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Verfahren zur Herstellung neuer Wuchsstoffe
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EMI1.2
EMI1.3
989,975, 935,810, 750 cm-, s. Fig. 3. Multiple Verteilung, Papierchromatographie und Papierelek - trophorese : vgl. Tabelle 1, Fig. 4 und Fig. 5.
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EMI2.2
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HydrolyseFerrioxamin A gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin A wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin A ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin A zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit andern Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grün-
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wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin C ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin C zurückgeführt werden.
Es re-
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ren Ferrioxamine D,D und E, die in den Systemen V und VI grössere Rf-Werte als 0,5 und Verteilungskoeffizienten über 1 aufweisen, verhalten sich bei der Elektrophorese und Titration als neutrale Verbindungen (vgl. Tabelle 1, Fig. 4 und Fig. 5). Ferrioxamin D, das bei der Ionenaustauschchromatographie als die am schnellsten wandernde Substanz aus einer einheitlich erscheinenden Bande isoliert wird (vgl.
Fig. 8) lässt sich durch einfache Verteilung zwischen Chloroform und Wasser in das lipophilere, aus Me- thanol-Äther in länglichen Prismen kristallisierende Ferrioxamin D und das nur in sehr geringer Menge anfallende Ferrioxamin D2 auftrennen. Ferrioxamin D ist gut löslich in Wasser, Methanol, Äthanol, Eis- essig, Methylcellosolve und Chloroform, schwer löslich in Äther, Aceton, Essigester, Pyridin und Dimethylformamid. Es kristallisiert aus Methanol-Äther in roten Nadeln. F. nach dreimaliger Kristallisation 194 - 2000. Rf im Lösungsmittelsystem I : 0, 73, Rf im Lösungsmittelsystem V: 0,72 (vgl. Tabelle 1).
Verteilungskoeffizient im System VI : 1, 80 (vgl. Tabelle 1). Elektrophorese vergleiche Fig. 5. Mikro-
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EMI3.3
dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin D ist farblos. Es kann mir Ferrichlorid in Ferrioxamin Dl zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit andern Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
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: Das IR-Spektrum(w), 13,22 (w), vgl. Fig. 16.
Rf im Lösungsmittelsystem I : 0, 64, Rf im Lösungsmitte]system V: 0,68 (vgl. Tabelle 1). Papierelektrophorese vergleiche Fig. 5.
Ferrioxamin E, das ein differenzierteres IR-Spektrum als die übrigen Ferrioxamine besitzt (vgl.
Pig. 14), unterscheidet sich von diesen auch durch seine schlechte Löslichkeit in Wasser und Methanol.
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EMI3.6
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Ferrioxamin E gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin E wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin E ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin E zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit andern Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des
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Ferrioxamin F, das gemäss seinem Verhalten bei der Papierchromatographie und bei der Gegenstromverteilung auch zu der lipophilen Gruppe (D,D , E) gehört, zeigt jedoch im Gegensatz zu D1, D2 und E basische Eigenschaften und wird als Hydrochlorid isoliert (vgl. Fig. 4 und Fig. 5).
Ferrioxamin F-Hydrochlorid ist gut löslich in Wasser, Methanol, Pyridin, Eisessig, Äthanol, Dimethylformamid ; wenig löslich in Chloroform ; unlöslich in Essigester, Aceton und Äther. Mikroanalyse :
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EMI3.10
Ferrioxamin F gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin F wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin F ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin F zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit andern Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind charakteristische physikalische Daten der bisher isolierten Ferrioxamine vergleichsweise zusammengestellt.
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Tabelle 1
EMI4.1
<tb>
<tb> Ferri- <SEP> Papier <SEP> Papierchromato- <SEP> Multiple <SEP> Extinktion <SEP> Titration
<tb> oxamin <SEP> elektro-graphie <SEP> Verteilung <SEP> bei <SEP> 430 <SEP> m
<tb> phorcse <SEP> RfI <SEP> RfV <SEP> K <SEP> VI <SEP> E1% <SEP> pKMCS <SEP> Äquiv.
<tb> a) <SEP> b) <SEP> c) <SEP> d) <SEP> lern <SEP> e) <SEP> Gew.
<tb>
A <SEP> 13,6 <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP> 0,21 <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP> 37 <SEP> 9,89 <SEP> 634
<tb> B <SEP> 13,0 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 0,29 <SEP> 0,23 <SEP> 39 <SEP> 9,74 <SEP> 704
<tb> C <SEP> 12, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 54 <SEP> 0,37 <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP> 39 <SEP> 8, <SEP> 88 <SEP> 762
<tb> D <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 0,73 <SEP> 0,72 <SEP> 1,80 <SEP> 44 <SEP> (neutral)
<tb> D2 <SEP> 3,9 <SEP> 0,64 <SEP> 0,48 <SEP> (neutral)
<tb> E <SEP> 3,9 <SEP> 0,68 <SEP> 0,59 <SEP> 1,59 <SEP> 42 <SEP> (neutral)
<tb> F <SEP> 12,5 <SEP> 0,80 <SEP> 3, <SEP> 12 <SEP> 34 <SEP> 9, <SEP> 75 <SEP> 695
<tb>
a) cm Laufstrecke in 0,33 N Essigsäure, nach 4 1/2 h bei 220 V.
Vergleichsweise wandert Fruktose 3, 9 cm. b) Rf I : Rf-Wert im System I : n-Butanol-Eisessig-Wasser (4 : 1 : 5). c) Rf V : Rf-Wert im System V: tert.-Butanol-Wasser-gesättigte wässerige Natriumchloridlösung- 0, In-Salzsäure (50:25:25:1). Papier imprägniert mit Aceton-Wasser-gesättigte wässerige Natriumchloridlösung (6:3:1). d) K VI : Verteilungskoeffizient im System VI :n-Butanol-Benzylalkohol-Wasser-gesättigte wässerige Natriumchloridlösung-0,1n-Salzsäure (200:100: 300 : 60 : 3). Verteilung von 10 mg über 34 Stufen von je 3 cm3 organischer und wässeriger Phase bei 23 - 250. Auswertung durch Extintkionsmessung (2 cm3 der mit Alkohol auf. 10 cm3 verdünnten Fraktionen) bei 425 mfl. e) W.
Simon et al., He. lv. 37 [1954], S. 1872.
In Tabelle 2 sind vergleichsweise chemische und physikalische Daten für Ferrioxamin B und verwandte Wuchsstoffe-sowie einige Sideramycin-Antibiotika (Grisein A, Albomycin und Ferrimycin A) zusammengestellt.
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Tabelle 2
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<tb>
<tb> Substanz <SEP> Analysenwerte <SEP> (%) <SEP> Mol-Gew. <SEP> pK <SEP> *MCSd) <SEP> Absorption <SEP> Nachgewiesene <SEP> Hydro- <SEP> e)
<tb> C <SEP> H <SEP> N <SEP> Cl <SEP> Fe <SEP> #max <SEP> E1%1cm <SEP> lysenprodukte
<tb> Ferrimycin <SEP> A <SEP> 1) <SEP> 48,65 <SEP> 7,09 <SEP> 12,95 <SEP> 6,10 <SEP> 4,56 <SEP> 1106 <SEP> a) <SEP> 4,18 <SEP> ; <SEP> 7,86 <SEP> 228 <SEP> 282 <SEP> NH3, <SEP> Bemsteinsäure, <SEP> (0,83)
<tb> 319 <SEP> 28, <SEP> 2 <SEP> 1-Amino-5-hydroxyl-
<tb> 425 <SEP> 22,6 <SEP> amino-pentan, <SEP> #-Aminovaleriansäure, <SEP> Cadaverin, <SEP> krist. <SEP> Substanz
<tb> mit <SEP> #max <SEP> 227 <SEP> und
<tb> 323 <SEP> m , <SEP> Prolin <SEP> und
<tb> nicht <SEP> identifizierte
<tb> Ninhydrin-positive
<tb> Substanzen.
<tb>
Grisein <SEP> A <SEP> 2) <SEP> 43, <SEP> 95 <SEP> 5, <SEP> 65 <SEP> 12, <SEP> 97 <SEP> 5, <SEP> 14 <SEP> 1034 <SEP> a) <SEP> 265 <SEP> 108 <SEP> Methyluracil,
<tb> 420 <SEP> 28, <SEP> 9 <SEP> Glutaminsäure
<tb> Albomycin <SEP> 3) <SEP> 4,16 <SEP> 1270 <SEP> Serin,
<tb> 1346 <SEP> Ornithin
<tb> Ferrioxamin <SEP> B- <SEP> 48, <SEP> 04 <SEP> 7, <SEP> 41 <SEP> 11,21 <SEP> 5,25 <SEP> 7,67 <SEP> 704 <SEP> a) <SEP> 9,74 <SEP> 430 <SEP> 39,0 <SEP> NH3, <SEP> Bemsteinsäure, <SEP> (1, <SEP> 2)
<tb> Hydrochlorid <SEP> l-Amino-5-hydroxylamino-pentan, <SEP> Cadaverin, <SEP> ö-Aminovaleriansäure, <SEP> Hydroxylamin, <SEP> kein <SEP> Glyzin, <SEP>
<tb> Ornithin <SEP> oder <SEP> Serin
<tb> Ferrichrom <SEP> 4) <SEP> 44,02 <SEP> 5,90 <SEP> 16,55 <SEP> 7,35 <SEP> 725 <SEP> c) <SEP> 425 <SEP> 39, <SEP> 4 <SEP> NH3'Glycin, <SEP> Ornithin <SEP> 2, <SEP> 89
<tb> Ferrichrom <SEP> A <SEP> 4) <SEP> 44,
75 <SEP> 5,80 <SEP> 11,18 <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 1100 <SEP> cl-440 <SEP> 33,8 <SEP> Serin, <SEP> Glycin, <SEP> Ornithin <SEP> 3,01
<tb> Coprogen <SEP> 5) <SEP> 50, <SEP> 96 <SEP> 6,83 <SEP> 10,26 <SEP> 6, <SEP> 61 <SEP> 440 <SEP> 36, <SEP> 6
<tb>
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a) durch Titration b) gemäss Fe-, SO-und NH-Gehalt c) durch zwei unabhängige Methoden ermittelt d) W. Simon, E. Kovats, L. H. Chopard-dit-Jean & E. Heilbronner, Helv. 37 [1954], S. 1872 e) kolorimetrisch nach Csaki 6) bestimmte"Hydroxylamin-Werte"pro Atom Fe. Die in Klammern angegebenen Werte sind unkorrigiert.
1) Patentanmeldung Nr. A 4042/60 (Case 4287/1+2/E)
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Die Salze der basischen Ferrioxamine A, B, C und F leiten sich von den bekannten anorganischen und organischen Salzen ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und Phosphorsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin-oder Ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von Ferrioxaminsulfat mit pantothensaurem Calcium oder durch Anionenaustausch an einem Ionenaustauscher, beispielsweise von Ferrioxaminchlorid an einem stark basischen Ionenaustauscher, wie IRA-400 in der Sulfat-Form.
Die Ferrioxamine besitzen wacl1stumsfördernde Eigenschaften für eine grosse Zahl von Organismen.
So besitzen sie einen solchen Effekt auf Bacillus subtilis, Micrococcus pyogenes var. aureus, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago sphaerogena und Chlamycomonas eugametos. Als Beispiel sind in der Tabelle drei Ergebnisse von Versuchen mit Ustilago sphaerogena (Brandpilz) und mit Chlamycomonas eugametos (Grünalge) zusammengefasst, wobei ein angereichertes Präparat von Ferrioxamin B verwendet wurde :
Tabelle 3
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<tb>
<tb> Relatives <SEP> Wachstum <SEP> im <SEP> Vergleich <SEP> zu <SEP> einer <SEP> unbehandelten <SEP> Kontrolle
<tb> Ferrioxamin <SEP> B-Zusatz <SEP> (y/cm)
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP>
<tb> Ustilago <SEP> sphaerogena
<tb> (24 <SEP> Stunden-Kultur) <SEP> 1000/0 <SEP> 540% <SEP> 4051o <SEP> 247% <SEP> 158% <SEP> 111% <SEP>
<tb> Chlamydomonas
<tb> eugametos
<tb> (4 <SEP> Tage-Kultur) <SEP> 100% <SEP> 280% <SEP> 271% <SEP> 138% <SEP> 98% <SEP> 98%
<tb>
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B. Vertretergonisierende Wirkung des Ferrioxamins B gegenüber verschiedenen Antibiotika ist aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich. Als Testorganismen wurden verwendet : Escherichia coli, Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.
Die zu prüfenden Antibiotika wurden im modifizierten Test nach Bonifas, der unten beschrieben ist, gegen Ferrioxamin B (1 mg/ml) geprüft.
Tabelle 4
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<tb>
<tb> Enthemmung <SEP> der <SEP> Testorganismen
<tb> Antibiotika <SEP> Bacillus <SEP> Staphylococcus <SEP> Escherichia
<tb> subtilis <SEP> aureus <SEP> coli
<tb> Ferrimycin <SEP> kompetitive <SEP> kompetitive <SEP> < & <SEP> 1)
<tb> Grisein
<tb> (40 <SEP> 000 <SEP> lE/mg) <SEP> kompetitive <SEP> kompetitive <SEP> keine
<tb> Albomycin <SEP> kompetitive <SEP> kompetitive <SEP> keine
<tb> A <SEP> 1787 <SEP> kompetitive <SEP> kompetitive <SEP> keine
<tb> A <SEP> 22765 <SEP> 2) <SEP> kompetitive <SEP> kompetitive <SEP> zip
<tb> Neomycin <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine
<tb> Streptomycin <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine
<tb> Streptothricin <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine
<tb> Viomycin <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine
<tb> Penicillin <SEP> keine <SEP> keine <SEP> 0
<tb>
1) 0 bedeutet,
dass das betreffende Antibiotikum gegen diesen Testor- ganismus fast keine Wirkung zeigt.
2) Stamm S. aureofaciens Duggar A 22765. Weitere in der Tabelle nicht aufgeführte, durch Ferrioxamine nicht beeinflusste Antibiotika sind :
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Cycloserin, Cinerubine, Desertomycin, Erythromycin, Exfoliatin, Granaticin, Holomycin, Lcucomycin, Megacidin, Methymycin, Narbomycin, Novobiocin, Oleandomycin, Oxytetracyclin, Pikromycin, Rhodomycin, Spiramycine, Streptogramin, Tetriomycine und Thiolutin.
Die Antisideramycin-Wirkung in vitro der Ferrioxamine eignet sich gut für eine qualitative Erkennung und quantitative Bestimmung der Ferrioxamine, indem der an und für sich zur Bestimmung von synergistisch wirkenden Substanzen ausgearbeitete Test von Bonifas (V. Bonifas, Experientia 8 [1952], S. 234) sinngemäss angewendet werden kann. Dazu werden Testplatten, z. B. Petrischalen, die eine Schicht eines geeigneten Agarnährbodens enthalten, mit Bacillus subtilis Cohn emend. Prazmowski oder Staphylococcus aureus Rosenbach beimpft. Auf die Agarschicht werden Streifen von Filtrierpapier (5 mm breit), z. B. von WhatmanNr. l-Papier, die mit einer Lösung eines Sideramycin-Antibiotikums, z. B. einer Lösung von 10 y/ml Ferrimycin in Methanol, getränkt sind, aufgelegt.
Senkrecht dazu werden darüber Streifen gleicher Breite gelegt, die mit der auf Ferrioxamin B-Gehalt zu testierenden Lösung getränkt sind. Nach einer 9- bis 15stündigen Bebrütung bei 360C ist eine Beeinflussung der antibiotischen Wirkung des Ferrimycins leicht zu erkennen : Im Hemmhòf, welcher sich aus den Streifen mit dem Antibiotikum bildet, entsteht an der Kreuzung der beiden Streifen eine keilförmige Einschnürung, deren Form und Dimensionen unter Standardbedingungen zur quantitativen Bestimmung der Ferrioxamine verwendet werden (vgl.
Fig. 10). Wenn eine Lösung sowohl Ferrioxamin als auch Ferrimycin enthält, muss sie 30 min bei neutralem PH auf 600 erhitzt werden. Dadurch wird die antibiotische Wirkung des Ferrlmycins zerstört, während die Ferrioxaminwirkung erhalten bleibt und folglich quantitativ bestimmt werden kann.
Im Antisideromycintest erwies sich B von allen Ferrioxaminen als das wirksamste. Mit Staphylo-
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Vitamincharakter für Arthrobacter terregens und Arthrobacter flavescens den Ferrioxaminen. Hingegen ist die oben geschilderte, für die Ferrioxamine typische, wachstumsfördernde Wirkung auf Bacillus subtilis, Micrococcus pyogenes, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago sphaerogena und Chlamydomonas eugametos für die drei Substanzen Ferrichrom, Terregens Faktor und Coprogen nicht bekannt. Es ist auch nichts über einen antagonistischen Effekt dieser Substanzen auf die antibakterielle Aktivität der Sideramycin-Antibiotika bekannt.
Bei der Papierchromatographie unterschiedet sich Ferrichrom beim direkten Vergleich im System V (vgl. Tabelle 1) eindeutig von den Ferrioxaminen B - F, zeigt in diesem System jedoch einen ähnlichen Rf-Wert wie Ferrioxamin A. Dagegen kann es als neutrale Substanz bei der Papierelektrophorese in 0, 33n-Essigsäure leicht vom stark basischen Ferrioxamin A unterschieden werden. Der Terregensfaktor enthält nur Spuren von Eisen und ist somit von sämtlichen aufgeführten Ferrioxaminen verschieden. Coprogen ist an Hand seiner analytischen Daten gut von den Ferrioxaminen A, B, D und E zu unterscheiden.
Das Verhältnis'C/' N beträgt bei Coprogen 4,97, bei den erwähnten Ferrioxaminen 3, 5-4, 3.
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74-4, 78).Ferrioxamine C und F sind jedoch starke Basen, die als Hydrochloride isoliert werden, während Coprogen gemäss den vorliegenden Daten eine neutrale Substanz darstellt (Journ. Amer. Chem. Soc. 74 ze S. 1362).
Die Ferrioxamine, ihre Derivate und Spaltprodukte sowie Salze dieser Verbindungen werden erhalten, wenn man aus pflanzlichen Organismen oder deren Extrakten die neuen Wuchsstoffe nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichtigung der oben angegebenen chemischen und physikalischen Daten und unter Anwendung des Antisideramycintestes isoliert und, wenn erwünscht, Salze, Derivate oder Spaltprodukte der neuen Verbindungen herstellt.
Die Ausgangsstoffe für die Gewinnung der Ferrioxamine sind z. B. höhere Pflanzen, wie Dicotyledoneae, z. B. die Gattung Solanaceae, beispielsweise Solanum lycopersicum, oder die Gattung Umbelliferae, beispielsweise Daucus carota L. und Monocotyledoneae, z. B. Commelinaceae, wie Rheoe discolor, ferner Algen-Kult. uren, z. B. von Chlamydomonas eugametos, oder vor allem Kulturen von Mikroorganismen, z. B. von Vertretern der Gattung Streptomyces, von Bakterien, z. B. von B. subtilis oder von Saccharomyces cerevisiae. Die Antisideramycin-Wirkung kann man im rohen Extrakt oder Kulturfiltrat an Hand des oben erwähnten Testes erkennen.
Eine besonders bevorzugte Quelle sind Kulturen von Streptomyceten, die an Hand der von Ettlinger et al. (Arch. Mikrobiol. 3 [1958], S. 326) vorgeschlagenen Merkmale den folgenden Arten zugeordnet werden : Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici, Streptomyces galilaeus Ettlinger et al., Streptomyces pilosus Ettlinger et
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(Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces aureofaciens Duggar, Streptomyces olivaceus (Waksman) Waksman et Henrici, Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces glaucescens Gause et al.
Aus der folgenden Tabelle sind die artbestimmenden Merkmale der Ferrioxamine bildenden Streptomycetenstämme ersichtlich.
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Tabelle 5
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<tb>
<tb> Merkmale <SEP> Morphologie <SEP> der <SEP> Farbe <SEP> des <SEP> Morphologie <SEP> des <SEP> Luftmycels <SEP> Melanoides
<tb> Art <SEP> Sporen <SEP> Luftmycels <SEP> Pigment
<tb> S. <SEP> griseoflavus <SEP> (Krainsky) <SEP> Sporen <SEP> mit <SEP> kurzen <SEP> Stacheln <SEP> aschgrau <SEP> Sporenketten <SEP> mit <SEP> offenen <SEP> regelmässigen <SEP> fehlt
<tb> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici <SEP> Spiralen, <SEP> oft <SEP> mehr <SEP> als <SEP> 6 <SEP> Windungen
<tb> S. <SEP> pilosus <SEP> Ettlinger <SEP> et <SEP> al. <SEP> Sporen <SEP> mit <SEP> feinen <SEP> zerbrech-aschgrau <SEP> Sporenketten <SEP> mit <SEP> offenen <SEP> regelmässigen <SEP> vorhanden
<tb> lichen <SEP> Haaren <SEP> Spiralen, <SEP> meist <SEP> mehr <SEP> als <SEP> 6 <SEP> Windungen
<tb> S.
<SEP> viridochromogenes <SEP> Sporen <SEP> mit <SEP> kurzen <SEP> Stacheln <SEP> hellblau <SEP> Sporenketten <SEP> mit <SEP> offenen <SEP> regelmässigen <SEP> vorhanden
<tb> (Krainsky) <SEP> Waksman <SEP> et <SEP> Spiralen, <SEP> oft <SEP> mehr <SEP> als <SEP> 6 <SEP> Windungen
<tb> Henrici
<tb> S. <SEP> olivaceus <SEP> (Waksman) <SEP> glatt <SEP> aschgrau <SEP> Sporenketten <SEP> monopodial <SEP> verzweigt, <SEP> fehlt
<tb> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici <SEP> gerade <SEP> oder <SEP> gewellt
<tb> S. <SEP> aureofaciens <SEP> Duggar <SEP> glatt <SEP> aschgrau <SEP> Sporenketten <SEP> monopodial <SEP> verzweigt, <SEP> fehlt
<tb> mit <SEP> unregelmässigen <SEP> offenen <SEP> Spiralen
<tb> S. <SEP> galilaeus <SEP> Ettlinger <SEP> glatt <SEP> aschgrau <SEP> Sporenketten <SEP> monopodial <SEP> verzweigt, <SEP> vorhanden
<tb> et <SEP> al.
<SEP> lange <SEP> gerade <SEP> Hauptachse, <SEP> offene
<tb> regelmässige <SEP> Spiralen, <SEP> meist <SEP> mehr <SEP> als
<tb> 6 <SEP> Windungen
<tb> S. <SEP> lavendulae <SEP> (Waksman <SEP> glatt <SEP> blasskarmin-zimtbraun <SEP> Sporenketten <SEP> mit <SEP> offenen, <SEP> unregel-vorhanden
<tb> et <SEP> Curtis) <SEP> Waksman <SEP> et <SEP> mässigen <SEP> Spiralen <SEP> an <SEP> den <SEP> Enden <SEP> langer
<tb> Henrici <SEP> gerader <SEP> Stücke
<tb> S. <SEP> polychromogenes <SEP> glatt <SEP> blasskarmin-zimtbraun <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder <SEP> gewellt <SEP> fehlt
<tb> Hagemann <SEP> et <SEP> al.
<tb>
S. <SEP> griseus <SEP> Waksman <SEP> et <SEP> glatt <SEP> gelblich-grünlichgrau <SEP> Sporenketten <SEP> gewellt, <SEP> sympodial <SEP> fehlt
<tb> Henrici <SEP> verzweigte <SEP> Büschel <SEP> ohne <SEP> Spiralen
<tb>
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5. Eine weitere Methode der Anreicherung der Ferrioxamine besteht darin, dass man sie zwischen einer wässerigen Lösung und einer Lösung von Phenol in Chloroform verteilt, wobei sowohl das PH der wässerigen Lösung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten von Ferrioxaminen das Verhältnis von Konzentration in der organischen
Phase zur Konzentration in der wässerigen, so ergibt sich, dass der Verteilungskoeffizient mit steigendem
Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem PH der wässerigen Phase abnimmt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten von Ferrioxaminen in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Verteilungsoperationen einen Grossteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.
6. Eine andere Methode zur Anreicherung und/oder Auftrennung der Ferrioxamine stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z. B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silicagel, Calciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel, Celite u. dgl., als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an Ionenaustauscherharzen, z. B. an Dowex 50. Amberlite IRC-50 u. dgl.
7. Weiter können die Ferrioxamine durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgende Lösungsmittelsysteme haben sich dabei besonders bewährt : a) Benzylalkohol - 20%ige wässerige Lösung von Ammoniumsulfat. b) n-Butanol (100 Vol.-Teile)-Benzylalkohol (200 Vol. -Teile - ln-Salzsäure (6 Vol. -Teile) - Wasser (300 Vol. -Teile) - wässerige, bei 190 gesättigte Natriumchloridlösung (60 Vol.-Teile).
8. Schliesslich eignet sich die präparative Elektrophorese an einer Säule mit Trägermaterial gut zur Reinigung, Anreicherung und Auftrennung von Ferrioxamin-Präparat. Diese wird als Hochspannungselektrophorese bei 500 - 4000 Volt durchgeführt. Eine weitere Verbesserung besteht darin, dass man dieses Verfahren nach dem sogenannten Gegenstromprinzip durchführt. Dabei werden die als Kationen vorliegenden Ferrioxamine A, B, C und F auf der Trägersäule örtlich festgehalten, indem man ihre durch das elektrische Feld hervorgerufene Bewegung mittels einer in entgegengesetzter Richtung verlaufenden Strömung des Elektrolyts genau kompensiert. Dadurch wird erreicht, dass Stoffe mit anderer elektrischer Beweglichkeit die Trägersäule an den beiden Elektrodenenden verlassen.
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Fig. 1 zeigt eine Gegenstromverteilung von rohem Ferrioxamin über 80 Stufen mit je 100 cm organischer und 100 cm3 wässeriger Phase im System n-Butanol-Benzylalkohol-gesättigte wässerige Kochsalz- lösung-N-Salzsäure (100 : 200 : 300 : 60 : 6). Extinktion bei 425 mg. Antisideramycinaktivität in mm (abgeänderter Bonifas-Test). Fig. 2 zeigt im Chromatogramm von Fraktion m von Fig. 1 an Dowex 50-WX mit Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel. Fig. 3 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin B
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in Nujol.
Fig. 4 zeigt im Papierchromatogramm der Ferrioxamine im System tert.-Butanol-Wasser-ge- sättigte wässerige Natriumchloridlösung-O, ln-Salzsäure (50 : 25 : 25 : 1), Papier imprägniert mit Aceton-Wasser-gesättigte wässerige Natriumchloridlösung (6 : 3 : 1). Fig. 5 zeigt Papierelektrophorese der Ferrioxamine cm Laufstrecke in 0, 33 N Essigsäure nach 4 1/2 h bei 220 Volt. Fig. 6 zeigt im Chromato-
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Bonifas-Test. Die schraffierten Flächen zeigen die Hemmung des Wachstums des Testorganismus. Fig. 11 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin A in Kaliumbromid. Fig. 12 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin C in Kaliumbromid. Fig. 13 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin D in Kaliumbromid. Fig. 14 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin E in Kaliumbromid.
Fig. 15 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin F in Kaliumbromid. Fig. 16 zeigt das IR-Spektrum von Ferrioxamin D in Kaliumbromid.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel l : Die Züchtung des Streptomyces pilosus, Stamm NRRL 2857 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Soyamehl und 20 g Mannit enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern 20-30 min bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein pH von 7,2 bis 7,6. Die Beimpfung erfolgt mit bis zu
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je Volumen Lösung pro Minute belüftet werden. Nach 48 - 240 h Bebrütung hat die Kulturlösung den höchsten Gehalt an Ferrioxamin B erreicht.
Man unterbricht die Kultur, gibt 0, 10/0 Ferrichlorid zu, trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Ferrioxamin B enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 10/0 eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird. Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser oder wässerigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem Kulturfiltrat. Das gewonnene Kulturfiltrat wird unter stetem Rühren mit 2% Tonerde, z. B. Frankonit, versetzt. Nach gründlicher Durchmischung filtriert man ab und wiederholt mit dem erhaltenen Filtrat den Absorptionsvorgang l-bis 2mal. Die Filterrückstände werden vereinigt und mehrmals mit Wasser und wässerigem Methanol gewaschen.
Anschliessend werden die Filterrückstände 2-bis 3mal mit einem Pyridin-Wasser-Gemisch (1: 4) eluiert. Das durch Filtration geklärte Eluat wird am Vakuum eingeengt. Die erhaltenen Konzentrate können entweder direkt weiter verarbeitet werden (s. Beispiel 3) oder man kann daraus mittels Gefriertrocknung ein Gemisch der Ferrioxamine in roher Form isolieren.
Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hohem Gehalt an Ferrioxamin B. a) Saccharose 20 g
Natriumcitrat 0,9 g
Ammoniumacetat 3 g sek. Kaliumphosphat 3 g
Magnesiumsulfat 0, 8 g
Kupfersulfat 0, 01 mg
Manganchlorid 0, 07 mg Ferricitrat 20 mg b) Rohglukose 10 g
Soyamehl 10 g
Cornsteep liquor 20 g
Kochsalz 5 g
Natriumnitrat 1 g.
Kalk 10 g
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c) Raps-Extraktionsschrot 20 g
Rohglukose 10 g sek. Kaliumphosphat 0, 2 g
Kalk 10 g d) Flachsmehl 40 g
Rohglukose 10 g sek. Kaliumphosphat 0. 2 g
Kalk 10 g
AnStelle des angegebenen Stammes der ArtStreptomyces pilosus können die folgenden Stämme verwendet werden (unter den angegebenen Stamm-Nummern werden die Stämme in Institut für spezielle Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, aufbewahrt. Nach analoger Züchtung und Aufarbeitung erhält man Kulturfiltrate von ähnlich hohem Ferrioxamingehalt.
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<tb>
<tb>
Stamm <SEP> Nr. <SEP> Streptomyces <SEP> Art
<tb> 9578 <SEP> S. <SEP> griseoflavus <SEP> (Krainsky)
<tb> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb> 15311 <SEP> S. <SEP> griseoflavus
<tb> 11686 <SEP> S. <SEP> pilosus <SEP> Ettlinger <SEP> et <SEP> al.
<tb>
23258 <SEP> S. <SEP> pilosus
<tb> 23305 <SEP> S. <SEP> pilosus
<tb> 17635 <SEP> S. <SEP> viridochromogenes <SEP> (Krainsky)
<tb> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb> 18055 <SEP> S. <SEP> viridochromogenes
<tb> 6445 <SEP> S. <SEP> olivaceus <SEP> (Waksman)
<tb> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb> 7346 <SEP> S. <SEP> olivaceus
<tb> 7437 <SEP> S. <SEP> olivaceus
<tb> 22083 <SEP> S. <SEP> aureofaciens <SEP> Duggar
<tb> 22765 <SEP> S. <SEP> aureofaciens
<tb> 18822 <SEP> S. <SEP> galilaeus <SEP> Ettlinger <SEP> et <SEP> al.
<tb>
14677 <SEP> S. <SEP> lavendulae <SEP> (Waksman <SEP> et
<tb> Curtis) <SEP> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb> 21510 <SEP> S. <SEP> lavendulae
<tb> 21837 <SEP> S. <SEP> polychromogenes <SEP> Hagemann
<tb> et <SEP> al.
<tb>
23217 <SEP> S. <SEP> polychromogenes
<tb> 23310 <SEP> S. <SEP> polychromogenes
<tb> 10112 <SEP> S. <SEP> griseus <SEP> Waksman <SEP> et <SEP> Henrici
<tb> 13495 <SEP> S. <SEP> griseus
<tb> 7419 <SEP> S. <SEP> griseus
<tb>
<Desc/Clms Page number 14>
Beispiel 2 : Der Stamm A 23978 der Art Streptomyces aureofaciens (Institut für spezielle Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich) wird submers gezüchtet auf einer Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Malzextrakt, 20 g Distillers solubles enthält. Die Züchtung und Aufarbeitung erfolgt gleich wie in Beispiel l, wobei Kulturfiltrate mit ähnlich hohem Ferrioxamin-Gehalt erhalten werden.
Beispiel 3 : 60 l Kultur werden in der in Beispiel 1 dargestellten Weise hergestellt und aufgearbeitet. Das gewonnene Pyridin-Wasser-Eluat (zirka 6 l) wird im Vakuum auf 31 eingeengt. In diesem Konzentrat werden 870 g Ammonsulfat gelöst. Die Lösung wird durch Filtration oder Zentrifugation, gegebenenfalls unter Zugabe von 15o Hyflo Supercel, geklärt. Durch 3-bis 4maliges Ausschütteln mit Benzylalkohol oder Isopropylalkohol werden die Ferrioxamine in das organische Lösungsmittel übergeführt.
Die organischen Phasen werden vereinigt und mit Hilfe von Natriumsulfat getrocknet. Man gibt einen Überschuss von Äther oder Äthylacetat zu und filtriert die ausgefällten Ferrioxamine ab. Der Zusatz von Filterhilfsmittel, z. B. Hyflo Supercel, vor der Ausfällung erleichtert die Gewinnung des Niederschlages.
Aus diesem können die Ferrioxamine mit Methanol oder Wasser ausgewaschen werden. Diese Eluate werden eingedampft oder lyophilisiert und man erhält so die Ferrioxamine in angereicherter Form.
Beispiel 4 : Einem gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturfiltrat werden pro Liter 20 g Kochsalz zugefügt. Die klare Lösung wird 3mal mit 1/10 Volumen Chloroform-Phenol-Gemisch (1 Vol. -Teil' Chloroform, 1 Gew.-Teil Phenol) ausgezogen. Die organischen Phasen werden vereinigt, unter Zusatz von Hyflo Supercel filtriert und mit einem Überschuss an Äther versetzt. Durch mehrmaliges Ausschütteln mit wenig Wasser werden die Ferrioxamine in die wässerigen Anteile übergeführt. Die erhaltenen wässerigen Phasen werden vereinigt und zur vollständigen Entfernung des Phenols 2mal mit Äther ausgeschüttelt. Durch Gefriertrocknung gewinnt man ein orange bis braunrotes Präparat von Ferrioxaminen, das durch Papierchromatographie zerlegt werden kann.
Beispiel 5 : 20 l Kulturlösung werden unter Rühren mit 400 g Hyflo Supercel und 200 ml einer lozingen wässerigen Ferrisulfatlösung versetzt und filtriert. Das Filtrat extrahiert man nach Zugabe von 3,6 kg Kochsalz in einem Gegenstrom-Extraktor mit 21 Phenol-Chloroform (l g : l ml), trocknet den
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nischer und 100 ml wässeriger Phase verteilt. Die Auswertung der Verteilung erfolgt durch biologische Testierung und durch Extinktionsmessung bei 425 mu : Jeder vierten Einheit entnimmt man 2 ml oberer und unterer Phase und vermischt diese mit 32 ml Methanol, wobei eine homogene Lösung erhalten wird, deren Konzentration für beide Testierungen geeignet ist (vgl.
Fig. 1). Die gemäss dieser Auswertung in vier Gruppen zusammengefassten Verteilungsfraktionen enthalten, wie sich papierchromatographisch zeigen lässt, neben dem Hauptprodukt Ferrioxamin B (in Verteilungsfraktion III) weitere Antisideramycinwirksame, rotgefärbte Verbindungen, die als Ferrioxamine A, C, D, D, E und F bezeichnet werden.
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Vertcilungs-hauptsächlichstes
<tb> fraktion <SEP> Ferrioxamin
<tb> 6-18 <SEP> II <SEP> A
<tb> 19-32 <SEP> m <SEP> B
<tb> 33-62 <SEP> IV <SEP> C
<tb> 63-80 <SEP> V <SEP> D, <SEP> D <SEP> , <SEP> B <SEP> und <SEP> F
<tb>
Die Verteilungsfraktion III schüttelt man mit 3 l Petroläther.
Die tiefrot gefärbte wässerige Phase wird mit Chloroform gewaschen, mit Kochsalz bis zu einer Konzentration von l o versetzt und mit Phenon-Chloroform (1 g : 1 ml) erschöpfend extrahiert. Den Phenol-Chloroformextrakt wäscht man mehrmals mit lO%o Natriumchlorid enthaltender O. Oln-Salzsäure, filtriert durch eine kleine Säule von 20 g Celite und fällt die Inhaltsstoffe durch Zugabe von 25 g Hyflo Supercel, 500 ml Äther und 11 Petroläther
<Desc/Clms Page number 15>
unter Rühren bei 00. Das pulverige Gemenge aus Filterhilfsmittel und Niederschlag wird gut mit Äther gewaschen und hierauf mit wenig Methanol eluiert. Aus dem Methanoleluat erhält man beim schonenden Eindampfen 982 mg rohes Ferrioxamin B in Form eines braunroten Pulvers.
Die Verteilungsfraktionen II, IV und V werden auf gleiche Weise aufgearbeitet.
Beispiel 7 : Ig eines gemäss Beispiel 6 erhaltenen Präparates von Ferrioxamin B wird in einer mit Kühlmantel versehenen und mit Cellulosepulver gefüllten, vertikalen Glassäule von 1, 5 m Höhe und 2, 6 cm Durchmesser der Zonenelektrophorese nach J. Porath (Biochim. et Biophys. Acta 22 [1956], S. 151) unterworfen. Als Elektrolytlösung dient 1/3n-Essigsäure. Man löst die Substanz in 20 ml Wasser und trägt die tiefrot gefärbte Lösung am oberen Anodenende auf die Säule auf. Die orangerot gefärbte, zirka
10 cm hohe Ferrioxaminzone wandert bei einer Spannung von 1600 Volt und einer Stromstärke von 30 mA mit einer Geschwindigkeit von 3,9 cm/h gegen die Kathode am unteren Säulenende.
Um die Trennwirkung der Säule zu erhöhen, wird diese elektrische Wanderung durch eine entgegengesetzt gerichtete Elektrolytströmung kompensiert, wodurch der wegen seiner Eigenfarbe gut erkennbare Wirkstoff in der Säule örtlich festgehalten wird. Begleitstoffe, die eine grössere bzw. kleinere elektrische Wanderungsgeschwindigkeit als der Wirkstoff haben, werden dabei in den Kathoden-bzw. Anodenraum abgetrieben undaus der Säule entfernt. Nach 5 - 6 Tagen hat der Wirkstoff unter diesen Bedingungen eine Flüssigkeitssäule von 4 bis 5 m Länge durchwandert. Nun bricht man die Elektrophorese ab und eluiert die Säule mit 1/3n-Essigsäure, wobei Fraktionen von je 15 ml aufgefangen werden. Diese werden einzeln untersucht. Die stark rot gefärbten, biologisch aktiven Fraktionen werden vereinigt.
Man setzt 10% Natriumchlorid zu und extrahiert erschöpfend mit einem Gemisch von Phenol-Chloroform (1 Gew. -Teil, 1 Vol. -Teil). Die vereinigten Extrakte werden mit 1/100n-Salzsäure, die 10% Natriumchlorid enthält, mehrere Male gewaschen und darauf durch Celite filtriert. Zum tiefrot gefärbten wasserfreien Filtrat gibt man Filterhilfsmittel (Hyflo Supercel) und versetzt unter Rühren mit dem fünffachen Volumen Äther-Petroläther (l : l), wobei der Wirkstoff auf das Filterhilfsmittel ausgefällt wird. Dieses wird ab filtriert und mit viel Äther gewaschen. Darauf eluiert man die aktive Substanz mit wenig Methanol und dampft die rote Lösung im Vakuum bei 200 zur Trockne ein. Man erhält so ein im Vergleich zum Ausgangsmaterial zweimal angereichertes Präparat des Ferrioxamins B.
Es stellt ein rotes amorphes Pulver dar, das in Wasser, Methanol, Butanol, Benzylalkohol, Phenol, Dimethylformamid und Essigsäure löslich ist und Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Eisen enthält. Es zeigt im übrigen folgende Eigenschaften : pK (66go wässerige Methylcellosolve) = 9, 54 ; Äquivalentgewicht = 645 ; Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei 430 mp
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das fünf ninhydrinpositive Substanzen enthält.
Diese zeigen bei der Papierchromatographie folgende RfWerte :
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<tb>
<tb> Substanz <SEP> Nr. <SEP> Lösungsmittelgemisch
<tb> Phenol-H <SEP> 0 <SEP> (8 <SEP> : <SEP> 2) <SEP> n <SEP> -Butanol-Eisessig- <SEP>
<tb> Wasser <SEP> (4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP>
<tb> 1 <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb>
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Der Ionenaustauscher wird vorher nach Vorschrift von Hirs et al. (J. Bio1.
Chem. 219 [1956], S. 623) gereinigt, in der Ammoniumform durch Sedimentation auf die Säule gebracht und mit 0,2 M Ammoniumacetatpuffer von pH 4, 60 während 48 h bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 200 ml/h äquilibriert.
Die in 9 ml der genannten Pufferlösung auf die Säule aufgetragene Substanz entwickelt man mit 0, 2 MPH 4, 6 Puffer während 72 h (100 ml/h). Hierauf wird das Elutionsmittel unter Verwendung eines 11-
<Desc/Clms Page number 16>
Mischgefässes mit 2 M Ammoniumacetatpuffer von PH 4, 7 kontinuierlich aufkonzentriert (Gradient Elution) und das Eluat kurz vor Austritt der ersten gefärbten Zone in Fraktionen zu 40 ml aufgefangen. Die gemäss Extinktionsmessung bei 425 mtL (vgl. Fig. 2) zusammengefassten Fraktionen extrahiert man in der bereits beschriebenen Weise unter Verwendung von Phenol-Chloroform, Äther-Petroläther-Hyflo Supercel und Methanol.
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<tb>
<tb>
Fraktion <SEP> Menge <SEP> in <SEP> mg <SEP> Substanz
<tb> 13-18 <SEP> 62 <SEP> nicht <SEP> identifiziert
<tb> 93-125 <SEP> 544 <SEP> Ferrioxamin <SEP> B-Hydrochlorid <SEP>
<tb> 185-197 <SEP> 36 <SEP> nicht <SEP> identifiziert
<tb>
Ferrioxamin B ist löslich in Wasser, Methanol, Alkohol, Phenol, Dimethylformamid und Eisessig,
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effizient im System VI : 0,228 (vgl. Tabelle 1).
Ferrioxamin B gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Es lässt sich leicht mit Ferrichlorid-Kaliumferricyanid-Reagens (J. M. Barton et al., Nature 170 [1952], S. 249) oxydieren. Anderseits kann es mit Natriumdithionit unter Entfärbung reduziert werden. Die dabei erhaltenen farblosen Lösungen gewinnen beim Stehen an der Luft rasch ihre ursprüngliche Rotfärbung zurück. Das im Ferrioxamin B gebundene Eisen wird dem Komplex bei der Einwirkung von Mineralsäuren, starken Alkalien oder 8-Oxychinolin entzogen.
Eisenfreies Ferrioxamin B (Desferrioxamin B) ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin zurückverwandelt werden. Auch mit andern Metallionen reagiert Desferrioxamin B unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlich gefärbten. Kupferdesferrioxamins.
Beispiel 9 : 20 mg eines gemäss Beispiel 8 erhaltenen Präparates von Ferrioxamin B werden in 3 ml l, 2n-Salzsäure gelöst und 5 min lang im kochenden Wasserbad erwärmt. Die anfänglich rotbraune Lösung wird dabei fast farblos. Sie wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man löst hierauf den
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len 6n-Salzsäure.
Es konnten die folgenden Substanzen identifiziert werden :
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<tb>
<tb> Substanz <SEP> Rf <SEP> a <SEP> b <SEP> c <SEP> d
<tb> Cadaverin <SEP> 0, <SEP> 12-grauviolett <SEP>
<tb> Fe++ <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP> blassgelb <SEP> - <SEP> tiefrot
<tb> 1-Amino-5-hydroylamino-pentan <SEP> 0, <SEP> 25-grauviolett <SEP> tiefrot <SEP>
<tb> Hydroxylamin <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> - <SEP> - <SEP> blassrot <SEP> violettrot
<tb> unbekannte <SEP> Substanz <SEP> 0, <SEP> 68 <SEP> - <SEP> bläulich <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> Fe' <SEP> 0,84 <SEP> gelb
<tb> unbekannte <SEP> Substanz <SEP> 0, <SEP> 93 <SEP> - <SEP> - <SEP> rot <SEP> - <SEP>
<tb>
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mit Ninhydrin, c) Farbreaktion mit Triphenyltetrazoliumchlorid + Natronlauge, d) Farbreaktion mit dem Reagens nach Czaki. (Alle Reagentien gemäss "Handbuch der Papierchromatographie"von I. M. Hais und K.
Macek, Verlag Gustav Fischer, Jena, 1958).
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Wird bei der Hydrolyse an Stelle von Salzsäure 57% igue Jodwasserstoffsäure (4 h, 110 ) verwendet, so fehlen im Papierchromatogramm Hydroxylamin, l-Amino-5-hydroxylamino-pentan und Fe+++. Dafür ist mehr Cadaverin vorhanden.
Eine zweite Portion Ferrioxamin B wird mit l, 2n-Salzsäure wie oben beschrieben hydrolysiert. Das
Hydrolysengemisch wird anschliessend mit Äther extrahiert. Man trocknet den Extrakt mit Natriumsulfat und dampft ihn ein. Aus dem Rückstand kann Bernsteinsäure in kristalliner Form erhalten werden.
Beispiel 10 : Zu einer Lösung von 450 mg eines gemäss Beispiel 8 erhaltenen Ferrioxamin B-Prä- parates und 450 mg Natriumhydrogencarbonat in Wasser gibt man eine Lösung von 450 mg 2, 4-Dinitro- fluorbenzol in 26 ml Äthanol. Nach 4stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird der Alkohol im
Vakuum abgetrieben. Das überschüssige Reagens wird durch Ausschütteln mit Äther entfernt. Das tief rot- braune Dinitrophenyl-ferrioxamin B lässt sich nun leicht mit n-Butanol ausschütteln (Ferrioxamin B selbst bleibt unter denselben Bedingungen in der wässerigen Phase). Der mit Wasser gewaschene und dann ge- trocknete Butanol-Auszug wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Aceton ausgezogen und die Acetonlösung von einem unlöslichen braunen Rückstand (114 mg) abfiltriert.
Aus der auf zirka 5 ml eingeengten Acetonlösung lässt sich das Dinitrophenyl-ferrioxamin B als amorphes orangerotes Pulver aus- fällen. Ausbeute : 338 mg.
Bei der Papierelektrophorese in verdünnter Essigsäure wandert das Dinitrophenylderivat bei 1000 Volt in 2 h 5,5 cm weit, während Ferrioxamin B unter den gleichen Bedingungen 18,5 cm wandert.
Beispiel 11 : Zur Isolierung der Ferrioxamine A, C, D, D, E und F werden die bei der Gegenstromverteilung von Roh-Ferrioxamin anfallenden Verteilungsfraktionen II, IV und V (vg. Beispiel 6) an
Dowex 50-WX2 (200/400 mesh) mit Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel chromatographiert. Das
Harz reinigt man vorerst nach Vorschrift von Hirs et al. (C. H. W. Hirs, S. Moore, W. H. Stein, J. Biol.
Chem. 219 [1956], S. 623). Es wird in der Ammoniumform durch Sedimentation auf die Säule gebracht und vorgängig der Substanzauftragung während zirka 70 h mit der zur Elution verwendeten Pufferlösung bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 20 ml/cm2/h äquilibriert. Die Substanzen trägt man je nach Lös- lichkeit in l-bis 10% iger Lösung auf die Säule auf und entwickelt die Chromatogramme bei 23 - 250 und bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 5 bis 15 ml/cm2/h mit Ammoniumacetatpuffer von pH 4,5 , in steigender Konzentration (Gradient-Elution).
Die Bewertung der Chromatogramme erfolgt durch Ex- tinktionsmessung der Eluatfraktionen (30-40 ml) bei 425 mj. t. Die entsprecnend zusammengefassten Eluat- fraktionen werden nach Zusatz von 100/0 Kochsalz mit Phenol-Chloroform (1 g : l ml) erschöpfend extrahiert. Die tiefrot gefärbten Extrakte wäscht man ausgiebig mit 100/0 Natriumchlorid enthaltender O. Oln- Salzsäure, filtriert durch eine Schicht von Celite und fällt die Inhaltsstoffe aus den klaren Filtraten durch Zusatz von Äther und Petroläther auf Hyflo Supercel. Das Gemisch von Substanz und Trägerstoff wird zur Entfernung von Phenol mit Äther gewaschen und hierauf mit wenig Methanol eluiert.
Aus den Methanoleluaten erhält man die Ferrioxamine beim schonenden Eindampfen in Form braunroter hygroskopischer Pulver, die für die Analyse während 50 h bei 250/0, 03 mm über Phosphorpentoxyd getrocknet werden.
5 g Fraktion II (vgl. Beispiel 6) werden an einer Dowex 50-WX2 -Säule von 90 cm x 22 cm2 nach dem oben beschriebenen Verfahren chromatographiert (Fig. 3). Pufferlösung bei Beginn : 0, Im-Ammonium- acetat pH 4,5. Durchlaufgeschwindigkeit : 110 ml/h. Volumen der Eluatfraktionen : 35 - 40 ml. Umstellung auf Gradientelution mit Mischkammer von 4 l und l, 75m-Ammoniumacetatpuffer von PH 4, 70 bei Fraktion Nr. 90.
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<tb>
<tb>
Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Gewicht <SEP> in <SEP> mg <SEP> Inhaltsstoffe
<tb> 283-300 <SEP> 302 <SEP> Ferrioxamin <SEP> A-Hydrochlorid
<tb> 301-325 <SEP> 488 <SEP> Ferrioxamin <SEP> B <SEP> + <SEP> A-Hydrochlorid <SEP>
<tb> 326-352 <SEP> 393
<tb> 353-385 <SEP> 452 <SEP> nicht <SEP> näher
<tb> charakterisierte <SEP> Stoffe
<tb> 416-445 <SEP> 415
<tb>
Ferrioxamin A-Hydrochlorid ist ein braunrotes Pulver, das sich in Wasser, Methanol, Äthanol, Eisessig und Dimethylformamid gut löst. Es ist unlöslich in Äther, Aceton, Essigester und Chloroform. Rf
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aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin A ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin A zurückgeführt werden.
Es reagiert auch mit andernMetallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
Beispiel 12 : 5 g Fraktion IV (vgl. Beispiel 6) chromatographiert man an einer Dowex 50-WX2Säule nach dem in Beispiel 11 beschriebenen Verfahren (vgl. Fig. 7). Pufferlösung bei Beginn : 0, 1m- Ammoniumacetat PH 4,5. Durchlaufgeschwindigkeit: 110ml/h. Volumen der Eluatfraktionen : 35-40 ml.
Umstellung auf Gradientelution mit Im-Ammoniumacetat von PH 4,6 bei Fraktion 720, mit 2m-Ammoniumacetat PH 4, 7 bei Fraktion 963 :
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Gewicht <SEP> in <SEP> mg <SEP> Inhaltsstoffe
<tb> 34- <SEP> 46 <SEP> 135
<tb> nicht <SEP> näher <SEP> charakterisierte <SEP> Stoffe
<tb> M-60 <SEP> < <SEP> 6
<tb> 218- <SEP> 284 <SEP> --- <SEP> gelb-grün <SEP> fluoreszierende <SEP> Substanz, <SEP> nicht <SEP> isoliert
<tb> 780-830 <SEP> 430 <SEP> Ferrioxamin <SEP> B <SEP> -Hydrochlorid <SEP>
<tb> 860-900 <SEP> 194 <SEP> Ferrioxamin <SEP> C <SEP> -Hydrochlorid <SEP>
<tb> 1034-1080 <SEP> 360 <SEP> nicht <SEP> näher <SEP> charakterisierte
<tb> Substanz
<tb>
Ferrioxamin C zeigt annähernd gleiche Löslichkeitseigenschaften wie A. Rf im Lösungsmittelsystem I : 0, 54, im Lösungsmittelsystem V : 0,37 (vgl. Tabelle 1).
Papierelektrophorese vgl. Fig. 5, Verteilungskoeffizient im System VI : 0, 489 (vgl. Tabelle. 1).
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:13, 23 Il (m), vgl. Fig. 12.
Ferrioxamin C gibt eine positive Farbreaktion mit Ninhydrin. Die Eisenbindung im Ferrioxamin C wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin C ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin C zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit andern Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des
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Beispiel 13 : 148g Fraktion V (vgl. Beispiel 6) werden vorerst auf einer Säule von 150 cmX79 cm2 vorfraktioniert. Das Chromatogramm entwickelt man bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 bis 3 l/h, während je 24 h mit 0,1m-, 0,2m-, 0,6m- und während 100 h mit 1,8m-Ammoniumacetatpuffer von pH 4, 7. Es werden Fraktionen von 5 1 aufgefangen. Die zusammengefassten Fraktionen 2 - 5 enthalten vorwiegend Ferrioxamine D,D und E (44 g), 48 - 55 hauptsächlich Ferrioxamin F (8, 4 g).
Rechromatographie von Fraktionen 2-5 :
5 g der Fraktionen 2 - 5 chromatographiert man unter den gleichen Bedingungen wie Fraktion II, jedoch ohne Gradientelution (vgl. Fig. 8).
<Desc/Clms Page number 19>
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<tb>
<tb>
Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Gewicht <SEP> in <SEP> mg <SEP> Inhaltsstoffe
<tb> 48-56 <SEP> 980 <SEP> Ferrioxamin <SEP> D1 <SEP> und <SEP> D2
<tb> 66-80 <SEP> 989 <SEP> Ferrioxamin <SEP> E
<tb>
Das aus Fraktion 48 - 56 mit Phenol-Chloroform isolierte Gemisch von D und D2 (980 mg) wird in 100 ml Wasser gelöst, mit Kochsalz gesättigt und zweimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt hinterlässt nach dem Trocknen über Natriumsulfat beim Eindampfen 697 mg Ferrioxamin D1. Die wässerige Phase wird ausgiebig mit Chloroform gewaschen und hierauf mit Phenol-Chloroform extrahiert. Beim Aufarbeiten des Extraktes in üblicher Weise erhält man 95 mg Ferrioxamin D. Ferrioxamin D ist gut löslich in Wasser, Methanol, Äthanol, Eisessig.
Methylcellosolve und Chloroform, schwer löslich in Äther, Aceton, Essigester, Pyridin und Dimethylformamid. Es kristallisiert aus Methanol-Äther in roten Nadeln. F. nach 3maliger Kristallisation 194-200 . Rf Im Lösungsmittelsystem I : 0. 73. Rf im Lösungsmittelsystem V:0, 88 (vgl. Tabelle 1). Verteilungskoeffizient im System VI : 1, 80 (vgl. Tabelle 1). Elektrophorese vgl. Fig. 5.
Mikroanalyse : C 49,31%, H 7, 47%, N 12.37%, Cl 0%, Fe 7,6nez
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auch mit andern Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
Ferrioxamin Dz :
Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei : 2, 95 (s). 3,43 (m), 6, 08 Il
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vgl. Fig. 16.
Rf im Lösungsmittelsystem 1 : 0, 64, Rf im Lösungsmittelsystem V : 0, 68 (vgl. Tabelle 1).
Papierelektrophorese vgl. Fig. 5.
Ferrioxamin E : Das aus Fraktion 66 - 80 erhaltene Ferrioxamin E (898 mg) ist in Eisessig löslich, in den meisten Lösungsmitteln, insbesondere auch in Wasser und Methanol, schwer- bis unlöslich. Durch 2maliges Umlösen aus viel Wasser-Aceton erhält man ein mikrokristallines Pulver.
Rf-Werte im System I : 0, 68, im System V : 0, 59.
Papierelektrophorese vgl. Fig. 5. Verteilungskoeffizient im System VI : 1, 59 (vgl. Tabelle 1).
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amin F besteht. Zur Weiterreinigung wird dieses Material im System n-Butanol-Wasser einer Craigschen Gegenstromverteilung über 20 Stufen (10/10 ml) unterworfen. Die Inhalte der Elemente extrahiert man anschliessend mit je 80 ml Petroläther, verwirft die Petrolätherphasen und lyophilisiert die wässerigen Raffinate. Mit dem aus den Elementen 1-4 gewonnenen Material (570 mg) wird die Verteilung wiederholt (30 Stufen). Aus Element 5 erhält man 64 mg papierchromatographisch einheitliches Ferrioxamin FHydrochlorid in Form eines braunroten Pulvers. Ferrioxamin F-Hydrochlorid ist gut löslich in Wasser.
Methanol, Pyridin, Eisessig, Äthanol, Dimethylformamid, wenig löslich in Chloroform, unlöslich in Essigester, Aceton und Äther.
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Verteilungskoeffizient im System VI : 3, 12 (vgl. Tabelle 1). Elektrophorese vgl. Fig. 5.
Titration : pKMCS 9, 75, Äquivalentgewicht 695.
Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt unter anderem Banden bei 2, 95 (s), 3, 45 n (m), 6, 19
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aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin F ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin F zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit andern Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
Beispiel 14 : 100 g frische Bäckerhefe wird in 11 Methanol aufgeschwemmt und 30 min kräftig gerührt. Die Aufschwemmung filtriert man und engt die methanolische Lösung am Vakuum auf 200 ml ein. Zu diesem Konzentrat werden 200 m1 Wasser zugesetzt und die Lösung durch Filtration oder Zentrifugation geklärt. Die geklärte Lösung wird 3mal mit einem Chloroform-Phenol-Gemisch (1 Vol. -Teil Chloroform, 1 Gew.-Teil Phenol) ausgezogen. Die vereinigten organischen Phasen versetzt man mit wenig Filterhilfsmittel (Hyflo Supercel) und gibt zu dieser Aufschwemmung unter stetem Rühren einen Überschuss an Äther zu. Das ausgefallene Roh-Ferrioxamin wird zusammen mit dem Filterhilfsmittel abgetrennt, mit Äther gewaschen und getrocknet.
Aus dem Filterhilfsmittel werden die Ferrioxamine mit Methanol eluiert. Die methanolische Lösung wird am Vakuum schonend eingedampft, wobei die Ferrioxamine in Form eines aktiven rotbraunen Harzes erhalten werden, das sich mittels Papierchromatogra- phie reinigen lässt.
Zu Präparaten mit ähnlich hohem Gehalt an Ferrioxaminen gelangt man, wenn man an Stelle der Bäckerhefe einen käuflichen Hefeextrakt, abgepresste Brauereihefe oder frische Hefekulturen wie beschrieben aufarbeitet.
Beispiel 15 : DieGrünalgeChlamydomonas eugametos wird submers auf einer Nährlösung folgender Zusammensetzung bei 24 gezüchtet :
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Leitungswasser 1000 m1 Spurenelementlösup. g 10 ml
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<tb>
<tb> :Cael2 <SEP> 8,35 <SEP> g <SEP> H2MoO4 <SEP> 0, <SEP> 71 <SEP> g <SEP>
<tb> H3BO3 <SEP> 11, <SEP> 42 <SEP> g <SEP> CuSO4.5H2O <SEP> 1,57 <SEP> g
<tb> FeSO. <SEP> 7H2O <SEP> 4,98 <SEP> g <SEP> Co(NO3)2.6H2O <SEP> 0,49 <SEP> g
<tb> ZnSO. <SEP> 7 <SEP> HO <SEP> 8, <SEP> 82 <SEP> g <SEP> Komplexon <SEP> m <SEP> 3g
<tb> Mac12. <SEP> 4 <SEP> H20 <SEP> 1. <SEP> 44g <SEP>
<tb>
Die Nährlösung wird in den Kulturgefässen 20 - 30 min bei 1 atü sterilisiert.
Die Beimpfung erfolgt
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lumen Luft/Volumen Lösung pro Minute belüftet. Nach einer 4-bis lZtägigen Kultur unter ständiger Be- lichtung werden die kräftig grünen Kulturen aufgearbeitet. Die Kulturen werden unfiltriert mit 2% Ton- erde, z. B. Frankonit, versetzt und kräftig durchgemischt. Die Aufschwemmung wird unter Zusatz von
Filterhilfsmittel filtriert und die Lösung erneut mit 2% Tonerde versetzt, ausgerührt und abfiltriert. Die vereinigten Filterrückstände werden mit Wasser und Methanol ausgewaschen und anschliessend mit einem
Pyridin-Wasser-Gemisch (1 : 4) eluiert. Das azeotrope Gemisch wird am Vakuum eingeengt und die Ferri- oxamine aus den Konzentraten durch Gefriertrocknung isoliert.
Die rotbraunen Präparate können in der oben angegebenen Weise weiter angereichert werden.
Beispiel 16 : Die Züchtung von Bacillus subtilis wird nach dem Submersverfahren durchgeführt.
Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, 5 g Kochsalz und 10 g Kalk enthält. Man inkubiert die Kulturen bei 33 - 370 unter Belüftung und unter stetem Schütteln oder Rühren. Nach 48 - 96 h Bebrütung werden die Kulturen unfiltriert mit ? f1/o Tonerde (Frankonit) versetzt, kräftig gerührt und anschliessend durch Filtration oder Zentrifugation geklärt. Das Sediment wird mit Methanol gewaschen und anschliessend mit einem Pyridin-Wasser-Gemisch (1 : 4) eluiert. Das Eluat enthält die Hauptmenge der Ferrioxamine, die wie oben beschrieben isoliert werden.
Beispiel 17 : Die Züchtung von Bacillussubtilis wird nach dem Submersverfahren durchgeführt.
Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, 5 g Kochsalz und 10 g Kalk enthält. Man inkubiert die Kulturen bei 33-37 unter Belüftung und unter stetem Schütteln oder Rühren. Nach 48-96 h Bebrütung werden die Kulturen unfiltriert mit 2% Tonerde (Frankonit) versetzt, kräftig gerührt und anschliessend durch Filtration oder Zentrifugation geklärt. Das Sediment wird mit Methanol gewaschen und anschliessend mit einem Pyridin-Wasser-Gemisch (1 : 4) eluiert. Das Eluat enthält die Hauptmenge der Ferrioxamine, die wie oben beschrieben isoliert werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung neuer eisenhaltiger Wuchsstoffe durch aerobe Züchtung von Streptomyces-Stämmen, Bacillen,. Hefen oder Algen, in einer wässerigen Nährlösung, die assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffverbindungen, anorganische Salze sowie allenfalls wachstumsfördernde Stoffe enthält, und anschliessende Isolierung der neuen Wuchsstoffe nach an den für die Isolierung von Antibiotika bekannten Methoden, Aufteilung in Komponenten und Überführung in therapeutisch verwendbare Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man einen der folgenden Stämme : Streptomyces pilosus NRRL 2857, ETH
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tomyces griseoflavus ETH 9578, ETH 15311 ; Streptomyces viridochromogenes ETH 17635.
ETH 18055 ; Streptomyces olivaceus ETH 6445, ETH 7346, ETH 7437 ; Streptomyces galilaeus ETH 18822 ; Streptomyces lavendulae ETH 14677, ETH 21510 ; Streptomyces polychromogenes ETH 21837, ETH 23217, ETH 23310 ; Streptomyces griseus ETH 10112, ETH 13495, ETH 7419, Bacillus subtilis, Chlamycomonas eugametos oder Bäckerhefe oder Mutationen dieser Stämme, vorzugsweise submers, während 36 - 120 h bei siner Temperatur zwischen 18 und 400. vorzugsweise 270, züchtet, die neuen Wuchsstoffe Ferrioxamine aus dem Kulturfiltrat abtrennt, weiter reinigt, gegebenenfalls in ihre Komponenten A, B, C, D, D, E und F zerlegt und, wenn erwünscht, Salze dieser Verbindungen herstellt.