AT221713B - Verfahren zur Herstellung zweier neuer Antibiotika und ihrer Gemische - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung zweier neuer Antibiotika und ihrer Gemische 
Die vorliegende Erfindung betrifft zwei neue Antibiotika, die im folgenden als Lankavamycin und
Lankavacidin bezeichnet werden, ihre Gemische sowie pharmazeutischen Präparate, welche diese Ver- bindungen und Gemische enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen und Substanzge- mische. 



   Die Antibiotika Lankavaniycin und Lankavacidin entstehen bei der Kultur eines neuen Stammes von Streptomyces violaceo-niger, der aus einer in Ceylon gesammelten Bodenprobe isoliert wurde und in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A 20388 und im United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, unter der Bezeichnung NRRL 2834 aufbewahrt wird. 



   Der Stamm NRRL 2834 bildet ein zimtbraunes Luftmycel. Die Sporenketten sind monopodial verzweigt mit engen, geschlossenen Spiralen. Die Oberfläche der einzelnen Sporen ist glatt. Beim Wachstum auf peptonhaltigen Nährböden wird keine melanoide Verfärbung beobachtet. Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 180 als auch bei 400 entwickelt sich der Pilz gut. 



   Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Stammes NRRL 2834 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien   1 - 7   und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. 



    Mikrobiol.   17 [1952],   S.     361   hergestellt. 



   1. Synthetischer Agar : Kolonien dünn, schleierartig, weissgelb
2. Synthetische Lösung : feine, weissgelbe Trübung
3. Glukose-Agar : Kolonien dünn, schleierartig, weissgelb bis hellgelb
4. Glukose-Asparagin-Agar : Kolonien dünn, schleierartig, hellgelb, Luftmycel sammetig, kreideweiss bis zimtbraun
5.   Ca1ciummalat-Agar :   Kolonien dünn, schleierartig, weissgelb, Luftmycel spärlich, meist milchweiss, an einigen Stellen zimtbraun
6. Gelatinstich   (180) :   Wachstum spärlich, Kolonien dünn, schleierartig, weiss- gelb bis bräunlichgelb ; geringe   Verflüssigung,   nach
60 Tagen 2 mm
7. Stärkeplatte : Kolonien dünn, schleierartig, weissgelb, Luftmycel fehlt, sehr geringe Hydrolyse, auch nach 10 Tagen nur Spur
8.

   Kartoffeln : Kolonien pustelig bis dünn,   schleierartig, bräunlichgelb ;  
Luftmycel sammetig, anfangs schneeweiss bis weissgrau, später blasskarmin und zimtbraun
9. Karotten : Kolonien spärlich, pustelig ; Luftmycel spärlich, weissgrau
10. Lackmusmilch : Kolonien in Ringform und pustelige Oberflächenkolonien. weissgelb, Lackmus rötlich, sehr starke Peptonisierung und starke Koagulation
In seinen wesentlichen Merkmalen, wie Luftmycelfarbe, Morphologie der einzelnen Sporen sowie der Sporenketten und melanoide Verfärbung von peptonhaltigen Nährböden, stimmt der Stamm NRRL 2834 

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   Wie bereits erwähnt, werden bei der Fermentation des Stammes NRRL 2834 meistens Gemische von Lankavamycin und Lankavacidin erhalten. Diese Substanzen lassen sich leicht mittels   Gegenstromvertei-   lung in einheitlicher Form isolieren. Für diese Auftrennung eignen sich speziell zweiphasige   Lösungsmit-     telsysteme,   die aus einem Gemisch von chlorierten Kohlenwasserstoffen, Alkoholen und Wasser bestehen. 



  Beispielsweise hat sich für diesen Zweck ein Gemisch von Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Methanol und Wasser gut bewährt. 



   Ein gutes Reinigungsverfahren für die beiden neuen Antibiotika stellt wiederum die Verteilung zwischen einer alkoholischen wässerigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. 



  Zweckmässig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstromverfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie, beispielsweise an Aluminiumoxyd, ist zur Reinigung sehr geeignet. Diese Reinigungsverfahren können einzeln oder in Kombination miteinander angewendet werden. 



   Die Gewinnung des reinen Lankavamycins und des reinen Lankavacidins in kristalliner Form nimmt man   z. B.   aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Essigester, Chloroform, Aceton-Methanol-Gemischen, Aceton-Äther-Gemischen, Aceton-Petroläther-Gemischen oder EssigesterPetroläther-Gemischen, vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wässerigorganische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton, usw. 



   Das Antibiotikum Lankavamycin bildet farblose Kristalle, die einen doppelten Schmelzpunkt bei 
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    - 1500temperaturbeständig gegen Kaliumpermanganat. Bei   der Hydrolyse mit 0,5n-Schwefelsäure bei 1000 wird ein reduzierender Zucker abgespalten. Bei der Behandlung mit Alkali wird Essigsäure freigesetzt. Lankavamycin gibt mit Salzsäure nach Fischbach und Levine (Antibiotics and Chemotherapy 3 [1953], S. 1159) die gleiche Farbreaktion wie das Makrolid-Antibiotikum Erythromycin. Ausserdem gibt es eine tiefblaue Farbreaktion nach Keller-Kiliani. 



   Das Antibiotikum Lankavacidin bildet blassgelbe Kristalle, die bei   165 - 1680   schmelzen und mit 
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 :tikum ist unter anderem löslich in Alkohol, Aceton, Chloroform und Essigester und nur mässig oder schwer löslich in Petroläther und Wasser. 
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 (log E Ì8,79  , 9,07  , 9,40  , 9,87  , 10,34  , 11,46  , 12,03  , 13,36   und 14, 31 p. Bei der Hydrolyse mit 6n-Salzsäure bei 1100 werden keine Spaltstücke gebildet, die mit Ninhydrin eine Farbreaktion geben. 



   Die Antibiotika Lankavamycin und Lankavacidin sowie ihre Gemische besitzen eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 370 bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen :

   
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<tb> 
<tb> Testorganismen <SEP> Hemmende <SEP> Konzentration <SEP>  g/cm
<tb> Lankavamycin <SEP> Lankavacidin <SEP> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 100 <SEP> lût
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Ent. <SEP> histolytica <SEP> 125 <SEP> * <SEP> 1000
<tb> 
 * Abtötung der Trophozoiten in Bacto Entamoeba-Medium 

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 d) 5 g Distillers solubles, 40 g Sojamehl, 20 g Rohglukose, 20 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 1 1 Leitungswasser ; pH vor der Sterilisation 7,5. e) 20 g Malzextrakt, 20 g Maisquellwasser, 5 g Natriumchlorid, 0,   2 g sek.

   Kaliumphosphat, 20 g   Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser ; PH vor der Sterilisation 7,5. f) 20 g Mannit, 20 g Sojamehl und 11 Leitungswasser ; PH vor der Sterilisation 7,3. 



   Beispiel 3 : Der Filterrückstand eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 150 1-Ansatzes wird mit 25 1 Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die pilzaktiven Acetonlösungen vereinigt im Vakuum zur Trockne eindampft. Nach Behandlung mit Essigester erhält man 
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Substanz in die organische Phase übergeht. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 5   l   eingedampft und dann mehrere Male mit   0,5n-Essigsäure   und mit 2n-Natronlauge ausgeschüttelt. Schliess- lich trocknet man die Äthylacetatlösung über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein, wobei ein öliger Rückstand erhalten wird. Durch Behandlung mit Petroläther gewinnt man daraus ein Pulver, das aus einem rohen Gemisch der Antibiotika Lankavamycin und Lankavacidin besteht. 



     Beispiel 4 :   5, 3 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Gemisches löst man in 100 cm3 absolu- tem Chloroform und trägt die Lösung auf eine Säule aus 150 g Aluminiumoxyd (Aktivität III nach Brock- mann) auf. 400 cm3 absolutes Chloroform lösen nur inaktive Begleitstoffe heraus. Anschliessend wird mit
450   cm3   Chloroform, das   31o   Methylalkohol enthält, eluiert, wobei die gesamte wirksame Substanz im
Eluat erhalten wird. Reichlich braune bis schwarze Verunreinigungen bleiben in der Säule haften. Durch
Eindampfen der aktiven Fraktionen gewinnt man 2,75 g eines angereicherten Gemisches der Antibiotika
Lankavamycin und Lankavacidin in Form eines dickflüssigen blass-bräunlichen Öls. 



     Beispiel 5 :   2,75 g des gemäss Beispiel 4 angereicherten Gemisches werden einer 100stufigen Ge- genstromverteilung unterworfen, wobei man folgendes Lösungsmittelgemisch verwendet : 3   Vol.-Teile   Tetrachlorkohlenstoff, 2   Vol.-Teile   Chloroform, 4   Vol.-Teile   Methanol und 1 Vol. -Teil Wasser. Die einzelnen Fraktionen werden auf ihre antibakterielle Aktivität geprüft, wobei als Testorganismen Bacillus subtilis und Micrococcus pyogenes, var. aureus verwendet werden. Mit dem ersten ergibt sich ein Aktivitätsmaximum bei der Stufe 27 (Antibiotikum Lankavamycin), während mit dem zweiten Testorganismus ein solches bei Stufe 80 (Antibiotikum Lankavacidin) beobachtet wird.

   Darauf vereinigt man einerseits die Stufen   20 - 37   und anderseits die Stufen   70 - 91   und arbeitet sie getrennt auf folgende Art auf : Nach dem Abtrennen der unteren Phase wird die obere Phase mit Wasser verdünnt und dreimal mit frischem Chloroform ausgeschüttelt. Man vereinigt diese Extrakte mit der abgetrennten unteren Phase, trocknet diese Lösung über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein. Man erhält so das Antibiotikum Lankavamycin und das Antibiotikum Lankavacidin in einheitlicher Form. 



     Beispiel 6 :   9,63 g des gemäss Beispiel 5 erhaltenen Antibiotikums Lankavamycin werden an einer Säule aus 200 gAluminiumoxyd (Aktivität III nachBrockmann) chromatographiert. Die mit 800 cm3 Benzol eluierten Anteile sind un wirksam und werden verworfen. 400 cm3 Chloroform, das man durch Destillation über Phosphorsäureanhydrid völlig von Alkohol befreit hat, lösen 2,0 g einer   blass-bräunlichen,   honigartigen Substanz mit mittelmässiger Aktivität heraus. Durch weitere Elution mit 300 cm3 Chloroform-Methylalkohel 99   : 1   gewinnt man die Hauptmenge des Antibiotikums als weisses amorphes Pulver (5,5 g). Die weiteren Eluate enthalten nur noch geringe Mengen an aktiver Substanz. 



     4, 0   g der Hauptfraktion löst man in wenig Aceton und verdünnt diese Lösung mit der fünffachen Menge Äther. Nun wird die Lösung konzentriert und das verdampfte Lösungsmittel sukzessive durch Petrol- äther ersetzt. Beim Stehen in der Kälte kristallisiert das Antibiotikum Lankavamycin in unregelmässigen derben Kristallen aus. Die farolosen Kristalle sind bei 1300 im Hochvakuum nicht   sublimierbar.   Einer Lösung in Äthylacetat kann das Antibiotikum weder mit verdünnter Essigsäure noch mit verdünntem Natriumcarbonat entzogen werden.

   Ein viermal umkristallisiertes und 20 Stunden im Hochvakuum bei 800 getrocknetes Präparat zeigt folgende Eigenschaften : F   147-150 ,   beim weiteren Erhitzen wachsen aus 
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    - 1820 schmelzen ; [etJg = -93. 80sprit) ; Elementaranalyse :   C   60, 18%,   H 8,75%, O 31,06%, CH3CO 11,49%. CH3-(C) 20,54%, OCH3 8,67%. 



   Eine   0, 25loige Lösung   des Antibiotikums in optisch reinem Feinsprit zeigt ein Absorptionsmaximum bei 289 mu (log E = 1, 50). Im Infrarot-Spektrum, aufgenommen in Kaliumbromid, vgl. Fig. 1, sind 
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