DE2638766A1 - Antibiotischer glykopeptidkomplex, verfahren zu seiner herstellung und diese enthaltende mittel - Google Patents

Antibiotischer glykopeptidkomplex, verfahren zu seiner herstellung und diese enthaltende mittel

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Description

M/17188 München, 27. August 1976
Antlbiotlacher Glykopeptidkomplex, Verfahren zu seiner Herstellung und diesen enthaltende Mittel
Die Erfindung betrifft einen neuen antibiotischen wasserlöslichen basischen Glykopeptidkomplex, der im folgenden als Bu-2231 bezeichnet wird, sowie seine Herstellung durch Fermentieren eines neuen Streptoalloteichus-Staiames, der in der Bristol-Banyu-KultursamEilung als E465-9** bezeichnet wird. Der vorstehende Organismus ist ein Actinomycetes-Bacteriura, das aus einer indischen Bodenprobe isoliert wurde. Eine Kultur des Organismus wurde in der American Type Culture Collection, Washington, D.C, hinterlegt und in die dortige permanente Sammlung von Mikroorganismen als A.T.C.C.31158 eingereiht.
Der neue erfindungsgemässe Glykopeptidkomplex umfasst zwei Haupt-Glykopeptidkomponenten, die als Bu-2231A und B bezeichnet werden. Diese beiden Komponenten sind bioaktiv. Der Komplex und 3ede der beiden vorstehenden Komponenten weisen eine inhibitorische Wirkung auf das Wachstum von Mikrobenorganismen, sowohl von Bakterien als auch von Fungi auf, die pathogen für Tiere und Pflanzen sind» Diese Antibiotika sind daher nützlich zur Therapie
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bakterieller Infektionen des Menschen oder von Tieren sowie zur Vorbeugung bzw. Behandlung von Reis, Erbsen, Weizen oder anderen Pflanzen, die durch pflanzenpathogene Organismen hervorgerufen werden. Der Komplex und seine Einzelbestandteile sind auch geeignet zur Behandlung verschiedener Tumorsysteme an Nagetieren einschliesslich des Walker 256-Karzinosarkoms (Aszitesform) und des Lewis-Lungenkarzinoms.
Die beigefügte Figur 1 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Bu-2231 A in Form des kupferfreien Hydrochloridsalzes als Pressling in Kaliumbromid.
Die Figur 2 zeigt das protonenmagnetische Resonanzspektrum von Bu-2231 A als kupferfreies Hydrochloridsalz, gelöst in DpO unter Anwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) als innerer Standard, bestimmt mit einem JEOL 60 MHz NMR-Spektrometer (Typ TNM-C-60 HL).
Die Figur 3 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von Bu-2231 B in Form des kupferfreien Formiatsalzes als Pressling in Kaliumbromid.
Die Figur 4 zeigt das protonenmagnetische P^esonanzspektrum von Bu-2231 B in Form des kupferfreien Formiatsalzes, gelöst in DpO unter Anwendung von 2,2-Dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat (DSS) als innerer Standard, bestimmt mit einem JEOL 60 MHz NMR-Spektrometer (Typ TNM-C-60 HL).
Im folgenden werden die morphologischen Charakteristika, KuI* turcharakteristika und physiologischen Charakteristika des Stammes E465-94 aufgeführt:
Der Stamm E465-94 erzeugt auf den meisten Agar-Medien im an der Luft befindlichen Mycel Trauben bzw. Bündel und ein SkIerotium. Die Traube bzw. das Bündel ist eine dominante bzw. vorherrschende sporenbildende Struktur und die Bildung von Sklero-
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tien ist etwas unberechenbar. Die Traube bzw. das Bündel besteht aus kurvenförmigen oder L-förmigen kurzen Sporenketten mit vielen Zweigen und entwickelt sich häufig zu einer dicken Masse. Einige Sporenketten erstrecken sich aus der Traubenbzw. Bündelstruktur heraus und bilden häufig offene Spiralen. Die Form des Sklerotiums ist oval oder gelegentlich unregelmässig. Eine Fragmentbildung des vegetativen Mycels tritt nicht auf. Windungen bzw. Ringe werden nicht gebildet.
Der Stamm E465-94 erzeugt an der Luft befindliche bzw. wachsende Mycelien auf den meisten untersuchten Agar-Medien« Die Farbe des reifen, an der Luft gewachsenen Mycels ist hellgelb, beige oder schwach blassrosa-gelb bzw. blassrötlich-gelb. Ein verbreitbares Pigment wird nicht erzeugt. Die Tyrosinase-Reaktion verläuft negativ. Der Stamm ist wärmebeständig und wächst reichlich bei 500C. Die Kulturcharakteristika und physiologischen Charakteristika sowie die Kohlenhydratverwertung des Stammes E465-94 sind in den Tabellen 1, 2 und 3 angegeben.
Tabelle 1 Kulturcharakteristika des Stammes E465-94
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar G: Reichlich
(ISP Nr. 2 Medium) R: Blassgelblich-braun bis
Pridham et al., 1956-57 hellbraun
A: Dick, samtartig, hellgelblichbeige oder blassrötlichbeige D: Keines
Hafermehl-Agar G: Massig
(ISP Nr. 3 Medium) R: Farblos, teilweise blass-
Kuster, 1959 gelblich-braun
A: Pulverförmig bis samtartig, gelegentlich mit Flecken, blassrötlich-beige Ds Keines
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Fortsetzung Tabelle
Anorganische Salaa-Stärke-Agar (ISP Nr. 4 Medium) Küster, 1959
Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Nr. 5 Medium) Pridham und Lyons, 1961
Pepton-Hefe extrakt-Eis en-Agar (ISP Nr. 6 Medium) Tresner und Danga, 1958
Tyrosin-Agar
(ISP Nr. 7 Medium) Shinobu, 1958 G: Massig
R: Farblos bis blassgelblichbraun
A: Pulverförmig bis samtartig, blassrötlich-gelb
D: Keines
G: Beschränkt
R: Farblos bis blass olivfarbenge Ib
A: Pulverförmig mit Flecken, weisslich bis blassgelblichbeige
D: Keines
G: Dürftig R: Braun Ai Dürftig, weiss D: Blass-braun
G: Massig
R: Blassgelb bis blassgrünlichgelb
A: Samtartig bis baumwollartig, weiss, später leicht rötlichgelb
D: Keines
G: Massig
R: Blass olivfarben-geIb bis hellbraun
A: Samtartig, hellgelblichbeige
D: Keines
G: Beschränkt R: Blassbräunlich-gelb A: Dürftig, weiss D: Blassgelb
G: Massig R: Farblos A: Dünn, blassgelblich-beige,
Flecken D: Keines
G: Massig
R: Hellgelblich-braun
A: Samtartig, blassrötlich-gelb
D: Keines
Abkürzungen: G = Wachstum; R * Färbung der Rückseite (reverse color); A = an der Luft befindliches bzw. gewach-
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Bennett-Agar
Nähr-Agar
Bodenextrakt-Agar
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar
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Fortsetzung Tabelle 1
senes Mycel; D= verbreitbares bzw. diffusions fähiges Pigment
Tabelle 2 Physiologische Charakteristik^ des Stammes E465-94
Gelatineverflüssigung Stärkehydrolyse Milch
Melanin aus L-Tyrosin Nitrit aus Nitrat Wachstumstemperatur
Fluoreszierendes Licht
NaCl-Toleranz
Kartoffelstempel-Säuretoleranz
Katalasereaktion Oxidase
Erzeugte Antibiotika Positiv; rasch verflüssigt Positiv
Beträchtliche Koagulation und leichte Peptonisierung. rH-V/ert ins alkalische verschoben. Gelbliches Ringwachstum
Negative Tyrosinase Positiv
Reiches Wachstum bei 32-5O0C, massig bei 25-30 C, beschränkt bei 230C und 520C, dürftig bei 200C und 54°C, Jcein Wachstum bei 12°C und
C
und 560C
Keine deutliche Inhibierung der Mycelbildung an der Luft unter einer fluoreszierenden Lampe von 15 W während 14 Tagen
Beschränktes Wachstum und Mycelbildung an der Luft in Leudemann's Agarmedium bei 3% NaCl. Kein Wachstum bei 7% NaCl.
Normales Wachstum und Mycelbildung an der Luft beim Leudemann-Kartoffeistempeltest
Positiv
Negativ
Bu-2231-Komplex und Nebramycin-Faktoren.,
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Tabelle 3 Kohlenhydrat-Verwertung des Stammes E465-94
D(-)-Arabinose - D(+)-Melibiose
L(+)-Arabinose - Trehalose
D-Xylose - Raffinose
D-Ribose + D(+)-Melezitose
L-Rhamnose - Lösliche Stärke
D-Glucose ++ Cellulose
D(+)-Galactose ++ Glycerin
D-Fructose ++ Inosit
D-Mannose ++ D-Mannit
L(-)-Sorbose - D-Sorbit
Sucrose bzw. Saccharose ++ Dulcit
Lactose ++ Salizin Cellobiose
Basalmedium: Pridham-Gottlieb Salze-Medium, ergänzt mit 0,196 Difco Hefeextrakt
Inkubationstemperatur: 370C
Zusammensetzung der Zellwand
Die Präparation der Zellwand wurde nach der von T.Yamaguchi in J.Bacteriol.89:444-453 (1965) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Analyse der Aminosäuren wurde wie folgt durchgeführt: 10 mg gereinigte Zellwand wurde in 1 ml 6n-HCl in einem verschlossenen Rohr bei 1200C während 18 Stunden hydrolysiert» Das Hydrolysat wurde mit einem gleichen Volumen von destilliertem Yfesser verdünnt,filtriert und anschliessend im Vakuum zur Trockne verdampft. Die Hälfte des Endprodukts wurde erneut in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie untersucht. Die andere Hälfte wurde
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in 2 ml Citratpuffer (pH-Wert 2,2) gelöst und durch Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Teil von 5 /ul des Hydrolysate wurde auf eine Siliciumdioxidgel-Dünnschichtplatte (60F2^, E.Merck AG, Deutschland) aufgetragen und mit Phenol-Wasser (4:1) in einer Richtung und anschliessend mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (3:1:1) senkrecht zum ersten Lauf entwickelt. Die Flecken wurden durch Aufsprühen von 0,2% athanolischem Ninhydrin-Reagens, gefolgt von Erwärmen der Platte während 5 Minuten auf 11O0C sichtbar gemacht. Zur Unterscheidung von meso- und/oder DD-DAP von LL-DAP wurden 5 /ul des Hydrolysats auf eine Cellulosepulver-Dünnschichtplatte aufgetragen. Die Platte wurde mit den Lösungsmittelsysten Methanol-Wasser-IOn-HCl-Pyridin (80: 17,5:2,5:10) während 24 Stunden entwickelt und anschliessend mit 0,2% NinhydrJa-Reagens besprüht. In diesem Dünnschichtchromatographie-System bewegte sich LL-DAP rascher als das als Bezugsstandard verwendete meso-DAP. Die Aminosäuren in dem Zellwandpräparat wurden auch in einem Aminosäuren-Analysator bestimmt. Die Aminosäurenanalyse des Zellwandpräparates von Stamm E465-94 zeigte die Anwesenheit von meso- o<f,£ -Diaminopimelinsäure (meso-DAP), Alanin und Glutaminsäure (Tabelle 4). Die Kohlenhydrate in der Zellwand wurden wie folgt bestimmt: Sine Probe von 50 mg der rohen Zellwand wurde in 3 ml 2n-H2S0^ gelöst und in einem verschlossenen Rohr während zwei Stunden bei 1200C hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde mit gesättigter Ba(OH)2-Lösung neutralisiert, das ausgefällte BaSO^ wurde durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert. Das so erhaltene Material wurde trimethylsilyliert und das Produkt wurde gaschromatographisch untersucht und mit verschiedenen Bezugszuckern verglichen. Die Kohlenhydratanalyse der Zellwand von E465-94 zeigte die Anwesenheit von Rhamnose, Mannose, Galactose und Glucosamin an (Tabelle 5)«
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Tabelle 4 Aminosäuren-Zusammensetzung der Zellwand
DAP (isomer) Glycin Glutamin- Asparagin- Alanin —————— —— säure säure —
++ (meso) + ++ Spuren +++
Tabelle 5
Kohlenhydrat-Zusammensetzung der Zellwand Arabinose Rhamnose Mannose Galactose Glucose
am in
Vergleich mit Actinomyceten-Stämmen Herstellung von Antibiotika vom Bleomycin-Typ
Der Stamm E465-94 erzeugt einen neuen antibiotischen Komplex Bu-2231, von dem angenommen wird, dass er aus Antibiotika vom Bleomycin-Typ besteht. Es wurden daher Vergleiche mit verschiedenen Actinomycetes-Stämmen durchgeführt, von denen bekannt ist, dass sie Bleomycin oder mit dem Bleomycin verwandte Antibiotika erzeugen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 aufgeführt. Der Stamm E465-94 unterscheidet sich deutlich von jedem dieser Mikroorganismen.
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Tabelle
Vergleich des Stammes E465-94 mit sechs Actinomyceten-Stämmen, die Antibiotika der Bleomycin-Gruppe erzeugen
Name des Mikroorganismus
Streptomyces verticillus
Nr.843-11^
Erzeugtes Antibiotikum
PhIe omyc ine
Streptomyces verti· cillus
B80-Z22)
Streptomyces bikiniensis
Variation zorbonensis5;
Bleomycine Zorbamycine
Streptomyces humidus Variation antitumoris MCRL-0387^
Streptosporangium violaceochromogenes
MK-,495)
YA-56 Komplex
Victomycin
Hauptunterschi ed zum Stamm E465-94
Ringbildung. Positive Ausnutzung von Inosit, Mannit, Raffinose und Rhamnose. Negative Verwertung von Galactose.
Ringbildung. Negative Verwertung von Galactose, Lactose und Sucrose bzw. Saccharose
Luftwachstum grau bis grauartig-gelb. Sporophor gerade. Verwertung ++: D-Xylose, L-Arabinose, Rhamnose, Cellobiose.
Verwertung +: Raffinose, Dulcit, D-Mannit, D-Sorbit und Inosit.
Luftmycel: Hellbräunlich-grau und hygroskopisch. Positive Verwertung von Arabinose, Xylose, Rhamnose, Mannit und Inosit.
Bildung von sphärischem Sporangium. Luftmycel: Muschelbzw. Shell-rosa. Positive Verwertung von Xylose.
Negative Verwertung von Lactose.
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Fortsetziang Tabelle 6
Name des Mikro- Erzeugtes Anti- Hauptunterschied Organismus biotikum zum Stamm E465-94
Streptosporangium Platomycine Bildung von sphäviolaceochromogenes rischem Sporangium.
mit 7A^) Luftmycel weiss
1^"'0 bis rötlich-weiss.
Positive Verwertung von Xylose. Negative Verwertung von Lactose und Glycerin.
1) K.Maeda et al. (Institute Microbial Chemistry): Japan. Patent 34-2598, April 17, 1959.
2) HiUmezawa et al.: New antibiotics, bleomycin A and B. J.Antibiotics 19:200-209, 1966.
3) The Upjohn Company: British Patent 1,277,150, 7.Juni 1972.
4) T.Furumai et al.: The antibiotic YA-56 komplex: Taxonomy and production of the producing strain. J.Antibiotics 26: 70-76, 1973.
5) I.Kawamoto et al.: A new antibiotic victomycin (XK 49-1-B-2). J.Antibiotics 28: 358-371, 1975.
6) T.Nara et al. (kyowa-Hakko Kogyo Co., Ltd.): Japan.Kokai, 49-108292, 15.Oktober 1974.
Taxonomie-Klassifizierung
Der Actinomyceten-Stamm E465-94 erzeugte auf Agar-Medium ein Büschel bzw. eine Traube und Sklerotium im an der Luft befindlichen Mycel, die morphologisch typisch für solche waren, die man bei gewissen Species von Streptomyces oder Chainia findet. Jedoch unterschieden sich die Aminosäure- und Zuckerzusammensetzung des Zellwandpräparates des Stammes E465-94 stark von jeglicher Species der Familie Spreptomycetaceae. Das Zellwandpräparat enthielt meso-o^-f -Diaminopimelinsäure (meso-DAP) anstelle von LL-DAP, die als spezifischer Zellwandbaustein der
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Genera Streptomyces und Chainia berichtet wurde. Darüberhinaus waren die Hauptzuckerbestandteile des Stammes Galactose, Mannose und Rhamnose, die sich von den für Streptomyces oder Chainia berichteten stark unterscheiden. Aufgrund der vorstehenden Fakten wird vorgeschlagen, einen neuen Genus Streptoalloteichus (Strepto-ein Streptomyces-ähnlicher Organismus, allo-geändert und teichos-Wand, d.h. ein streptomycesartiger Organismus mit ungewöhnlicher Zellwandzusammensetzung) unter der Familie Streptomycetaceae zu schaffen, um Actinomycetenstämme, die Streptomyces in der Morphologie ähneln, die jedoch die Zellwandzusammensetzung des Stammes E465-94 vom Typ meso-DAP, Alanin und Glutaminsäure als Hauptaminosäuren und Galactose, Mannose und Rhamnose als diagnostisch neutrale Zucker aufweisen, zu unterscheiden. So ist Streptoalloteichus ein alleiniger Genus unter den Genera der Familie Streptomycetaceae, der meso-DAP anstelle von LL-DAP in der Zellwandzusammensetzung aufweist. Es wird auch vorgeschlagen, den Stamm E465-94- als Streptoalloteichus hindustanus gen.nov. und sp.nov. zu bezeichnen, da der Organismus in Nordindien isoliert wurde. Der Stamm E465-94 erscheint deutlich unterschiedlich von den Mikroorganismen, die zur Herstellung von Bleomycinen und zum Bleomycin verwandten Antibiotika bekannt sind.
Es versteht sich, dass für die Herstellung von Bu-2231 die vorliegende Erfindung nicht auf den spezifischen Stamm Streptoalloteichus hindustanus, d.h. Stamm E465-9^, A.T.C.C.31158, beschränkt ist oder auf Mikroorganismen, die durch ihre Kulturcharakteristika hier voll beschrieben wurden, beschränkt ist, obwohl die folgende Beschreibung auf diesen speziellen Stamm Bezug nimmt. Die vorliegende Erfindung soll auch andere Bu-2231-produzierende Stämme oder Mutanten des genannten Mikroorganismus umfassen, die auf bekannte Weise beispielsweise durch Röntgenstrahlen-, Ultraviolettstrahlen-Behandlung, Stickstofflost-Behandlung, Phagenbehandlung und dergleichen des neuen Mikroorganismus erhalten werden können«
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Herstellung der Antibiotika
Der Antibiotikakomplex Bu-2231 wird durch Kultivieren eines Bu-2231-produzierenden Stammes von Streptoalloteichus hindustanus, vorzugsweise des Stammes Streptoalloteichus hindustanus E465-94, A.T.C.C.31158 oder einer Mutante davon unter submergen aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium erzeugt. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, beispielsweise ein assimilierbares Kohlenhydrat enthält. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Ribose, Galactose, Fructose, Mannose, Sucrose bzw. Saccharose, Lactose,lösliche Stärke und Glycerin. Das Nährmedium sollte auch eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthalten wie beispielsweise Fischmehl, Sojabohnenmehl, Mais- bzw. Korn-quell- bzw.-einweichflüssigkeit, Peptone, Fleischextrakt, Erdnussmehl, Hefeextrakt oder Ammoniumsalze. Anorganische Salaswie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Phosphate usw. können gegebenenfalls zugesetzt werden. Spurenelemente wie Kupfer, Mangan, Eisen, Zink usw. werden dem Medium gegebenenfalls zugesetzt oder können als Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums zugeführt werden. Die Inkubationstemperatur kann jegliche Temperatur sein, bei der ein Bu-2231-erzeugender Stamm wachsen kann, z.B. 20 bis 5^°C Vorzugsweise wird die Fermentation bei 25 bis 35°C und besonders bevorzugt bei 27 bis 320C durchgeführt. In dem Medium wird vorzugsweise ein neutraler oder fast neutraler pH-Wert, z.B. pH etwa 6-7, angewendet und die Erzeugung des Antibiotikums wird im allgemeinen während etwa zwei bis sieben Tagen durchgeführt. Gewöhnlich wird eine optimale Produktion in drei bis fünf Tagen erzielt. Zur Herstellung von relativ geringen Mengen können Schüttelkolben- und Oberflächenkulturen angewendet werden, jedoch wird für die Herstellung grosser Mengen die submerge aerobe Kultur in sterilen Tanks bzw. Bottichen bevorzugt. Wird eine Fermentation im Bottich durchgeführt, so ist es günstig, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe durch Inokulieren
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der Kulturbrühe mit einer Spore des Organismus herzustellen. Hat man ein junges aktives vegetatives Inokulum erhalten, so führt man dieses aseptisch in das Mediuni des Fermentationsbottichs über. Die Belüftung in Bottichen und Flaschen kann durch Einleiten von steriler Druckluft durch oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums erfolgen. Darüberhinaus wird in den Bottichen mit einem mechanischen Flügelrührer gerührt. Gegebenenfalls kann ein Antischaummittel wie Specköl zugesetzt werden.
Die Erzeugung von Bu-2231 in dem Fermentationsmedium kann leicht im Verlauf der Fermentation durch die Papierscheiben-Agar-Diffusionsmethode unter Anwendung von Bacillus subtilis PCI-219 und Mycobacterium 607 Stamm M6-3 als Testorganismus verfolgt werden.
Bu-2231 A und B sowie die Nebramycin-Faktoren,von denen man annimmt, dass sie koproduziert werden, sind Jeweils aktiv gegen B.subtilis PCI-219, jedoch zeigten lediglich die Komponenten Bu-2231 A und B eine Wirksamkeit gegen M.607 M6-3. Bei der Fermentation im Schüttelkolben erzeugte der Stamm Ξ465-94 50-100 mcg/ml Bu-2231 Komplex nach drei bis fünf Tagen.
Isolierung und Reinigung des Bu-2231 Komplexes
Nachdem die Nährbrühe ihr optimales Leistungsvermögen erreicht hat (wie beispielsweise durch die vorstehende Untersuchung bestimmt) werden das Mycel und die ungelösten Rückstände von der Fermentationsbrühe auf übliche Weise durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt. Die antibiotische Aktivität ist im Filtrat enthalten und kann daraus durch Anwendung üblicher Adsorptionstechniken gewonnen werden. Die Adsorbentien, die man für die Gewinnung besonders bevorzugt verwendet, sind Kationenaustauscherharze, beispielsweise Harze vom Typ IRC-50, die im Handel von Rohm und Haas unter dem Handelsnamen "Amberli·
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te IRC-50" erhältlich sind. Das nötigenfalls auf den pH-Wert 7 neutralisierte FiItrat wird durch eine mit einem Kationenaustauscherharz wie Amberlite IRC-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule geleitet. Es wird anschliessend mit Wasser gewaschen. Zusätzlich zu dem Komplex Bu-2231 produziert der Organismus E465-94 auch einen antibiotischen Aminoglykosidkoiaplex, der aus Nebramycinfaktoren besteht» Diese Aminoglykosidverunreinigung kann von dem Komplex Bu-2231 gemäss der Erfindung durch Eluieren mit einer verdünnten Base, z.B. 0,25n-Ammoniumhydroxid abgetrennt werden. Der gewünschte Komplex Bu-2231, der auf dem Harz adsorbiert verbleibt, kann anschliessend mit einer Mineralsäurelösung, z.B. Chlorwasserstoffsäure vom pH-Wert 2 eluiert werden und die Fraktionen von Bu-2231 des EIuats werden gesammelt und vereint.
Eine partielle Reinigung des Komplexes kann durch Chromatographie der vereinten Fraktionen von Bu-2231 an einem geeigneten Adsorbens wie Aktivkohle und Eluieren mit beispielsweise wässrigem Butanol bei saurem pH-Wert erzielt werden. Die Butanolschicht wird abgetrennt und die wässrige Schicht wird lyophilisiert oder im Vakuum konzentriert, wobei man den festen Bu-2231 Komplex erhält. Der Komplex kann weiter chromatographiert und/ oder einer Gelfiltration unterzogen werden, wobei man den gereinigten, kupferenthaltenden festen Komplex erhält.
Trennung der Komponenten Bu-2231 A und B
Die Glykopeptid-Komponenten Bu-2231 A und B können von dem Komplex durch Gradienten-Elutions-Chromatographie über einem modifizierten Dextranderivat als Kationanaustauscher abgetrennt werden» Beispielsweise kann ein modifiziertes PoIysacchariddextran des im Handel unter dem Namen CM-Sephadex C-25 üblichen Typs verwendet werden. Eine wässrige Lösung des Komplexes Bu-22311 der vorzugsweise wie vorstehend beschrieben gereinigt wurde, wird in eine Säule gefüllt, die den modifizier-
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ten Dextranionenaustauscher enthält. Wie im Falle der Bleomycine (J.Antibiotics, 19, 210-21 (1966)) ist es leichter, die Komponenten auf diese Weise abzutrennen, wenn der Komplex mit Kupfer ausreichend cheliert ist. Die bevorzugte Herstellungsweise umfasst so das Auflösen des Komplexes in einer Kupfer-II-Chloridlösung, um sicherzustellen, dass er in einer ausreichend chelierten Form mit Kupfer vorliegt und das Einbringen dieser Lösung in die Säule. Die Komponenten werden anschliessend stufenweise mit wässriger Ammoniumformiatlösung in von 1 bis 7% variierenden Konzentrationen eluiert. In den ersten Fraktionen erscheint das Bu-2231 B, während das Bu-2231 A in den letzten Fraktionen des Eluats enthalten ist. Die die gleichen Komponenten enthaltenden Fraktionen werden vereint, durch Gelfiltration entsalzt, konzentriert und lyophilisiert, wobei man die gereinigten Komponenten Bu-2231 A und B in Form ihrer Kupferkomplexe erhält.
Die Anwendung von Ammoniumformiat als Eluiermittel bei der chromatographischen Trennung, die vorstehend beschrieben wurde, führt dazu, dass man die Komponenten beim Lyophilisieren als Formiatsalze erhält. Zur Umwandlung der Formiatsalze in die jeweiligen freien Basen und/oder zur Umwandlung der Formiatsalze oder der freien Basen in andere gewünschte Säureadditionssalze, z.B. die Hydrochloridsalze, können dem Fachmann bekannte bzw. übliche Standardtechniken verwendet werden.
Die Glykopeptid-Komponenten Bu-2231 A und B weisen wie die Bleomycine die Eigenschaft auf, mit Kupfer Chelate zu bilden und die Komponenten und ihre Säureadditionssalze können daher entweder in der Kupferkomplexform oder in der kupferfreien Form vorliegen. Die kupferfreien Formen von Bu-2231 A und B können aus den Kupferkomplexen durch Anwendung von HpS in Methanol, wie in der US-Patentschrift 3,646,197 beschrieben, hergestellt werden.
Die beiden Glykopeptid-Antibiotikakomponenten können vonein-
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90
0,22 0,05
0,41 0,11
0,16 0,04
0,31 0,09
ander und von den verwandten Bleomycinen und Phleomycinen entweder in Form des Kupferkomplexes oder in der kupferfreien Form durch die in der nachstehenden Tabelle 7 gezeigten Dünnschichtsysteme S-102 und S-123 unterschieden werden.
Tabelle 7 Rf-Werte
S-102 S-123
Cu-A Cu-B Freies A Freies B
Bleomycine 0,34, 0,44, 0,69 0,21, 0,50, 0,79 Phlemycine 0,37, 0,54, 0,72 0,22, 0,41, 0,59
S-102: SiO2-Platte, CH3OH-I0% CH3COONH4 (1:1)
S-123: SiO2-Platte, CH3OH-I0# CH3COONH4-I0# NH4OH (10:9:1)
Daten zur Charakterisierung von Bu-2231 Antibiotlsche Komponenten
Die antibiotischen Substanzen Bu-2231 A und B sind jeweils amorphe Basen, die in der Form des Kupferkomplexes als blaue Feststoffe und in der kupferfreien Form als weisse Feststoffe vorliegen» Beide Substanzen sind in Wasser und Methanol löslich, gering löslich in Äthanol und praktisch unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln.
Bu-2231 A und B können mit Säuren Salze bilden und die pharmazeutisch brauchbaren Säureadditionssalze der Antibiotika
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werden von der vorliegenden Erfindung unifasst. Beispiele für geeignete pharmazeutisch brauchbare Säureadditionssalze umfassen die nicht-toxischen Salze mit organischen und anorganischen Säuren wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Stearinsäure, Propionsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure und dergleichen.
Die Elementaranalysen des Kupferkoraplexes und der kupferfreien Verbindungen Bu-2231 A und B sind im folgenden angegeben:
Bu-2231 A (Kupferkomplex)s
C64H112N20°32S2Cu
ber.s C 42,68, H 6,27, N 15,56, S 3,56 gef.: C 42,66, H 6,16, N 15,31, S 3,14
Bu-2231 A (kupferfrei):
C64H112N20O32S2
ber.: C 44,24, H 6,50, N 16,12, S 3,69 gef.: C 45,10, H 6,51, N 16,05, S 3,55
Bu-2231 B (Kupferkomplex):
C58H1OON18°31S2CU
ber.: C 41,63, H 6,02, N 15,07, S 3,83 gef.: C 40,96, H 5,61, N 14,78, S 3,39
Bu-2231 B (kupferfrei);
C58H100N18°31S2
ber.; C 43,27, H 6,26, N 15,66, S 3,98 gef.: C 43,01, H 6,22, N 14,81, S 3,61
Der Kupfergehalt wurde in einer vereinten Probe von Bu-2231 A und B durch Atomabsorptionsspektrometrie als etwa 3% bestimmt.
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2G307GG
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Die Ultraviolettabsorptionsmaxima und die optische Drehung der Komponenten sind im folgenden aufgeführt:
UV Absorption /ά/^ Verbindung "1^ in op &\% cm) (c 0
Bu-2231 A (Kupferkomplex) 243(125), 291 (98) +50°
Bu-2231 A (kupferfrei) 235(Sch), 290 (67) -21
Bu-2231 B (Kupferkomplex) 243(134), 291 (109) +76
Bu-2231 B (kupferfrei) 235(Sch), 289,5 (77) -19
Bleomycin A (Kupferkomplex) 242(149), 291 (121)
Phleomycin (Kupferkomplex) 244(138), 301 (49) +84,5
(Literatur ref.)
Das Verhältnis der UV-Absorptionsvermögen der beiden Absorptionsmaxima für Bu-2231 (relatives Absorptionsvermögen bei 240 τψ und 290 mu: 1,2-1,3) lässt eher auf die Ähnlichkeit der neuen Komplexe mit Antibiotika der Bleomycin-Gruppe schliessen als mit solchen der Phleomycin-Gruppe.
Die Infrarot- und kernmagnetischen Resonanz-Spektren des kupferfreien Hydrochloridsalzes von Bu-2231 A und des kupferfreien Formiatsalzes von Bu-2231 B sind in den beigefügten Figuren 1 bis 4 angegeben.
Beide aitibioti sehen Komponenten ergeben positive Reaktionen mit dem Ninhydrin-Reagens.
Strukturmerkmale der Komponenten von Bu-2231
Die nahe strukturelle Ähnlichkeit von Bu-2231 A und B mit Bleomycin wurde durch die vorstehend beschriebenen physikalisch-
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chemischen Eigenschaften aufgezeigt. Die kupferfreien Präparate der beiden Komponenten sowie Bleomycin A2 wurden in einem verschlossenen Rohr mit 6n-HCl während 20 Stunden bei 1050C hydrolysiert. Jedes der Hydrolysate wurde im Vergleich durch Hochspannungs-Papierelektrophorese untersucht. Die Lokalisation der Aminosäuren wurde mit Ninhydrin-Reagens sowie auch durch UV-Licht bestimmt.
Wie in der Tabelle 8 gezeigt, wurde jede der sechs Aminosäuren (I bis VI) und ein Aminrest (VII) des Bleoiaycins A2, der in der Literatur beschrieben wird (J.Antibiotics 21: 79, 1968) durch Papierelektrophorese identifiziert. Die Hydrolyseprodukte von Bu-2231 A und B zeigten positive Ninhydrin-Zonen, die den Aminosäuren I, II, IV und V des Bleomycins A2 entsprachen. Die Identität jeder der vier aus Bu-2231 A und B isolierten Aminosäuren mit den Aminosäuren I, II, IV und V aus Bleomycin A2 wurde chemisch und spektroskopisch bewiesen. Die Aminosäure III (Zone bei 13,5 cm) des Bleomycins A2 war in Bu-2231 A und B nicht vorhanden. Dieses zeigte indessen eine zusätzliche Ninhydrin-positive Zone bei 14,8 cm (bezeichnet als Aminosäure VIII). Die Struktur der Aminosäure VIII wurde als 4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure bestimmt, die das Desmethylanalogon der Aminosäure III ist.
Die Aminosäure VI (Zone bei 8,5 cm, UV-Absorptionsmaximum bei 290 mu) des Bleomycins A2 war in Bu-2231 A und B nicht vorhanden. Jedoch wurde eine saure Verbindung (IX) mit einem UV-Ab-
196
sorptionsmaximum bei 283 mu (Eicm = 280) als Ausfällung aus
dem sauren Hydrolysat von Bu-2231 A und B isoliert.
Der endständige Aminorest (VII der Tabelle 8) von Bleomycin A2 erschien in der Zone 31,5 cm. Bu-2231 A und B ergaben dieselbe Zone wie das Amin VII des Bleomycins A2, jedoch zeigen verschiedene Aminoreste des Bleomycin-Komplexes eine vergleichbare Mobilität bei dieser Papierelektrophorese-Methode.
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Die anschliessende Analyse zeigt tatsächlich, dass der endständige Aminorest von Bu-2231 A und B Spermidin (X), der Aminorest von Bleomycin A1- ist. Bu-2231 A ergab eine zusätzliche Ninhydrin-positive Zone bei 23,0 cm (XI ind Tabelle 8), die im Bleomycin Ap und Bu-2231 B nicht vorhanden war. Die Verbindung XI wurde als ß-Lysin identifiziert.
Die Strukturen der vorstehend beschriebenen Aminosäuren und Aminoreste sind im nachfolgenden aufgeführt:
Aminosäuren und Amin-Bestandteile von Bleomycin A2 und Bu-2231 A und B
CH^-CH-CH-COOH J ι ι
OH NH2
L-Threonin
II
CH3-/ y_ CH-CH2-COOH
iN NH9 COOH
ß-Amino-ß-(4-amino-6-carboxy-5-methyl-pyrimidin-2-yl)-propionsäure
III CH,-CH - CH-CH-COOH 3 1 11
NH2 OH CH3 A-Amino^-hydroxy-^-methyl-n-valeriansäure
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IV N
CH-CH-CCOH I
Π Η OH NHn
β-Hydroxyhistidin
V NH2-CH2-CH-COOH NH2
L-ß-Aminoalanin
VI
COOH
2' - (2-Aminoäthyl)-2,4·-bithiazol-^-carbonsäure
VII NH2-(CH2)5-S+(CH3)2· Χ"
3-Aminopropyldimethylsulfoniumsalz
VIII CH,-CH—CH-CH -COOH 3 1 ι
NH2 OH
4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure
IX Unbekannte Struktur (/I
283 ιημ)
-(CH2 )3-NH-( CH2 )A-NH2 (Spermidin)
XI NH2-(CH2)3-CH-CH2-C00H (ß-Lysin)
Die Zuckerkomponente von Bu-2231 A und B wurde auch im Vergleich mit Bleomycin untersucht. Eine Mischung der Komponenten
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A und B wurde in Methanol mit einem stark sauren Harz (Amberlyst 15) während 20 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Basische Fragmente der Hydrolyse wurden an dem Harz adsorbiert und neutrale Produkte, die in der Lösung freigesetzt wurden, wurden im Vakuum zu einem klebrigen Sirup konzentriert. Dieses Material wurde trimethylsilyliert und anschliessend gaschromatographisch analysiert. Bleomycin ergab Peaks, die Glucose und Mannose zuzuordnen waren, und die Bu-2231-Komponenten zeigten fast das gleiche Eluierungsmuster wie das Bleomycin, was die gleiche Struktur des Kohlenhydratteils der Antibiotika anzeigte«.
Tabelle 8 Papierelektrophorese von Produkten der sauren Hydrolyse
Lokalisierung von Ninhydrin-positiven Zonen (Entfernung vom Ausgangspunkt)*»
Aminosäuren und Amin*
VI I
II
III
VIII IV
XI
VII (X)
* Die Strukturen der Aminosäure- und Amin-Komponenten sind im Text angegeben,
** Toyo Filterpapier Nr. 51, Pufferlösung: Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25:75:900)
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Bleomycin A^ Bu-2231 A Bu-2231 B
6,5 cm - —
9,7 9,7 9,7
12,0 12,0 12,0
13,5 - -
- 14,8 14,8
16,0 16,0 16,0
18,5 18,5 18,5
- 23,0 -
31.5 31,5 31,5
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Antimikrobiell Wirksamkeit
Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) von Bu-2231 A und B wurden gegenüber einer Vielzahl von Bakterien und Fungi nach der zweifachen Agar-Verdünnungsmethode untersucht. Es wurde ein MUller-Hinton-Agar-Medium zur Bestimmung der bakteriellen MIC-Werte (grampositiv und gramnegativ) verwendet. Für säurefeste Bakterien wurde ein Medium Nr. 1001 verwendet /Glycerin (3%), Natriumglutamat (0,3%), Pepton (0,2%), Na2HPO4 (0,31%), KH2PO4 (0,196), Ammoniumeitrat (0,005%), MgSO4.7H£0 (0,001%), Agar (1,5%)/. Für Fungi wurde ein Sabouraud-Agar verwendet.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 9 und 10 im Vergleich mit Bleomycin und Phleomycin aufgezeigt. Die antibakteriellen Wirksamkeiten und Antifungus-Wirksamkeit von Bu-2231 A und B liegen über denen der Vergleichsantibiotika. Bu-2231Azeigte eine etwas stärkere antibakterielle Wirksamkeit als das Bu-2231 B, war jedoch in seiner Antifungus-Wirksamkeit geringer.
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Tabelle 9« Antibakterielle Spektren von Bu-2231 A und B
O CD CO
O O CD
Testorganismus
E.coil NIHJ
" Juhl AI5II9
" K-12 A9632
" A20665
" A20683
" A20732
E.cloacae A21006
K.pneumoniae D11
" A9678
" A20680
" A20328
P.vulgaris A9436
P.morganii A9553
P.mirabilis A9554
P.rettgeri A15167
P.stuartii A20854
H A20734
S.marcescens A20019
" A20460
" A2O333
" A21235
P.aeruginosa A9923
" A993O
" H9, D 113
" A20741
Bu-2231 A
Bu-2231 B
Cu-frei Cu-Komplex Cu-frei Cu-Komplex
Bleomycin Phleomycin
NIHJ
0,025
0,1
0,05
0,05
6,3
0,05
1,6
<ro,oo63
0,2
6,3
0,8
0,2
0,4
0,1
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,2
0,2
50
0,4
>1OO
0,2
gramnegativ
0,025
0,1
0,05
0,05 25
0,05
1,6
0,0125
0,4 50
0,8
0,4
0,4
0,1
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,2
0,4 >100
0,4 >100
0,2
0,2
0,2
0,1
0,05 12,5
0,2
6,3
0,025
0,4 25
1,6
0,2
1,6
0,2
0,8
0,4
0,8
0,8
0,8
0,8
1,6 >100
0,8 >100
0,2 0,1 0,2 0,2
0,25 50
0,1
12,5 < 0,0063
0,4 100
1,6 0,2 1,6 0,2 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,4
1,6 >1OO
1,6 >1OO
0,2
0,8 1,6 0,8 0,2
>100 1,6
>100 0,2
6,3 >1OO 25
6,3 >100 50 >100
3,1 >100 >100 >100 >100
100
>100 >100
•100
12,5
Nr.616
0,8 1,6 1,6 0,4
100
1,6 50
0,4 12,5
100
100 0,8
6,3 1,6
3,1 0,8 1,6 0,8 0,8 0,8 0,8
100 3,1
100 6,3
Fortsetzung Tabelle 9
TestOrganismus
S.aureus 209P
« Smith A9537
" Nr.193
M 209P, R4
" A20239
" BX-1633, A9606
S.lutea PCI-1001
M.flavus D12
B.mycoides "0"
B.sphaericus Nr.122
B.cereus ATCC 10702A
B.subtilis PCI-219
B.ahthracis 115
Mycobacterium 607, D87
" 607, D46
w 607, D47
" phlei, D88
" ranae, ATCC110
Bu-2231 A
Bu-2231 B
Cu-frei Cu-Komplex Cu-frei Cu-Komplex
0,1
0,1
0,1
0,4
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2 <O,OO63
0,2 <TO,OO63
0,05
grampositiv
0,2
0,1
0,2
0,4
0,2
0,2
0,2
0,2
0,1 <r 0,0063
0,2 /0,0063
0,05
0,4 0,05 0,4 0,8 0,8 0,8 0,4 0,4 0,2 0,2 0,2
<^O,OO63 0,1
säurefest
0,2 0,1
0,1 0,1
0,1 0,1
0,05 0,05
0,1 0,1
0,1 0,1
0,05 0,05
0,1
0,4
0,05
0,4
0,8
0,8
0,2
0,8
0,8
0,2
0,2
0,1
40,0063
0,2
Bleomycin Phleomycin NIHJ Nr.616
6,3
3,1
12,5
12,5
12,5
6,3
100
50
12,5
6,3
1.6
<f 0,0063
12,5
0,05 0,8
0,05 0,2
0,025 0,4
0,025 0,2
0,05 0,8
0,2
0,1
0,2 0,4 0,4 0,4 0,4 0,2 0,2 0,4 0,2
<O,OO63 0,4
0,4 0,2 0,2 0,1 0,4
CD CO CO
Tabelle 10, Ant!fungus-Spektrum yon 3u-2251 A und B
BBRI
Code- Testorganismus
Nr.
Bu-2231 A
Cu-
frei
Cu-Komplex
Bu-2231 B
Cufrei Cu-Komplex
Bleomycin
NIHJ
Phleomycin Nr.616
Ca-I
Ca-2
Ca-4
Ck-I
Ck-2
Ct-I
Ct-4
Cn-I
Cn-2
Sc-I
Sc-2
An-I
Af-I
Hy-I
Sy-I
Vx-I
My-I
Fm-I
Cl-I
Pt-I
Tm-I
Ta-I
Tr-I
Mc-I
C,
Il Il
C. kruset IAM 4489
I!
Il
albtcans IAM 4888 0.8
Nystatin-R 0.8
#520 Yale A9540 3.1
0.8 0.8 0.8 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 0.8. 0.8
• #96 A15052
tropicalis IAM 4157
#125 A15051
neo formans
IAM 4514
S. cerevisiae ATCC 9763
IAM 4009
A. niger var Tieghem
ϋ· futnlgatus IAM 2530
Hormodendrum sp.
Sporotrinbum sp.
Verticillium sp.
Mucor sp.
C.
T. T. M.
NRRL A2284
lunata ATCC 13432
cit:rinum IAM 7008
mentagrophytes D-155
asteroides rubrum D-55
canis D-51 ·
3,
3,
1 1
6.3
0,8 0.8 1.6 12.5 3.1 3.1 3.1
1.6 1.6 6.3 0.8 0.8 1.6 1.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.2 3.1 6.3 6.3 0.8 0.2 1.6 12.5 . 1.6 1.6
0.8 0.8 1.6 0.4 0.4 0.8" 0.8 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.2 3.1 1.6 3.1 0.8 0.2 1.6 6.3 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 3.1 0.2 0.2 0.8 0.8
1
1
1
1
0.2 0.2 0.2 1.6 3.1 3.1 0.8 0.2 0.8 6-3 1.6 1.6 1.6
,5 ,5
,5
.1 ,5
12, 12.
>100 12. 3, 12,
>100 1.6 1.6 0.8 0.4 0.4 0.8 0.8
>100 6.3 3.1
MOO 0.1
>100
>100
>100
>100
>100
3.1 1.6 6.3 0.8 0.8 3.1 6.3 0.4 0.4 0.8 0.8 0.4 0.8
. 0.8
12.5 6.3 3.1
12.5 0.4 3.1
12.5 6.3 3.1 6.3
M/17188
Die Aktivität in vivo des Bu-2231-Komplexes wurde an experimentellen Infektionen von Mäusen gegen S.aureus Smith und E. coli NIHJ untersucht. Als Vergleichsantibiotikum wurde Bleomycin verwendet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 11 aufgeführt. Bu-2231 war etwa 2Ofach (S.aureus) bis 8Ofach (E.coli) wirksamer als Bleomycin, ausgedrückt als Wert der mittleren Schutzdosis
Tabelle 11 Bleomycin Bleomycin
4/5 5/5
Aktivität in vivo von Bu-2231 - 1/5
Dosis (se) gegenüber S.aureus Smith-Infektion 2/5 1/5
8 mg/kg Bu-2231 (A + B) 0/5
4 mm V5
2 - - -
1 - 0/5 2,55 mg/kg
0,5 5/5 -
0,25 5/5 -
0,13 5/5 2,5 mg/kg
0,06 1/5 gegenüber E.coli NIHJ-Infektion
0,03 1/5 Bu-2231 (A + B)
PD50 0/5
0,14 mg/kg 5/5
Dosis (se) 5/5
8 mg/kg 5/5
2 2/5
0,5 1/5
0,13 0,031 mg/kg
0,03 709878/1009
0,008
PD50
2G38766 M/17188 - se -
a»
Die Aktivität in vivo der einzelnen Komponenten von Bu-2231 wurde sowohl in der kupferfreien als auch in der Form des Kupfer-Komplexes bei der E.coli-Infektion untersucht. Wie aus der Tabelle 12 ersichtlich ist, war das Bu-2231 A etwas aktiver als das Bu-2231 B. Die Anwesenheit des Kupfers im Bu-2231 Molekül beeinflusste die in vivo-Wirkung nicht nennenswert.
Tabelle 12
Aktivität in vivo von Bu-2231 A und B in der kupferfreien Form sowie in der Form des Kupfer-Komplexes (gegen E.coli NIHJ-Infektion)
Bu-2231 A 5/5 Bu-2231 B 3/5
Dosis (se) Cu-frei Cu-Komplex 5/5 Cu-frei Cu-Komplex 5/5
8 — 5/5 5/5
2 5/5 4/5 5/5 3/5
0,5 5/5 3/5 5/5 2/5
0,13 5/5 0/5 4/5 2/5
0,03 3/5 0,031 1/5 0,040
0,008 1/5 mg/kg 0/5 mg/kg
PDso 0,024 0,065
mg/kg mg/kg
Die akute Toxizität des kupferfreien Bu-2231 A und B wurde an Mäusen durch eine einzige subcutane Injektion bestimmt. Für Jede Dosis wurden Gruppen von drei Mäusen verwendet und das Körpergewicht wurde während 16 Tagen aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 13 aufgeführt. Das Bu-2231 A erwies sich als etwas toxischer als das Bu-2231 B. Bei einer Dosis bis zu 50 mg/kg traten bei Bu-2231 B keine Todesfälle auf, jedoch wurde an allen untersuchten Tieren eine Abnahme des Körpergewichts festgestellte
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Tabelle 13. Akute Toxizität von Bu-2231
Bu-2231 A Dosis (se) Anzahl der überlebenden
an ,iedem Tag		 3 3 2 3 3 5 3 3 9 3 3 12 3 3 Tiere 3 3 Mittleres
(er)		 15,0 Körpergewicht 16 LD50 7188
Cu-frei O 3 1 O O 16 JL 14,7 10 -
50 mg/kg 3 3 3 3 3 3 3 2 3 O 3 19,3 16,7 - 14,5
25 3 3 3 3 3 3 2 3 20,0 18,7 13,3 16,3
12,5 3 3 3 3 3 3 20,0 15,7 19,3 28
mg/kß
O Bu-2231 B 6,3 3 3 3 3 3 3 20,0 15,7 17,3
CO Cu-frei 15,7 15,3
OO
N> 		50 mg/kg 19,3 16,7 14,7 17,3
OO
— 		25 18,7 16,0 16,7 20,7 >50
mg/kg		 si
O 12,5 20,0 19,3 20,3 I
O
CO 		6,3 18,7 18,7
M/17188
07GG
Tumorwirksamkeit
Es wurde auch gefunden, dass der Bu-2231-Komplex und seine Hauptkomponenten Bu-2231 A und B zusätzlich zu der vorstehend gezeigten antimikrobiellen Wirksamkeit auch verschiedene experimentelle Tumore bei Tieren inhibieren. Im nachfolgenden sind Untersuchungen beschrieben, die an zwei transplantierten Nagetiertumorsystemen durchgeführt wurden, nämlich am Walker 256 Karzinosarkom in der Ascitesform und am Lewis-Lungenkarzinom mit intraperitonealer Tumorbreiverpflanzung. Die angewendete Methodologie entsprach im allgemeinen der vom National Cancer Institute in Cancer Chemotherapy Reports 3 (2):1-103 (1972) beschriebenen. Die wesentlichen Einzelheiten der Untersuchungen sind in den nachfolgenden Tabellen I bis III aufgeführt.
Dosis
mcg/kg/Tag		 Versuch-Nr« C Walker 256-Ascites-Tumor +10 überlebende
Tag Tag
5 44		 4/6
2560 MST
Tage		 .5439 + 9 6/6 1/6
Tabelle ] 640 >44,0 Wirkung Durch-
MST schnitt-
96T/C liehe Ge-
wichtsän-
derung/κ		 +11 6/6 0/6
Wirkung von Bu-2231 auf den 160 17,5 >489 + 7,5 6/6 0/6
2560 10,0 194 +18 6/6 5/6
Verbindung 640 26,0 111 +19 6/6 4/6
Bleomycin 160 >44,0 288 +19,5 6/6 1/6
40 >44,0 ^489 +18 6/6 1/6
10 9,0 >489 +34 6/6 0/10
Bu-2231 8,5 100 10/10
9,0 94
Kontroll
salzlösung
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Tumor:
Behandlung:
Bewertung: Wirkung: Kriterien:
Überlebende:
JS
10 Asciteszellen, i.p.in weibliche SD-Ratten implantiert.
Einmal täglich während acht Tagen, beginnend mit dem ersten Tag i.p.
MST - Mittlere Überlebenszeit in Tagen. 96T/C = MST behandelt/MST Kontrolle χ 100
T/C > 125 bedeutet eine beträchtliche Inhibierung des Tumors (Verlängerung der Lebensdauer des Wirtes).
Bewertung der T'oxizität und der Gewichtsänderung am 5.Tag; am 44.Tag wurde die Untersuchung abgeschlossen. Die Überlebenden waren "geheilt". Die anderen Tiere starben am Tumor.
Tabelle II 640 1 Untersuchung Nr. Wirkung
MST
%T/C		 5501 Überlebende
Tag
5
Wirkung 160 MST
Tage		 179 Durch
schnitt
liche Ge-
wichtsän-
derung/ß		 6/6
640 12,5 157 + 4,5 6/6
der Bu-2231-Fraktionen auf den Walker 256- 160 11,0 250 + 7,8 6/6
Ascites-Tumor - 40 17,5 179 + 7,2 6/6
Dosis
Verbindung mcg/kg/Tag		 10 12,5 157 +28,8 6/6
Bleomycin 640 11,0 129 + 6,0 6/6
160 9,0 186 + 5,5 6/6
Bu-2231 A 40 13,0 186 +10,7 6/6
10 13,0 157 +36,5 6/6
11,0 114 + 8,3 6/6
8,0 ... +36,5 10/10
Bu-2231 B 7,0 M009 +38,4
Ό9828/
Kontroll
salzlösung
M/17188
Tumor:
Behandlung s
Bewertung: Wirkung: Kriterien:
Überlebende:
10 Asciteszellen, implantiert i.p. in weibliche SD-Ratten .
feinmal täglich i.p.während acht Tagen, beginnend am ersten Tag.
MST = mittlere Überlebenszeit in Tagen.
S6T/C = MST behandelt/MST Kontrolle χ 100
125 bedeutet eine beträchtliche Inhibierung des Tumors (Verlängerung der überlebenszeit des Wirtes).
Toxizitätsbewertung und Aufzeichnung der Gewichtsänderung am 5.Tag.
Tabelle III Wirkung der Bu-2231-Fraktionen auf das Lewis*sehe Lun
genkarzinom
Untersuchung Nr. 55
Verbindung Dosis
mcg/kg/Tag		 MST
Tage		 Wirkung
MST
%T/C		 Durch
schnitt
liche Ge
wichtsän
derung/ff
Bleomycin 8 10,5 48 - 1,1
4 12,5 57 - 2,3
2 24,0 109 - 1,5
1 24,0 109 - 1,3
Bu-2231 A 8 6,0 27 - 3,3
4 7,0 32 - 3,1
2 25,0 114 - 1,3
1 27,0 123 - 2,3
0,5 26,5 120 - 1,1
Bu-2231 B 8 6,0 27 - 1,8
4 10,5 48 - 1,4
2 30,0 136 - 1,8
1 29,5 134 - 0,8
überlebende
Tag
6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 5/6 6/6 6/6 6/6
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Fortsetzung Tabelle III
Wirkung Durch- überlebende Dosis MST MST schnitt- „ Verbindung mcg/kg/Tag Tage %T/C liehe Ge- g
wichtsän- 5 derung/g
Bu-2231 B
Kontrollsalzlösung
0,5
22,5 22,0
102
- 1,1
- 0,8
6/6 10/10
Tumor:
Behandlung:
Bewertung: Wirkung: Kriterien:
Überlebende:
2 χ 10 Zellen aus zerkleinertem Tumorbrei implantiert i.p. in männliche C57 Bl/6 Mäuse.
Einmal täglich i.p. während neun Tagen, beginnend am ersten Tag.
MST = Mittlere Überlebenszeit in Tagen. %1/C = MST behandelt/MST Kontrolle χ 100.
T/C > 125 bedeutet eine beträchtliche Inhibierung des Tumors (Verlängerung der Lebenszeit des Wirtes).
Bewertung der Toxizität und Aufzeichnung der Gewichtsänderung am 5.Tag.
Die in den Tabellan aufgeführten Ergebnisse sind folgendermassen zu interpretieren:
Tabelle I:
Die Untersuchungen wurden am Walker 256-Ascites-Tumor mit dem Komplex Bu-2231 sowie mit dem Bleomycin-Komplex zum Vergleich durchgeführt. Die Dosis von 2560 mcg/kg ist wirksam, jedoch toxisch, da der Wert T/C unter der nächstniedrigeren Dosis lag und keine langzeitigen Überlebenden (A4 Tage) festgestellt wurden. Die minimal wirksame Dosis (MED) des Bleomycins betrug
709828/ 1 009
M/17188 -*♦-
640 mcg/kg, wohingegen die MED von Bu-2231 160 mcg/kg betrug, was anzeigte, dass Bu-2231 etwa viermal stärker wirksam als Bleomycin ist.
Tabelle II:
Bu-2231 A und B wurden in Form ihrer kupferfreien Formiatsalze am Walker 256-Ascites-Tumor untersucht. Die wahrscheinlich minimal wirksame Dosis (MED) beträgt bei dieser Untersuchung 160 mcg/kg. Ein vergleichsweiser Anstieg der Überlebenden (T/C =s 157) wurde bei beiden Komponenten bei 40 mcg/kg festgestellt, was anzeigt, dass die Wirksamkeit von Bu-2231 A und B vierfach überlegen ist. Die Komponente A kann leicht wirksamer sein als die Komponente B (Wirksamkeit bei 10 mcg/kg), jedoch kann der Unterschied nicht als bedeutend angesehen werden.
Tabelle III:
Bleomycin zeigte gelegentlich bei der Untersuchung am Lewis-Lungenkarzinom starke Grenzwirkungen. Bei dieser Untersuchung lag Bu-2231 A bei einer Verabreichung von 1 mg/kg (T/C = 123) gerade unter dem aktiven Niveau, wohingegen Bu-2231 B bei Dosierungen von 2 und 1 mg/kg aktiv war.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken. CM-Sephadex C-25 ist ein Handelsname für ein trockenes unlösliches Pulver (hergestellt von der Pharmacia Fine Chemicals Inc.), bestehend aus mikroskopischen Kügelchen, die synthetische organische Verbindungen sind und funktionelle Carboxymethylgruppen enthalten, und sich von Polysacchariddextran ableiten. Amberlyst 15 ist ein Handelsname für ein Ionenaustauscherharz der Rohm & Haas Company» Amberlite XAD-2 ist ein Warenzeichen für ein adsorbierendes
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Harz, das aus einem Styrol-divinylbenzol-Copolymeren der Rohm & Haas Company besteht.
Beispiel 1. Fermentation des Komplexes
Eine gut gewachsene Agar-Schrägkultur des Bu-2231 produzierenden Organismus E465-94 wurde zum Inokulieren eines flüssigen wachstumfördernden Mediums aus folgenden Bestandteilen verwendet: 1,5% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 0,05% K2HPO4 und 0,05% MgSO4.7Η£0. Die Impfkultür wurde bei 28°C während zwei Tagen auf einem Rotationsschüttler (250 Upm) inkubiert und 2 ml der Kultur wurden in 100 ml des Fermentationsmediums in einem 500 ml Erlencieyer-Kolben gefügt, das folgende Zusammensetzung aufwies: 2% Glycerin, 1% Pharmamedien, 1% Mais-Quellflüssigkeit, 0,3% (NH4J2SO4, 0,003% ZnSO4.7H2O und 0,4% CaCO,. Die Erzeugung des Antibiotikums erreichte nach drej-bis fünftägigem Schütteln bei 280C ein Maximum.
Beispiel 2. Extraktion und Reinigung
Die gewonnene Brühe (etwa 10 1, 50 mcg/ml), die gemäss Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde filtriert und das bioaktive Material im Filtrat wurde beim pH-Wert 7 an Amberlite IRC-50 (NH4-Form, 900 ml) adsorbiert. Das Harz wurde mit 5 1 Wasser und anschliessend mit 4 1 0,25n-NH40H-Lösung gewaschen, um Nebramycin-Faktoren .zu eluiersn. Der Bu-2231-Komplex wurde anschliessend mit dreimal ein Liter HCl-Lösung vom pH-Wert 2 eluiert. Die Bu-2231-Fraktionen wurden vereint, an 30 g Kohle adsorbiert und mit dreimal ein Liter wässrigem Butanol vom pH-Wert 2 eluiert. Die Butanolschicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht wurde im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der so erhaltene rohe Feststoff (1,2 g) wurde durch Chromatographie an Amberlite XAD-2 und anschliessend an Sephadex LH-20 gereinigt, wobei man ein schwach-grünliches Pulver des Bu-2231·
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M/17188 -»- 2G38766
Komplexes (150 mg in Form des Kupferkomplexes) erhielt.
Beispiel 3. Trennung der Komponenten
Zur Trennung ^eder Komponente wurden 140 mg des Bu-2231-Komplexes in 3 ml 0,7% Kupfer-II-chloridlösung gelöst und auf eine Säule von 85 ml CK-SephadexC-25 aufgetragen, die im Gradienten mit wässriger Ammoniumformiatlösung von 1-7% eluiert wurde. Bu-2231 B wurde mit 3% Ammoniumformiatlösung und Bu-2231 A bei einer Konzentration von 5% eluiert. Jede Fraktion wurde durch Chromatographie an Sephadex LH-20 entsalzt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man die Jeweiligen Formiatsalze von Bu-2231 A (84 mg) und B (21 mg) (Kupfer-Komplexformen) erhielt. Die kupferfreien Formiatsalzpräparate wurden durch Behandeln der Kupfer-Komplexformen mit H2S in Methanol nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 der US-Patentschrift 3t646,197 erhalten.
Beispiel 4. Bu-2231 A-Hydrochloridsalz
Eine Lösung von 750 mg des kupferfreien Bu-2231 A-Formiats in 100 ml Methanol wurde durch Zusatz von 2n-methanolischer Chlorwasserstoff lösung auf den pH-Wert 2,0 eingestellt. Die Lösung wurde anschliessend unter Rühren zu 300 ml Aceton getropft. Die Ausfällung, die sich bildete, wurde durch Filtrieren abgetrennt und im Vakuum getrocknet, wobei man 673 mg des rohen Bu-2231 A-Hydrochloridsalzes als weisses Pulver erhielt. Ein Teil von 140 mg dieses Pulvers wurde auf eine Säule aufgetragen, die 70 ml Sephadex LH-20 (Handelsname für ein modifiziertes alkyliertes Dextrangel der Pharmacia Fine Chemicals Inc.), eingefüllt in 98% Methanol, enthielt. Die Säule wurde mit 98% Methanol entwickelt und die bioaktiven Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man 105 mg des kupferfreien Hydrochlorids von Bu-2231 A erhielt.
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Leerseite

Claims (4)

  1. P a tentansprüche
    Antibiotikum mit der Bezeichnung Bu-2231 A oder seine pharmazeutisch brauchbaren Säureadditionssalze, das in Form eines Glykopeptidkomplexes vorliegt, wobei die antibiotische Substanz eine Base ist, die sowohl in einer Kupfer-Komplexform als auch in einer kupferfreien Form vorliegen kann, das bei der sauren Hydrolyse die Aminosäuren L-Threonin, ß-Amino-ß-(4-amino-6-carboxy-5-raethylpyrimidin-2-yl)-propionsäure, ß-Hydroxyhistidin, L-ß-Aminoalanin, 4-Amino-3-hydroxyn-valeriansäure, ß-Lysin und eine Aminosäure ergibt, die im Ultraviolett-Absorptionsspektrum ein Maximum bei 283 mu (E..£ 280) aufweist, als terminales Amin Spermidin und die Kohlenhydrate Mannose und Gulose ergibt; das in der Form des Kupferkomplexes 1. ein bläulicher amorpher Feststoff ist, der in Wasser und Methanol löslich ist, gering löslich ist in Äthanol und praktisch unlöslich ist in anderen organischen Lösungsmitteln, 2. eine positive Reaktion mit Ninhydrin ergibt, 3. die folgende Elementaranalyse (in %) aufweist: C 42,66, H 6,16, N 15,31 und S 3,14, 4. eine Ultraviolett-Absorption
    ^ mix 243 und 291 Ψ (2I^Cm = 125 1^ 98) aufweist, 5- eine
    J °
    spezifische Drehung von /WJq = +50° (c 0,5, H2O) aufweist und 6. bei der Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol-10% Ammoniumacetat (1:1) einen Rf-Wert von 0,22 und bei Anwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol-1096 Ammoniumacetat - MJft Ammoniumhydroxid (10:9:1) einen Rf-Wert von 0,05 auf v/eist; das in der kupferfreien Form 1. ein weisser amorpher Feststoff ist, 2. eine spezifische Drehung von /et /jp = -21° (c 0,5, H2O) aufweist, 3. die folgende Elementaranalyse (in 56) ergibt: C 45,10, H 6,51,
    N 16,05 und S 3,55, 4. Ultraviolett-Absorptionen L%2° 235 1wax
    196
    und 290 rn^i (E1Jj1n Schulter und 67) aufweist und 5. bei der Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol-10% Ammoniumformiat (1:1) einen Rf-Wert von 0,16 und unter Anwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol-
    709828/1009
    ORIGINAL INSPECTSsD
    10% Ammoniumacetat -10% Ammoniumhydroxid (10:9:1) einen Rf-Wert von 0,04 aufweist; das in der kupferfreien Form als Hydrochloridealζ in mit Kaliumbromid gepresster Form ein Infrarotspektrum aufweist, das im wesentlichen in der Figur 1 gezeigt ist, und das bei der Auflösung in Deuteriumoxid in einer Konzentration von 10% ein NI-IR-Spektrum ergibt, das im wesentlichen in der Figur 2 gezeigt ist; und das sowohl in der kupferfreien Form als auch in Form des Kupfer-Komplexes das Wachstum von Bakterien und Pilzen wirksam inhibiert.
  2. 2. Das mit Bu-2231 A bezeichnete Antibiotikum gemäss Anspruch 1 als Formiatsalz oder Hydrochloridsalz der freien Base.
  3. 3. Antibiotikum mit der Bezeichnung Bu-2231 B oder seine pharmazeutisch brauchbaren Säureadditionssalze, das in Form eines Glykopeptids vorliegt, eine Base ist, die sowohl in der Form eines Kupfer-Komplexes als auch in einer kupferfreien Form vorliegen kann; das bei der sauren Hydrolyse die Aminosäuren L-Threonin, ß-Araino-ß-(4-amino-6-carboxy-5-methyl-pyrimidin-2-yl)-propionsäure, ß-Hydroxyhistidin, L-ß-Aminoalanin, 4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure und eine Aminosäure, die im Ultraviolettabsorptionsspektrum
    1?£
    ein Maximum bei 283 mu (E1Jn £ 280) aufweist, das endständige Amin. Spermidin und die Kohlenhydrate Mannose und Gulose ergibt; das in Form des Kupfer-Komplexes 1. ein bläulich-amorpher Feststoff ist, der in Wasser und Methanol löslich, gering löslich in Äthanol und praktisch unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln ist, 2. eine positive Reaktion mit Ninhydrin ergibt, 3. die folgende Elementaranalyse (in %) aufweist: C 40,96, H 5,61, N 14,78 und S 3,39, 4. die Ultraviolett-Absorptionen 1 ]*2° 243 und 291 mu (e2* und 109) zeigt, 5. eine spezifische Drehung von /oC/q = +76° (c 0,5, HpO) ergibt und 6. bei der Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol-10% Ammoniumacetat (1:1) den Rf-Wert 0,41 und unter Anwendung
    7098?Β / 1 009
    von Siliciumdioxidgel und Methanol-10% Ammoniumacetat-10% Ammoniumhydroxid (10:9:1) den Rf-Wert 0,11 ergibt; das in der kupferfreien Form 1. ein weisser amorpher Feststoff ist, 2. eine spezifische Drehung von /dl/-q - -19° (c 0,5, H2O), aufweist, 3. folgende Elemtaranalyse (in %) ergibt: C 43,01, H 6,22, N 14,81 und S 3t61, 4. die Ultraviolett-Absorptionen ^"Six 235 Und 289»5 ^ (E1cm Schulter und 77) ergibt und 5. bei der Dünnschichtchromatographie unter Anwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol-1096 Ammoniumformiat (1:1) den Rf-Wert 0,31 und unter Anwendung von Siliciumdioxidgel und Methanol-1096 Ammoniumacetat-10% Ammoniumhydroxid (10:9:1) den Rf-Wert 0,09 ergibt; das als kupferfreies Formiatsalz gepresst mit Kaliumbromid.das im wesentlichen in Figur 3 gezeigte Infrarotspektrum ergibt und beim Auflösen in Deuteriumoxid in einer Konzentration von 10% das im wesentlichen in Figur 4 gezeigte NMR-Spektrum ergibt; und das sowohl in der kupferfreien Form als auch in der Form des Kupfer-Komplexes das Wachstum von Bakterien und Pilzen wirksam inhibiert.
  4. 4. Das mit Bu-2231 B bezeichnete Antibiotikum gemäss Anspruch 3 in Form des Formiatsalzes oder Hydrochloridsalzes der freien Base.
    5. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum-Komplexes Bu-2231)
    dadurch gekennzeichnet,
    dass man einen Bu-2231 erzeugenden Stamm von Streptoalloteichus hindustanus in einem wässrigen Nährmedium, das Quellen für assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff enthält, unter submergen aeroben Bedingungen bzw. unter Bedingungen der aeroben Tauchkultur kultiviert, bis dieser Organismus in dem Medium eine wesentliche Menge an Bu-2231-Komplex erzeugt hat»
    6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stamm Streptoalloteichus hindustanus A.T.CoC.31158 oder eine Mutante davon verwendet.
    7 Π Q P Ί R / 1 Π 0 9
    7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man zusätzlich den Komplex Bu-2231 aus dem Kulturmedium durch Abtrennen des wasserlöslichen äntibiotischen Komplexes von dem Mycel, Adsorbieren des Komplexes an einem Kationanaustauscherharz, Abtrennen des koproduzierten Aminoglykosid-Komplexes von dem Glykopeptid Bu-2231-Komplex durch Eluieren des Aminoglykosid-Komplexes mit einer verdünnten Base und Eluieren des Bu-2231-Komplexes von dem Adsorbens mit einer Mineralsäurelösung gewinnt.
    8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Komplex Bu-2231 einer Chromatographie unter Eluierung im Gradienten zur Aufspaltung des Komplexes in die Einzelbestandteile Bu-2231 A und B in Form der Kupfer-Komplexe unterzieht und gegebenenfalls die Formen des Kupfer-Komplexes mit Schwefelwasserstoff in Methanol behandelt, um die entsprechenden kupferfreien Formen zu erhalten.
    9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Kupfer-II-chloridlösung des Komplexes Bu-2231 über einen Kationenaustauscher aus einem modifizierten Polysaccharid-Dextranderivat mit funktionellen Carboxymethylgruppen chromatographiert, wobei man als Eluiermittel wässriges Ammoniumformiat in Konzentrationen von 1 bis 7% verwendet.
    10. Arzneimittel, bestehend aus wenigstens einem Wirkstoff, einem pharmazeutisch brauchbaren Träger und/oder pharmazeutisch brauchbaren Zusätzen, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff wenigstens eine Verbindung der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
    7098 2 8/1009
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SE (1) SE432781B (de)
YU (1) YU39084B (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2649604A1 (de) * 1975-10-29 1977-05-05 Meiji Seika Kaisha Neue antibiotika sf-1771 und sf- 1771-b und verfahren zu ihrer herstellung
DE2950980A1 (de) * 1978-12-27 1980-07-03 Meiji Seika Kaisha Antibiotikum bn-183b, verfahren zu dessen herstellung und arzneimittel, welche dieses enthalten
DE3026425A1 (de) * 1979-07-13 1981-01-29 Bristol Myers Co Antibiotische verbindungen

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4314028A (en) * 1979-07-13 1982-02-02 Bristol-Myers Company Fermentation process for producing tallysomycin compounds
AU634250B2 (en) * 1989-07-10 1993-02-18 Bristol-Myers Squibb Company Antiviral antibiotic bu-3889v
ID18900A (id) * 1996-11-21 1998-05-20 Lilly Co Eli Alkilasi menurun dari gliko peptida anti biotik
US5952466A (en) * 1997-11-12 1999-09-14 Eli Lilly And Company Reductive alkylation of glycopeptide antibiotics

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1038242A (en) * 1963-03-05 1966-08-10 Zaidan Hojin Biseibutsu Bleomycin and processes for preparation thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS-ERMITTELT *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2649604A1 (de) * 1975-10-29 1977-05-05 Meiji Seika Kaisha Neue antibiotika sf-1771 und sf- 1771-b und verfahren zu ihrer herstellung
DE2950980A1 (de) * 1978-12-27 1980-07-03 Meiji Seika Kaisha Antibiotikum bn-183b, verfahren zu dessen herstellung und arzneimittel, welche dieses enthalten
DE3026425A1 (de) * 1979-07-13 1981-01-29 Bristol Myers Co Antibiotische verbindungen

Also Published As

Publication number Publication date
DK384076A (de) 1977-03-01
DE2638766C2 (de) 1985-07-04
IL50357A (en) 1979-07-25
US4051237A (en) 1977-09-27
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JPS5653318B2 (de) 1981-12-17
IL50357A0 (en) 1976-10-31
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SE432781B (sv) 1984-04-16
CA1073386A (en) 1980-03-11
FR2321897A1 (fr) 1977-03-25
SE7609425L (sv) 1977-03-01
GB1539740A (en) 1979-01-31
FR2321897B1 (de) 1978-11-17

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