Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Strepto- myces fradiae, Stamm A 20675, züchtet und das Antibiotikum Actinomycin Z hierauf isoliert.
Im folgenden wird das neue Antibiotikum mit cActinomycin Z bezeichnet.
Das Antibiotikum Actinomycin Z entsteht bei der Kultur eines neuen Stammes von Streptomyces fradiae, der im folgenden als Stamm A 20675 be schrieben wird. Er wurde aus einer in Horsham, England, gesammelten Bodenprobe isoliert, und wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Tech nischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich,
unter dieser Bezeichnung aufbewahrt. Streptomyces fradiae A 20675 bildet ein dunkel- rotes-zimtbraunes-bräunlichgraues Luftmycel. Die einzelnen Sporen sind glatt. Die Sporenketten bilden offene, regelmässige Spiralen von meist mehr als fünf Windungen. Sie sind monopodial verzweigt und haben eine lange gerade Hauptachse. Bei der Züch tung auf peptonhaltigen Nährböden verursacht der Stamm A 20675 keine melanoide Verfärbung.
Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Tempe ratur; sowohl bei 18 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32 .
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgen den das Wachstum des Stammes A 20675 auf ver schiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nähr medien 1-7 und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952) hergestellt. 1. Synthetischer Agar: Wachstum punktförmig bis pustelig, sattgelb oder kastanienbraun. Luftmycel sammetig, weissgrau bis bräunlichgrau. Substrat sattgelb bis dunkelbraun.
2. Synthetische Lösung: Sediment, Flocken milchweiss bis hellbraun. Pellikel punktförmig, weissgelb. Substrat hellbraun.
3. Glucose-Agar: Wachstum dünn, schleierartig, weissgelb. Luftmycel wird nicht gebildet. Substrat unverfärbt.
4. Glucose-Asparagin-Agar: Wachstum dünn, schleierartig, anfangs dottergelb, später goldgelb bis bräunlichgelb. Luftmycel sammetig, zimtbraun bis bräunlichgrau.
5. Calciummalat-Agar : Wachstum punktförmig bis pustelig, dottergelb, Luftmycel sammetig, schneeweiss bis zimtbraun. Substrat bräunlichgelb.
6. Gelatinestich (180C): Oberflächenwachstum punktförmig, bräunlichgelb. Luftmycel wird nicht gebildet. Substrat kastanienbraun. Verflüssigung nach 20 Tagen 0,6 cm, nach 30 Tagen 1,1 cm.
7. Stärkeplatte: Wachstum pustelig, goldgelb. Luftmycel spärlich, staubig, einen feinen L7berzug bildend, kreideweiss. Hydrolyse nach 8 Tagen 0,7 cm.
B. Kartoffeln: Wachstum runzelig, hellbraun. Luftmycel spärlich, hellgrau bis bräunlichgrau. Substrat nicht verfärbt. 9. Karotten: Wachstum runzelig, hellbraun. Luftmycel spärlich, kreideweiss. Substrat dunkelbraun.
10. Lackmusmilch : Wachstum spärlich. Pellikel dünn, hellgelb. Keine Peptonisierung oder Koagulation. Lackmus rot. Der Stamm A 20675 ist bezüglich Aussehen der Sporen, Farbe des Luftmycels, Spiralenbildung der Sporenketten und melanoider Verfärbung pepton- haltiger Nährböden identisch mit S. fradiae und wird deshalb vorläufig dieser Art zugezählt.
Zur Herstellung des Antibiotikums Actino- mycin Z können auch Varianten, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgen strahlen oder von Stickstoff-Senfölen, gewonnen wer den, Verwendung finden.
Der Streptomycetenstamm A 20675 kann z. B. in wässriger, anorganische Salze, eine Kohlenstoff und Stickstoffquelle enthaltender Nährlösung aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern gezüchtet werden. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 C. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 24 bis 96 Stunden.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Kohlenstoffquellen sind vor allem Kohle hydrate, wie z. B. Glukose, Saccharose, Lactose und Stärke. Als stickstoffhaltige Verbindungen und gege benenfalls zuzusetzende wachstumsfördernde Stoffe seien z.
B. genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen bei der Alkoholher stellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soja pflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwoll pflanze.
Zur Isolierung des Antibiotikums dienen z. B. folgende Verfahren: Man trennt das Mycel vom Kul- turfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Anti biotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders orga nische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungs mittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B.
Aceton und Methyl- äthylketon. Diese Mycelextrakte werden entweder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das Ge misch mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Ester niederer Fett säuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasserstoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlen wasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, z.
B. Methylpropylketon, Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern und dergleichen.
Anstelle einer Lö- sungsmittel-Extraktion der Kulturen, oder in Kom bination mit einer solchen als weitere Reinigungs operation, kann man das Antibiotikum auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extraktion des Adsor- bates z. B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon.
Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vor gängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
Eine weitere Anreicherung lässt sich dadurch erzielen, dass man die antibiotikumhaltigen orga nischen Extrakte zuerst mit einer sauren wässrigen Lösung mit einem pH unter 5 und dann mit einer alkalischen wässrigen Lösung mit einem pH über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in der organischen Phase bleibt, aus der das Actinomycin Z isoliert wird.
Als saure wässrige Lösungen eignen sich verdünnte Säu ren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphat puffer, und als alkalische wässrige Lösungen ver dünnte Alkalien, wie Natronlauge oder Kalilauge, oder Pufferlösungen, wie Phosphatpuffer und der gleichen.
Das rohe Actinomycin Z kann aus den Konzen traten solcher Extrakte durch Zugabe von Petrol- äther, Pentan, Hexan und dergleichen direkt als amorphes rotes Pulver ausgefällt werden.
Ein gutes Reinigungsverfahren für das neue Anti biotikum stellt die Chromatographie dar, wobei sich Aluminiumoxyd als Adsorbens besonders bewährt hat. Die Gewinnung des reinen Antibiotikums in kristalli ner Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungs mitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloro form, Aceton-Methanol-Gemischen, Aceton-Äther- Gemischen oder Aceton-Petroläther-Gemischen vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungs mittel oder auch wässrig-organische Lösungen, die verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton, usw.
Das Actinomycin Z kristallisiert in roten feinen Stäbchen. F. 260-264 , [a]r, = -314 (c - 0,246 in Chloroform). Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 54,88 -%, H = 6,42',%, N - 12,25 0/a. Sein UV.-Absorptionsspektrum zeigt Banden bei 242 in /i. (log E i # = 2,34),
bei 429 ma (log E i m = 2,25) und bei 443 m,u (log E i % = 2,27). Im Infrarot-Spektrum sind Banden u. a. bei folgenden Wellenlängen sichtbar:
2,89,u, 3,36,u, 3,40,u, 5,70 6,056,306,60 ,u, 6,67,u., <I>7,07</I> ,u, 7,31 7,58 7,658,36,u, 9,00,u, 9,12 ,u, 9,39 13,30 ,lc und 14,40 ,u.
Das Antibiotikum Actinomycin Z besteht aus mindestens sechs Komponenten Z., Z1, Z2, Z3, Z4 und Z5, die mittels Papierchromatographie ge trennt werden können und die verschieden sind von den Komponenten der bekannten Actinomycine C, X und I.
Die entsprechenden Daten sind in der fol genden Tabelle zusammengestellt, wobei für die ein- zelnen Komponenten nach einem Vorschlag von Brockmann und Gröhne (Chemische Berichte 87, 1036 [1954]) die RC2 Werte (= Verhältnis der Lauf strecke auf dem Papier eines unbekannten Actino- mycins zur Laufstrecke des Actinomycins C2) ange geben werden:
EMI0003.0030
Für diese papierchromatographischen Unter suchungen bewährt sich ein Lösungsmittelsystem, bestehend aus Natrium-metakresotinat und einem Gemisch von 1 Volumteil Di-n-butyläther und 3 Volumteilen n-Butylacetat. Zur Isolierung der sechs Komponenten des Actinomycins Z ist die Chromatographie geeignet. Als Adsorbentien haben sich Aluminiumoxyd oder Cellulose besonders bewährt.
Auch die Verteilung zwischen zwei nicht oder nur teilweise mischbaren Phasen ist für die Anreicherung der einzelnen Kom ponenten sehr zweckmässig. Vorteilhafterweise wird dabei nach dem Gegenstromverfahren gearbeitet. Als besonders günstiges Lösungsmittelsystem hat sich ein Gemisch einer wässrigen Lösung von Natrium-ss- naphthalin-sulfonat mit Isopropyläther erwiesen. Diese genannten Methoden können einzeln oder in Kombination miteinander angewandt werden.
Für die Reindarstellung der sechs Actinomycin-Z-Kompo- nenten hat sich folgende Kombination als besonders günstig erwiesen: 1. Chromatographie an Aluminiumoxyd, wobei die Komponenten Z, und Z1 voneinander und von den Komponenten Z2_. getrennt werden können; 2.
Gegenstromverteilung, wobei die Komponente Z5 abgetrennt wird; 3. Chromatographie an Cellulose, wobei die Kom ponenten Z2, Z3 und Z4 voneinander getrennt werden. Die Komponenten des Actinomycins Z können in kristalliner Form erhalten werden, wobei vorzugs weise die für die Kristallisation des Actinomycins Z angegebenen Lösungsmittel und Lösungsmittelge- mische verwendet werden.
Im folgenden werden diese Komponenten näher charakterisiert: Actinomycin Z.: orange-braunes mikrokristallines Pulver; bei 250 Zersetzung; UV.-Absorption in Feinsprit: Banden bei 236 mu (log
EMI0003.0073
= 2,44) und bei 437 m/c (log
EMI0003.0075
= 2,17).
Actinomycin Z1: orangerote Kristalle; F. 256-260 (Zers.); [a]D =-362 (c = 0,185 in Chloroform); Elementaranalyse: C = 53,97%, H = 6,79%, N = 12,300/u, (CH3)N = 7,48'%, CH30 = 01/0;
UV.-Absorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei 240 m,u (log
EMI0003.0097
= 2,25), bei 427 my (log
EMI0003.0099
= 2,00) und bei 442 mu (log
EMI0003.0101
= 2,01).
Actinomycin Z5: rote Kristalle; F. 261-267 (Zers.); lab = -284 (c = 0,244 in Chloroform); Elementaranalyse: C = 55,710/0,H = 6,44 %, N = 12,25 %; UV.-Absorptionsspektrum in Feinsprit:
Banden bei 240 m,u (log E i % = 2,40), bei 428 my (log E i m = 2,21) und bei 443 rau (log Ei m = 2,24).
Bei der sauren Hydrolyse von Actinomycin Z und von seinen Komponenten Z., Z1, Z2, Z3, Z4 und Z5 entstehen u. a. die Aminosäuren N-Methylvalin, Valin, N-Methylalanin, Sarkosin und Threonin.
Das Antibiotikum Actinomycin Z besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber ver schiedenen Testorganismen. Verwendet man als Test methode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpoten zen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37 C bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen:
EMI0004.0001
Hemmende
<tb> Testorganismen <SEP> Konzentration
<tb> Uglcm3
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 10
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 10
<tb> Bacillus- <SEP> megatherium <SEP> 10
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> 1 <SEP> 100
<tb> Entamoeba <SEP> histolytica2 <SEP> 1000
<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> 3 <SEP> < <SEP> 40 i In Kirchners synthetischem Medium mit 597" bovinem Albumin kultiviert;
Ablesung des Wachstums nach zwei Wochen.
= Kultur in Bacto-Entamoeba-Medium; Ablesung der amoebiciden Wirkung nach 24 Stunden.
In Bouillon mit 10 ,ö Pferdeserum bei 370 C kultiviert; Ablesung nach 4 Tagen.
Die Entwicklung von Influenza-Virus auf isolier ten Membranen der Hühner-Chorioallantois von 14tägigen Bruteiern wird noch in einer Konzentration von 10 ,ug/cm3 gehemmt.
Das Antibiotikum Actinomycin Z, seine Kompo nenten Z., Z1, Z., Z3, Z4 und Z5, oder entsprechende Gemische können als Heilmittel in Form pharmazeu- tischer Präparate Verwendung finden. Diese enthal ten die genannten Verbindungen zum Beispiel in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeu tischen organischen oder anorganischen Träger material. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagie ren, wie z. B.
Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magne- siumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharma zeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie steri lisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Kon- servierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgier- mittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tempe raturen in Celsiusgraden angegeben. <I>Beispiel 1</I> Man bereitet eine Nährlösung der Zusammen setzung: 20 g Sojamehl, 20 g Mannit und 1 Liter Leitungswasser und stellt sie auf pH 7,8 ein. Diese, bzw. ein Vielfaches derselben, wird in 500-em3-Erlen- meyern (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500- Liter-Fermentern (mit je 300 Liter Nährlösung) abge- füllt und 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert.
Dann impft man mit bis zu 10 la einer teilweise sporulie- renden, vegetativen Kultur des Stammes A 20675 an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute) bei 27 .
Nach 70-120 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wässrige Lösung vom Mycel und anderen festen Bestandteilen.
<I>Beispiel 2</I> Verwendet man anstelle des in Beispiel 1 ange gebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen a, b, c oder d, so erhält man nach analoger Sterilisation, Beimpfung mit dem Stamm A 20675, Inkubation bei 27 und Filtration wässrige antibiotisch wirksame Lösungen: a) 10 g Galaktose, 5 g Pepton, 3 g Fleisch extrakt (Oxo Lab Lemco) und 1 Liter Leitungs wasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
b) 20 g Malzextrakt, 20 cm; Maisquellwasser (corn steep liquor), 5 g Natriumchlorid, 0,2 g sek. Kaliumhydrophosphat, 2 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
c) 20 g Glycerin, 2,5 g Glykokoll, 1,0 g Na triumchlorid, 0,1 g sek. Kaliumhydrophosphat, 0,1 g krist. Ferrosulfat, 0,1 g krist. Magnesiumsulfat, 0,5 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
d) 20 g Glycerin, 1 g Caseinhydrolysat, 10 g Kaliumnitrat, 5 g sek. Kaliumhydrophosphat, 5 g Natriumchlorid, 5 g Magnesiumsulfat, 10 mg krist. Ferrosulfat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
<I>Beispiel 3</I> Der Filterrückstand eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 120-Liter-Ansatzes wird mit 15 Liter Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die antibiotikum- haltigen Acetonlösungen vereinigt, im Vakuum auf 5 Liter einengt und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird mit 70 Liter Äthylacetat ausge zogen, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in die organische Phase übergeht. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 5 Liter einge dampft und dann mehrere Male mit 0,5n Essigsäure und mit 2n Natronlauge ausgeschüttelt.
Schliesslich trocknet man die Athylacetatlösung über Natrium sulfat und konzentriert sie im Vakuum auf 2 Liter. Durch Zugabe von 1 Liter Petroläther wird daraus das rohe Actinomycin Z in Form eines orangeroten Pulvers ausgefällt.
(Ausbeute 11,5 g.) <I>Beispiel 4</I> 9,5 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Actinomycins Z werden an einer Säule von 260 g neutralem Aluminiumoxyd der Aktivität III ehro- matographiert. Man eluiert die Säule mit je 500 cm3 abs. Benzol und Chloroform und mit 700 cm3 eines Gemisches von Chloroform-Methanol (98:2).
Mit den ersten beiden Lösungsmitteln werden nur farb lose, inaktive Nebenprodukte abgelöst, während das Chloroform-Methanol-Eluat tief rot gefärbt ist und nach dem Eindampfen im Vakuum 4,5 g eines roten amorphen, biologisch aktiven Rückstandes liefert. Durch Kristallisation aus einem Gemisch von Aceton und Äther wird daraus das reine Actinomycin Z in Form von rotorangen Kristallen erhalten, die bei 260 bis 264 unter Zersetzung schmelzen. Die Elementar analyse gibt folgende Werte: C = 54,88 0/0, H = 6,42 0/0 und N = 12,25 0/a.
Das in Feinsprit aufgenommene UV.-Spektrum zeigt folgende Absorptionsmaxima: 4,11, 242 429 443 ml-,t log
EMI0005.0016
2,34 2,25 2,27 Im Infrarot-Absorptionsspektrum finden sich u. a.
Banden bei 2,89 lt, 3,36 lt, <I>3,40</I> ,it, 5,70 alt, 6,05 ,u, 6,30 ,c1, 6,60,u, 6,67,u, <I>7,07</I> ,u, 7,317,58 ,u, 7,65 /1, 8,36 114 9,00,u, 9,12,u, 9,39,u, 13,30 ,u und 14,40 lt.
Die papierchromatographische Untersuchung des kristallinen Actinomycins Z (Rundfiltermethode mit 10 0/aiger wässriger Lösung von Natrium-meta-kreso- tinat als stationäre und mit einem Gemisch von 3 Volumteilen Butylacetat und 1 Volumteil Dibutyl- äther als mobile Phase) zeigt, dass es aus mindestens sechs Komponenten (Z0, Z1, Z2, Z3,
Z4 und Z5) be steht, die folgende RC-Werte zeigen (RC2 = Ver hältnis der Laufstrecke der unbekannten Substanz zur Laufstrecke der Komponente C2 des Actino- mycins C):
EMI0005.0057
Komponente <SEP> RG-Wert
<tb> <B>ZO</B> <SEP> 0,35
<tb> Z1 <SEP> 0,39
<tb> Z2 <SEP> <B>0,78</B>
<tb> Z3 <SEP> 1,63
<tb> Z4 <SEP> 2,36
<tb> Z5 <SEP> 2,55 Eine Lösung von 30 mg Actinomycin Z in einem Gemisch von 1 cm3 konzentrierter Salzsäure und 1 cm2 Wasser wird in einem Glasrohr einge schmolzen und 20 Stunden auf 110-120 erhitzt. Nach dem Erkalten wird das Hydrolysegemisch fil triert und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird mittels zweidimensionaler Pa- pierchromatographie untersucht, wobei folgende Lö- sungsmittelsysteme verwendet werden: a) wassergesättigtes Phenol und b) ein Gemisch von n-Butanol, Eisessig und Wasser im Volumen-Verhältnis 4: 1 : 1.
Die Papierchromatogramme werden einerseits mit Ninhydrin und anderseits mit Pyridin und p-Nitro- benzoylchlorid angefärbt. Auf diese Weise können im Hydrolysegemisch die Aminosäuren N-Methyl- valin, Valin, N-Methylalanin, Sarkosin und Threonin festgestellt werden.
<I>Beispiel 5</I> Eine Lösung von 750 mg gemäss Beispiel 4 erhal tenem kristallinem Actinomycin Z in 20 cm3 Benzol wird auf eine Säule von 100 g Aluminiumoxyd (Akti vität III nach Brockmann, neutral) gegeben. Man lässt je 100 cm3 Benzol und Chloroform durch die Säule laufen, wobei keine Elution stattfindet. Dann entwickelt man das Chromatogramm mit einem Ge misch von Chloroform und Methanol (99-. 1), wobei sich drei rote Zonen bilden.
Die unterste kann mit 120 em3 dieses Gemisches eluiert werden und be steht aus den Actinomycinen Z2, Z3, Z4 und Z5. Weitere 500 cm3 des genannten Gemisches eluieren die zweite Zone, die aus einheitlichem Actinomycin Z1 besteht.
Dieses wird aus Aceton-Äther kristalli siert und bildet orangerote Kristalle vom F. 256-260 (Zers.); [a]D = -362 (c = 0,185 in Chloroform); Elementaranalyse:
C = 53,97%, H = 6,79%, N = 12,30 0/0, (CH3)N = 7,48 0/a, CH30 = 0'%; UV.-Absorptionsspektrum in Feinsprit:
<B>...</B> 1,t = 240 my (log
EMI0005.0129
= 2,25), <I>427</I> mu (log
EMI0005.0131
= 2,00), 442 mcc (log
EMI0005.0133
= 2,01).
Das IR-Spektrum stimmt mit dem von Actinomycin- Z-Gemisch völlig überein.
Die dritte Zone des Chromatogrammes wird mit 150 cm3 eines Chloroform-Methanol-Gemisches <B>(97:</B> 3) eluiert. Sie besteht aus einheitlichem Actino- mycin Z.. Aus Aceton-Äther erhält man dieses als orangebraunes, mikrokristallines Pulver, das sich bei etwa 250 zersetzt. Im Papierchromatogramm verhält es sich wie Actinomycin Z1, die Zone ist aber weniger scharf.
Sein UV.-Absorptionsspektrum in Feinsprit zeigt Banden bei 236 mu (log Ei % = 2,44) und bei 437 m/,c (log Ei m = 2,17).
<I>Beispiel 6</I> 390 mg des gemäss Beispiel 5 erhaltenen Ge misches der Komponenten Z2, Z3, Z4 und Z5 von Actinomycin Z werden einer 100stufigen Gegen stromverteilung unterworfen, wobei folgendes Lö- sungsmittelgemisch verwendet wird:
2 %ige wässrige Lösung von Natrium-naphthalin-,B-sulfonat als statio näre Phase und ein Gemisch von 4 Volumteilen Iso- propyläther und 1 Volumteil Essigester als mobile Phase. Nach 100 Überführungen finden sich drei Substanz- und Farb-Maxima bei den Fraktionen 6, 55 und 88. Der Inhalt der Verteilungsgefässe 0-15, 41-65 und 81-92 wird vereinigt.
Die Fraktionen 0-15 enthalten Actinomycin Z1 und Verunreinigun- gen, während in den Fraktionen 41-65 ein Gemisch der Actinomycine Z2, Z3 und Z4 vorhanden ist, das aus Aceton-Äther in feinen roten Kristallen erhalten wird, die sich bei etwa 260 langsam zersetzen.
EMI0006.0001
= -296 (c = 0,257 in Chloroform); UV.-Absorptionsspektrum in Feinsprit: = 240 mu (log
EMI0006.0005
= 2,36); 428 my (log = 2,17); 441 nu (log
EMI0006.0008
= 2,18).
Aus den Fraktionen 81-92 wird durch Behandlung mit Aceton und Äther reines kristallines Actino- mycin Z5 erhalten. F. 261-267 (Zers.); [a]D = -248 (c = 0,244 in Chloroform); UV.-Absorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei 240 mu (log
EMI0006.0019
= 2,40), bei 428 mu (log
EMI0006.0021
= 2,21) und bei 443 mA (log
EMI0006.0022
= 2,24); Elementaranalyse:
C = 55,71 1/a, H = 6,44 0/a, N = 12,25 11/9, <B>0</B> (ber.) = 25,60 a/U.
<I>Beispiel 7</I> 30 g Cellulosepulver werden mit 120 cm3 einer 10 o/oigen wässrigen Natrium-meta-kresotinat-Lösung verrührt und dann in eine Chromatographiersäule von 2,6 cm Durchmesser eingefüllt. Die überschüssige wässrige Lösung wird entfernt, worauf die Säule mit einem Gemisch von 3 Volumteilen Butylacetat und 1 Volumteil Dibutyläther durchgewaschen wird.
Man löst 280 mg Actinomycin Z in 15 cms dieses Lö- sungsmittelgemisches und bringt diese Lösung auf die Säule und eluiert weiter mit dem gleichen Ge misch, wobei folgende Fraktionen einzeln aufgearbei tet und papierchromatographisch untersucht werden: Fraktion 1: 40 cm3, Actinomycin Z5, einheitlich. Fraktion 2: 40 cm3, Gemisch Actinomycin Z4, Z3 und Z2.
Fraktion 3: 180 cm3, Gemisch Actinomycin Z3, Z2 und Z1.
Fraktion 4: 130 cm3, fast ausschliesslich farblose Nebenprodukte. Fraktion 5: 300 cm3, Actinomycin Z1, einheitlich.
<I>Beispiel 8</I> Nach der in Beispiel 7 beschriebenen Methode chromatographiert man 250 mg eines gemäss Bei spiel 6 erhaltenen Gemisches von Actinomycin Z2, Z3 und Z4 an 30 g Cellulosepulver, wobei Fraktionen von je 20 cm3 Lösungsmittel aufgefangen werden.
Die Fraktionen 4, 6 resp. 10 enthalten papierchro- matographisch einheitliches Actinomycin Z4, Z3 resp. Z2. Diese Fraktionen werden einzeln aufgearbeitet. Durch Behandlung mit Aceton-Äther erhält man die Actinomycine Z4, Z3 und Z2 in kristalliner Form.
25 mg des Gemisches der Actinomycine Z2, Z3 und Z4 (vgl. Beispiel 6) werden auf 4 Bogen What- man-Papier Nr. 1 nach dem in Beispiel 7 beschrie benen Verfahren getrennt.
Die Zonen der einzelnen Komponenten werden ausgeschnitten und dreimal mit Alkohol eluiert. Die Eindampfrückstände der Eluate, die reichlich Natrium-meta-kresotinat enthal- ten, werden in Äthylacetat gelöst und dreimal mit verdünnter Natriumcarbonatlösung und Wasser ge waschen. Die getrockneten Lösungen werden einge dampft und die Rückstände an Kolonnen aus etwa 1 g Aluminiumoxyd nochmals gereinigt.
Es werden so je etwa 5 mg der reinen Actinomycine Z3 und Z4 erhalten. Das Actinomycin Z2 fällt in einer Menge von weniger als 1 mg an.
Bestimmung der Aminosäuren. Je etwa 3-5 mg der reinen Actinomycine Z., Z1, Z3, Z4 und Z5 werden mit je 0,5 ml Wasser und 0,5 ml konz. Salz säure in ein kleines Rohr eingeschmolzen und über Nacht bei etwa 1l0 hydrolysiert. Die Hydrolysate werden im Vakuum eingedampft und in je etwa 100 14,1 Wasser gelöst. Die Aminosäuren werden durch zweidimensionale Papierchromatographie be stimmt.
Fliessmittel: 1. wassergesättigtes Phenol, z. Butanol-Eisessig-Wasser 4 : 1 : 1. Mittels der Ninhydrin-Reaktion können in den Hydro- lysaten von allen Actinomycin-Z-Komponenten die selben 5 Aminosäuren nachgewiesen werden, nämlich Threonin, Sarkosin, N-Methylalanin, Valin und N- Methylvalin. Prolin wird in keinem Falle gefunden.