 839cm-¹ (vgl. Fig. 1).

Das papierchromatographische Verhalten
Coprogen ist im Vergleich zu dem anderer
Sideramine in der Tabelle zusammengestellt:

Tabelle

von Pilz-

Sideramin	Rf(D	Rf (II)
Ferrichrom Ferrichrysin Ferricrocin Ferrirhodin Coprogen Ferrirubin	0,28 0,26 0,29 0,43 0,43 0,42	0,30 0,34 0,28 0,88 0,55 0,73

15

System I
n-Butanol—Eisessig—Wasser 4:1:1.

System II

tert.-Butanol—Wasser—gesättigte Natriumchloridlösung—0,1 n-Salzsäure 50 : 25 : 25 : 1. Papier imprägniert mit Aceton — Wasser — gesättigtes Natriumchlorid 6:5:1 (V/V/g) und an der Luft 15 Minuten getrocknet.

Das gleiche Produkt wird erhalten, wenn man den Stamm Penicillium camemberti M 98, Penicillium urticae 4277, Penicillium notatum 1613 oder Penicillium chrysogenum 4360 züchtet und das Kulturfiltrat wie beschrieben aufarbeitet.

Beispiel 2

69 mg Coprogen werden in 5 ml Wasser gelöst und 100 mg 8-Hydroxychinolin in etwa 1 ml Methanol zugefügt. Unter stetem Rühren wird das Gemisch 16 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Darauf wird vom schwarzen Niederschlag

(Hydroxychinolin—Eisenkomplex) mit Hilfe von Celit abfiltriert und die klare, blaßbräunliche Lösung mehrmals mit Chloroform ausgeschüttelt, um das überschüssige Reagens zu entfernen. Die wäßrige Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand aus Methanol mit viel Äther umgefällt. Das Reaktionsprodukt fällt als blaßbräunliches Pulver an. Das NMR-Spektrum dieser Verbindung ist in Fig. 2 wiedergegeben.

Beispiel 3

5 mg eisenfreies Coprogen werden mit je 1 ml Wasser und konzentrierter Salzsäure 5 Stunden auf 110° erhitzt und das Hydrolysegemisch im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in 5 ml Feinsprit gelöst und in Gegenwart von 10 mg Platinoxyd in einer Wasserstoffatmosphäre magnetisch gerührt, um Hydroxylaminogruppen zu Aminogruppen zu reduzieren. Dann wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Eine papierchromatographische Untersuchung des Rückstandes mit dem Fließmittel Phenol—Wasser (8 : 2) und Anfärben mit Ninhydrin zeigt die Anwesenheit von Ornithin als einzigem ninhydrinpositivem Spaltstück.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Die Verwendung von Penicillium citrinum M 3614, Penicillium camemberti M 98, Penicillium urticae 4277, Penicillium notatum 1613 und/oder Penicillium chrysogenum 4360 zur Herstellung der Wuchsstoffe Coprogen und/oder Desferricoprogen durch übliche biologische Züchtung, Gewinnung der. Wuchsstoffe aus dem Kulturfiltrat, gegebenenfalls nachträgliche Abspaltung von Eisen aus Coprogen mittels Mineralsäuren, starker Alkalien oder eisenkomplexbildender Substanzen und Reindarstellung der Verbindungen.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 123 436.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   409 759/361 12.64 θ Bundesdruckerei Berlin