AT200258B - Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotika - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotika 
 EMI1.1 
 undSubstanzgemische. 



   Die Cinerubine entstehen bei der Kultur einer   neuenAktinomyceten-Art   der Gattung Streptomyces, die mit keiner der   inBergey's"Manual   of Determinative Bacteriology", 6.   Aufl.   oder in"Actinomycetes and theirAntibiotics"vonWaksman und Lechevalier 1953 aufgeführten Arten identisch ist und im folgenden als Streptomyces cinereoruber Corbaz et   al. var. fructofermentans   beschrieben wird. Sie wurde aus einer im Zürcher Zoo gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien und in der Eidgenössischen Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A 6143 aufbewahrt. 



   Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans bildet ein spärliches Luftmycel, das anfänglich weiss, dann weissgrau und schliesslich aschgrau gefärbt ist. Es hat Konidienketten, die ein typisches Merk-   mal der Gattung Streptomyces sind. Die Sporen sind glatt. Das Substratmycel ist rot und bildet ein lösliches Pigment. Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18 als auch    bei 400 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 320. 



   Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans auf verschiedenen   Nährmedien   beschrieben. Die Nährmedien   1 - 7   und 11 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17,361 (1952) hergestellt. 



  Synthetischer Agar : Wachstum dünn, schleierartig, farblos nach 3 Tagen, später rosa ; Luftmycel staubig, nach 8 Tagen milchweiss oder blasskarmin, nach 14 Tagen asch- grau ; ein rosarotes lösliches Pigment wird nach 4 Tagen gebildet. 



  Synthetische   Lösung : Flocken weissgrau   bis rosa ; Pellikel mit spärlichem weissgrauem Luftmycel ;
Pigment blasskarmin. 



  Glucose-Agar : Punktförmiges Wachstum, farblos oder stellenweise korallenrot nach 3 Tagen, fleischrot nach 8 Tagen ; Luftmycel spärlich, weissgrau nach 8 Tagen, asch- grau nach 14 Tagen ; Substrat fleischrot gefärbt nach 8 Tagen. 



  Glucose-Asparagin-Agar : Wachstum wie auf Glucose-Agar ; Luftmycel staubig, kreideweiss nach 4 Ta- gen, später   weissgrau ; blasskarminrotes   lösliches Pigment. 



  Calciummalat-Agar : Wie Glucose-Asparagin-Agar. 



  Gelatinestich   180 C :   Oberflächliches Wachstum weissgelb bis hellgelbrot ; Luftmycel spärlich, weissgrau ; lösliches Pigment intensiv kastanienbraun bis   rötlichbraun ;   Ver- flüssigung sehr langsam, beginnend nach 34 Tagen, 0,4 cm nach 42 Tagen. 



  Stärkeplatte : Wachstum punktförmig, farblos ; Luftmycel mehlig bestäubt, weissgrau ; Stär- kehydrolysierung Spuren nach 4 Tagen. 



    Nähragar :   Spärliches Wachstum, hellgelb ; kein Luftmycel ; Pigment schwach, rötlich- braun. 



  Kartoffeln : Flechtenartiges Wachstum, kupferrot nach 4 Tagen, bräunlich bis pech- schwarz nach 8 Tagen, kein Luftmycel ; Substrat blauschwarz gefärbt. 

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  Karotten : Flechtenartiges Wachstum, graublau und   blasskaimin   Luftmycel nach 8 Ta- gen sammetig, weissgrau bis   aschgrau ;   Pigment blauschwarz. 



  Lackmusmilch : Ringwachstum, Pellikel hellbraun ; Luftmycel spärlich weissgrau ; Peptonisie- rung nach 7 Tagen ; keine Gerinnung. 



   Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans wächst, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb,   J.   Bacteriology 56,107 (1948) untersucht, bei Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen wie folgt : 
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<tb> 
<tb> L-Xylose <SEP> + <SEP> Inulin <SEP> (-) <SEP> 
<tb> L-Arabinose <SEP> + <SEP> D-Mannit <SEP> +
<tb> L-Rhamnose <SEP> (+) <SEP> D-Sorbit <SEP> +
<tb> D-Fruktose <SEP> + <SEP> Dulcit <SEP> (-) <SEP> 
<tb> D-Galaktose <SEP> + <SEP> Mesoinosit <SEP> +
<tb> Saccharose <SEP> (+) <SEP> Salicin <SEP> +
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> Natriumacetat <SEP> (-) <SEP> 
<tb> Lactose <SEP> + <SEP> Natriumcitrat <SEP> (-) <SEP> 
<tb> Raffinose <SEP> - <SEP> Natriumsuccinat <SEP> (-) <SEP> 
<tb> 
 Dabei bedeutet :

   + gutes Wachstum, sichere Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle (+) schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle fraglich sehr schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle unwahrscheinlich kein Wachstum, keine Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle. 



   Streptomyces cinereorubervar. fructofermentans stimmt morphologisch gut   mitStreptomyces cinereo-   ruber (R. Corbaz, L. Ettlinger, W.   Keller-Schierlein und H. Zähner, Arch.   Mikrob., im Druck) überein, unterscheidet sich aber biologisch von dieser Art durch seine Fähigkeit, verschiedene Kohlenstoffquellen auszuwerten. 
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 cens Lindenbein, welcher aber stachelige Sporen bildet und ein völlig abweichendes Kohlenstoffquellenspektrum zeigt. Letzteres gilt ebenfalls für S. Bobiliae (Waksman et   Curtis)   Waksman et Henrici. 



   Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung der Antibiotika Cinerubin A und Cinerubin B oder ihrer Gemische anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans oder andrer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senföl gewonnen werden. 



   Zur Erzeugung der Cinerubine wird der Streptomyceten-Stamm A 6143 z. B. in wässeriger, anorganische Salze, stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls Kohlenhydrate enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, und hierauf Cinerubin A und/ oder Cinerubin B oder Gemische davon aus dem Kulturfiltrat isoliert. 



   Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Als stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende Kohlehydrate und wachstumsfördernde Stoffe seien   z. B. genannt : Amino-   säuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von   Destillationsrückstän-   den bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze, ferner Glukose, Saccharose, Lactose, Stärke usw. 



   Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermetern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 20 und 400. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach   l   1/2-5 Tagen. 



   Je nach der Zusammensetzung der verwendeten Nährlösung wird entweder ein Gemisch von Cinerubin A und B oder vorwiegend Cinerubin A oder vorwiegend Cinerubin B produziert. Beispielsweise kann Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans auf Nährlösungen gezüchtet werden, die auf 1 Liter Wasser folgende Substanzen enthalten : 

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Nährlösung Nr. 12/41 : Glycerin 20 g, Sojamehl 10 g, Natriumchlorid 5 g, Calciumcarbonat 10 g und Natriumnitrat 1 g. 



   Nährlösung Nr. 22 : Mannit 20   g,"Distillers solubles"20   g, Natriumchlorid 3 g und Natriumnitrat 1 g. 



   Nährlösung Nr. 19 : Mannit 20 g und Sojamehl 20 g. 



   Dabei wird bei der Verwendung von Nährlösung Nr. 19 vorwiegend Cinerubin A gebildet und mit Nährlö- sung Nr. 12/41 hauptsächlich Cinerubin B. Mit Nährlösung Nr. 22 wird ein Gemisch von Cinerubin A und B produziert. 



   Zur Isolierung der Cinerubine können z. B. folgende Verfahren dienen. Man trennt das Mycel vom
Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge der Antibiotika im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen der Antibiotika am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton und Methyläthylketon, oder aber organische oder anorganische Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure. Diese My- celextrakte werden entweder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat ge- geben.

   Man extrahiert das Gemisch vorteilhaft bei einem pH über 7 mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat,
Kohlenwasserstofien, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlo- rid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alko holen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern u. dgl. An Stelle einer Lösungsmittel-Extraktion der Kulturen, oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation, kann man die Antibiotika auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extraktion des Adsorbates z.

   B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon. 



   Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vorgängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren. 



   Eine weitere Anreicherung lässt sich dadurch erzielen, dass man die antibiotikahaltigen organischen Extrakte mit einer sauren wässerigen Lösung mit einem PH unter 5 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in die   wässerige   Phase übergeht. Eine geringere Menge aktiver Substanz bleibt in der organischen Phase zurück. Die vereinigten sauren wässerigen Lösungen werden dann bei einem PH über 7 in der beschriebenen Weise wieder mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Diese Prozedur kann mehrere Male wiederholt werden. Als saure wässerige Lösungen eignen sich verdünnte Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphatpuffer. 



   Ein gutes Reinigungs- und gegebenenfalls Trennungsverfahren für die neuen Antibiotika stellt die Verteilung zwischen einer sauren oder einer alkoholischen wässerigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweckmässig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstromverfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie ist zur Reinigung und gegebenenfalls Trennung geeignet. 



  Die Gewinnung der reinen Antibiotika in kristalliner Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloroform, Aceton-Methanol-Gemischen, Aceton-ÄtherGemischen,   Aceton-Petroläther-GemischenoderBenzol-Methanol-Gemischen   vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch   wässerig- organische   Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw. 
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Bei der Hydrolyse mit verdünnten Mineralsäuren zerfällt das Antibiotikum Cinerubin A in zwei reduzierende Zucker-Komponenten und in ein neutrales, antibiotisch wirksames Aglykon, das Cinerubinon.

   

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<tb> 
<tb> Hemmende <SEP> Konzentration
<tb> Testorganismen <SEP>  g/cm
<tb> Cinerubin <SEP> A <SEP> Cinerubin <SEP> B
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 0,1 <SEP> 10
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.

   <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,01 <SEP> 0,01
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> * <SEP> l <SEP> 10
<tb> Entamoeba <SEP> histolytica <SEP> * <SEP> * <SEP> < <SEP> 33 <SEP> < <SEP> 100
<tb> 
   *     in Kirchner's   synthetischem Medium mit 5   #bovinem   Albumin kultiviert ; Ablesung des Wachstums nach zwei Wochen. 



  * * Kultur in   Bacto-Entamoeba-Medium ;   Ablesung der amoebiciden Wirkung nach 24 Stunden. 

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   Die Entwicklung von Influenza-Virus auf isolierten Membranen der Hühner-Chorioallantois von
14-tägigen Bruteiern wird von Cinerubin A und B noch in einer Konzentration von weniger als 1   big/cma   gehemmt, während das Chorioallantois-Gewebe selbst durch 100   jug/cmS   nicht toxisch geschädigt wird. 



   Ferner sind die Cinerubine stark tumorhemmend wirksam, so wird z. B. das Wachstum des Mäusetu- mors Adenocarcinom EO 771 stark gehemmt. 



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden ausser den Herstellungsverfahren für die kristallinen
Antibiotika Cinerubin A und B und für ihre neutralen und sauren Salze auch die genannten Verbindungen selbst, insbesondere die Cinerubinsulfate, die   Cinerubin-hydrochloride, -acetate und -pantothenate,   wei- ter die mittels Hydrierung oder Oxydation erhaltenen Umwandlungsprodukte, sowie die Spaltprodukte, wie sie z. B. bei der Hydrolyse von Cinerubin A und B erhalten. werden. 



   Die Antibiotika Cinerubin A und B, ihre Salze und Derivate, die oben genannten Umwandlung-un
Spaltprodukte, oder entsprechende Gemische können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Prä- parate Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorgani- schen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Ben- zylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträ- ger. Die pharmazeutischen Präparate können z.

   B. als Tabletten, Dragées, Pulver, Salben, Cremen, Sup- positorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder
Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. 



   Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. 



     Beispiel l :   Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung : 20 g Sojamehl, 20 g Mannit und 11 Leitungswasser und stellt sie auf PH 7, 8 ein. Diese, bzw. ein Vielfaches derselben, wird in
500   cms-Erlenmeyern   (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500 l-Fermentern (mit je 300   l   Nährlösung) abgefüllt und   20 - 30   Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10   %   einer teilweise spo- rulierenden, vegetativen Kultur des Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans an und inkubiert un- ter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit zirka 1 Volumen steri- ler Luft pro Volumen Nährlösung pro Minute) bei 270.

   Nach   70-120 Stunden   Wachstum filtriert man die
Kulturen unter Zusatz eines Filterhilfsmittel je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Fil- terpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wässerige Lösung, die hauptsächlich Cinerubin A enthält, vom Mycel und andern festen Bestandteilen. 



     Beispiel 2 :   Verwendet man an Stelle des in Beispiel 1 angegebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen a, b, c, d oder e, so erhält man nach analoger Sterilisation, Beimpfung mit Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans, Inkubation bei 270 und Filtration wässerige antibiotisch wirksame Lösungen, wobei mit den Nährlösungen a, b, c und e ein Gemisch von Cinerubin A und B und mit Nährlösung d vorwiegend Cinerubin B erhalten wird. a) 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt (oxo Lab Lemco), 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 1   l   Leitungswasser ; PH vor der Sterilisation   7, 5.   b) 10 g Rohglukose, 10 g"Distillers solubes", 1 g Natriumnitrat, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 1   l   Leitungswasser ;

   PH vor der Sterilisation   7, 5.   c) 10 g Rohglukose, 20 cm3 Maisquellwasser (corn steep liquor), 2 g sek. Kaliumhydrophosphat und 1   l   Leitungswasser ; PH vor der Sterilisation   7, 5.   d) 20 g Glycerin, 10 g Sojamehl, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat, 1 g Natriumnitrat und 1   l   Leitungswasser ; PH vor der Sterilisation 7, 5. e) 20 g Mannit, 20 g"Distillers solubles", 3 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat und 11 Leitungswasser ; PH vor der Sterilisation 7,8. 



   Beispiel 3 : Der Filterrückstand eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 150 -Ansatzes wird mit   25 I   Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die antibiotikumhaltigen Acetonlösungen vereinigt im Vakuum auf   5 1   einengt und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird nun bei pH 8,5 mit   70 I   Äthylacetat im Westfalia-Extraktor ausgezogen, wobei die gesamte antibakteriell aktive Substanz in die organische Phase übergeht. Der Extrakt wird nun mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 5 1 eingedampft und dann mehrere Male mit 0,5-n. Essigsäure ausgeschüttelt. Die Äthylacetatlösung zeigt nun eine geringe antibakterielle Aktivität, während der Hauptteil der Aktivität in den   essigsauren Lösungen   gefunden wird.

   Diese orangerot   gefärbten Lösungen   werden vereinigt, 

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 Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein. Man erhält so die dunkelrot gefärbten, antibakteriell hochwirksamen Rohbasen. 



   Der Äthylacetatextrakt, der nach der beschriebenen Behandlung mit verdünnter Essigsäure noch eine relativ geringe antibakterielle Aktivität zeigt, wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält ein dünnflüssiges, rotes Öl. Dieses wird mit Petroläther behandelt, wobei ein rotes Pulver erhalten wird, das je nach der verwendeten Nährlösung aus Cinerubin A, Cinerubin B oder Gemischen davon besteht. 



   Beispiel 4 : 2, 95 g der gemäss Beispiel 1 und 3 erhaltenen Rohbasen werden einer 120-stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei man das folgende Lösungsmittelgemisch verwendet : 5 Vol.-Teile Tetrachlorkohlenstoff,   4, 5 Vol. -Teile   Methanol und 0,7 Vol.-Teile Wasser. Nach dem Eindampfen des Inhaltes der einzelnen Verteilungsgefässe im Vakuum bei 300 findet man bei den Stufen 7, 51, 63, 88 und 155 kleine Substanz- und Aktivitätsmaxima, während die Hauptmenge der Substanz und der Aktivität bei Stufe 22 angereichert ist. Die Fraktionen   14 - 35   werden vereinigt und man erhält 1, 61 g papierchromatographisch einheitliches Cinerubin A. Es wird aus einem Aceton-Methanol-Gemisch umkristallisiert und bildet stark lösungsmittelhaltige Plättchen, die beim Trocknen zu einem dunkelroten Pul- 
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    - 1570.

   Analyse :13, 10 p, 13, 49 p,   13,75   p   und   14, 21 je.   



   Im   Rundfilter-Papierchromatogramm   mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid zeigt Cinerubin A einen   Rp-Wert   von 0, 55. Unter den gleichen Bedingungen bleiben Rhodomycin A und B an der Auftropfstelle. 



   Beispiel 5 : Eine Lösung von 50 mg Cinerubin A in 10   cms1-n.   Schwefelsäure wird 20 Minuten auf 100  erhitzt. Dabei scheiden sich rote Flocken aus. Nach dem Abkühlen wird die rote Lösung mit Äthylacetat ausgeschüttelt, wobei die Farbe in die organische Phase übergeht. 



   Die wässerige Phase wird nun mit 2-n. Bariumhydroxyd neutralisiert, filtriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand enthält mindestens zwei reduzierende Zucker, die im Papierchromatogramm mit einem mit Wasser gesättigten Gemisch von Butanol-Eisessig   (9 : 1) Rp - Werte   von 0, 13, resp.   0, 38   zeigen. 



   Die rot gefärbten Äthylacetat-Extrakte werden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält das Cinerubinon aus einem Benzol-Methanol-Gemisch in leuch- 
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 ;Rp-Wert von 0, 8. Mit konzentrierter Schwefelsäure gibt es eine reine blaue Färbung. 



   Das Cinerubinon ist gegenüber verschiedenen Testorganismen antibiotisch wirksam. 



     Beispiel 6 : 16 g   der gemäss Beispiel 2 (Nährlösung d) und Beispiel 3 erhaltenen Rohbasen werden einer 300-stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei das folgende Lösungsmittelgemisch verwendet wird : 7, 5 Vol.-Teile Tetrachlorkohlenstoff, 6, 375VoI.-Teile Methanol und 1, 125 Vol.-Teile Wasser. Der Inhalt der einzelnen Verteilungsgefässe wird im Vakuum bei 300 eingedampft. Neben kleineren Ak- 
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 und mit 500 cm3 Wasser versetzt. Darauf trennt man die untere Phase ab und extrahiert die obere Phase noch zweimal mit je 200 cm3 Tetrachlorkohlenstoff. Die Extrakte werden vereinigt, mit etwas Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man löst den Rückstand in 50 cm3 Benzol und gibt in der Wärme etwa Methanol zu.

   Beim Stehen scheidet sich das Cinerubin B in 

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<tb> 
<tb> - <SEP> 1810.\max <SEP> 235 <SEP> 258 <SEP> 291 <SEP> 297 <SEP> 394 <SEP> 415
<tb> log <SEP> E <SEP> @@ <SEP> 2,77 <SEP> 2,46 <SEP> 2,03 <SEP> 2,025 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 1, <SEP> 67 <SEP> 
<tb> 1 <SEP> cm <SEP> 
<tb> X <SEP> max <SEP> (mal) <SEP> 471 <SEP> 488 <SEP> 497 <SEP> 519 <SEP> 533
<tb> logE% <SEP> 2, <SEP> 17 <SEP> 2, <SEP> 24 <SEP> 2, <SEP> 27 <SEP> 2, <SEP> 16 <SEP> 2, <SEP> 10 <SEP> 
<tb> 1cm
<tb> 
 
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 auf 100  erhitzt und wie in Beispiel 5 beschrieben aufgearbeitet. Die aus den Äthylacetat-Extrakten gewonnene Substanz ist identisch mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Cinerubinon. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotika durch aerobe Züchtung neuer Streptomyces-Stämme in einer wässerigen Nährlösung, die anorganische Salze, Stickstoff- und Kohlenstoffverbindungen und ge- gebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe enthält, und darauffolgende Abtrennung der antibiotisch wirksa- men Substanzen aus dem Kulturfiltrat und allfälliger weiterer Reinigung und Gewinnung kristallisierter
Reinsubstanzen bzw. Überführung in kristallisierbare Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man den
Streptomyces-Stamm A 6143 (Zürich) (bzw. seine Varianten oder Mutanten) aerob züchtet, bis die Nähr- lösung eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt,   u.

   zw.   vorzugsweise submers während 36-120
Stunden und bei einer Temperatur zwischen 20 und   400 C,   die antibiotisch wirksamen Substanzen bzw. Substanzgemische (Cinerubin A und Gemische mit Cinerubin B) hierauf aus dem Kulturfiltrat nach an sich bekannten Methoden isoliert, gegebenenfalls auftrennt und weiter reinigt und allenfalls durch
Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren bzw. ihren Salzen die Antibiotikum-Salze her- stellt. 



   2. Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotika durch aerobe Züchtung neuer Streptomyces-Stämme in einer wässerigen Nährlösung, die anorganische Salze, Stickstoff- und Kohlenstoffverbindungen und ge- gebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe enthält, und darauffolgende Abtrennung der antibiotisch wirksa- men Substanzen aus dem Kulturfiltrat und allfälliger weiterer Reinigung und Gewinnungkristallisierter   Reinsubstanzen bzw. Überführunginkristallisierbare   Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man. den Strepto- myces-Stamm A 6143 (Zürich) (bzw. seine Varianten oder Mutanten) aerob züchtet, bis die Nährlösung eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, u. zw.

   vorzugsweise submers während   36 - 120   Stunden und bei einer Temperatur zwischen 20 und 400 C, die antibiotisch wirksame Substanz Cinerubin B hier- auf aus dem Kulturfiltrat nach an sich bekannten Methoden isoliert, gegebenenfalls weiter reinigt und allenfalls durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Säuren bzw. ihren Salzen die Anti- biotikum-Salze herstellt.

Claims (1)

1. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die antibiotisch wirksamen Substanzen aus dem Kulturfiltrat bei einem PH über 7 durch ein mit Wasser nicht mischbares, organisches Lösungs- mittel extrahiert werden.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die antibiotisch wirksamen Substanzen aus dem abgetrennten Mycel durch ein mit Wasser wenigstens teilweise mischbares organisches Lösungs- mittel extrahiert werden.

   5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die antibiotisch wirksamen Substanzen aus dem abgetrennten Mycel durch eine organische oder anorganische Säure extrahiert werden.

   6. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass die antibiotisch wirksamen Substanzen durch Adsorption, vorzugsweise mittels Aktivkohle, und Extraktion aus dem Adsorbat mit einem in Was- ser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel gereinigt und gegebenenfalls getrennt wer- den. <Desc/Clms Page number 8>

   7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die antibiotisch wirksamen Substanzen durch Verteilung zwischen einer wässerigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise nach dem Gegenstromverfahren, gereinigt und gegebenenfalls getrennt werden.

   8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man Cinerubin A oder Gemische von Cinerubin A und B einer sauren Hydrolyse unterwirft und das antibiotisch wirksame Aglykon Cinerubinon isoliert.

   9. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man Cinerubin B einer sauren Hydrolyse unterwirft und das antibiotisch wirksame Cinerubinon isoliert.