DE1070782B

DE1070782B -

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Publication number: DE1070782B
Application number: DENDAT1070782D
Authority: DE
Publication date: 1959-12-10

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen, wasserlöslichen Antibiotikums, das im folgenden mit Grisonomycin bezeichnet wird, und seiner Derivate.

Das Antibiotikum Grisonomycin entsteht bei der Kultur eines neuen Actinomyceten-Stammes, der aus einer bei Bergün, Kanton Graubünden, Schweiz, gesammelten Erdprobe isoliert worden ist und der in den Laboratorien des Erfinders sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, unter der Bezeichnung A 10073 aufbewahrt wird.

Der Actinomyceten-Stamm A 10073 gehört zur Art Streptomyces griseus. Er bildet ein gelblichgrünlichgraues Luftmycel. Die Sporenketten sind unregelmäßig verzweigt und bilden keine Spiralen. Die einzelnen Sporen sind glatt. Wird der Organismus auf pep tonhaltigen Nährböden kultiviert, so kann keine schwarzbraune melanoide Verfärbung beobachtet werden. Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 18° C als auch bei 40° C entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32° C

Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces griseus A 10073 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 sowie 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952), hergestellt.

1. Synthetischer Agar: Wachstum anfangs dünn, schleierartig und hellgelb, später runzelig und hellbraun bis kupferrot. Luftmycel sammetig, hellgelb bis grünlichgrau.

2. Synthetische Lösung: Sediment, Flocken, milchweiß. Pellikula anfangs gelblich, nach 9 Tagen rötlichbraun. Luftmycel sammetig, weißgrau.

3. Glukose-Agar: Wachstum spärlich, dünn, schleierartig, hellgelb.

4. Glukose - Asparagin - Agar: Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb. Luftmycel mehlig, bestäubt, hellgelb.

5. Calciummalat-Agar: Wachstum schleierartig, hellbraun. Luftmycel sammetig, hellgelb bis grünlichgrau. Substrat kastanienbraun.

6. Gelatinestich (18° C): Wachstum oberflächlich, schleierartig, bräunlichgelb, Substrat rötlichbraun. Verflüssigung nach 18 Tagen 0,8 bis 1,2 cm.

7. Stärkeplatte: Wachstum dünn, schleierartig, farblos bis hellgelb. Luftmycel wenig entwickelt, hellgelb. "Substrat graublau. Hydrolyse nach 14 Tagen 1,6 cm.

8. Kartoffeln: Wachstum schleierartig, hellbraun bis weißgrau. Luftmycel spärlich, hellgelb bis grünlichgrau. Substrat hellbraun.

9. Karotten: Wachstum sehr langsam, hellgelb.

Herstellung des Antibiotikums
Grisonomycin

Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann₁ Patentanwalt,
Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beansprudite Priorität:
SAweiz vom 1. November 1957 und 2. September 1958

Dr. Ernst Gäumann, Zürich,
und Dr. Hans Bickel₁ Binningen (Schweiz),
sind als Erfinder genannt worden

as 10. Lackmusmilch: Pellikula hellbraun. Luftmycel sammetig, farblos bis hellgelb, zuletzt grünlichgrau. Substrat rot. Langsame Koagulation und Hydrolyse.

Die wichtigsten Merkmale des Stammes A10073

stimmen mit denjenigen von Streptomyces griseus (Krainsky) Waksman überein, so daß er vorläufig dieser Art zugezählt wird.

Es ist bekannt, daß einige Vertreter der Art Streptomyces griseus Antibiotika produzieren, so Streptomycin (S.A. Waksman, Streptomycin, Verlag Williams and Willkins, 1949), Rhodomycetin (G. Shockman und S.A. Waksman, Antibiotics and Chemotherapy, 1, S.68 bis 75 [1951]), Actidion (B. B. Leach, Η. J. Ford und A. J. Whiffer,

J. A. CS., 69, S. 474 [1947]), Candicidin (H. Lechevalier, R. F. Ack«r, C. T. Corke, C. M. Haense-Ier und S. A. Waksman, Mycologia, 45, S. 155 bis 171 [1953]), Grisein (D. M. Reynolds und S.A. Waksman, J. Bacteriol., 55, S. 739 bis 752 [1948]) und Streptocin (S. A. Waksman, D.A.Harris, A. B. Kupf erberg, H.O.Singher und H. Styles, Proc.Soc. Exp. Biol. Med., 70, S.308 bis 312 [1949]). Es wird weiter unten gezeigt, daß sich das neue Antibiotikum Grisonomycin in charakte-

so ristischer Weise von diesen bereits bekannten Antibiotika unterscheidet.

Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums Grisonomycin anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces griseus A 10073

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oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen, gewonnen werden.

Zur Erzeugung des Antibiotikums Grisonomycin wird ein die Eigenschaften von Streptomyces griseus A 10073 aufweisender Streptomyceten-Stamm, z. B. in wäßriger, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Grisonomycin hierauf isoliert.

Als Kohlenstoffquelle kommen z. B. Kohlenhydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose, Mannit, Stärke sowie Glycerin, in Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender, Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40° C. Eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach IV2 Tagen.

Zur Isolierung des Antibiotikums Grisonomycin können z. B. folgende Verfahren dienen: Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich Wasser und wäßrige organische Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. wäßriges Methanol.

Das Antibiotikum Grisonomycin ist eine wasserlösliche Substanz, die in organischen Lösungsmitteln, insbesondere in Lipoidlösungsmitteln, unlöslich ist. Es läßt sich bei neutralem p_H weder aus Kulturfiltraten noch aus angereicherten Lösungen mit den für die Isolierung basischer hydrophiler Antibiotika üblichen Fällungsmitteln, wie z. B. Pikrinsäure, Ammoniumreineckat, Helianthin, Pikrolonsäure, ausfällen. Gemäß seinem Verhalten bei der elektrometrischen Titration, bei der Elektrophorese auf dem Papier und bei der Adsorption an Ionenaustauschern handelt es sich möglicherweise um einen amphoteren Stoff mit überwiegend basischen Eigenschaften.

Gemäß diesen Eigenschaften sind zur Gewinnung •des Antibiotikums Grisonomycin aus dem Kulturnitrat und zu seiner Reinigung verschiedene Methoden geeignet, die einzeln oder in Kombination miteinander angewandt werden können. So können verschiedene Adsorptionsmittel verwendet werden, z. B. Aktivkohlen, aktivierte Erden, wie Aluminiumoxyd, Fullererde oder Harzadsorber. Die Affinität des Antibiotikums Grisonomycin ist insbesondere zu Aktivkohle über einen weiten p_a-Bereich und zu Asmit in neu-

tralem und alkalischem p_H-Bereich sehr groß. Weiter kann das Antibiotikum Grisonomycin aus dem Kulturfiltrat oder wäßrigen Lösungen auch durch stark saure Ionenaustauscher, z. B. Dowex 50, adsorbiert werden. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmäßig mit Gemischen von Wasser und organischen Lösungsmitteln, z. B. binären Gemischen von Wasser mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Wasser—Methanol, Wasser—Aceton, Wasser—Alkohol, Wasser—Propanol, Wasser—Pyridin oder aber Mehrkomponentensystemen wie von Wasser mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel und einem oder mehreren mit Wasser mischbaren, als Mischungsvermittler dienenden organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Butanol— Methanol—Wasser, Butanol—Pyridin—Methanol— Wasser, Phenol—Methanol—Wasser. Diese zur Elution dienenden Lösungsmittelgemische können mit oder ohne Zusatz von anorganischen oder organischen Säuren, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Ameisensäure, Essigsäure, oder mit oder ohne Zusatz von basischen Mitteln, z. B. Ammonik, niederen aliphatischen Aminen, angewendet werden. Bei der Verwendung von Aktivkohle als Adsorptionsmittel haben sich Gemische von Butanol—Methanol—Wasser im Volumenverhältnis von 2:1:2, von Butanol—Methanol— Pyridin—Wasser im Volumenverhältnis von 2:1:1:2 oder von Alkohol—Wasser im Volumenverhältnis von 3 : 2 zur Elution des Antibiotikums als besonders geeignet erwiesen. Adsorbate an Harzadsorber-Phenolharz werden vorzugsweise mit einem Gemisch von Methanol—Wasser—1 η-Salzsäure im Volumenverhältnis von 75 : 15 : 10 und solche an den erwähnten Ionenaustauschern zweckmäßigerweise mit basischen Mitteln, z. B. mit wäßrigen Lösungen von Ammoniak, eluiert.

Aus den antibiotisch wirksamen Eluaten kann das Antibiotikum durch Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum in Form eines Trockenpulvers erhalten werden oder aber in Form einer stark konzentrierten Lösung, aus der das Antibiotikum durch Zusatz der 4- bis 6fachen Volumenmenge von Aceton oder von einem Gemisch von Methanol und Aceton in Form eines braungelben Pulvers ausgefällt werden kann.

Enthält das Elutionsmittel mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel, z. B. im Falle einer Aktivkohleabsorption das erwähnte Gemisch Butanol—Methanol—Wasser (2:1:2), dann kann dieses auch zweckmäßigerweise mit einem weiteren mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Äther, Chloroform, Essigester, n-Butylacetat, in solcher Menge versetzt werden, daß sich zwei Phasen bilden. Das Antibiotikum befindet sich dann fast ausschließlich in der wäßrigen Phase, aus welcher es wiederum entweder durch direktes schonendes Eindampfen zur Trockne oder durch Einengen zu einer konzentrierten Lösung mit anschließender Fällung in Form eines Pulvers erhalten wird. Enthält das Elutionsmittel Säuren oder Basen, z. B. im Falle der Harzadsorberabsorption das erwähnte Gemisch Methanol—Wasser—ln-Salzsäure (75 : 15 : 10), dann ist es vorteilhaft, die im Eluat vorhandene Säure bzw. Base vor dem Einengen durch Zugabe von Lauge bzw. Säure zu neutralisieren oder aber aus dem Elutionsmittel durch Filtration durch einen schwachen Anionenaustauscher bzw. einen schwachen Kationenaustauscher zu entfernen, an welchen das Antibiotikum Grisonomycin nicht adsorbiert wird.

Das Antibiotikum Grisonomycin ist im weiteren

löslich in Phenol und Mischungen von Phenol mit

ι υ / υ / ö 'Z

organischen Lösungsmitteln, ζ. Β. Phenol-ChloroformGemischen. Es läßt sich aus wäßrigen Lösungen mit solchen Gemischen extrahieren. Verteilt man das Antibiotikum zwischen wäßrigen Salzsäurelösungen und phenolhaltigen Chloroformlösungen, dann kann der Verteilungskoeffizient durch Variieren der Phenolkonzentration in der wäßrigen Phase über einen weiten Bereich nach Wunsch eingestellt werden. Versteht man unter dem Verteilungskoeffizienten des Antibiotikums das Verhältnis der Konzentration in der organischen Phase zur Konzentration in der wäßrigen Phase, dann ergibt es sich, daß der Verteilungskoeffizient mit steigendem Phenolgehalt zu- und mit steigendem Salzsäuregehalt abnimmt. Durch eine Kombination von wenigen Verteilungsoperationen in solchen Systemen kann eine wesentliche Anreicherung erzielt werden. Aus Phenol-Chloroform-Gemischen kann das Antibiotikum durch Zugabe Iypophiler organischer Lösungsmittel, wie z. B. Aceton, Äther oder Petroläther, in Form eines Pulvers ausgefällt werden. Eine weitere Möglichkeit der Isolierung besteht darin, daß man das Antibiotikum aus dem Phenol-Chloroform-Gemisch durch Zugabe solcher Lösungsmittel auf ein Filterhilfsmittel ausfällt und den leicht filtrierbaren Rückstand mit den gleichen Lösungsmitteln gut auswäscht. Der auf dem Filterhilfsmittel niedergeschlagene antibiotische Rückstand kann mit einem kleinen Volumen Wasser herausgelöst werden und die derart erhaltene konzentrierte Lösung des Antibiotikums durch Gefriertrocknung in ein Pulver übergeführt werden. Schließlich ist es auch möglich, das Antibiotikum aus der Phenol-Chloroform-Lösung nach Zugabe von Äther-Petroläther-Gemischen direkt mit wenig Wasser zurückzuextrahieren. Die Menge des Petroläther-Äther-Gemisches richtet sich dabei nach der Phenolmenge.

Die beschriebenen Adsorptions-, Elutions- und Extraktionsverfahren können einzeln oder in Kombination miteinander angewandt werden. Besonders geeignet ist ein kombiniertes Verfahren, gemäß welchem das Antibiotikum zuerst an Harzadsorber adsorbiert und sodann eluiert wird, worauf eine Adsorption an Aktivkohle mit anschließender Elution folgt. Das dabei erhaltene Antibiotikumkonzentrat wird hierauf durch einige Verteilungen zwischen Phenol-Chloroform-Lösungen und Salzsäurelösung weiter angereichert.

Die Adsorptions-Elutions-Prozesse können im »Batche-Verfahren oder an der Säule erfolgen. Vorgängig der Elution der Adsorbate können die mit dem Antibiotikum belegten Adsorptionsmittel zwecks Entfernung antibiotisch inaktiver Begleitstoffe mit geeigneten Lösungsmitteln gewaschen werden. Im Falle des Aktivkohleadsorbates haben sich Wasser, 30°/oiges Methanol und trockenes Aceton als Waschmittel geeignet erwiesen.

Eine Anreicherung des Antibiotikums Grisonomycin aus den nach den vorstehend geschilderten Verfahren gewonnenen Konzentraten kann erfolgen, wenn Lösungen solcher Konzentrate mit Fällungsmitteln, wie z. B. Pikrinsäure oder Helianthin, versetzt werden, wobei Begleitstoffe des Antibiotikums, welche zum Teil in vitro ebenfalls antibiotische Wirkung aufweisen, ausgefällt werden, während das Antibiotikum selbst in Lösung bleibt. Nach der Abtrennung dieser Fällungen durch Filtration wird das überschüssige Fällungsmittel aus dem Filtrat durch Passage über einen geeigneten Ionenaustauscher wiederum entfernt, im Falle von Helianthin oder Pikrinsäure z. B. durch Passage über einen Austauscher in der Chloridionen-

form, worauf das angereicherte Antibiotikum nach den beschriebenen Verfahren aus den Lösungen isoliert werden kann.

Um das Antibiotikum weiter anzureichern, wird es vorzugsweise einer Säulenadsorptionschromatographie unterworfen. Als Adsorbentien eignen sich die bereits für das Isolierungsverfahren erwähnten Adsorptionsmittel. Im weiteren läßt sich das Antibiotikum auch an Cellulose chromatographieren. Für die Entwicklung der Chromatogramme werden dieselben Lösungsmittelgemische verwendet, die für die Elution der Adsorbate in den vorstehend geschilderten Isolierungsverfahren angegeben sind, und zwar in konstanter oder variierender Zusammensetzung. Ein gutes Anreicherungsverfahren stellt die Säulenchromatographie an Aktivkohle dar, wobei sie vorzugsweise zwecks Erhöhung der Laufgeschiwindigkeit des Elutionsmittels mit einem Filtrierhilfsmittel im Gewichtsverhältnis 1 :1 bis 1 : 2 verdünnt wird. AVeiter ist die Chromatographie an Cellulosesäulen besonders gut zur Anreicherung des Antibiotikums geeignet. Als Elutionsmittel dient in diesem Falle eine Mischung von Butanol—Methanol—Wasser im Volumenverhältnis von 4 : 1: 2.

Das Antibiotikum Grisonomycin wird so in Form eines antibiotisch hoch wirksamen blaßgelben Pulvers erhalten, das durch seine Löslichkekseigenschaften durch Papierchromatographie, Elektrophorese sowie durch sein Verhalten gegen Farb- und Fällungsreageuzien charakterisiert wird. Das Antibiotikum Grisonomycin ist sehr gut löslich in Wasser. Es löst sich im weiteren in IVfischungen von Wasser und niederen Alkoholen, in Phenol sowie in Mischungen von Phenol mit organischen Lösungsmittel'
unlöslich in den .c^Wt?
mitteln, insbesondere LifJöic

Wi^^^^^-Nr. !-Papier er_g

Hosunl
Verhalten

Antibio
rgib

Sin A (2) fnd Ristocetin B (3) aus folgender Tabelle.

Lösungsmitte 1-gemisch

Rf-Wert

Grisonomycin

A.
B.
C .
D
E.
F.
G.
H
I .

O
O

0,15
0,52
5,15
0,65
0,92
0,90
0,11

0,12
0,25
0,61
1

0,07
0,13
0,29
0,15

	3
0	0
0	0
0,22	0,19
0,53	0,24
5,15	11,4
0,69	0,69
Ό,41	0,25
0,38	0,17
0,05	0,25

A
B
C

D =

E =
F =
G =
H =

I =

Butanol, mit Wasser gesättigt. _o,_{Toluolsulfosäure}. Butanol mit Wasser gesättigt + 2 % p-1 ^oluoI^sul.' ^urc öutanoi, mnw» -f.. « 51/, Natriumchlorid ent-800/o.ges wäßriges Äthanol, I_fSin
hiltend, auf Whatman-Nr. 4-Papier •mpr g _u
0,95m Natriumsulfat und 0,05m Natnumnyarug
(NaHSO₄- H₂O). Natriumchlorid ent-

80°/oiges wäßriges Methanol, 1,5 /0 iNainu«
hiltend. . ,

Butanol — Methanol - Wasser 3 Vi:1 . 2.
Butanol — Äthanol — Wasser 1: 1 = f.
Wasser, gesättigt mit Methylisobutylketon.
71<"/„ Wasser + 25°/o einer Mischung von 3 leiten SthanIi^aUnd I⁺Teil Aceton, mit ^-n.ak auf ρ 10 5 gebracht und mit Phosphorsäure auf p_H 7,5 rurucfc

Sekundäres Butanol, gesättigt mit Wasser,
chloressigsäure.

■0,2 ⁰ZoTri

(Im Falle des Lösungsmittelsystems E handelt es sich um ein Durchlaufchromatogramm. Die angegebenen Zahlen bedeuten in diesem Falle das Verhältnis der Laufstrecke des Antibiotikums zur Laufstrecke von Streptomycinsulfat.)

Das Antibiotikum Grisonomycin verhält sich papierchromatographisch ähnlich wie Grisein. Grisein wandert jedoch in den meisten Systemen schneller als Grisonomycin, z. B. im System Butanol—Eisessig— Wasser (4 : 1 : 5) um den Faktor 1,4; im System C um den Faktor 1,3.

Bei der Elektrophorese auf Whatman-Nr. I-Papier wandert das Antibiotikum Grisonomycin an die Kathode, und zwar in einem 0,03m Kalium-Natrium-Phosphatpuffer von p_H 5,5 bei einer Spannung von IlOVolt während 5 Stunden um 4,2 cm. Unter gleichen Bedingungen zeigen Streptomycinsulfat bzw. Ristocetin A bzw. Ristocetin B Wanderungsstrecken von 8,3 bzw. 5,0 bzw. 3,9 cm. In einem 0,2m Boratpuffer von p_H 8,13 wandert das Antibiotikum Grisonomycin unter sonst gleichen Bedingungen um 2,9 cm gegen die Kathode. Streptomycin bzw. die Ristocetine A und B wandern in diesem Falle um 6,7 bzw. 3,4 cm in der gleichen Richtung.

Das Antibiotikum Grisonomycin gibt aus einer 10°/oigen wäßrigen, neutralen Lösung bei der tropfenweisen Zugabe einer gesättigten wäßrigen Lösung von Pikrinsäure, Ammoniumreineckat, Helianthin oder einer gesättigten Lösung von Pikrolonsäure in 90%igem Alkohol keine Fällung, im Falle von Helianthin höchstens eine schwache Trübung, Negativ sind weiter der Sackaguchi-, Maltol-, Elson-Morgan-, Biuret- und der Benedict-Test.

£c!'^im Grisonomycin unterscheidet sich ^^^JMpMtegrifQHpfljHMPW^''' -^r Art Strepto-..T^ii'acUb produzierten Antibiotika Streptomycin, hodomycetin, Aesidion, Streptocin, Grisein und 'icidin durch seine Löslichkeitseigenschaften, Eigenfarbe, die Farbreaktionen und sein papieromatographisches Verhalten.

Das Antibiotikum Grisonomycin besitzt eine hohe »Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Mikroorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, so ergeben sich bei 2 Stunden Bebrütung bei 37° C mit den verschiedenen Testorganismen folgende noch hemmende Konzentrationen.

des Antibiotikums Grisonomycin folgende Hemmzonen :

Testorganismen Micrococcus pyogenes, var. aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus viridans Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli

Escherichia coli, streptomycin-resistent
Escherichia coli, chloromycetin-resistent

Shigella sonnei Pseudomonas aeruginosa KlebsieIlaTypA Pasteurella pestis Bacillus megatherium Endomyces albicans

Hemmende Konzentration
'(g/cm'

Wird für die Testierung in vitro die Plattentestmethode mit Papierrondellen von 6 mm Durchmesser verwendet, so erhält man mit einer l°/oigen Lösung

	Testorganismen	Hemmzone
S		mm
21
Micrococcus pyogenes, var. aureus
20
10	Escherichia coli	18
Escherichia coli, streptomycin-resistent	18
Escherichia coli, chloromycetin-resistent	18
12
Klebsiella Typ A	17
15		19

In vivo ist das Antibiotikum Grisonomycin ebenfalls wirksam. Bei zweimaliger subkutaner Applikation von 20 mg/kg an mit Klebsiella Typ A infizierte

ao Mäuse werden 100% Überlebende beobachtet. Diese Dosen werden von nicht infizierten Mäusen ohne Schädigung ertragen.

Das Antibiotikum Grisonomycin oder seine Derivate können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.

Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremes, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1 Die Züchtung des Streptomyces A 10073 wird nach

dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser 20 g Distillers Solubles, 20 g Malzextrakt, l g Natriumnitrat und 5 g Natriumchlorid enthält. Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentern während 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein p_H von 7,5 bis 8,0. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus. Man inkubiert unter gutem Schütteln oder Rühren bei 27°, wobei Kulturen in Fermantern mit etwa 1 Volumen steriler Luft pro Volumen Lösung in der Minute belüftet werden. Nach 48 bis 120 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den größten Hemmwert gegenüber den Testorganismen (B. subtilis, Micrococcus pyogenes, var. aureus, Escherichia coli, Klebsiella) erreicht. Man trennt das Mycel sowie andere feste Bestandteile von der die Hauptmenge des Antibiotikums enthaltenden Lösung mittels Filtration ocjer Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kultu lösung vor der Filtration etwa 1 % eines ΡϋίεΓίύΙ^

mittels zugesetzt wird. Die Filterrückstände wäscht man mit Wasser und mit wäßrigem Methanol und vereinigt die Waschflüssigkeiten mit dem antibiotisch wirksamen Kulturnitrat.

Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die folgenden Nährstoffe enthalten, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotischer Wirksamkeit.

a) Laktose 20 g

Distillers solubles 20 g Natriumchlorid 5 g Natriumnitrat Ig

b) Glukose IOg

Distillerssolubles IOg Natriumchlorid 5 g Natriumnitrat Ig Calciumcarbonat IOg

c) Mannit 20 g

Disterillers solubles 20 g Natriumchlorid 3 g Natriumnitrat Ig

d) Glyzerin 20 g _a5

Sojamehl 10g

Natriumchlorid 5 g Natriumnitrat Ig Calciumcarbonat 10 g

e) Glukose 20 g 3<>

Sojamehl 10g

Natriumchlorid 5 g Natriumnitrat Ig Calciumcarbonat 10 g

35

Beispiel 2

7 1 eines nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturnitrates werden mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 41 pro Stunde durch eine 40 cm hohe Schicht von 700 ml Harzadsorber durchfiltriert. Das Antibiotikum wird dabei vollständig adsorbiert. Nachfolgend wird die Säule bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 7 bis 8 1/Std. mit 2 1 Wasser gewaschen und hierauf mit einem Gemisch von Methanol—Wasser—1 n-Salzsäure im Volumenverhältnis von 75 :15:10 eluiert. Das Elutionsmittel wird in Fraktionen von 1 1 aufgefangen. Die Fraktionen 2 bis 4, die bis zu 80% der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität enthalten, werden vereinigt (etwa 3 1). Die im Eluat vorhandene Salzsäure wird mit verdünnter Natronlauge neutralisiert, wobei zuvor die dazu erforderliche Menge Natronlauge durch Titration eines mit Wasser auf das doppelte Volumen verdünnten aliquoten Teiles festgestellt wird. Die neutrale Lösung wird am Rotationsverdampfer bei 35° auf 200 ml eingeengt und hierauf durch ein Papierfilter filtriert und mit wenig Wasser nachgewaschen. Durch Gefriertrocknung erhält man aus dem Filtrat das rohe Antibiotikum in Form eines braunen Pulvers. Die Ausbeute beträgt etwa 7 g pro Liter Kulturfiltrat.

Beispiel 3

1001 des nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturnitrates werden mit 2 kg Aktivkohle während 1 Stunde verrührt, wobei die gesamte antibiotische Aktivität an der Aktivkohle adsorbiert wird. Die letztere wird, vorteilhaft unter Zugabe eines Filtrierhilfsmittels, abgetrennt und hierauf dreimal mit je 20 1 destilliertem Wasser gewaschen, wobei jedesmal während 30 Minu-

ten mechanisch gerührt und anschließend filtriert wird. Die Waschlösung ist antibiotisch inaktiv. Die Kohle wird nachfolgend mit 20 1 einer wäßrigen 30°/oigen Lösung von Alkohol während 30 Minuten verrührt und durch Filtration wiederum abgetrennt. Diese Operation wird mit 201 und schließlich noch mit 101 30%igem Alkohol wiederholt. Die vereinigten wäßrigalkoholischen Filtrate enthalten 0,5 bis 0,6 g Trockensubstanz pro Liter mit lediglich geringer antibiotischer Wirksamkeit. Die Aktivkohle wird nun gleicherweise mit drei Portionen (2-201, 1-101) von 60°/oigem Alkohol eluiert. Diese Eluate enthalten eine große antibiotische Wirksamkeit. Sie werden vereinigt und im Dünnschichtenverdampfer bei höchstens 30° auf ein kleines Volumen eingeengt. Die solcherweise erhaltene konzentrierte wäßrige Lösung gießt man in das fünffache Volumen von Aceton, wobei das Antibiotikum Grisonomycin vorwiegend als blaßgelbes Pulver ausgefällt wird. Nach mehrstündigem Stehen bei 0° wird die überstehende Lösung durch Dekantieren vom Rückstand abgetrennt und letzterer mit trockenem Methanol gewaschen. Der verbleibende Rückstand wird im Vakuum gut getrocknet. Man erhält derart 7 bis 8 g des rohen Antibiotikums Grisonomycin in Form eines blaßgelben Pulvers (Fraktion 1). Die vereinigten Aceton- und Methanol lösungen enthalten weitere 12 bis 13 g Substanz, welche durch Entfernen der Lösungsmittel im Vakuum isoliert wird. Sie besitzt eine kleinere spezifische antibiotische Wirksamkeit (Fraktion 2).

Beispiel 4

1 1 eines nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturfiltrates wird mit 15 g Aktivkohle während 1 Stunde verrührt. Die Aktivkohle wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von Filterhilfsmitteln von der antibiotisch inaktiven Lösung abgetrennt. Durch halbstündiges Schütteln mit 200 ml Wasser wird die Aktivkohle gewaschen und dann abfiltriert. Gleicherweise wird mit 200 ml 30°/oigem Methanol gewaschen und die Kohle anschließend auf einer Glafilternutsche scharf abgesaugt. Die Waschflüssigkeiten sind antibiotisch inaktiv. Das solcherweise gewaschene Kohleadsorbat wird durch 1 stündiges Schütteln mit 200 ml einer Mischung von Butanol—Methanol—Wasser im Volumenverhältnis von 2:1:2 eluier.t. Die von der Kohle durch Filtration befreite dunkelgefärbte Lösung enthält etwa 70% der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität. Man schüttelt die Lösung mit 100 ml n-Butylacetat. Die sich dabei ausscheidenden zwei Phasen werden getrennt. Die wäßrige, dunkelgefärbte Phase von 140 ml enthält praktisch die gesamte im Eluat vorhandene antibiotische Aktivität und wird anschließend der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält das rohe Antibiotikum Grisonomycin als dunkelgelbes Pulver. Ausbeute: 0,93 g.

Beispiel 5

15 g eines nach Beispiel 4 erhaltenen, mit Wasser und 30%igem Methanol gewaschenen Kohleadsorbates werden mit 200 ml einer Mischung von Butanol— Methanol—Pyridin—Wasser im Volumenverhältnis von 2:1:1:2 während 1 Stunde geschüttelt. Das durch Filtration über einer Glasfilternutsche von der Kohle befreite dunkelgefärbte Eluat enthält bis 80% der im Kulturfiltrat vorhandenen antibiotischen Aktivität. Die Lösung wird mit 100 ml n-Butylacetat geschüttelt. Die dabei ausgeschiedene, die antibiotische Aktivität enthaltende wäßrige Phase von etwa 110 ml wird am Rotationsverdampfer bei 35° auf ein kleines Volumen ein-

909 6M/3M

ro7<

geengt. Aus dieser konzentrierten Lösung erhält man das rohe Antibiotikum Grisonomycin durch Gefriertrocknung in Form von 1,01 g eines braungelben Pulvers.

Beispiel 6

5 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibiotikumkonzentrates (Fraktion 2) werden an einer 5,5 cm hohen Säule einer Mischung von 10 g Aktivkohle und 20 g Filtnohilfsmittel chromatographiert, wobei die Substanz in Form einer 10°/oigen wäßrigen Lösung auf die Säule aufgetragen wird. Es werden Fraktionen zu Vi 1 aufgefangen. Die Fraktionen 1 bis 6, die mit Wasser eluiert werden, werden eingedampft und enthalten 4,3 g antibiotisch inaktives Material. Aus den Fraktionen 7 bis 10, die mit IO¹Voigem Alkohol eluiert werden, erhält man 155 mg Trockensubstanz, die ebenfalls antibiotisch unwirksam ist. Die Fraktionen 11 bis 14, eluiert mit 30°/oigem Alkohol, und die Fraktion 15, eluiert mit 2 1 60°/oigem Alkohol, enthalten zusammen 140 mg des angereicherten Antibiotikums Grisonomycin, das aus den Lösungen durch Einengen am Rotationsverdampfer bei 35° und durch anschließende Gefriertrocknung in Form eines beigen Pulvers erhalten wird.

Beispiel 7

10 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibiotikumkonzentrates (Fraktion 2) werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 5 kg kristallinem Helianthin(Orange III, Natriumsalz der 4' - Dimethylamino-azobenzol - 4 - sulfonsäure) versetzt. Die Aufschlemmung wird während 1 Stunde am Vibromischer stark gerührt und hierauf über 10 g Filtnohilfsmittel filtriert. Das Filtrat wird vom überschüssigen Helianthin mittels einer Passage durch 50 ml Amberlite IRA 400 in der Chloridionenform befreit. Man wäscht den Ionenaustauscher mit 200 ml Wasser und engt das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat am Vakuum bei 35° auf ein kleines Volumen ein. Aus der konzentrierten Lösung erhält man das gegenüber dem Ausgangsmaterial angereicherte Antibiotikum durch Gefriertrocknung in Form eines Pulvers (6 g). Das im abfiltrierten Rückstand befindliche Helianthatgemisch enthält in kleiner Menge einen antibiotisch wirksamen Stoff, dessen biologisches Wirkungsspektrum sich von jenem des Antibiotikums Grisonomycin unterscheidet.

Beispiel 8

8,1 g eines nach Beispiel 3 erhaltenen Antibiotikumpräparates (Fraktion 1) werden an 647 g aschefreiem Cellulosepulver Whatman Standard Grade chromatographiert. Zu diesem Zweck wird das Cellulosepulver portionsweise in eine Glassäule eingefüllt und mit einem genau in die Säule hineinpassenden Stöpsel aus rostfreiem Stahl möglichst stark eingepreßt, so daß jeweils etwa 5 cm hohe Schichten entstehen. Es resultiert dabei eine homogene Cellulosesäule von 70 cm Höhe und 5,5 cm Durchmesser. Diese wird während 2· 24 Stunden bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 70 ml/Std. mit einem Gemisch von Butanol—Methanol—Wasser im Volumenverhältnis von 4:1:2 gewaschen. Die zu chromatographierende Substanz wird in 100 ml Wasser gelöst und mit 50 ml Methanol sowie 50 ml Butanol versetzt. Bevor diese Lösung auf die Säule aufgebracht werden kann, wird die Säule »akklimatisiert«, d. h., es werden auf die Säule kleine Portionen des Gemisches Butanol—Methanol—Wasser mit abnehmendem Butanolgehalt derart aufgetragen, daß man eine neue Portion unter Vermeidung von

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Turbulenz gerade dann aufträgt, wenn die vorangehende Portion ganz in die Cellulose eingesickert ist. Es werden dabei 20 ml Butanol-Methanol-Wasser-Gemisch 3 :1:2, 20 ml Gemisch 2:1:2 und 20 ml Gemisch 1:1:2 aufgetragen. Anschließend läßt man die 200 ml der Lösung in die Säule einsickern und beginnt dann, kleine Portionen des Gemisches Butanol—Methanol— Wasser mit ansteigendem Butanolgehalt aufzubringen. Man verwendet dazu IOml des Gemischesl ^lIt: 1:2,

ίο 20 ml des Gemisches 2:1:2 und 20 ml des Gemisches 3:1:2. Hierauf wird die Säule mit dem Gemisch 4:1:2 entwickelt. Es werden Fraktionen zu 135 bis 140 ml aufgefangen. Jede antibiotisch aktive Fraktion versetzt man mit 50 ml Äther und schüttelt sie dreimal

»5 mit 20 ml Wasser aus. Die vereinigten wäßrigen Phasen werden mit 50 ml Äther durch Ausschütteln gewaschen und anschließend durch Gefriertrocknung in Form eines beigen Pulvers erhalten. Die Fraktionen 7 bis 26 enthalten antibiotisch wirksames Material, wo-

ao bei das Aktivitätsmaximum in den Fraktionen 11 bis 20 vorhanden ist. Diese werden vereinigt, und man erhält 1,45 g des angereicherten Antibiotikums Grisonoinycin.

Beispiel 9

780 mg eines nach Beispiel 8 erhaltenen angereicherten Antibiotikumkonzentrates werden an 154 g aschefreiem Cellulosepulver Whatman Standard Grade chromatographiert. Gemäß der im Beispiel 8 angegebenen Vorschrift erhält man in einem Chromatogrammrohr von 3 cm innerem Durchmesser eine Cellulosesäule von 62 cm Höhe. Diese wird während 4-24 Stunden bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 20 ml/Std. mit einem Gemisch von Butanol—Methanol—Wasser im Volumenverhältnis von 4:1:2 gewaschen. Die Substanz wird in 5 ml Wasser gelöst und mit 2,5 ml Methanol und 4 ml Butanol versetzt. Die Säule wird vor dem Auftragen der Lösung, wie im Beispiel 8 angegebenen, »akklimatisiert«, und zwar mit 2ml Gemisch 3:1:2, mit 2ml Gemisch 2:1:2 und schließlich mit 2 ml Gemisch 1,6:1:2. Hierauf wird die Lösung aufgetragen und die Cellulosesäule mit 2-ml-Portionen der Butanol-Methanol-Wasser-Gemische 2:1:2, 2Vi:l:2, 3:1:2 und 3V»:1:2 beschickt, Nachfolgend wird die Säule mit dem Gemisch 4:1:2 bei einer konstanten Temperatur von 25° entwickelt. Es werden Fraktionen zu je 40 ml aufgefangen. Die antibiotisch aktiven Fraktionen 14 bis 33 werden einzeln mit 50 ml Äther—Chloroform (4 :1) geschüttelt.

Die dabei abgeschiedene wäßrige Phase, welche die antibiotische Aktivität enthält, wird abgetrennt und die organische Phase zweimal mit 5 ml Wasser nachgeschüttelt. Die vereinigten wäßrigen Phasen (etwa 20 ml) werden mit 20ml Äther—Chloroform (4:1) gewaschen und durch Gefriertrocknung in blaßgelbe Pulver übergeführt. Die Fraktionen 19 bis 21 ^ind antibiotisch am stärksten wirksam. Sie werden vereinigt, und man erhält insgesamt 75 mg des reinen Antibiotikums Grisonomycin, das, verglichen mit dem im Kulturfiltrat vorhandenen Material, eine etwa 300fache antibiotische Wirksamkeit besitzt. Das Infrarotspektrum, aufgenommen in Nujol, ist in Fig. dargestellt. Das reine Antibiotikum Grisonomycin löst sich sehr leicht in Wasser. Es ist schwer bis unlöslich in organischen Lösungsmitteln, insbesondere Lipoidlösungsmitteln. Es verhält sich papierchromatographisch einheitlich in den Lösungsmittelgemischen A bis I (vgl. Tabelle in der Beschreibung) und unterscheidet sich in diesen Systemen auch von anderen bckannten wasserlöslichen Antibiotika, wie z. B. Strep-

Claims

tomycin, Neomycin, Ristocetin A und B und Viomycin. Das Antibiotikum Grisonomycin läßt sich aus neutralen konzentrierten wäßrigen Lösungen mit Pikrinsäure, Helianthin, Ammoniumreineckat und Pikrolonsäure nicht ausfällen. Es wird aus solchen Lösungen von schwach sauren oder schwächt basischen Ionenaustauschern nicht adsorbiert. Es gibt keine Farbreaktion nach Sackaguchi, Ehrlich, Benedict und Elson-Morgan. Die Biuretreaktion ist negativ.

Beispiel 10

10 g eines nach Beispiel 4 erhaltenen Antibiotikumpräparates werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 5n-Salzsäure auf einen p_H-Wert von annähernd 1 eingestellt. Diese Lösung wird zweimal mit 100 ml einer Mischung von 100 g Phenol in 100 ml Chloroform ausgeschüttelt. Der organische Extrakt enthält nur wenig antibiotische Aktivität und wird verworfen. Die wäßrige Lösung wird durch Zugabe von festem Kaliumbicarbonat auf p_H 6,5 gebracht und in drei Portionen mit insgesamt 150 ml einer Lösung von 300 g Phenol in 1 1 Chloroform extrahiert. Das wäßrige Raffinat wird verworfen. Den Phenol-Chloroform-Extrakt filtriert man durch eine kleine Schicht von Celite und

extrahiert das Filtrat dreimal mit 20 ml V₁₀Ii-Salz säure. Der Salzsäureextrakt, in dem sich das Antibio tikum befindet, wird auf p_H 2 eingestellt und in sech: Portionen mit insgesamt 100 ml eines Gemisches voi 100 g Phenol in 100 ml Chloroform extrahiert. De Phenolextrakt wird erneut durch Filtnohilfsmittel fil triert, mit 50 ml Wasser, 300 ml Äther und 300 ml Pe troläther versetzt und gut geschüttelt. Nach dem Ab trennen der wäßrigen Phase wird die organische Phas

ίο mehrmals mit kleinen Portionen Wasser nachge waschen. Die vereinigten wäßrigen Phasen werda zwecks Entfernung des Phenols mehrmals mit Äthe geschüttelt und hierauf lyophilisiert. Man erhält 85 mj eines beigen Pulvers von hoher antibiotischer Wirk samkeit.

Patentanspruch:

Die Verwendung von Streptomyces griseu A 10073 oder eines dessen Eigenschaften aufwei

ao senden Mikroorganismus der Gattung Strepto myces zur Herstellung des Antibiotikums Grisono mycin durch übliche biologische Züchtung, Gewin nung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrai Reindarstellung und Herstellung von desse Salzen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen