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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das im folgenden mit Echanomycin bezeichnet wird.
Das Antibiotikum Echanomycin entsteht bei der Kultur einer neuen Aktinomyceten-Art der Gattung Streptomyces, die mit keiner der in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 6. Aufl., oder in Actinomycetes and their Antibiotics von Waksman und Lechevalier 1953 aufgeführten Arten identisch ist und im folgenden als Streptomyces echinatus nov. sp. beschrieben wird.
Sie wurde aus einer in Angola gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A 8331 aufbewahrt.
Streptomyces echinatus bildet ein aschgraues Luft- mycel. Es trägt Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces sind. Die Sporen sind elliptisch bis oval. Ihre Oberfläche ist mit langen, dünnen Stacheln bedeckt, und ihre Grösse beträgt 0,9,u x 0,6-0,7,u. Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32 .
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces echinatus auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1-8 und 12 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (l952) hergestellt.
1. Synthetischer Agar: Wachstum dünn, schleierartig, grünlichgelb oder zitronengelb bis lauchgrün ; Luftmycel sammetig, schneeweiss nach 4 Tagen, zitronengelb nach 7 Tagen; Pigment grünlichgelb bis grasgrün nach 14 Tagen.
?. Synthetische Lösung: Wachstum spärlich, feine Trübung. 3. Glucosebrühe: Flottierendes Wachstum, punkt- förmig, hellbraun; kein Pigment.
4. Glucose-Agar: Substratmycel runzlig, dottergelb; Luftmycel sammetig, schneeweiss im Zentrum, bräunlichgelb am Rand nach 4 Tagen, wollig, grauweiss bis aschgrau nach 7 Tagen; Pigment sattgelb bis goldgelb.
5. Glucose-Asparagifa-Agar: Substramycel dünn, glatt, goldgelb bis grünlichgelb, nach 7 Tagen auch grünlichgrau; Luftmycel sammetig, von oben nach unten im Reagensglas aschgrau, rötlichviolett, weissgrau nach 4 Tagen, auf die ganze Länge des Schrägagars aschgrau nach 7 Tagen; kein deutliches Pigment.
6. Calciufnf7nalat-Agar: Wachstum dünn, schleierartig, blassgelb nach 4 Tagen, grünlichgelb nach 7 Tagen; Luftmycel staubig milchweiss bis blassgelb; kein Pigment.
7. Gelatinestich 18 C: Wachstum oberflächlich, dünn, dunkelbraun; Luftmycel sammetig grünlichgrau nach 14 Tagen; Pigment dunkelbraun; keine Verflüssigung nach 31 Tagen.
B. Stärkeplatte: Wachstum pustelig, sattgelb; Luft- mycel sammetig, aschgrau; keine Hydrolysierung oder höchstens Spuren nach 5 Tagen.
9. Nähragar: Wachstum punktförmig, hellgelb; kein Luftmycel; kein Pigment.
10. Kartoffeln: Substratmycel flechtenartig, grünlichbis rabenschwarz; Luftmycel spärlich, staubig, weissgrau nach 4 Tagen, graublau nach 7 Tagen; Substrat bräunlich-pechschwarz gefärbt.
11. Karotten: Wachstum dünn, hellgelb; Luftmycel staubig, weissgrau nach 4 Tagen, grünlichblau nach 7 Tagen; kein diffundierendes Pigment.
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12. Lackmusmilch: Ringwachstum und Decke; Luft- mycel staubig, weissgrau bis aschgrau; Gerinnung und Peptonisierung nach 5 Tagen, vollständig nach 12 Tagen.
Streptomyces echinatus wächst, nach der Methodik von T. G. Pridham und D. Gottlieb, J. Bacteriology 56, 107 (l948) untersucht, bei Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen wie folgt:
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L-Xylose Inulin L-Arabinose -E- D-Mannit L-Rhamnose @- D-Sorbit D-Fruktose -f- Dulcit D-Galaktose + Mesoinosit -ESaccharose - Salicin Maltose Natriumacetat Lactose -+- Natriumcitrat Raffinose -f- Natriumsuccinat -+- Dabei bedeutet: -f- gutes Wachstum, sichere Verwendung der betr. Kohlenstoffquelle.
- kein Wachstum, keine Verwendung der betr. Kohlenstoffquelle.
Streptomyces echinatus zeigt gewisse Ähnlichkeiten mit S. griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici und mit S. flaveolus (Waksman) Waksman et Henrici, die beide ebenfalls ein aschgraues Luftmycel und Sporen mit Fortsätzen besitzen. Bei S. flaveolus bestehen diese Fortsätze aber nach T. R. Vernon [Nature, 176, 935 (1955)1 aus bis zu 1,ss langen Haaren.
Andererseits besitzt S. griseoflavus maximal 0,2,u lange Stacheln auf den Sporen, also bedeutend kürzer als bei S. echinatus. Ausserdem bildet S. griseoflavus kein gelbes Pigment und gibt totale Gelatineverflüssigung sowie mittlere Stärkehydrolyse.
Zur Herstellung des Antibiotikums Echanomycin können auch Varianten des Streptomyces echinatus, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- und Röntgenstrahlen oder von Stickstoff Senfölen gewonnen werden, verwendet werden.
Zur Erzeugung des Antibiotikums Echanomycin wird Streptomyces echinatus oder dessen Mutanten vorzugsweise in wässriger, anorganische Salze, eine Kohlenstoff und Stickstoffquelle enthaltender Nährlösung gezüchtet.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Als stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende Kohlehydrate und wachstumsfördernde Stoffe seien z.B. genannt:
Amino- säuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie von Mais und Weizen, von Destillations- rückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefc, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze, ferner Glukose, Saccharose, Lactose, Stärke usw.
Die Züchtung erfolgt am besten acrob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 . Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1 %2-5 Tagen.
Zur Isolierung des Antibiotikums können z. B. folgende Verfahren dienen: Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton und Methyläthylketon. Diese Mycelextrakte werden entweder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben.
Man extrahiert das Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasserstoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern und dergleichen.
Anstelle einer Lösungs- mittel-Extraktion der Kulturen oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation kann man das Antibiotikum auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extraktion des Adsorbates z. B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon.
Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vorgängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
Eine weitere Anreicherung lässt sich dadurch erzielen, dass man die antibiotikumhaltigen organischen Extrakte zuerst mit einer sauren wässrigen Lösung mit einem pH unter 5 und dann mit einer alkalischen wässrigen Lösung mit einem pH über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in der organischen Phase bleibt, aus der das Echinomycin isoliert wird.
Eine geringere Menge Aktivität findet sich in den alkalisch-n wässrigen Auszügen, aus denen mittels Extraktion mit den oben genannten organischen Lösungsmitteln bei einem pH unter 5 eine antibiotisch aktive organische Säure ge-
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wonnen werden kann. Als saure wässrige Lösungen eignen sich verdünnte Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphatpuffer, und als alkalische wässrige Lösungen verdünnte Alkalien, wie Natronlauge oder Kalilauge, oder Pufferlösungen, wie Phos- phatpuffer und dergleichen.
Ein gutes Reinigungsverfahren für das neue Antibiotikum stellt die Verteilung zwischen einer alkoholischen wässrigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweckmässig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstromprinzip in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie ist zur Reinigung sehr geeignet. Die Gewinnung des reinen Antibiotikums in kristalliner Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloroform, Aceton-Methanol- Gemischen, Aceton-Äther-Gemischen oder Aceton- Petroläther-Gemischen vor.
Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wässrib organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton usw.
Das Antibiotikum erhält man als farbloses, mikrokristallines Pulver. F. 217-218', [pa]n = -310'. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 55,79 ö, H = 5,74 -ä, N = 15,20 ä, S = 5,24 ,ö, (N)CI-I3 = 5,20 ", (C)CH, = 2,63 ö. Diese Werte weisen auf die Formel C291-1"0,N,S hin, wobei die Substanz keine O-Methylgruppen, jedoch 2 N-Methyl- gruppen und 2 C-Methylgruppen enthalten würde.
Sein UV.-Absorptionsspektrum zeigt zwei Banden bei 242 mli (log = 2,76) und bei 322 mu (log = 2,02). Im
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Infrarot-Spektrum sind Banden
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u. a. bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 5,74,u, 6,00,u, 6,81,u, 7,06[c, 7,22,u, 7,85-8,001c (sehr breite Bande), 8,75,u, 9,06[c, 12,78[c und 13,161c. Echinomycin besitzt keine basischen Eigenschaften und keine leicht acylierbaren Hydroxylgruppen.
Bei der sauren Hydrolyse von Echanomycin entstehen die Aminosäuren D-Serin und L-Alanin sowie weitere Spaltprodukte, die eine positive Farbreaktion mit Ninhydrin geben. Anderseits wird bei milder Behandlung von Echanomycin mit Alkali ein saures Hydrolysierungsprodukt, die Echanomycinsäure , gebildet. Ihr UV.-Absorptionsspektrum zeigt zwei Banden bei 242 mu (log = 2,83) und bei 322m/,t (log = 2,11).
Bei saurer Hydrolyse dieser Säure entsteht
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unter anderem
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Alanin, aber kein Serin. Beim Kochen mit konz. Natronlauge spaltet Echanomycin etwa 1,2 Mol Ammoniak ab, während sich aus dem alkalischen Reaktionsgemisch nach Ansäuern und Ausziehen mit Äthylacetat Chinoxalincarbonsäure-(2) isolieren lässt.
Nach diesen Untersuchungen ist Echa- nomycin offenbar eine peptidartig gebaute Verbindung, in der neben L-Alanin, D-Serin, Chinoxalin-carbon- säure-(2) und wahrscheinlich amidartig gebundenem Ammoniak noch ein dreiwertiger Rest C"H2,03MS vorliegt.
Das Antibiotikum Echanomycin besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschie- denen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37 bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen:
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<tb> Hemmende
<tb> Testorganismen <SEP> Konzentration
<tb> kt <SEP> g/Cm3
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 0,1
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,1
<tb> Streoptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 0,1
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> e1 <SEP> Tor <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 100
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis* <SEP> 100
<tb> Entamoeba <SEP> histolytica** <SEP> 1000
<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> * <SEP> * <SEP> * <SEP> < <SEP> 4
in Kirchners synthetischem Medium mit 5 bovinem Albumin kultiviert; Ablesung des Wachstums nach zwei Wochen.
** Kultur in Bacto-Entamoeba-Medium; Ablesung der amoebiciden Wirkung nach 24 Stunden.
*** In Bouillon mit 10% Pferdeserum bei 37' kultiviert; Ablesung nach 4 Tagen. Die Entwicklung von Influenza-Virus auf isolierten Membranen der Hühner-Chorioallantois von 14- tägigen Bruteiern wird noch in einer Konzentration von weniger als l.,ug/cm' gehemmt, während das Chorioallantois-Gewebe selbst durch 100 [cg/cm3 nicht toxisch geschädigt wird.
In vivo ist das Antibiotikum Echanomycin ebenfalls wirksam. Bei fünfmaliger subkutaner Verabreichung von 5 mg/kg an mit Streptococcus infizierte Mäuse wird der Exitus um 2 Tag-- verzögert. Bei Mäusen wird bei subkutaner Applikation von 1 mg/kg eine 100%ige suppressive Wirkung von Infektionen mit Borrelia recurrens beobachtet. Weiter sind bei amoebeninfizierten Ratten perorale Gaben von 5 mg/kg 100% wirksam.
Lokale Behandlung von Hamstern, die vaginal mit Trichomonas foetus infiziert sind, mit einer 1 %- igen Echanomycin-Lösung zeigt gute Heilwirkung.
Das Antibiotikum Echanomycin kann als Heilmittel Verwendung finden. Man verwendet gewöhnlich Präparate, welche die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial enthalten. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Poly- alkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere be-
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kannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.
B. als Tabletten, Dragdes, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabi- lisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung: 20 g Sojamehl, 20 g Mannit und 1 Liter Leitungswasser und stellt sie auf p$ 7,8 ein. Diese bzw. ein Vielfaches derselben wird in 500-cms-Erlen- meyern (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500-Liter- Fermentern (mit je 300 Liter Nährlösung) abgefüllt und 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10'/'" einer teilweise sporulieren- den, vegetativen Kultur des Streptomyces echinatus an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw.
Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute) bei 27'. Nach 70-120 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wässrige Lösung vom Mycel und andern festen Bestandteilen.
Beispiel 2 Verwendet man anstelle des in Beispiel 1 angegebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen a, b oder d, so erhält man nach analoger Sterilisation, Beimpfung mit Streptomyces echinatus, Inkubation bei 27' und Filtration wässrige antibiotisch wirksame Lösungen.
a) 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt ( Oxo Lab Lemco ) eingetragene Marke, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; p-u vor der Sterilisation 7,5.
b) 10 g Rohglukose, 10 g Distillers solubles, 1 g Natriumnitrat, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calcium- carbonat und 1 Liter Leitungswasser; pg vor der Sterilisation 7,5.
e) 10 g Rohglukose, 20 cm3 Maisquellwasser (corn steep liquor), 2 g sek. Kaliumhydrophosphat und 1 Liter Leitungswasser; p$ vor der Sterilisation 7,5.
d) 20 g Glycerin, 10 g Sojamehl, 5 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; p.H vor der Sterilisation 7,5. Beispiel 3 Der Filterrückstand eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 150-Liter-Ansatzes wird mit 25 Liter Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die antibiotikumhaltigen Acetonlösungen vereinigt im Vakuum auf 5 Liter einengt und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird mit 70 Liter Äthylacetat im Westfalia- Extraktor ausgezogen, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in die organische Phase übergeht.
Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 5 Liter eingedampft und dann mehrere Male mit 0,5-n. Essigsäure und mit 2-n. Natronlauge ausgeschüttelt. Schliesslich trocknet man die Äthylacetat- lösung über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein, wobei ein öliger Rückstand erhalten wird. Durch Behandlung mit Petroläther gewinnt man daraus das rohe Antibiotikum Echinomycin in Form von gelblichen Flocken.
Die oben erwähnten Natronlauge-Auszüge besitzen eine schwache antibiotische Wirksamkeit. Sie werden auf pH 3 gebracht und mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wäscht man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Der gelbe amorphe Rückstand ist antibiotisch wirksam.
Beispiel 4 5,7 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Antibiotikums Echanomycin werden einer 82stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei man das folgende Lösungsmittelgemisch verwendet: 2,63 Vo- lumteile Tetrachlorkohlenstoff, 0,37Volumteile Chloroform, 2,4 Volumteile Methanol und 0,6 Volumteile Wasser. Nach dem Eindampfen des Inhaltes der einzelnen Verteilungsgefässe im Vakuum bei 30' findet man die Hauptmenge der Substanz und der Aktivität bei Stufe 35.
Die Fraktionen 30-40 werden vereinigt und man erhält 1,20 g papierchromato- graphisch einheitliches Echanomycin. Es wird aus Methanol umkristallisiert und bildet ein farbloses, mikrokristallines Pulver. F. 217-218'. [a]D = -310' (in Chloroform).
Analyse: C 55,79 ,ö, H 5,74%, N 15,20%, S 5,24%, (N)CH, 5,20%, (CCH3 2,63%, akt. H' 0,68%. UV.-Absorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei 242 my (log = 2,76 und 322 m,a (log = 2,02); IR.-Absorptionsspektrum in Nujol: Banden
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u. a. bei folgenden
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Wellenlängen: 5,74,u, 6,00,u, 6,81,u, 7,06,u, 7,22,u, 7,85,u-8,OO,u (sehr breite Bande), 8,75,u, 9,06,u, 12,78,u und 13,16,u.
Beispiel 5 5 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Antibiotikums Echanomycin werden an einer Säule aus 150 g Aluminiumoxyd (Aktivität III) nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wobei mit Benzol, Chloroform, Chloroform-Methanol-Gemischen und Methanol eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 400 cm3) werden im Vakuum eingedampft und auf ihre antibiotische Aktivität untersucht. Die Benzol- und Chloroform-Fraktionen enthalten nur wirksame Begleitsubstanzen, während die mit Chloroform- Methanol (99:1)-Gemischen eluierten Anteile hochwirksam sind. Sie werden vereinigt und aus Methanol kristallisiert.
Man erhält 900 mg Echanomycin, F. 217-2l8', [a]D = -310' (in Chloroform).
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