Verfahren zur Herstellung neuer Wuchsstoffe
Die Ferrioxamine sind stickstoff-und eisenhaltige organische Verbindungen, deren Säurehydrolysate ninhydrinpositive Substanzen enthalten. Sie besitzen eine braunrote Farbe und sind leicht löslich in Säuren und stark polaren Lösungsmitteln, wie Wasser, Dimethylformamid, Glykol, ¯thylenglykol-monomethylÏther, sowie in niederen aliphatischen Alkoholen, wie Methanol. Auch in höheren aliphatischen Alkoholen sowie in aromatischen Alkoholen und Phenolen besitzen sie eine beschränkte Löslichkeit, z. B. in Butanol, Benzylalkohol, Phenol.
Ein charakteristischer Vertreter solcher Wuchsstoffe ist das Ferrioxamin B. Im Hauptpatent Nr. 413 853 ist ein Verfahren zu dessen Herstellung beschrieben. Es wird als Hauptprodukt z. B. von Streptomyceten produziert. Daneben findet man weitere Stoffe, die als Ferrioxamin A, C, D, E und X bezeichnet werden sollen.
Zur Erkennung der Ferrioxamine auf dem Papier kann ihre blaue Farbreaktion mit Ferrichlorid-Kalium- ferricyanid-Reagens sowie ihre Antisideramycinwir- kung verwendet werden.
Bei der Hydrolyse mit Säuren erhält man Produkte, die zum Teil mit Ninhydrin eine positive Farbreaktion geben. Bei der Craig'schen Verteilung des aus dem Kulturfiltrat von Streptomyceten (2-10-tägige Fermentation bei 27 ) durch Extraktion mit Phenol-Chloroform (1 g : l ml) erhaltenen Rohproduktes lassen sich 5 Fraktionen gewinnen, deren Extinktion bei 425 m, ce in Fig. 2 dargestellt ist. Aus der Hauptfraktion III erhält man bei der Chromatographie an dem Ionenaustauscherharz Dowex 50 WX2 reines Ferrioxamin B-hydrochlorid als braunrotes Pulver (Fig. 3, Fraktionen 93-125).
Die aus den Fraktionen II und IV (vgl. Fig. 2) isolierten Ferrioxamine A bzw. C verhalten sich physikalisch-chemisch sehr ähnlich wie Ferrioxamin B. A erweist sich im Papierchromatogramm und in der multiplen Verteilung um ein geringes polarer als B. Bei C verhält es sich umgekehrt. Diesem Befund entspricht auch die im Vergleich zu B schwach erhöhte Basizität von A sowie seine um wenig grössere elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit in schwach essigsau- rer Lösung, bzw. die im Vergleich zu B kleinere Basizität und elektrische Beweglichkeit von C. A und C zeigen weiterhin ähnliche IR.-Spektren und Löslich- keitseigenschaften wie Ferrioxamin B und konnten wie dieses als Hydrochloride bis anhin nur in amorpher Form erhalten werden.
Ferrioxamin A-hydrochlorid ist ein braunrotes Pulver, das sich in Wasser, Methanol, Äthanol, Eisessig, und Dimethylformamid gut löst. Es ist unlöslich in Ather, Aceton, Essigester und Chloroform Rf im Lösungssystem I : 0, 35 im Lösungssystem V : 0, 21 (vgl.
Tab. 1). Mikroanalyse : C 44, 21"/o, H 7, 52 /o, N 12, 63 %, Fe 7,95 %, Cl 5,93 %. Titration : pK*MCS : 9, 89, Aquiv. Gew. : 634. UV-Spektrum in Wasser : max 430 m, u (E 1% 1cm = 37).
Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. folgende Banden : (s = starke Bande, m = mittlere Bande, w = schwache Bande) : 2, 92, u (s) ; 3, 42, u (m) ; 6, 10, u (s) ; 6, 32, u (s) ; 6, 88, u (m) ; 7, 30, bt (w) ; 7, 92, u (w) ; 8, 98, u (w) ; 9, 55, (w) ; 10, 15, (w) ; 10, 67, (w).
Ferioxamin A gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin.
Ferroxamin C-hydrochlorid zeigt annähernd gleiche Löslichkeitseigenschaften wie A. Rf im Lösungsmittelsystem I : 0, 54, im Lösungsmittelsystem V : 0, 37 (vgl.
Tab. 1). Verteilungskoeffizient im System VI : 0, 489 (vgl. Tab. 1). Mikroanalyse : C 48, 33%, H 7,92 %, N 10, 20"/o, C15, 15 /o, Fe6, 82"/o. Titration : pK*, ICs : 8, 88 ; Äquiv. Gew. : 762. UV-Spektrum in Wasser : max 430 mÁ(E 1% 1cm = 39).
Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei : 2, 92, u (s), 3, 43, (s), 5, 85, u (m), 6, 10, u (s), 6, 33, u (s), 6, 87, u (s), 7, 30, u (m), 7, 95, u (m), 8, 23, (m), 9, 65, (w), 13, 23, u (m). Ferrioxamin C gibt eine positive Farbreaktion mit Ninhydrin.
Die aus Fraktion V (vgl. Fig. 2) mittels Chromatographie an Ionenaustauschern isolierten lipophileren Ferrioxamine D und E verhalten sich bei der Elektrophorese und Titration als neutrale Verbindungen (vgl. Tab. 1). Ferrioxamin D, das bei der Ionenaustauschchromatographie als die am schnellsten wandernde Substanz aus einer einheitlich erscheinenden Bande isoliert wird, lÏsst sich durch einfache Verteilung zwischen Chloroform und Wasser in das lipophilere, aus Methanol-Ather in länglichen Prismen kristallisierende Ferrioxamin Dt und das nur in sehr geringer Menge anfallende Ferrioxamin D2 auftrennen, Ferrioxamin D1 ist gut löslich in Wasser, Methanol, ¯thanol, Eisessig, Methylcellosolve und Chloroform, schwer l¯slich in Äther, Aceton, Essigester,
Pyridin und Dimeth ylformamid. Es kristallisiert aus Methanol-Äther in roten Nadeln. F. nach 3maliger Kristallisation 194-200 . Rf im Lösungsmittelsystem I : 0, 73, Rf im Lösungsmittelsystem V : 0, 72 (vgl. Tab. 1). Verteilungskoeffizient im System VI : 1, 80 (vgl. Tab. 1).
Mikroanalyse : C 49, 31 %, H 7, 47 O/o, N 12, 37 %, Cl 0"/o, Fe 7, 66 /o. Titration : keine sauren oder basischen Funktionen feststellbar. UV.-Spektrum im Wasser : ? 430 mÁ (E 1% 1cm = 44).
Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei 2, 95 (s), 3, 06, (s), 3, 25, u (w), 3, 43 u (s), 6,08 Á (s), 6,35 Á (s), 6,86 Á (s), 7,30 Á (m), 7,94 Á (m), 8,20 Á (w), 8,49 Á (w), 8,83 Á (w), 9,00 Á (w), 9, 65, (w), 10, 00, u (w), 10, 31 (w), 10, 67, u (w), 12, 20, u (w), 13, 30, (m). Ferrioxamin D1 gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin.
Ferrioxamin E, das ein differezierteres IR,-Spektrum als die übrigen Ferrioxamine besitzt, unterscheidet sich von diesen auch durch seine schlechte Löslich keit in Wasser und Methanol. Mikroanalyse : C 49, 80"/o, H 7, 37 %, N 12, 48 %, Cl 0 O/o, Fe 8, 14 %.
Titration : keine sauren oder basischen Funktionen feststellbar. UV.-Spektrum in Wasser : imax 430 mA (E = 42).
Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei : 2, 92, (s), 3, 02, (s), 3, 45, u (s), 5, 96, u (s), 6, 15, u (s), 6, 36, u (s), 6, 90, (s), 7, 10, u (m), 7, 15, in (m), 7, 39, u (m), 7, 82, u (w), 7, 98, u (m), 8, 45 u (w), 8, 54, (w), 8, 85, u (w), 9, 01 (w), 9, 20, u (w), 9, 98, (m), 10, 07, (w), 10, 23, (w), 10, 43, u (w), 10, 71, (w), 11, 87, u (w), 13, 20 Á (m), 13, 66, u (w).
Ferrioxamin E gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin.
Ferrioxamin X, das gemäss seinem Verhalten bei der Papierchramatographie und bei der Gegenstromverteilung auch zu der lipophilen Grappe (D und E) gehört, zeigt jedoch, im Gegensatz zu D und E basische Eigenschaften und wird als Hydrochlorid isoliert.
Ferrioxamin X-hydrochlorid ist gut l¯slich in Wasser, Methanol, Pyridin, Eisessig, ¯thanol, Dimethylformamid ; wenig löslich in Chloroform, unlöslich in Essigester, Aceton und Ather. Mikroanalyse : C 50, 44 %, H 7,29 %, N 10, 53 /o, Cl 4,10 %, Fe 5, 57 /o. Rf im Lösungsmittelsystem V : 0, 80 (vgl.
Tab. 1). Verteilungskoeffizient im System VI : 3, 12 (vgl. Tab. 1). Titration : pKMCS9, 75, Aquivalent- gew. 695. Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei 2, 95, u (s), 3, 45 t (m), 6, 10, u (s), 6, 37, (s), 6, 92, u (m), 7, 40 (w), 7, 97, u (w), 8, 50, u (w), 8, 88, (w), 9, 72, u (w), 10, 10, (w), 10, 70, (w), 13, 75, (w). UV.-Spektrum in Wasser : ?max 430 mÁ (E 1% 1cm = 34).
Ferrioxamin X gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin.
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind charakteristische physikalische Daten der bisher isolierten Ferrioxamine vergleichsweise zusammengestellt.
Tabelle I Ferri-Papier-Papierehromatographie Multiple Extinkbion Titration oxamin elektro- Verteilung bei 430 mÁ phorese RfI RfV K VI E1% pK-MCS ¯quiv. a) b) c) d) iem e) Gew.
A 13, 6 0, 35 0, 21 0, 11 37, 9, 89 634 B 13, 0 0, 44 0, 29 0, 23 39 9, 74 704 C 12, 3 0, 54 0, 37 0, 49 39 8, 88 762 Dr 3, 9 0, 73 0, 72 1, 80 44 (neutral) D2 3,9 0, 64 0, 48 (neutral) E 3, 9 0, 68 0, 59 1, 59 42 (neutral) X 12, 5 0, 80 3, 12 34 9, 75 695 a) cm Laufstrecke in 0, 33 N Essigsäure, nach 4t/2 Stunden bei 220 V.
Vergleichsweise wandert Fruktose 3, 9 cm. b) Rf I : Rf-Wert im System I : n-Butanol-Eisessig Wasser (4 : 1 : 5). c) Rf V : Rf-Wert im System V : tert.-Butanol-Was ser-gesättigte wässrige Natriumchloridlösung-0, 1-n.
Salzsäure (50 : 25 : 25 : 1), Papier imprägniert mit Aceton d) K VI : Verteilungskoeffizient im System VI : Wassergesättigte wässrige Natriumchloriglösung (6 : 3 : 1). n-Butanol-Benzylalkohol-Wasser-gesÏttigte wÏssrige Natriumchloridl¯sung-0, 1-n. Salzsäure (200 : 100 : 300 : 60 : 3). Verteilung von 10 mg ber 34 Stufen von je 3 ml organischer und wässriger Phase bei 23-25 . Auswer tung durch Extinktionsmessung (2 ml der mit Alkohol auf 10 ml verdünnten Fraktionen bei 425 m, zl. e) W. Simon et al., Helv. 37 1872 (1954).
Die freien Basen der Ferrioxamine A, C und X sind leicht in üblicher Weise aus ihren Salzen zugäng- lich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wÏssrigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutrralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumcarbonat-und-sulfatniederschlages und Isolierung der freien Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines basischen Anionenaus- tauschers.
Die Salze der Ferrioxamine A, C und X und ihrer Komponenten leiten sich von den bekannten anorganischen und organischen Salzen ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren und Phosphorsäu- ren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin-oder Olsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von Ferrioxaminsulfat mit pantothensaurem Calcium.
Die Ferrioxamine besitzen wachstumfördernde Eigenschaften für eine grosse Zahl von Organismen.
So besitzen sie einen solchen Effekt auf Bacillus subtilis, Micrococcus pyogenes var. aureus, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago sphaerogena und Chlamydomonas eugametos.
Andere Organismen, z. B. Vertreter der Gattung Arthrobacter, wie Arthrobacter terregens und Arthrobacter flavescens, entwickeln sich überhaupt nur in Anwesenheit von Ferrioxaminen. In diesen Fällen besitzen die Ferrioxamine also einen ähnlichen Vitamincharakter, wie es für die Wirksubstanzen Ferrichrom, Terregens Factor und Coprogen gezeigt worden ist.
[Bact. Rev. 21, 101 (1957)].
Eine weitere biologische Eigenschaft der Ferrioxamine besteht darin, dass sie im Stande sind, die Wirkung von Antibiotika, die der Gruppe der Sideramycine angehören, gegenüber grampositiven Erregern kompetitiv aufzuheben. Zu den Sideramycinen gehören u. a. die eisenhaltigen Antibiotika Grisein, Albomycin, die Ferrimycine, das Antibiotikum 1787 [H. Thrum, Naturwiss. 44, 561 (1957)] und die Substanzen L. A. 5352 und L. A. 5937 [P. Sensi und M. T. Timbal, Antibiotics & Chemotherapy 9, 160 (1959)]. Der Antagonismus zwischen den Ferrioxaminen einersaits und den Sideramycinen anderseits kann sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen werden.
Die geschilderte antagonistische Wirkung beschränkt sich ausschliesslich auf die Sideramycin-Antibiotika und konnte bei anderen Antibiotika, wie Neomycin, Viomycin, Streptomycin, Streptothricin, Penicillin, Erythromycin oder Novobiocin, nicht beobachtet werden. Oberraschend ist, dass die Ferrioxamine die Wirkung der griseinartigen Sideramycine gegenüber grampositiven Bakterien aufheben, nicht aber gegen über gramnegativen. Daher lassen sich die griseinarti- gen Antisideramycine leicht neben Ferrioxamin B erkennen.
Die Aufhebung der antibiotischen Wirkung der Sideramycine in vitro eignet sich gut für eine qualitative Erkennung und quantitative Bestimmung der Ferrioxamine, indem der an und für sich zur Bestimmung von synergistisch wirkenden Substanzen ausgearbeitete Test von Benifas [V. Bonifas, Experientia 8, 234 (1952)] sinngemäss angewendet werden kann. Dazu werden Testplatten mit Bacillus subtilis Cohn emend.
Prazmowski oder Staphylococcus aureus Rosenbach hergestellt. Auf diese Platten werden 5 mm breite, mit einer methanolischen Lösung eines Sideramycin-Antibiotikums, z. B. 10 y/ml Ferrimycin, getränkte und auf Filterpapier getrocknete Streifen von Whatman Papier Nr. 1 aufgelegt. Quer dazu werden Streifen gleicher Breite gelegt, die mit der auf Ferrioxamin-Gehalt zu testierenden Lösung getränkt sind.
Nach einer 9-15-stündigen Bebrütung bei 36 C ist eine Beeinflussung der antibiotischen Wirkung des Ferrimycins leicht zu erkennen : im Hemmhof, welcher sich um den Streifen mit dem Antibiotikum bildet, entsteht an der Kreuzung der beiden Streifen eine keilförmige Einschnü- rung, deren Form und Dimensionen unter Standardbe- dingungen zur quantitativen Bestimmung verwendet werden (vgl. Fig. 1). Die gleichzeitige Anwesenheit z. B. von Ferrimycin und äquivalenten Mengen Ferrioxamin in einer zu prüfenden Lösung erkennt man, indem man sie erhitzt, wobei die antibiotische Wirkung verschwindet, während die Ferrioxaminwirkung erhalten bleibt.
Die bereits genannten Substanzen Ferrichrom, Terregens Factor und Coprogen gleichen in ihrem Vitamincharakter für Arthrobacter terregens und Arthrobacter flavescens den Ferrioxaminen. Hingegen ist die oben geschilderte, für die Ferrioxamine typische, wachstumsfördemde Wirkung auf Bacillus subtilis, Micrococcus pyogenes, Saccharomyces cerevisiae, Ustilago sphaerogena und Chlamydomonas eugametos für die drei Substanzen Ferrichrom, Terregens Factor und Coprogen nicht bekannt.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden die Ferrioxamine A, B, C, D, E und X erhalten, wenn man Stämme der Gattung Streptomyces züchtet, die Stoffe mit Antisideramycinwirkung aus dem Kulturmedium isoliert und das erhaltene Ferrioxamin-Gemisch in die Komponenten A, B, C, D, E und X auftrennt.
Die Antisideramycinwirkung kann man im rohen Extrakt oder Kulturfiltrat an Hand des oben erwähnten Testes erkennen. Eine besonders bevorzugte Quelle sind Kulturen von Streptomyceten, die an Hand der von Ettlinger et al. [Arch. Mikrobiol. 3, 326 (1958)] vorgeschlagenen Merkmale den folgenden Arten zugeordnet werden :
Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici, Streptomyces galilaeus Ettlinger et al., Streptomyces pilosus Ettlinger et al., Streptomyces polychromogenus Hagemann, Pinasse et Teillon, Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces aureofaciens Duggar, Streptomyces olivaceus (Waksman) Waksman et Henrici, Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman et Henrici, Streptomyces glaucescens Gause et al.
Zur Gewinnung der Ferrioxamine in grösserem Massstab wird z. B. ein die Eigenschaften der oben angeführten Streptomyceten aufweisender Stamm in wässriger, eine Kohlenstoffquelle, stickstoffhaltige Verbindungen sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche Antisideramycinwirkung zeigt, und die Ferrioxamine hierauf isoliert. Für die Züchtung kommen als Kohlenstoffquelle z. B. Glukose, Saccharose, Laktose, Mannit, Stärke sowie Glycerin in Frage.
Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekömer, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Samen, insbesondere der Raps-und Soyapflanze, der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sau- erstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 . Eine wesentliche Ferrioxaminwirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach lut/2 bis 5 Tagen.
Man gibt zur Kultur 0, 1 O/o Ferrichlorid zu und trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge der Ferrioxamine im Kulturfiltrat gefun- den wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon im Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wässrige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wässriges Methanol.
In ähnlicher Weise kann man auch Bakterien, z. B.
B. subtilis, züchten und das Kulturfiltrat als Quelle für die Isolierung der Ferrioxamine verwenden.
Für die Isolierung der Ferrioxamine aus den genannten Materialien, insbesondere den Kulturfiltraten von Pilz-oder Bakterienzüchtungen, kann man nach an sich bekannten Methoden vorgehen und z. B. eine der nachfolgend angegebenen Arbeitsweisen oder Kombinationen davon verwenden.
1. Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z. B.
Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Frankonit, Fullererde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Slution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser, z. B. mit Wasser Methanol, Wasser-Pyridin-, verdünnte Essigsäure-Meth- anol-oder Wasser-Methanol-Eisessig-Butanol-Gemi- schen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Frankonit-oder Noritadsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Volumteile) und Pyridin (1 Volumteil) erwiesen.
2. Eine zweite Methode zur Abtrennung der Ferrioxamine besteht darin, dass man sie an Kationenaustauschern adsorbiert, wobei besonders Säuregruppen enthaltende Harze, wie Dowex-50, geeignet sind. Letzteres kann sowohl in der Säureform als auch in der Natriumform verwendet werden, doch hat sich auch ein Gemisch dieser beiden Formen bewährt. Die Elution geschieht zweckmässig mit sauren Agentien, z. B. mit methanolischer Salzsäure oder mit sauren Pufferlö- sungen.
3. Weiter können die Ferrioxamine einer wässrigen Lösung mittels organischen Lösungsmitteln entzogen werden. Für diese Extraktionsverfahren haben sich höhere organische Alkohole, z. B. Benzylalkohol oder Isopropylalkohol, besonders bewährt. Zweckmässiger- weise wird dabei der wässrigen Phase ein anorganisches Salz, z. B. Ammoniumsulfat oder Natriumchlo- rid, zugesetzt. Aus den erhaltenen organischen Extrakten können die Ferrioxamine entweder durch Abdamp- fen des Lösungsmittels oder durch Ausfällung mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z. B.
Ather, Petroläther oder Athylacetat, in angereicherter Form erhalten werden.
4. Eine Anreicherung der Ferrioxamine wird auch dadurch erreicht, dass man konzentrierte, wässrige oder alkoholisch-wässrige Lösungen des Salzes mit einem tÇberschuss an organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Aceton, Dioxan etc., versetzt, wobei die Salze in fester Form ausgefällt werden.
5. Eine weitere Methode der Anreicherung der Ferrioxamine besteht darin, dass man wässrige Lösun- gen desselben mit Lösungen von Phenol in Chloroform extrahiert, wobei sowohl das pH der wässrigen Lösung als auch der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden. So befinden sich die Ferrioxamine z. B. bei einer Verteilung zwischen einer Lösung, die auf 100 ml Chloroform 100 g Phenol enthält, und einer wässmgen Phase von pH 1 bis 6 fast ausschliesslich in der organischen Phase, während sie bei der Verwendung einer Lösung, die auf 100 ml Chloroform nur 33 g Phenol enthält, der wässrigen Phase lediglich bei einem pH zwischen 4 und 6 annähernd vollständig entzogen werden.
Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten der Ferrioxamine das Verhältnis von Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wässrigen, so geht aus den obigen Angaben hervor, dass der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt der organischen Phase zunimmt und mit sinkendem pH der wässrigen Phase abnimmt. Da es somit möglich ist, jeden beliebigen Verteilungskoeffizienten der Ferrioxamine in diesem System einzustellen, kann man durch Kombination von wenigen Vertei lungsoperationen einen Grossteil inaktiver Verunreinigungen abtrennen.
6. Eine andere Methode zur Anreicherung und/oder Auftrennung der Ferrioxamine stellt die Chromato- graphie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z. B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silicagel, Calciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel, Celite und dgl. als Trägersubstanzen, oder aber Chromatographie an lonenaustauscherhar- zen, z. B. an Dowex-50, Amberlite IRC-50 und dgl.
7. Weiter können die Ferrioxamine durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert und/oder voneinander getrennt werden. Folgende Lösungsmittelsy- steme haben sich dabei besonders bewährt : a) Benzylakohol-20 /oige wässrige Lösung von Ammoniumsulfat. b) n-Butanol (100 Volumteile)-Benzylalkohol (200 Volumteile)-1-n. Salzsäure (6 Volumteile) Wasser (300 Volumteile)-wässrige, bei 19 gesättigte Natriumchloridlösung (60 Volumteile).
8. Schliesslich eignet sich die präparative Elektrophorese an einer Saute mit Trägermaterial gut zur Rei nigung, Anreicherung und Auftrennung von Ferriox amin-Präparaten. Diese wird vorzugsweise als Hoch spannungselektrophorese bei 500-4000 Volt durchgeführt. Eine weitere Verbesserung besteht darin, dass man dieses Verfahren nach dem sogenannten Gegen stromprinzip durchführt. Dabei werden die als Kationen vorliegenden Ferrioxamine auf der Trägersäule örtlich festgehalten, indem man die durch das elektri- sche Feld hervorgerufene Bewegung mittels einer in entgegengesetzter Richtung verlaufenden Strömung des Elektrolyts genau kompensiert.
Dadurch wird erreicht, dass Stoffe mit anderer elektrischer Beweglichkeit die Trägersäule an den beiden Elektrodenenden verlassen.
Die Ferrioxamine A, C, D, E und X, ihre Kompo- nenten und Derivate und die Salze dieser Verbindungen können als Wuchsstoffe für verschiedene Organis men verwendet werden und zwar entweder allein oder in Form von speziellen Präparaten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Fig. 1 zeigt den Antagonismus zwischen Ferrioxaminen und Ferrimycin im abgeänderten Bonifas-Test.
Die schraffierten Flächen zeigen die Hemmung des Wachstums des Testorganismus.
Fig. 2 zeigt eine Gegenstromverteilung von rohem Ferrioxamin über 80 Stufen mit je 100 ml organischer und 100 ml wässriger Phase im System n-Butanol-Ben zylalkohol-gesätt. wässrige Kochsalzlösung-N-Salzsäure (100 : 200 : 300 : 60 : 6).
..Extinktionbei425mu.))Antisider- amycinaktivität in mm (abgeänderter Bonifas-Test).
Fig. 3 zeigt ein Chromatogramm von Fraktion III von Fig. 2 an Dowex 50-WX2 mit Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel.
Beispiel 1
Die Züchtung des Streptomyces pilosus, Stamm A 21748, (Institut für spezielle Botanik, Eidgenössi- sche Technische Hochschule, Zürich) wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Soyamehl und 20 g Mannit enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein pH von 7, 2-7, 6. Die Beimpfung erfolgt mit bis zu 20 /o einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des genannten Organismus.
Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 24-30 , wobei die Kulturen in Fermentern mit ca. 2 Volumen Luft je Volumen Lösung pro Minute belüftet werden. Nach 72-144 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den höchsten Gehalt an Ferrioxamin erreicht. Man unterbricht die Kultur, gibt 0, 1 O/o Ferrichlorid zu, trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge der die Ferrioxamine enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1 /o eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird. Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser oder wässrigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem Kulturfiltrat.
Das gewonnene Kulturfiltrat wird unter stetem Rühren mit 2 /o Tonerde, z. B. Frankonit, versetzt. Nach gründlicher Durchmischung filtriert man ab und wiederholt mit dem erhaltenen Filtrat den Absorptionsvorgang 1-2 mal. Die Filterrückstände werden vereinigt und mehrmals mit Wasser und wässrigem Methanol gewaschen.
Anschliessend werden die Filterrückstände 2-3 mal mit einem Pyridin-Wassergemisch (1 : 4) eluiert. Das durch Filtration geklärte Eluat wird am Vakuum eingeengt. Die erhaltenen Konzentrate können entweder direkt weiter verarbeitet werden (siehe Beispiel 3) oder man kann daraus mittels Gefriertrocknung ein Gemisch der Ferrioxamine in roher Form isolieren.
Verwendet man anstelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hohem Gehalt an Ferrioxaminen. a) Saccharose 20 g
Natriumcitrat 0, 9 g
Ammoniumacetat 3 g sek. Kaliumphosphat 3 g
Magnesiumsulfat 0, 8 g
Kupfersulfat 0, 01 mg Manganchlorid 0, 07 mg
Ferricitrat 20 mg b) Rohglukose 10 g
Soyamehl 10 g
Cornsteep liquor 20 g
Kochsalz 5 g
Natriumnitrat 1 g
Kalk 10 g c) Raps-Extraktionsschrot 20 g
Rohglukose 10 g sek.
Kaliumphosphat 0, 2 g
Kalk 10 g d) Flachsmehl 40 g
Rohglukose 10 g sek. Kaliumphosphat 0, 2 g
Kalk 10 g
Anstelle des angegebenen Stammes der Art Streptomyces pilosus können die folgenden Stämme verwendet werden (unter den angegebenen Stamm-Nummern werden die Stämme im Institut für spezielle Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich, aufbewahrt). Nach analoger Züchtung und Aufarbeitung erhält man Kulturfiltrate von ähnlich hohem Ferriox amingehalt.
Stamm Nr. : Streptomyces Art :
9578 S. griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici 15311 S-griseoflavus 11686 S-pilosus Ettlinger et al.
23258 S-pilosus 23305 S-pilosus 17635 S-viridochromogenes (Kreinsky)
Waksman et Henrici 18055 S-viridochromogenes
6445 S-olivaceus (Waksman) Waksman et Henrici
7346 S-olivaceus
7437 S-olivaceus 22083 S-aureofaciens Duggar 22765 S-aureofaciens 18822 S-galilaeus Ettlinger et al.
14677 S-lavendulae (Waksman et Curtis)
Waksman et Henrici 21510 S-lavendulae 21837 S-polychromogenes Hagemann et al.
23217 S-polychormogenes 23310 S-polychromogenes 10112 Sgriseus Waksman et Henrici 13495 S-griseus
7419 S-griseus
Beispiel 2
Der Stamm A 23978 der Art Streptomyces aureofaciens (Institut für spezielle Botanik, Eidgenössische Technische Hochschule, Zürich) wird submers gezüch- tet auf einer Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Malzextrakt, 20 g Distillers solubles enthält. Die Züchtung und Aufarbeitung erfolgt gleich wie in Beispiel 1, wobei Kulturfiltrate erhalten werden mit ähn- lich hohem Ferrioxamingehalt.
Beispiel 3
60 Liter Kultur werden in der in Beispiel 1 dargestellten Weise hergestellt und aufgearbeitet. Das gewonnene Pyridin-Wasser-Eluat (ca. 6 Liter) wird im Vakuum auf 3 Liter eingeengt. In diesem Konzentrat werden 870 g Ammonsulfat gelöst. Die Lösung wird durch Filtration oder Zentrifugation, gegebenenfalls unter Zugabe von 1 /o Hyflo Supercel, geklärt. Durch 3-4-maLiges Ausschütteln mit Benzylalkohol oder Isopropylalkohol werden die Ferrioxamine in das organische Lösungsmittel übergeführt. Die organischen Phasen werden vereinigt und mit Hilfe von Natriumsulfat getrocknet. Man gibt einen Oberschuss von Ather oder Athylacetat zu und filtriert die ausgefällten Ferriox- amine ab. Der Zusatz von Filterhilfsmittol, z. B.
Hyflo Supercel, vor der Ausfällung erleichtert die Gewinnung des Niederschlages. Aus diesem können die Ferrioxamine mit Methanol oder Wasser ausgewaschen werden.
Diese Eluate werden eingedampft oder lyophilisiert und man erhält so die Ferrioxamine in angereicherter Form.
Beispiel 4
Einem gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturfiltrat werden pro Liter 20 g Kochsalz zugefügt. Die klare Lösung wird 3mal mit'/,, Volumen Chloroform-Phenol-Gemisch (1 Volumteil Chloroform, 1 Gewichtsteil Phenol) ausgezogen. Die organischen Phasen werden vereinigt, unter Zusatz von Hyflo Supercel filtriert und mit einem Oberschuss an Ather versetzt.
Durch mehrmaliges Ausschütteln mit wenig Wasser werden die Ferrioxamine in die wässrigen Anteile übergeführt. Die erhaltenen wässrigen Extrakte werden vereinigt und zur vollständigen Entfernung des Phenols 2mal mit Ather ausgeschüttelt. Durch Gefriertrocknung gewinnt man ein orange bis braunrotes Präparat von Ferrioxaminen, das durch Papierchromatographie zerlegt werden kann.
Beispiel 5
20 Liter Kulturlösung werden unter Rühren mit 400 g Hyflo Supercel und 200 ml einer 10"/oigen wässrigen Ferrisulfatlösung versetzt und filtriert. Das Filtrat extrahiert man nach Zugabe von 3, 6 kg Kochsalz in einem Gegenstrom-Extraktor mit 2 Liter Phenol-Chlo roform (1 g : 1 ml), trocknet den Extrakt über Natriumsulfat und lässt ihn innerhalb 1 Stunde in eine gut gerührte Suspension von 20 g Hyflo Supercel in 2 Liter Ather und 10 Liter Petroläther einlaufen. Nach dem Filtrieren des pulverigen Gemenges aus Filterhilfsmittel und Niederschlag und Auswaschen mit ca. 2 Liter Ather wird 5mal mit je 600 ml Methanol eluiert.
Die vereinigten Eluate liefern beim schonenden Eindampfen 10 g rohes Ferrioxamin in Form eines braunroten Pulvers.
Beispiel 6
4 g rohes Ferrioxamin werden im System n-Buta nol-Benzylalkohol-Wasseir-ges. wäss,. Natriumchloridlo-1 sung-1-n. Salzsäure (100 : 200 : 300 : 60 : 6) über 80 Stufen zu je 100 ml organischer und 100 ml wässniger Phase verteilt. Die Auswertung der Verteilung erfolgt durch biologische Testierung und durch Extinktionsmessung bei 425 m, : jeder 4. Einheit entnimmt man 2 ml oberer und unterer Phase und vermischt diese mit 32 ml Methanol, wobei eine homogene Lösung erhalten wird, deren Konzentration für beide Testierungen geeignet ist (vgl. Fig. 2).
Die gemäss dieser Auswertung in 4 Gruppen zusammengefassten Verteilungsfraktionen enthalten, wie sich papierchromatographisch zeigen lässt, neben dem Hauptprodukt Ferrioxamin B (in Verteilungsfraktion III) weitere Antisideramycin-wirksame, rotgefärbte Verbindungen, die als Ferrioxamine A, C, D, E und X bezeichnet werden.
Fraktion Nr. Verteilungs-hauptsächlichstes fraktion Ferrioxamin
6-18 II A 19-32 III B 33-62 IV C 63-80 V D, E und X
Die Verteilungsfraktion III schüttelt man mit 3 Liter Petroläther. Die tiefrotgefärbte wässrige Phase wird mit Chloroform gewaschen, mit Kochsalz bis zu einer Konzentration von 10 ouzo versetzt und mit Phenol-Chloroform (1 g : 1 ml) erschöpfend extrahiert. Den Phenol-Chloroformextrakt wäscht man mehrmals mit 10 /o Natriumchlorid enthaltender 0, 01-n.
Salzsäure, filtriert durch eine kleine Säule von 20 g Celite und fällt die Inhaltsstoffe durch Zugabe von 25 g Hyflo Supercel, 500 ml Äther und 1 Liter Petroläther unter Rühren bei 0 . Das pulverige Gemenge aus Filterhilfsmittel und Niederschlag wird gut mit Ather gewaschen und hierauf mit wenig Methanol eluiert. Aus dem Meth anoleluat erhält man beim schonenden Eindampfen 982 mg rohes Ferrioxamin B in Form eines braunroten Pulvers.
Die Verteilungsfraktionen II, IV und V werden auf gleiche Weise aufgearbeitet.
Beispiel 7
Ein gemäss Beispiel 3 erhaltenes Ferrioxamin-Roh- produkt wird einer Gegenstromverteilung über 83 Stufen unterworfen, wobei das Lösungsmittelsystem Ben zylalkohol-20"/oige wässrige Ammoniumsulfatlösung verwendet wird. Der Inhalt der einzelnen Verteilungs gefässe wird hierauf kolorimetrisch (Absorption bei 425 m, u) und biologisch (Bonifas-Test) untersucht.
Dabei können zwei Maxima festgestellt werden und zwar bei Stufe 32 und bei Stufe 76. Das erstere enthält zur Hauptsache Ferrioxamin B und das zweite ein Gemisch von Ferrioxamin A, C, D und E. Die Stufen 23-42 werden vereinigt und bis zur Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Dann wird die Benzylalko holphase, die nun die genannte Ferrioxamin-Aktivität enthält, abgetrennt und mit dem gleichen Volumen Ather versetzt. Diesem Gemisch wird die Ferrioxamin Aktivität mit wenig Wasser entzogen. Durch Gefriertrocknung der konzentrierten wässrigen Lösung erhält man Ferrioxamin B in Form eines braunroten Pulvers, das in bezug auf das Ausgangsmaterial der Gegenstromverteilung ca. 10 mal angereichert ist.
Beispiel 8
Zur Isolierung der Ferrioxamine A, C, D, E und X werden die bei der Gegenstromverteilung von Roh Ferrioxamin anfallenden Verteilungsfraktionen II, IV und V (vgl. Beispiel 6) an Dowex 50-wu2 (200/400 mesh) mit Ammoniumacetatpuffer als Elutionsmittel chromatographiert. Das Harz reinigt man vorerst nach Vorschrift von Hirs et al. [C. H. W. Hirs, S. Moore, W. H. Stein, J. Biol. Chem. 219, 623 (1956)]. Es wird in der Ammoniumform durch Sedimentation auf die Saute gebracht und vorgängig der Substanzauftragung während ca. 70 Stunden mit der zur Elution verwende- ten Pufferlösung bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 20 ml/cm2/Std. äquilibriert.
Die Substanzen trägt man je nach Löslichkeit in 1-10 /0iger Lösung auf die Säule auf und entwickelt die chromatogramme bei 23-25 und bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 5-15 m1/cm2/Std. mit Ammoniumacetatpuffer von pH 4, 5 in steigender Konzentration (Gradient-Elution).
Die Bewertung der Chromatogramme erfolgt durch Extinktionsmessung der Eluatfraktionen (30-40 ml) bei 425 mÁ. Die entsprechend zusammengefassten Eluatfraktionen werden nach Zusatz von 10 ouzo Kochsalz mit Phenol-Chloroform (1 g : 1 ml) erschöpfend extrahiert. Die tiefrot gefärbten Extrakte wäscht man ausgiebig mit 10 /o Natriumchlorid enthaltender 0, 01-n. Salzsäure, filtriert durch eine Schicht von Celite und fällt die Inhaltsstoffe aus den klaren Filtraten durch Zusatz von Ather und Petroläther auf Hyflo Supercel. Das Gemisch von Substanz und Trägerstoff wird zur Entfernung von Phenol mit Äther gewaschen und hierauf mit wenig Methanol eluiert.
Aus den Meth- anoleluaten erhält man die Ferrioxamine beim schonenden Eindampfen in Form braunroter hygroskopischer Pulver, die für die Analyse während 50 Stunden bei 25 /0, 03 mm über Phosphorpentoxyd getrocknet werden.
5 g Fraktion II (vgl. Beispiel 6) werden an einer Dowex 50-WX2-Säule von 90 cmx22 cm2 nach dem oben beschriebenen Verfahren chromatographiert.
Pufferlösung bei Beginn : 0, 1-m. Ammoniumacetat pH der Eluatfraktionen : 35-40 ml. Umstellung auf Gra4, 5. Durchlaufgeschwindigkeit : 110 ml/Std. volumen dientelution mit Mischkammer von 4 Liter und 1, 75-m. Ammoniumacetatpuffer von pH 4, 70 bei Fraktion Nr. 90.
Fraktion Gewicht Inhaltsstoffe Nr. in mg 283-300 302 Ferrioxamin A-hydrochlorid 301-325 488 Ferrioxamin B + A-hydrochlorid 326-352 393 353-385 452 nicht näher charakterisierte Stoffe 416-445 415
Ferrioxamin A-hydrochlorid ist ein braunrotes Pulver, das sich in Wasser, Methanol, ¯thanol, Eisessig und Dimethylformamid gut löst. Es ist unlöslich in Ather, Aceton, Essigester und Chloroform. Rf im Lösungssystem I : 0, 35, im Lösungssystem V : 0, 24 (vgl.
Tab. 1). Verteilungskoeffizient im System VI : 0, 111 (vgl. Tab. 1).
Mikroanalyse : C 44, 21 /o, H 7, 52 1/0, N 12, 63 %, Fe 7, 95 /o, Cl 5, 93 /o.
Titration : pKMCS: 9, 89, Aquiv. Gew. : 634.
UV.-Spektrum in Wasser : ?max 430 mÁ (E 1% 1cm = 37).
Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. folgende Banden : (s = starke Bande, m = mittlere Bande, w = schwache Bande) : 2, 92, u (s), 3, 42, u (m), 6, 10, u (s), 6, 32, (s), 6, 88, u (m), 7, 30, u (w), 7, 92, (w), 8, 10, u (w), 8, 49, u (w), 8, 98, u (w), 9, 55, u (w), 10, 15, u (w), 10, 67, u (w).
Ferroxiamin A gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Das Eisen im Ferrioxamin A wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin A ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin A zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
Beispiel 9
5 g Fraktion IV (vgl. Beispiel 6) chromatographiert man an einer Dowex 50-WX2-Säule nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren. Pufferlösung bei Beginn : 0, 1-m. Ammoniumacetat pH 4, 5. Durchlaufge schwindigkeit : 110 ml/Stunde. Volumen der Eluatfraktionen : 35-40 ml. Umstellung auf Gradientelution mit 1-m. Ammoniumacetat von pH 4, 6 bei Fraktion 720, mit 2-m. Ammoniumacetat pH 4, 7 bei Fraktion 963 : Fraktion Gewicht Inhaltsstoffe Nr. in mg
34-46 135 nicht naher charakteri
54-68 226 sierte Stoffe
218-284 gelb-grün fluoresz.
Subst. nicht isoliert
780-830 430 Ferrioxamin B-hydrochlorid
860-900 194 Ferrioxamin C-hydrochlorid 1034-1080 360 nicht näher charakteri sierte Substanz
Ferrioxamin C zeigt annähernd gleiche Löslich- keitseigenschaften wie A. Rf im Lösungsmittelsystem I : 0, 54, im Lösungsmittelsystem V : 0, 37 (vgl. Tab. 1).
Verteilungskoeffizient im System VI : 0, 489 (vgl.
Tab. 1). Mikroanalyse : C 48, 33 /o, H 7, 92 /o, N 10, 20 /o, Cl 5, 15 %, Fe 6, 82 /o.
Titration : pKMCS : 8, 88 ; Aquiv. Gew. 762.
UV.-Spektrum in Wasser imax 430 mlt (E % m = 39) Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei : 2, 92, u (s), 3, 43, (s), 5, 85, (m), 6, 10, u (s), 6, 33, u (s), 6, 87, (s), 7, 30, (m), 7, 95, u (m), 8, 23Á (w), 8, 52, u (m), 9, 65, u (w), 13, 23, u (m).
Ferrioxamin C gibt eine positive Farbereaktion mit Ninhydrin. Das Eisen im Ferrioxamin C wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin C ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin C zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
Beispiel 10
148 g Fraktion V (vgl. Beispiel 6) werden vorerst auf einer Säule von 150 cmX79 cm2 vorfraktioniert.
Das Chromatogramm entwickelt man bei einer Durch flussgeschwindigkeit von 2-3 Lt./Std. wÏhrend je 24 Stunden mit 0, 1-m., 0, 2-m., 0, 6-m. und während 100 Stunden mit 1, 8-m. Ammoniumacetatpuffer von pH 4, 7. Es werden Fraktionen von 5 Liter aufgefangen.
Die zusammengefassten Fraktionen 2-5 enthalten vor wiegend Ferrioxamine D und E (44 g), 48-55 hauptschlich Ferrioxamin X (8, 4 g).
Rechromatographie von Fraktionen 2-5 :
5 g der Fraktionen 2-5 chromatographiert man unter den gleichen Bedingungen wie Fraktion II, jedoch ohne Gradientelution.
Fraktion Nr. Gewicht in mg Inhaltsstoffe 48-56 980 Ferrioxamin D 66-80 989 Ferrioxamin E
Das aus Fraktion 48-56 mit Phenol-Chloroform isolierte Ferrioxamin D (980 mg) wird in 100 ml Wasser gelöst, mit Kochsalz gesättigt und zweimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Der Chloro formextrakt hinterlässt nach dem Trocknen über Natriumsulfat beim Eindampfen 697 mg Ferrioxamin Dl.
Die wässrige Phase wird ausgiebig mit Chloroform gewaschen und hierauf mit Phenol-Chloroform extrahiert. Beim Aufarbeiten des Extraktes in üblicher Weise erhält man 95 mg Ferrioxamin D2. Ferrioxamin D1 ist gut l¯slich in Wasser, Methanol, ¯thanol, Eisessig, Methylcellosolve und Chloroform, schwer l¯slich in ¯ther, Aceton, Essigester, Pyridin und Dimethylformamid. Es kristallisiert aus Methanol-Ather in roten Nadeln. F. nach 3 maliger Kristallisation 194-200 . Rf im Lösungsmittelsystem I : 0, 73, R1 im Lösungsmittel- system V : 0, 88 (vgl. Tab. 1). Verteilungskoeffizient im System VI: 1,80 (vgl. Tab. l).
Mikroanalyse: C 49,31 %, H 7,47 %, N 12,37 %, Cl 0 %, Fe 7,66 %, Titration: keine sauren oder basischen Funktionen feststellbar.
UV.-Spektrum in Wasser : ?max 430 mÁ (E 1%1cm=44) Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei 2,95Á (s), 3,06Á (s), 3,25Á (w), 3,43Á (s), 6,08Á (s), 6,86Á (s), 7,30Á (m), 7,94Á (m), 8,20Á (w), 8,49Á (w), 8,83Á (w), 9,00Á (w), 9,65Á (w), 10,00Á (w), 10,31Á (w), 10,67Á (w), 12,20Á (w), 13,30Á (m). Ferrioxamin D1 gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin. Das Eisen im Ferrioxamin Dl wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin Dt ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin Dt zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
Ferrioxamin D2: Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a. Banden bei: 2,95Á (s), 3,43Á (m), 6,08Á (s), 6,36Á (s), 6,90Á (s), 8,49Á (w), 8,87Á (w), 9,65Á (w), 10,05Á (w), 10,70Á (w), 13,22Á (w).
Rf im Lösungsmittelsystem I : 0, 64, Rf im Lösungs- mittelsystem V : 0, 68 (vgl. Tab. 1).
Ferrioxamin E : Das aus Fraktion 66-80 erhaltene Ferrioxamine E (898 mg) ist in Eisessig löslich, in den meisten Lösungsmitteln, insbesondere auch in Wasser und Methanol, schwer-bis unlöslich. Durch 2 maliges Umlösen aus viel Wasser-Aceton erhält man ein mikrokristallines Pulver. Rf-Werte im System I : 0, 68, im System V : 0, 59.
Verteilungskoeffizient im System VI : 1, 59 (vgl.
Tab. 1).
Mikroanalyse : C 49, 80 /o, H 7, 37"/o, N 12, 48 O/o, Cl 0 /o, Fe 8, 14 /o.
Titration : keine sauren oder basischen Funktionen feststellbar.
UV.-Spektrum in Wasser : A 430 m, ?(E 1% 1cm=42).
Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a.
Banden bei :
2,92Á (s), 3,02Á (s), 3,45Á (s), 5,96Á (s), 6,15Á (s), 6,36Á (s), 6,90Á (s), 7,10Á (m), 7,15Á (m), 7,39Á (m), 7,82Á (w), 7,98Á (m), 8,45 Á (w), 8,54Á (w), 8,85Á (w), 9,01Á (w), 9,20Á (w), 9,98Á, (m), 10,07Á (w), 10,23Á (w), 10,43Á, (w), 10,71Á (w), 11,87Á (w), 13,20Á (m), 13,66Á (w).
Ferrioxamin E gibt keine Farbreaktion mit Ninhydrin. Das Eisen im Ferrioxamin E wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin E ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin E zurückgeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkomplexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.
Rechromatographie der Fraktionen 48-55 :
5 g von Fraktionen 48-55 werden unter den gleichen Bedingungen wie Fraktionen 2-5 (s. o.) rechroma tographiert. Pufferlösung bei Beginn : 0, 5-m. Ammoniumacetat, pH 4, 7. Umstellung auf Gradientelution mit Mischkammer von 4 Liter und Zufluss von 2-m.
Ammoniumacetatpuffer von pH 4, 7 bei Fraktion 663.
Die Fraktionen 821-880 enthalten 1, 12 g Material, das vorwiegend aus Ferrioxamin X besteht. Zur Weiterrei nigung wird dieses Material im System n-Butanol-Wasser einer Craig'schen Gegenstromverteilung über 20 Stufen (10/10 ml) unterworfen. Die Inhalte der Elemente extrahiert man anschliessend mit je 80 ml Petrol- äther, verwirft die Petrolätherphasen und lyophilisiert die wässrigen Raffinat. Mit dem aus den Elementen 1-4 gewonnenen Material (570 mg) wird die Verteilung wiederholt (30 Stufen). Aus Element 5 erhält man 64 mg papierchromatographisch einheitliches Ferrioxamin X-hydrochlorid in Form eines braunroten Pulvers.
Ferrioxamin X-hydrochlorid ist gut löslich in Wasser, Methanol, Pyridin, Eisessig, ¯thanol, Dimethylformamid, wenig löslich in Chloroform, unlöslich in Essig- ester, Aceton und Ather.
Mikroanalyse : C 50, 44"/o, H 7, 29 % N 10, 53 O/o, Cl 4, 10 O/o, Fe 5, 57 %.
Rf im Lösungsmittelsystem V : 0, 80 (vgl. Tab. 1).
Verteilungskoeffizient im System VI : 3, 12 (vgl.
Tab. 1). Titration : pKMCS 9, 75, Aquiv. Gewicht 695.
Das IR.-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u. a.
Banden bei 2, 95 Á (s), 3, 45 u (m), 6, 19 Á (s), 6, 37 u (s), 6, 92Á (m), 7, 40, u (w), 7, 97, (w), 8, 50, (w), 8, 88, ? (w). 9, 72, u (w), 10, 10, ? (w), 10.70Á, (w) 13, 75 u (w).
UV.-Spektrum in Wasser : A 430 ,MÁ (E 1% 1cm=34).
Ferrioxamin X gibt eine positive Reaktion mit Ninhydrin. Das Eisen im Ferrioxamin X wird aus dem Komplex entfernt, wenn es mit Mineralsäure oder starken Alkalien behandelt wird. Eisenfreies Ferrioxamin X ist farblos. Es kann mit Ferrichlorid in Ferrioxamin X zugeführt werden. Es reagiert auch mit anderen Metallionen unter Bildung der entsprechenden Metallkom- plexe, beispielsweise des grünlichen Kupferkomplexes.