DE3026425A1

DE3026425A1 - Antibiotische verbindungen

Info

Publication number: DE3026425A1
Application number: DE19803026425
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kawaguchi; Masataka Konishi; Takeo Miyaki; Osamu Tenmyo
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1979-07-13
Filing date: 1980-07-11
Publication date: 1981-01-29
Also published as: FI67876C; CY1317A; JPS6328080B2; HK8286A; IL60541A; YU43218B; GR82324B; IT1174296B; IT8049183A0; DK151633C; SE449751B; FR2460961B1; DE3026425C2; NZ193921A; AU533469B2; GB2053221A; IL60541A0; NO155701B; AU5919080A; LU82612A1

Description

Q-

J. RBITSTÖTTBR W. KINZBBACH

PROP. DR. DR. DIPL. ING. DR. PHIU DIPL. CHBM.

W. BUNTE (ΐθ58-ΐ97β) K. P. HÖLLER

DR. ING. DR. RER. NAT. DIPU CHBM.

TBLBFONl (089) 37 60 83 TELBXl 0215208 ISAR D

BAUERBTRASBB 22. BOOO MÜNCHEN 40 J

München, den 11 · Juli 1980 M/21 130

BRISTOL-MYERS COMPANY

345, Park Avenue

New York, N.Y. 10022 (U.S.A.)

Antibiotische Verbindungen

POSTANSCHRIFT l POBTKACH 780, D-BOOO MÜNCHEN 43

030QG5/U915

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Reihe semi- ; biosynthetischer Tallysomycin-Derivate mit vorteilhaften antimikrobiellen und Antitumor-Eigenschafen.

Es sind zwar Glycopeptid-Antiobiotika bereits bekannt, von denen einige auch das Wachstum von Tumoren bei Säugetieren inhibieren können, es bleibt jedoch ein Bedarf für weitere antimikrobielle und Antitumor-Mittel. Besonders benötigt werden Antitumormittel, welche gegenüber den | bereits bekannten Mitteln eine größere Aktivität und/oder ; ein breiteres Spektrum aufweisen, oder welche weniger un- !

erwünschte Nebenwirkungen haben. Nachstehend wird eine '

ί kurze Zusammenfassung der wichtigsten Glycopeptid-Antibiotika ·

gegeben. ;

Die Bleomycine sind wasserlösliche, basische Glycopeptide, j

welche durch Fermentation von Streptomyces verticillus her- j

gestellt werden. Sie wurden erstmals von Umezawa et al. in '

J. Antibiotics 19A:200 (1 66) erwähnt; vgl. auch U.S.-PS '■

3 681 491. Der Bleomycinkomplex wurde in verschiedene j

Komponenten, wie Bleomycin A₁, A₀, A_c und B_ unterteilt.

Der Bleomycin-Komplex wird derzeit zur Behandlung verschiedener Neoplasmen beim Menschen, wie Squamazellen-Karzinom, Lymphosarkom, Reticulumzellen-Sarkom, Testikelkarzinom und der Hodkin¹sehen Krankheit, vertrieben. Eine geänderte. Struktur für die Bleomycine wurde kürzlich von H. Umezawa et al. in

J. Antibiotics 31:801-804 (1978) veröffentlicht.

Die Phleomycin-Gruppe der Antibiotika, welche durch Fermentation eines anderen Streptomyces verticillus-Stammes erhalten wird, wurde von Maeda et al. in J. Antibiotics:

030065/0915

Vol. A9, S. 82-85 (1956); Vol. A12, S. 111 (1959); Vol. A12, S. 285-289 (1959) und Vol. A17, S. 194-199 (1964)beschrieben. Wie der Bleomycin-Komplex wurde auch Phleomycin in eine Anzahl von Komponenten aufgetrennt, welche sowohl in kupferfreier als auch in Kupferchelat-Form vorliegen können.

Zorbamycin und dessen verwandte Antibiotika Zorbonomycin B und Zorbonomycin C werden in J. Antibiotics 24(8): 543-557 (1971) und in der GB-PS 1 277 150 beschrieben. Diese Antibiotika,

! welche aus der Fermentation von Streptomyces bikiniensis var.

zorbonensis erhalten werden, sind den Bleomycin- und ί Phleomycin-Familien nahe verwandt.

Eine weitere Familie der Phleomycin-Bleomycin-Antibiotika wurde aus der Kulturbrühe eines Varianten von Streptomyces ' humidus erhalten und mit YA-56 bezeichnet. Eine Beschreibung ; des YA-56 Komplexes und der aktiven Bestandteile YA-56X ; und YA-56Y erschien in J. Antibiotics 24 (10): 727-731 (1971) und in J. Antibiotics 26: 77-83 (1973).

Über den Antibiotika-Komplex XK 49 und dessen Hauptkomponente Victomycin (auch XK 49-1-B-2 genannt) wird in J. Antibiotics j 28: 358-371 (1975) berichtet. Victomycin wird aus einem Sporangien bildenden Actincmyceten Streptosporangium violaceochromogenes MK 49, gewonnen und scheint den Bleomycinen und Zorbonomycin B ähnlich zu sein.

I I Der Glycopeptid-Antibiotikakomplex Bu-2231 und dessen Komponenten Bu-2231 A und B (nachstehend Tallysomycin bzw. : Tallysomycin A oder B genannt)sind in der US-PS 4 051 237 beschrieben; vgl. auch J. Antibiotics: Vol. 30, S. 779-805

(1977) und Vol. 31, S. 667-674 (1978). Die Tally.somycine . werden aus der Fermentationsbrühe bestimmter Streptoalloteichus, hindustanus Stämme isoliert und haben bedeutsame antimikrobiell j und Antitumor-Aktivitäten.

03006S/0915

M/21 130 - 12 -

Die Herstellung verschiedener semi-biosynthetischer Phleomycin- und Bleomycin-Derivate mittels Fermentationstechnik mit Precursorbeschickung wurde in den ÜS-PSen 3 984390 und 3 846 400 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Mikroorganismenstämme, welche Phleomycin- oder Bleomycin-Antibiotika produzieren können, in einem Fermentationsmedium in Gegenwart eines Aminprecursors kultiviert, wobei man neue Phleomycin- oder Bleomycin-Derivate mit einer Seitenkettenstruktur entsprechend dem zugegebenen Amin erhält.

Die veröffentlichte Britische Patentanmeldung 2,001,962 A beschreibt die Herstellung von 3-[(S)-1'-Phenyläthylamino]-propylaminobleomycin (Pepleomycin) als besonders bevorzugtes semi-biosynthetisches Bleomycin-Derivat mit hoher Antitumoraktivität und geringer Lungentoxizität.

Die vorliegende Erfindung schafft neue semi-biosynthetische Tallysomycin A und B Derivate, .·.:. ein Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel.

Insbesondere werden Tallysomycin A Derivate der Formel Ia:

o o

„ Jl

C-NH-(CH₂)₃-CH-CH₂-C-R ^ · ^NH2

Q3G06S/Ö915

M/21 130

worin R für

oder

NH-(CH₂)₃-S®(CH₃)₂

NH-(CH₂J₃-NH-CH₂-CH₂Oh NH-(CH₂J₃-N(CH₂CH₂OH)₂

NH-(CH₂J₄-NH₂

NH-(CH₂J₃-NH-CH₃

NH-(CH₂J₃-NH-CH-^ CH₃ steht,

und Tallysomycin B Derivate der Formel Ib:

CO-NH,

H₂N

H₃C HN S IST Y^KOCHj HCr*>CH₃

HO

Jt
'^NH₂

1-CH-Il₅I

0 Il

C-R

worin R für:

-NH-(CH₂J₃-NH₂ -NH-(CH₂)_rS©( CH₃J₂ -NH-(CH₂J₂-NH₂

-NH-CH₂-CH-CH₂-NH₂

OH

-NH-(CH₂ J₂-NH-CH₂-CH-CH₃

OH

030065/0915

-NH-(CH₂J₃-NH-CH₂-CH₂Oh -NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂

-NH-(CH₂J₃-N(CH₂CH₂OH)₂ -nh-(ch₂)₂-nh-ch₂-ch₂oh -NH-(CH₂J₄-NH₂ -NH-(CH₂J₃-NH-CH₃

oder ^CH3

-NH-(CH₂J₃-NH-CH

steht

sowie pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze dieser Derivate geschaffen. Die obigen Verbindungen können als Kupfer-Chelate oder in kupferfreier Form vorliegen.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Tallysomycin-B Derivat der Formel:

CO-NH₂ NH₂

H OH

Taltysomycin S_10b

M/21 130 - 15 -

Anfängliche Untersuchungen mit Versuchstieren zeigen, daß Tallysomycin S₁_, (sowohl in der kupferfreien als auch in der Kupferchelat-Form und in Form seiner pharmazeutisch verträglichen Salze)eine ausgezeichnete Antitumorwirkung gegen ein breites Spektrum maligner Tumoren aufweist und gleichzeitig weniger unerwünschte Nebenwirkungen (z.B. Nephrotoxizität)zeigt als die natürlich vorkommenden TallysomycineA und B.

Die US-PS 4 051 237 beschreibt die Herstellung und Isolierung zweier neuer Glycopeptid-Antibiotika, die darin als Bu-2231 A und B bezeichnet werden. Spätere Untersuchungen haben gezeigt, daß Bu-2231 A und B (nunmehr Tallysomycin A und B genannt) die folgenden Strukturen aufweisen:

CO-NH₂ NH₂ 0

I J^^NH

N-H-C-NH-(CH₂ )₃ -CH-CH₂-C-NH ^^ (

N NH, (CH₉)

² Ä²

ÄH ι

(CH₂I₄

NH,

Tallysomycin A

030085/0915

CO-NH₂ NH₂

_A^NH₂ 0

it II

^H0-^ ϊΎΊί

HO _^_Wz

Tallysomycin B

Die oben bezeichneten Tallysomycine sind die Hauptbestandteile ' der Fermentation tallysomycin-produzierender Streptoalloteichus ; hindustanus Stämme, welche nach herkömmlichen chromatographischen

Verfahren isoliert werden. ι

Erfindungsgemäß wurde nun/gefunden, daß das in der US-PS

4 051 237 beschriebene Fermentationsverfahren in Gegenwart j

gewisser Precursoramine durchgeführt werden kann, wobei sich I

neue Tallyisomycin A und B Derivate ergeben, welche wertvolle ■

antimikrobiell und Antitumor-Eigenschaften haben. !

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das in den US-PSen
3 984 390 und 3 846 400 beschriebene allgemeine Fermentationsverfahren mit Precursoramin-Beschickung angewendet. Beim
vorliegenden Verfahren wird ein Precursoramin dem Tallysomycin-Fermentationsmedium nach US-PS 4 051 237 zugesetzt und wird
während der Fermentation in die Aminendgruppe von Tälly.somycin
A oder B aufgenommen, wobei sich neue semi-biosynthetische
Derivate bilden, die eine Aminendgruppe mit Seitenkette,
die dem zugefügten Precursoramin entspricht, aufweisen.

030065/0915

Isolieren und Reinigen der so erhaltenen Derivate kann nach herkömmlichen chromatographischen Verfahren, wie sie in der US-PS 4 051 237 beschrieben sind, erfolgen. Nachstehend und in den folgenden Beispielen wird dieses Verfahren ausführlicher beschrieben.

Herstellung der Antibiotika:

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Tallysomycin-produzierender Stamm von Streptoalloteichus hindustanus (wie in der US-PS 4 051 237 beschrieben), am bevorzugtesten- der Stamm Streptoalloteichus hindustanus E 465-94, ATCC 31158 oder ein Mutant davon, in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert. Das Nährmedium enthält eine assimilierbare Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose, Ribose, Galactose, Fructose, Mannose, Saccharose, Lactose, lösliche Stärke oder Glycerin) und eine assimilierbare Stickstoffquelle (z.B. Fischmehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maiseinweichflüssigkeit, Peptone, Fleischextrakt, Erdnußmehl, Hefeextrakt oder Ammoniumsalze). Falls nötig gibt man anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Phosphate, etc. zu. Gewünschtenfalls werden dem Medium Spurenelemente, wie Kupfer, Mangan, Eisen, Zink, etc. zugesetzt, sie können aber auch als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums enthalten sein.

Zusätzlich zu den herkömmlichen, oben beschriebenen Nährbestandteilen, gibt man dem Medium ein Precursoramin, wie nachstehend beschrieben in Form der freien Base oder als Säureadditionssalz davon zu. Im allgemeinen wird das Precursoamin in Form einer neutralisierten wäßrigen Lösung zugegeben. Die erfindungsgemäß verwendbaren Precursoramine sind nachstehend zusammen mit dem Codenamen des entsprechenden TaLlysoTnycdnprodukts aufgeführt!

030065/0915

M/21 130

Amin

;Chemische Bezeichnung

- 18 Struktur

Tallysomycin-Endprodukt *

1,2-Diaminoethan.

1,3-Diaminopropan

1,4-Diaminobutan NH₂-(CH₂J₂-NH₂

NH₂-(CH₂J₄-NH

3b

^Sla' ^Slb

^S10a' ^S10b

1,3-Dianrino-2-hydroxyproparv

N-(3-HydroxyethylJ-1,2-diaminoethan

N-(ß-Hydroxypropyl)-l,2-diaminoethan

NH₂-CH₂-CH-CH₂-NH₂

-CH-OH

NH₂-(CH₂J₂-NH-Ch₂-CH-CH₃

OH

i N-ifethyl-l.a-diaminopropan' NH₂-(CH₂J₃-NH-CH₃

N-(ß-ÖydroxyethylJ-I,3-diaminopropanr

NH₂-(CH₂J₃-NH-CH₂-CH₂Oh

⁵4b

NH₂-(CH₂J₂-NH-CH₂-CH₂Oh s_9b

³5b

^Slla^{J S}llb

^S6a' ^S6b

N-(I'-Phenylethyl J-1,3-diaminopropan

N,N-Dimethyl-1,3-diaminopropan

NH₂-(CH₂J₃-NH-CH-^ CH₃

NH₂-(CH₂J₃-N(CH₃J₂

^S14a' ^S14b

^J7b

N,N-di(0-HydroxyethylJ-1,3-diaminopropan

NH₂-(CH₂J₃-N(CH₂-CH₂OH)₂ N-(3-Aminopropyl)-morpholin NH₂~{ CH₂ J ₃-f

H-(3-Am1nopropyl)-2-pipecolin·

3-A.uinoprOpyi-diinethyT sulfonium .-cbloHd

^Ί3
JB

^S8a» ^S8b

^S12b

»13b

^S2a* ⁵2b

ι * Die Tallysoitiycin-Derivate erhalten ihre Bezeichnungen, indem man jedem Precursoramin eine Nummer zuordnet und dann das Tallysomycin-endprodukt mit der Nummer der Amin-Endgruppe und einem Buchstaben a oder b bezeichnet, je nachdem, ob es eine Derivat von Tallysomycin A oder B ist. Beispielsweise ist Tallysomycin S₁_, das Tallysomycin B Derivat mit 1,4-Diaminobutan als Aminendgruppe.

Die Amine, welche in Form der freien Base oder als Säureadditionssalze mit anorganischen Säuren, wie HBr oder HCl, verwendet werden, gibt man vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,05 bis 0,4 % (Gew./Vol.), noch bevorzugter von etwa 0,1 bis 0,2 % (Gew./Vol.) zu Beginn der Fermentation in das Medium, man kann jedoch auch gute Ergebnisse erzielen, wenn man die Aminlösung während des Anfangsstadiums der |

ι Fermentation portionsweise zusetzt. j

Die Fermentation erfolgt nach dem in der US-PS 4 051 237 j beschriebenen Verfahren. Demgemäß kann die Inkubationstemperatur; jede Temperatur sein, bei der ein Tallysomycin-produzierender | Stamm wachsen kann, beispielsweise 20 bis 54 ⁰C, bevorzugt j führt man die Fermentation jedoch bei 25 bis 35 ⁰C und am bevorzugtesten bei 27 bis 32 ⁰C durch. Vorzugsweise verwendet man für das Medium einen neutralen oder nahezu neutralenAusgangspH-Wert, z.B. ungefähr pH 6 bis 7 und die Herstellung des Antibiotikums erfolgt im allgemeinen während einer Zeitdauer

! von etwa 2 bis 10 Tagen, üblicherweise erreicht man die optimale Produktion innerhalb von 3 bis 7 Tagen. Zur Herstellung

relativ kleiner Mengen können Schüttelkolben und Oberflächen- ! kulturen verwendet werden, für die Produktion im großtech-j nischen Maßstab bevorzugt man jedoch submerse aerobe Kultur^' in sterilen Tanks. Wenn"die Fermentation in Tanks durchgeführt werden soll, ist es wünschenswert, ein pflanzliches Inokulum in einer Nährbrühe herzustellen, indem man die Brühenkultur mit Spuren des produzierenden Organismus beimpft.

030065/091B

Hat man ein junges, aktives vegetatives Inoculum erhalten, wird es aseptisch in das Medium im Fermentationstank übertragen. Die Belüftung in den Tanks und Flaschen kann erfolgen, indem man Luft durch das Fermentationsmedium oder über dessen ■ Oberfläche leitet. Das Umrühren in den Tanks erfolgt mit einer mechanischen Rührvorrichtung und falls nötig kann ein Antischaummittel, wie Specköl, zugesetzt werden.

Die Produktion der gewünschten Tallysomycin-Derivate in dem Kulturmedium kann im Verlauf der Fermentation mittels Papier-

; scheiben-Agar-Diffusionsverfahren unter Verwendung von Mycobacterium smegmatis Stamm M6-3 als Testorganismus erfolgen.

Isolieren und Reinigen:

Nachdem eine optimale Brühenaktivität erreicht ist (wie beispielsweise durch die oben beschriebene Testmethode bestimmt), werden das Mycel und ungelöste Rückstände auf herkömmliche Weise, wie durch Abfilti-ieren oder Zentrifugieren, aus der Fermentationsbrühe entfernt. Das antibiotisch wirksame Prinzip liegt im Filtrat, es kann daraus mittels herkömmlicher Adsorptionstechniken gewonnen werden; vgl. beispiels-| weise J. Antibiotics 30(10): 779-788 (1977).

Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Filtrat zuerst an einem kationischen Austauscherharz adsorbiert, beispielsweise einem Harz, wie es von Rohm & Haas Company unter der Handelsbezeichnung AMBERLITE IRC-50 (NH₄ ⁺ Form) erhältich ist. Man wäscht das Harz mit Wasser und eluiert die Tallysomycin-Fraktionen mit einer wäßrigen, anorganischen Säure, z.B. 0,1 N HCl. Das die aktiven Fraktionen enthaltende. Eluat wird mit wäßrigem Ammoniak neutralisiert und vorzugsweise mit Aktivkohle gerührt. Die Aktivkohle wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und dann mit wäßrigem Butanol (1:1 Butanol : verd. HCl (Vol./Vol.) bei

030065/0915

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saurem pH (z.B. pH 2) eluiert. Die wäßrige Schicht des Eluierungsmittels wird mit einem basischen Anionenaustausbherharz neutralisiert und im Vakuum eingeengt. Das eingeengte Eluat von IRC-50 (wenn die Kohle-Adsorptionsstufe ausgelassen wird) oder von der Aktivkohlebehandlung, wird dann in Wasser gelöst, an einem Harz vom Typ DIAION HP-20 (Handelsbezeichnung für ein makroporiges, nicht-ionisches Adsorptionsharz, bestehend aus einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat, das von Mitsubishi Chemical Co., Japan erhältlich ist) adsorbiert und mit Wasser eluiert, wobei sich eine Mischung roher Tallysomycine in Kupferchelat-Form ergibt.

Die Abtrennung und Reinigung der gewünschten Tallysomycin-Derivate, welche sich bei der Precursor-beschickten Fermentation gebildet haben, kann erreicht werden, indem man den rohen Tallysomycinkomplex, der wie oben beschrieben erhalten wurde, an einem kationischen Ionenaustauscher aus einem modifizierten Dextranderivat, beispielsweise einem modifizierten Polysaccharid-Dextran, wie es unter der Handelsbezeichnung CM-SEPHADEX C-25 von PHARMACIA FINE CHEMICALS INC. vertrieben wird, adsorbiert. Das (die) Tallysomycin-Derivat(e) wird stufenweise mit wäßriger Ammoniumformiatlösung in Konzentrationen, die von etwa 1 bis 7 % variieren, eluiert. Die Fraktionen, welche die gleichen Derivate enthalten werden vereinigt, durch Aktivkohle entsalzt (Eluieren mit saurem wäßrigem Butanol) und lyophilisiert, wobei man ein gereinigtes Tallysomycin-Derivat als Kupferchelat erhält. Falls gewünscht kann eine weitere Reinigung durch herkömmliche Chromatographie- und/oder Gel-Filterverfahren erfolgen.

Die Tallysomycinderivate der vorliegenden Erfindung haben die Eigenschaft, mit Kupfer Chelate zu bilden, wie dies Tallysomycin A und B tun, und somit können die neuen Derivate und deren Säureadditionssalze in Form des Kupferkomplexes oder in kupferfreier Form vorliegen. Die kupfer- , freien Formen der Tallysomycin-Derivate können nach bekannten j

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Verfahren, wie sie in der US-PS 4 051 237 und der veröffentlichten Britischen Patentanmeldung 2 001 962 A beschrieben sind, aus den entsprechenden Kupferkomplex-Formen erhalten werden.

Die erfindungsgemäßen Tallysomycinderxvate in Form der freien Base können durch herkömmliche Verfahren in pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze überführt .wertden. Beispiele für solche Salze sind die nicht-toxischen Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, wie Chlorwasserstoff-Schwefel-, Phosphor-, Essig-, Ameisen- Stearin- Malein-, Benzoe-Bernstein- und Bromwasserstoff-Säure.

!

Antimikrobielle Aktivität ·

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) der erfindungsgemäßen | semi-biosynthetischen Tallysomycin-Derivate wurden gegenüber Pilzen und gram-positiven, gram-negativen und säurefesten Bakterien nach dem zweifach-Agar-Verdünnungsverfahren bestimmt, j Für die Bakterien wurde Nähragar und für die Pilze Sabouraud- j Agar verwendet. Die Ergebnisse sind im Vergleich mit j

Tallysomycin A und B in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.

330065/0915

Antimikrobielle Aktivität von Tallysomycin Derivaten Staphylo-

coccus Sarcina Bacillus Myco-TaTiyso- aureus lutea subtil is bacterium mycin Smith PCIIOOI PCI 219 607

A	0.1	0.05	<0.003	0.2
B	0.1*	0.1*	0.006	0.2
^Sla	o.i*	0.1	<0.003	0.012
^S!b	1.6	1.6	<0.05	<0.05
^S2a	0.2	0.8	<0.05	<0.05
^S2b	1.6	6.3	<0.05	0.2
^S3b	0.8	1.6	0.013	0.05
^S4b	0.8	3.1	o,oo6	0.003
^S5b	6.3	12.5	0.025	0.2
^S6a ^S6b	0.8 6.3	1.6 12.5	0.03 0.02	O.U 0.2
^S7b	6.3	12.5	0.1	3.1
^S8a	0.2	0.1*	0.006	0.1
^S8b	o.i*	0.8	0.013	0.1
^S9b	o.i»	0.8	0.013	0.1
^S10a	1.6	O.U	o.oi»	0.2
^S10b	6.3	3.1	0.2	0.2
^Slla	0.8	0.2	0.025	0.1
^S11b	3.1	0.8	0.1	0.1
^S12b	12.5	12.5	O.U	0.2
^S13b ^S14a	6.3 0.8	6.3 0.8	0.8 0.1	0.2 0.1
^S14b	3.1	3.1	O.U	0.2

030065/0915

Antimikrobielle Aktivität von Tallysomycin Derivaten

	Eschen'chia	Proteus	Candida	IAM 4888	AsperqiTIus
Tailyso-	coli	mirabilis albicans	12.5	fumigatus
mycin	NIHJ	A9554	6.3	IAM 2593
A	0.05	O.U	3.1	1.6
B	0.2	0.2	12.5	0.8
^Sla	0.1	O.U	6.3	0.8
^Slb	o.U	1.6	25	1.6
^S2a	<0.05	0.2	12.5	O.U
^S2b	O.U	1.6	25	0.8
^S3b	0.1	0.2	25	0.8
V	o.U	O.U	6.3	0.8
^S5b	o.k	3.1	25	O.U
^S6a	o.k	1.6 .	>50	0.2
^S6b	o.k	3.1	12.5	0.8
^S7b	o.k	6.3	>50	O.U
^S8a	0.1	O.U	25	0.8
^S8b	0.2	0.8	3.1	1.6
^S9b	0.1	0.8	12.5	1.6
^S10a	o.u	0.8	1.6	1.6
^S10b	0.8	3.1	12.5	6.3
⁵IIa	0.1	0.2	>100	0.8
^Sllb	0.2	1.6	>100	6.3
^S12b	1.6	50	50	25
* ^S13b	O.U	12.5	>100	12.5
^S14a	0.2	3.1	3.1
^S14b	o.i»	25	25 .

030065/0915

M/21 130 - 25 -

Die relative antibakterielle Aktivität (Tallysomycflfr ft "%T**i = ΙΟΟΟγ/mg) der Tallysomycinderivate wurde mittels der Papier-■ scheiben-Agarverdünnungsmethode unter Verwendung von My.cobacterium smegmatis Stamm M6-3 als Testorganismus bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.

Antibakterielle Aktivität von Tallysomycin-Derivaten

Tallysomycin	Antibakterielle Aktivität (U/mq)
A	1,000
B	900
⁵Ia	1,075
^S1b	1,000
⁵Za	350
⁵Zb	300
^S3b	725
^S4b	UO₅
Hb	500
^S6a	U6o
^S6b	3U0
^S7b	380
^S8a	550
^S8b	370
^S9b	380
^S10a	1,U5G
^S10b	1,100
^Slla	570
⁵Hb	U50
^S12b	"390
^S13b	1,090
^S14a	1,300
^S14b	1,090
030065	/0916

M/21 130 - 26 -

Antitumor-Aktivität

Die Aktivität von Prophagen Induktion von Iysinbildenden Bakterien E. coli W1709 (A) wurde nach der von Lein et al. in Nature 196: 783-784 (1962) beschriebenen Methode bestimmt. Die Plaquen-Zählung erfolgte auf den Agarplatten, welche die Testverbindung (t) enthielt und auf der Kontrollplatte (c). j Ein Verhältnis der Plaquen-Zählung t/c größer als 3,0 wurde

j als signifikanter Spiegel betrachtet und die Lysogen-Induktions-Aktivität (ILB Aktivität) wurde ausgedrückt als die minimal induzierbare Konzentration der Testverbindung. Die Ergebnisse sind in der nachstehende Tabelle zusammengefßt.

ILB-Aktivität von Tallysomycin-Derivaten

Tallysomycin	6ü	ILB Aktivität (γ/ml)
A		0.00125
B	0.01
^Sla	0.l6
^Slb	0.31
^S2a	0.31
^S2b	0.63
^S3b	0.31
^S4b	-
^S5b	0.08
_s	0.02

0.08

c 0vO8

7b
S₈, ^β·°°⁵

€30065/3915

Tallysomycin ILB-Aktivität (γ/ml)

0.	02	16
0.16	31
0.	.08
0.	.63
0	.31
0	,08
0	.01
0	.0U
0
0

^S8b ^S9b ^S10a ^S10b

^sna ^Sllb

^S12b ^S13b ^S!4a ^S14b

Die Antitumor-Aktivität der Tallysomycin-Derivate wurde bei j . vier experimentellen Tumorsystemen bei Mäusen untersucht. | . Lymphocytische Leukämie P388 und Lewis Lungenkarzinom |

wurden BDF₁ Mäusen beiderlei Geschlechts intraperitoneal j

' 5 5

in einer Inokulum-Größe von 3x10 und 5x10 Zellen pro

I

; Maus implantiert. Sarkom 180 Aszites Tumor wurde männlichen ;

j Mäusen vom dd-Stamm intraperitoneal mit 2,5 χ 10 Zellen pro Maus inokuliert. Melanotisches Melanom B16 wurde BDF₁-Mäusen subkutan mit 5x10 Zellen pro Maus implantiert. 24 Stunden nach der Implantation von Tumorzellen wurden den Mäusen abgestufte Dosen der Testverbindungen bei einem Injektionsvolumen von 0,2 ml pro 10 g Körpergewicht verabreicht. Die Testverbindungen wurden einmal täglich während 9 Tagen (qd 1 -> 9 Schema) verabreicht, mit Ausnahme der Mäuse die mit Lewis Lungenkarzinom inokuliert waren und welche 11 Tage lang behandelt wurden (qd 1 —* 11). Tod oder überleben der behandelten und nicht-behandelten (Kontroll-)Tiere wurde während einer Beobachtungsdauer von 45 Tagen nach der

030065/091B

M/21 130 - 28 -

Implantation der Tumorzellen täglich aufgezeichnet und es wurde die mittlere Uberlebensdauer für jede Test- (T) und Kontrollgruppe (C) berechnet. Ein T/C Wert gleich oder größer als 125 % zeigt, daß gegen Leukämie P388 und Lewis Lungenkarzinom ein signifikanter Antitumoreffekt erreicht wurde. Die wirkliche Dosis, welche einen T/C-Wert von 125 % ergibt wurde mittels linearer Regressionsanalyse bestimmt ι und als effektive Dosis 125 oder ED_1oc definiert. Die effektive

j I £O

Dosis 150 (ED₁₅₀) wurde für die Bewertung der Antitumorwirkung gegen Sarkom 180 verwendet. Beim B16 Melanom-Versuch wurde die Tumorgröße am 16. Tag nach der Tumorinokulation gemessen und die Dosis, welche eine 50 %-ige Inhibierung ergab (ID₁- ) wurde aus Regressionslinien berechnet. Die Antitumorwirkung der Derivate ist in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

030065/0915

M/21 130 - ²⁹ -

Anti tumor wirkung (mg/kg/ Tag ΐ

	P388	S180	B16	Lewis lung f rn \
Tallysomycin *	(EDi₂₅)	(ED₁₅₀)	(ID₅₀)	(ED₁₂₅)
A (Cu-fre )	0.26	0.07	0.27	0.13
B (Cu-fre )	O.89	0.06	O.82	0.11
^Sla	1.2	0.07	0.81*	-
⁵Ib	2.0	o.n	0.15	0.12
^S2a	>3.0	0.07	0.17	0.1U
^S2b	O.91	0.12	0.33	O.65
^S3b	0.32	0.06	0.20	O.26
^S4b	>3.0	0.13	O.5O	-
^S5b	0.66	0.10	0.31	0.38
^S6a	0.70	0.09	0.12	0.1*7
^S6b	2.2	0.08	0.22	0.17
^S7b	2.1	0.1U -	O.I6	-
^S8a	O.78	-	-	-
^S8b	1.5	0.25	O.26	0.12
^S9b	>3.0	0,1*2	O.29	0.1*1
^S10a	O.28	O.O8	0.39	-
^S10b	-	0.03	0.59	-
^Sl0b (^Cu-^freii	*0.17**	0.02	0.75	0.21
^Slla	0.60	-■	-	-
^Sllb	0.28	0.20	0.70	0.32
^S12b	1.30	O.O6	1.30	-
Siok.	0,70	0.33	0.23

S
H4a

. 3.0 0.08 o.i*3 0.29

*Kupfer-Chelat-Form, wenn:nicht anders angegeben.

Ö30065/091S. . " .' ■

Abgestufte Dosen an Testverbindungen wurden Gruppen von dd-Mäusen intraperitoneal verabreicht. Die Injektion wurde nur ein einziges Mal oder einmal täglich an 9 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. 30 Tage lang nach Verabreichung der letzten Dosis der Testverbindung wurde Tod oder Überleben der Tiere aufgezeichnet, um die mittlere lethale Dosis (LD₅₀) ; für die einmalige oder die mehrfache Verabreichung zu

' errechnen.

^l

-

Akute und Subakute Toxizität der Tallysomycin-Derivate !

* Tallysomycin	Einzeldosis
A (Cu-frei)	19
B (Cu-frei)	U6
^Sla	25
^Slb	19
s_2a	25
^S2b	32
^S3b	19
^S4b	13
^S5b	U6
^S6a	15
^S6b	30
S7b	30
^S8b	30
	32

LD₅₀ (mg/kg/Tag, i.p.) .

Mehrfachdosis (qd 1 9) j

ütü ; ■

6.8 !

2.0

U.O

LD₅₀ (mg/kg/Tag, i.p.)

* Tallysomycin	Einzeldosis
^S10a	27
^s10b	27
SiOb (Cu-frei)	U2
^Slla	18
^Sllb	21
^S12b	>50
^S13h	35

Mehrfachdosis (qd 1- 9)

k.O

^S14a

^S!4b - ¹⁶

Kupferchelatform, wenn nicht anders angegeben.

Der Antitumor therapeutische Index wurde für jedes Derivat aus dem Verhältnis der Toxizität und der Antitumorwirkung berechnet. Wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt, ergeben bei einigen der untersuchten, experimentellen Antitumor-Systeme einige der neuen semibiosynthetischen Tallysomycinderivate bessere therapeutische Indices als die natürlich erhaltenen Tallysomycine A und B.

Antitumor therapeutische	(Cu-frei)	P388	Indices von	Tallysomycin-Derivaten	Bl6 Lewis Lunge
	(Cu-frei)	73	Antitumor therapeutisches Indices	70 lU6
		52	Sl 80	56 U18
Tal 1 v^cnmviTⁿ	271
A	767
B

030065/0915

M/21 130	*	Tallysomycin	^S4b	- 32 -	V V A- « ^ «- >^	,Antitumor therapeutische Indices	P388	ß180	.B16	Lewis Lunge	angegeben.
	⁵Ia	j >		**		21	357	30	-	C_n)/antitumor-wirksame Dosis
	^{; s}ib	i ^S6a		10	173	127	158
^S2a	I i ^S6b		<8	357	ll*7	179 .
i ^S2b	'■ ^S7b	35	267	97	U9
I	^S8a	59	317	95	73
I ^S8b	<U	100	26	-
OU ^S9b	70	1*60	1U8	121
^S10a	21	167	125	32
I ^S10b	Ht	375	136	176
; S_lob (Cu-frei)	IU	au	188	—
ς	5U	-	-	—
HIa	20	120	115	250
^Sllb	<11	76	110	78
^S12b	96	338	69	-
ς	-	900	U6	—
: ^bi3b	89	2100.	50	200
■ ^S14a	30		—	—
^S14b
	75	105	30	66
	>38	>833	>38	-
50	106	152	-


—
* Kupferchelat-Form/ wenn	nicht anders
** Toxizität Einzeldosis (LD
(ED₁₀₁-, ED_1fcn oder ID_cn)

030065/0915

Tallysomycin S₁«, wurde hinsichtlich Nierentoxizität bei einem Mäuseversuch unter Verwendung einer BUN-Messung als Endpunkt und an einem Lungen-Hydroxyprolinmodell auf Lungentoxizität getestet (vgl. Cancer Res. 35:787 (1978)). Die Toxizität von Tallysomycin S₁_, gegen die Niere war bei gleich toxischen Dosen nicht größer als die von Bleomycin. Tallysomycin S_1Q, verursachte eine Zunahme an Lungenhydroxyprolin, was auf Lungentoxizität weist. Die Dosis-Reaktionskurve war jedoch flacher als dies bei Bleomycin beobachtet wurde und der Hydroxyprolingehalt bei hohen Dosen war gegenüber dem von Tieren, welche mit Bleomycin bei gleich toxischen Dosen verabreicht wurden, geringer.

Wie die obigen Daten zeigen, sind die erfindungsgemäßen Tallysomycin-Derivate als anti-mikrobielle Mittel zur Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen, sowohl Bakterien als auch Pilzen,welche pathogen auf Tier- und Pflanzenleben wirken, brauchbar. Sie sind auch brauchbar zur Inhibierung des Wachstums von Tumoren bei Säugetieren. Die Verbindungen können auf die gleiche Weise wie das im Handel erhältliche Bleomycin verabreicht werden, und die optimale Dosierung für einen bestimmten Zustand kann vom Fachmann auf herkömmliche Weise und anhand der obigen Daten bestimmt werden.

Die Erfindung umfaßt auch pharmazeutische Mittel, welche eine wirksame antimikrobielle oder Tumor-inhibierende Menge eines erfindungsgemäßen Tallysomycin-Derivats oder ein j pharmazeutisch verträgliche» Säureadditionssalz davon in Kombination mit einem inerten pharmazeutisch verträglichen

Träger oder Verdünnungsmittel, enthalten. ;

030065/091S

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
einer wirksamen antimikrobiellen oder Tumor-inhibierenden
Dosis eines erfindungsgemäßen Tallysomycin-Derivats oder
eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes
davon, zur Behandlung von Tieren (bevorzugt Säugetieren)
welche von einer mikrobiellen Infektion oder einem malignen
Tumor befallen sind.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher
beschreiben, sie jedoch nicht einschränken.

ι Beispiel

^S2a ^{und S}2b

Malzextrakt Schrägagar, der mit Streptoalloteichus '

hindustanus ATCC 31158 inokuliert ist, inkubiert man eine i

Woche bei 28 ⁰C. Man verwendet die Schrägkultur, um ]

ι 100 ml Keimmedium der folgenden Zusammensetzung in einem j 500 ml Erlenmeyerkolben zu inokulieren:

Glucose 1,5 % !

Hefeextrakt 0,2 j

Polypeton 0,5 I

K₃HPO₄ 0,05

MgSO₄·7H₂O 0,05

CaCO₃ 0,5

Man stellt den pH auf 7,2 ein, bevor man in einem Autoklaven j sterilisiert. Die Samenkulturkolben werden 48 Stunden bei i 33 ⁰C auf einem Rotationsrüttler, der mit 230 fpm arbeitet, \ inkubiert. Die oben erhaltene Samenkultur gibt man zu 100 ml
Fermentationsmedium in einem 500 ml Erlenmeyerkolben bei
einer Inokulumgröße von 10 % (Volumenteile) . Das Fermentationsmedium enthält die folgenden Bestandteile:

030065/0916

Sucrose 2,5

Glukose 0,5

PHARMAMEDIA 3,0
(Baumwollsamenmehl)

Brennereischlempe ^,0

JoSO. 0,3

ZnSO₄-7H₂O 0,003

CuSO₄-5H₂O 0,01

CaCO₃ 0, 4

Eine neutralisierte wäßrige 3-Aminopropyldimethylsulfoniumchlorid-Lösung gibt man vor der Sterilisation bei einer Konzentration von 0,1 % (Gewicht/Volumen) in Form des

Hydrochloridsalzes zum Fermentationsmedium. Der pH des Mediums ^; wird vor dem Sterilisieren auf 7,0 eingestellt. Die inokulierten Fermentationskolben inkubiert man bei 28 C fünf Tage auf ι einem Rotationsrüttler der sich mit 250 rpm dreht. Das Fortschreiten der Fermentation wird durch Papierscheiben-Agardiffusionsversuche unter Verwendung von M. smegmatis, Stamm M6-3 als Testorganismus überwacht.

Die Fermentationsbrühe, welche Tallysomycin S„ und S , enthält, rührt man mit Filterhilfe und das Filtrat (20 1) rührt man mit AMBERLITE IRC-50 (60 % NH₄ ⁺ Form, 3,5 1). Man wäscht das Harz mit Wasser und eluiert dann die aktiven Bestandteile mit 0,2 N HCl (4 1 χ 3). Das aktive Elu.at stellt man auf pH 6,0 ein und rührt mit Aktivkohle (400 g). Bioaktive Komponenten, welche an der Aktivkohle adsorbiert sind, werden dreimal unter Rühren mit einer Mischung von n-Butanol und Wasser eluiert, wobei man den pH während des Eluierens bei 2,0 hält. Die vereinigten wäßrigen Eluate neutralisiert man, engt im Vakuum auf ca. 100 ml ein und chromatographiert an einer DIAION HP-20 Kolonne (1,2 1). Man entwickelt die Säule mit Wasser, wobei man blaugefärbte Tallysomycinfraktionen erhält. Eindampfen geeigneter Fraktionen ergibt eine rohe Tallysomycin Mischung (4,85 g) welche an einer Kolonne von

030065/091B

CM-CEPHADEX C-25 (330 ml) chromatographiert und mit einer zunehmenden Menge Ammoniumformiatlosung entwickelt wird. Tallysomycin Sp, , S„ und B eluiert man nacheinander mit 2 % HCOONH. und Tallysomycin A eluiert man mit 4 % HCOONH₄. Jede antibiotische Fraktion wird durch Adsorption an Aktivkohle entsalzt und anschließend mit saurem, wäßrigem n-Butanol eluiert. Lyophilisation der wäßrigen Eluate ergibt Tallysomycin S„ (156 mg) und S~, (570 mg) zusammen mit Tallysomycin A (210 mg) und B (540 mg)_r alle in Form des Kupferchelats.

Beispiel 2

: S, und S,,
6a 6b

j Man wiederholt das Fermentationsverfahren nach Beispiel 1,

mit der Ausnahme, daß als Precursoramin N-(ß-Hydroxyäthyl)-

! 1,3-diaminopropan (HCl-SaIz) verwendet wird. Die geerntete

Brühe (11 1) filtriert man mit Filterhilfe. Die antibiotische

j Aktivität im Filtrat adsorbiert man an AMBERLITE IRC-50 Harz

' (60 % NH. Form, 2,4 1) und eluiert sie aus dem Harz mit

ί 0,1 N HCl. Man stellt das Eluat auf pH 6,5 ein und gibt dann über eine DIAION HP-20-Säule. (21). Man eluiert die

Säule mit Wasser, Fraktionen, welche Tallysomycine enthalten, 1

engt man im Vakuum ein und lyophilisiert, wobei man einen

blauen Feststoff erhält (824 mg). Tallysomycine werden durch ■ CM-SEPHADEX C-25 Chromatographie (200 ml) getrennt, wobei man wäßrige Ammoniumformiatlosung als Eluierungsmittel verwendet. Tallysomycin Sg, eluiert man mit 2 % HCOONH₄,

S, und B mit 3 % HCOONH- und schließlich A mit 5 % HCOONH.- ! oa ^ "

j Lösung. Jede Fraktion wird zum Entsalzen mit Aktivkohle : behandelt. Die Ausbeuten an Kupferchelat-Tallysomicinen sind:

! A 61 mg, B 31 mg, Sg 201 mg und Sg_b 288 mg.

030065/0915

Beispiel

^S8a ^{und S}8b

Man wiederholt das Fermentationsverfahren nach Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß man N,N-Di(ß-hydroxyäthyl)-1,3-diaminopropan (HCl-SaIz) als Precursoramin in einer Konzentration von 0,2 % (Gew./VoI) verwendet. Man filtriert die geerntete Brühe (10 1). Die in dem Kulturfiltrat enthaltenen Tallysomycinkomponenten werden an ' AMBERLITE IRC-50 (60 % NH. -Form, 2,2 1) adsorbiert und mit verdünnter HCl-Lösung eluiert. Man neutralisiert das aktive Eluat und bringt es auf eine DIAION HP-20 Säule (2 1) auf, welche mit Wasser entwickelt wird. Man engt die bioaktiven Fraktionen im Vakuum ein, wobei man 1,16 g rohes Tallysomycin erhält. Den Feststoff chromatographiert man an einer Säule CM-SEPHADEX C-25 (300 ml). Tallysomycin S₀, wird zuerst aus der Säule

ÖD

eluiert mit 2 % HCOONH₄, Sg_a und B mit 3 % HCOONH₄ und dann A mit 5 % HCOONH₄-Lösung. Die geeigneten Fraktionen werden durch Aktivkohleadsorption entsalzt. Die Ausbeuten an Tallysomycinen in Form des Kuperchelats betragen: A 184 mg, B 171 mg, Sg 63 mg und Sg, 248 mg.

Beispiel

^S10a ^{Und S}10b

Man wiederholt das Fermentationsverfahren nach Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß man 1,4-Diaminobutan-dihydrochlorid als Precursoramin-Verbindung verwendet. Die Fermentationsbrühe (35 1, pH 7,5) zentrifugiert man, um den Mycelkuchen abzutrennen. Die so erhaltene klare überstehende Flüssigkeit rührt man 30 Minuten mit AMBERLITE IRC-50 Harz (60 % NH₄ ⁺ Form, 6 1). Man wäscht das Harz mit zwei 30 1 Anteilen Wasser und eluiert dann mit drei 10 1 Anteilen saurem Wasser, wobei der pH während des Eluierens unter 2,0 gehalten wird. Man vereinigt die Eluate, stellt auf pH 7,8 ein und rührt mit Aktivkohle (800 g). Die aktiven Anteile eluiert man mit einer

030065/0915

1:1-Mischung von n-Butanol und saurem Wasser (jeweils 5 1, pH 2,0) und wiederholt das Eluieren dreimal. Man vereinigt die wäßrigen Schichten, neutralisiert mit *AMBERLITE IR-45 (OH-Form) und engt im Vakuum auf 300 ml ein. Das Konzetrat bringt man auf eine DIAION HP-20 Säule (3 1) auf, welche mit Wasser entwickelt wird. Man überwacht das Eluieren mittels Bioassay und engt die bioaktiven Fraktionen ein, wobei man eine Mischung von TalIysomyeinen in Form eines blauen Fest! stoffs erhält (6 g). Den Feststoff chromatographiert man an

einer CM-SEPHADEX C-25 Säule (300 ml), welche mit einer [ 1 %-igen HCOONH₄-Lösung vorgewaschen wurde. Man entwickelt die Säule mit zunehmenden Konzentrationen (1 %~3 %) wäßriger Ammoniumformiatlösung. Die ersten bioaktiven Fraktionen, ' die mit 3 % HCOONH₄ eluiert wurden, vereinigt man (250 ml) ! und rührt mit 30 g Aktivkohle. Man trennt die Kohle ab, wäscht

mit Wasser und eluiert zweimal mit einer 1:1 Mischung n-Butanol ! und angesäuertem Wasser (jeweils 120 ml). Die wäßrigen Eluate neutralisiert man mit AMBERLITE IR-45 (OH-Form) Harz und engt dann ein, wobei man ein halbreines Tallysomycin S--, j Präparat erhält (1,60 g). Man chromatographiert die Probe an einer Amberlite XT-2 Säule (240 ml) welche mit Wasser ■

; entwickelt wird. Die bioaktiven Eluate vereinigt man, engt j

! ein und lyophilisiert, wobei man reines Kupferchelat-Tallyso- i

mycin S„_, erhält (1,25 g). Tallysomycin S_1n, und B eluiert man ι UD ιua

erfolgreich aus der CM-SEPHADEX Säule mit einer 3 %-igen

HCOONH₄-Lösung, wobei man Tallysomycin S₁₀ (360 mg) und j

Tallysomycin B (370. g) in Form des Kupferchelats erhält. !

Eine Spurenmenge Tallysomycin A erhält man aus 5 %-igem 1

HCOONH₄-Eluat. ·

♦basisches Anionenaustauscherharz, von Rohm & Haas Co, USA, vertrieben.

⁺Makropores, nicht-ionisches StyrolDivinylbenzol-Copolymeres-i j Adsorptionsharz,
USA, erhältlich.

Adsorptionsharz, feine.Teilchengroße, von Rohm & Haas Co, j

030065/0915

Beispiel

Mittels im wesentlichen der gleichen Verfahren wie in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben, werden die nachstehenden semibiosynthetischen Tallysomycin-Derivate durch"-^; Fermentation unter Zusatz von Aminen hergestellt.

Tallysomycin Fermentations-

Derivat Amin-Hydrochlorid-Vorläufer brühe

Produkt Verbindung Volumen (1) Ausbeute (mg)

^S1a ^S1b ^S3b ^S4b ^S5b

^S7b ^S9b

^S11a ^S11b ^S12b ^S13b ^S14a

1,3-Diaminopropan	6,7	Spur
Il	Il	70
1,2-Diaminoäthan	1,9	6
1,3-Diamino-2-hydroxypropan	8,5	17
N- (ß-Hydraxypropyl) -1,2-diamino- äthan	5	32
N,N-Dimethyl-1,3-diaminopropan	10	96
N-(ß-Hydroxyäthyl)-1,2-diamino- äthan	10	286
N-Methyl-1,3-diaminopropan	3,2	43
Il	»	259
N-(3-Aminopropyl)-morpholin	2,2	94
N-(3-Aminopropyl)-2-pipecolin	10	137
N-(T -Phenyläthyl) -1,3-diamino propan	4	20
Il	Il	210

030065/091B

Beispiel

Die kupferfreien Tallysomycine, die den kupferchelierten

Derivaten gemäß den Beispielen 1 bis 5 entsprechen,
können durch Behandeln mit H_S in Methanol nach dem Vei des Beispiels 1 der US-PS 3,646,197 hergestellt werden

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der nach den Beispielen 1 bis 5 hergestellten Tallysomycinderivate sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.

030065/0915

-28-

Physikalisch-chemische Eigenschaften der neuen Tallysanycin-Derivate

TLC (R_f

f*

Tallysomycin	la
S	Ib
S	2a
S	2b
S	3b
S	4b
S	5b
S	6a
S	6b
S	7b
S	8a
S	8b
S	9b
S	10a
S	10b
S	11a
S	11b
S	12b
S	13b
- S	14a
S	14b
S

S-102	S-123	( Retentionszeit)
0.50	0.23	6'2U"
0.65	0.37	k '1+8"
0.2U	0.15	6· 30"
0.38	0.31*	5Ί8"
0.59	0.51	U'U9"
0.66	0.1*0	U'U7"
0.50	O.58	If · 5U"
0.1*2	0.22	6'18"
0.50	O.I4O	I₁IU₂"
O.UU	0.25	*U'51"**
0.56	o.i»o	6'2U"
0.70	0.5¹*	1+ · U8"
O.56	0.U8	U '52"
0.U3	O.2U	6'20"
0.61	0.39	1* '1*7"
0.27	O.I6	-
O.I49	0.35	*1'17"*
0.U9	0.60	*1'17"*
*0.16**	O.36	5'37"
0.52	0.37	-
0.62	0.50	7'05"

030065/091S

Physikalisch-chemische Eigenschaften der neuen Tallysomycin-Derivate

H₂O _n Anal. gefunden

TaUysomycin ^Xmax^nm ^{E1cm' CHN

^Sla 2U2(126), 292(102)

S_lb 2l»2(lO8), 290(9¹O 39-5I* 5.^5 15.01

S_2a 2Uo(l2O), 290(108)

S₂b 2UU.5(129),292(1OU) 38.51 5.51 IU.30

^S3b 2UO(123), 291(112)

^S4b 2U2(12O), 290(103)

S_nu 2UU(12U), 290(102) UO.17 6.05 15.02 5b

S- 2U3(1O5), 291(83) 39.73 6.39 15.35 ba

^S6b 2U3(128), 291(103) 39.81 6.00 15-21

^S7b 2U5(12O), 290(96) UO.89 6.0U 1U.51

Sg₃ 2U3(1O7), 291(85)

S_ßb 2U3(llU), 290(92) Uo.73 6.18 1U.79

S_gb 2U3(1OU), 290(87) 39-80 5-97 I5-U2

^S10a 2UU(lU2), 292(112) 39.76 5.9U 15.58

S-,nu 2UU(IUl), 292(116) 38.81 5.85 1U.7U 10b

^Slla 2UU(62), 292(53)

S_1lb 2UU(112), 292(91) Uo.16 5.U8 15-OU

^S12b 2U5(7U), 292(59) 3U.98 5.09 13.OU

2U3(lU2), 292(llU) 39-lU 5.85 13-63

2U3(1O2),"292(72)

2U3(lU3), 292(109)

030065/091

** TLC-System S 102 verwendet Kieselgel-Platten 6OF₃₅₄ (Merck) und als Lösungsmittelsystem Methanol:wäßriges 10 %-iges Ammoniumacetat (1:1 Volumenteile);

TLC-System S-123 verwendet Kieselgel-Platten 6OF₃₅₄ (Merck) und als Lösungsmittelsystem Methanol:10 %-igem Ammoniumacetat:10 %-igem Ammoniumhydroxid (10:9:1 Volumenteile). Zur Anzeige verwendet man einen Dual-Wellenlängen TLC-Scanner (Shimadzu GS-910) bei 290 nm.

Apparat: Waters Associtates Modell ALC 204 mit einer Injektionssäule vom Type U6K: Waters Associates μ-Bondapak C₁Q(4x300 mm), vorgewaschen mit 0,5 %-iger EDTA-Lösung. Mobile Phase: CH CN:H₃O (3:7 Volumenteile) enthaltend Waters Assocites Reagenz PIC B-7.
Detektor: Modell 44 0 UV-Detektor bei 254 nm Fließgeschwindigkeit: 10 ml/Min. (Druck 800 psi) Größe der injizierten Probe: 1 μΐ einer 2 mg/ml Lösung

Die vorliegende Erfindung kann inudstriell angewendet werden.

203/Hch

030065/0915

Claims

M/21 130

3P2S425

Patentansprüche

V 1. Tallysomycin A Derivate der allgemeinen Formel

worin R für:

-NH-(CH₂)₃-NH₂

-NH-(CH₂)₃-S®(

-NH-(CH₂)₃-NH-CH₂-CH₂0H

-NH-(CH₂J₃-N(CH₂CH₂OH)₂

-NH-(CH₂J₄-NH₂

-NH-(CH₂J₃-NH-CH₃

oder

-NH-

CH₀

steht,

oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.

030065/0915

M/21 130 ^3
2. Tallysomycin S₁ nach Anspruch 1, worin R für -NH-(CH₀)-NH₉ steht, oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.

',
3. Tallysomycin S₀ nach Anspruch 1, worin R für

)-,-S (CH-)„ steht, oder pharmazeutisch verträgliche Säureaddxtxonssalze davon.
4. Tallysomycin S, nach Anspruch 1, worin R für

-NH-(CH₂J₃-NH-CH₂CH₂OH steht, oder pharmazeutisch verträgliche Säureaddxtxonssalze davon.

i
5. Tallysomycin S« nach Anspruch 1, worin R für ; -NH-(CH₂)₃-N(CH₂CH₂OH)₂ steht, oder pharmazeutisch

' verträgliche Säureaddxtxonssalze davon.

'
6. Tallysomycin S_1n nach Anspruch 1, worin R für ] .ι ua

■ -NH-(CH₂).-NH₀ steht, oder pharmazeutisch verträgliche j Säureadditionssalze davon. ί

^!
7. Tallysomycin S₁₁ nach Anspruch 1, worin R für ι -NH-(CH₂J₃-NH-CH₃ steht, oder pharmazeutisch verträgliche j ! Säureaddxtxonssalze davon.
8. Tallysomycin S₁₄ nach Anspruch 1, worin R für

j -NH-(CH )_-NH-CH -γ. λ steht, oder pharmazeutisch

; . ^CH3

verträgliche Säureaddxtxonssalze davon.

0300ßB/Ö915

M/21 130 "'Ό 3 -
9. Tallysomycin B Derivate der allgemeinen Formel:

CO-NH₂ NH₂ S

oder

worin R für: -NH

-NH-(CH₂)₃-S®( CH₃J₂ -NH-(CH₂J₂-NH₂

-NH-CH₂-CH-CH₂-NH₂

OH -NH-(CH₂ J₂-NH-CH₂-CH-CH₃

OH -NH-(CH₂ J₃-NH-CH₂-CH₂OH

-NH-(CH₂J₃-N(CH₃J₂ -NH-(CH₂J₃-N(CH₂CH₂OHJ₂ -NH-(CH₂ J₂-NH-CH₂-CH₂OH -NH-(CH₂J₄-NH₂

-NH-(CH₂J₃-NH-CH₃

r—\ -WH-(CH₉),-N 0

CH₃

030065/0915

M/21 130 - ST- «_ηί)ΡηΕ

-NH-(CH₂)₃-NH-CH-( } steht,

oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.

^;
10. Tallysomycin S₁, nach Anspruch 9, worin R für -NH-(CH„)_-NH„ steht, oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon. ■
11. Tallysomycin S„, nach Anspruch 9, worin R für

)^-S (CH.,) „ steht, oder pharmazeutisch veri trägliche Säureadditionssalze davon.

;
12. Tallysomycin S_, nach Anspruch 9, worin R für ■ -NH- (CH₂) 2~^NH2 ^ste^^lt' oder pharmazeutisch verträgliche

ι Säureadditionssalze davon.
13. Tallysomycin S., nach Anspruch 9, worin R für

-NH-CH₉-CH-CH_-NH„ steht, oder pharmazeutisch verträgliche ! OH I

Säureadditionssalze davon.

j
14. Tallysomycin S₅, nach Anspruch 9, worin R für ι -NH-(CH₂J₂-NH-CH₂-CH-CH₃ steht, oder pharmazeutisch

OH

! verträgliche Säureaddifeionssalze davon.

030065/0915
15. Tallysomycin S,, nach Anspruch 9, worin R für

oD

)--NH-CH₉-CH₉OH steht, oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.

j
16. Tallysomycin S₇, nach Anspruch 9, worin R für -NH-(CH₂)₃~N(CH₃)₂ steht, oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.
17. Tallysomycin S_R, nach Anspruch 9, worin R für : -NH-(CH₂J₃-N(CH₂CH₂OH)₂ steht, oder pharmazeutisch ι verträgliche Säureadditionssalze davon.

I
18. Tallysomycin S_q, nach Anspruch 9, worin R für

^; -NH-(CH₂J₂-NH-CH₂-CH₂OH steht, oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.

i
19. Tallysomycin S₁ , nach Anspruch 9, worin R für . -NH-(CH₉J₄-NH₉ steht, oder pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.
20. Tallysomycin S₁₁, nach Anspruch 9, worin R für

-NH (CH₉) ..-NH-CH-. steht, oder pharmazeutisch verträgliche ι Säureadditionssalze davon.
21. Tallysomycin S₁₉, nach Anspruch 9, worin R für

-NH-(CH₉J-N 0 steht, oder pharmazeutisch verträgliche

Säureadditionssalze davon.

'.
22. Tallysomycin S₁₀, nach Anspruch 9, worin R für

i -NH-(CH_)_-N / steht, oder pharmazeutisch verträgliche

CH₃
Säureadditionssalze davon.

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ι
23. Tallysomycin S₁₄, nach Anspruch 9, worin R für

-NH-(CH₂J₃-NH-CH-^ Δ steht, oder pharmazeutisch

CH₃
verträgliche Säureadditionssalze davon.
24. Verfahren zur Herstellung der Tallysomycin-Derivate nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Tallysomycin-produzierenden Stamm von Streptoalloteichus hindustanus in einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart eines Aminvorläufers der Formel:

NH₂-(CH₂J₂-NH₂, NH₂-(CH₂J₃-NH₂, NH₂-(CH₂J₄-NH₂,

NH₂-CH₂-CH-CH₂-NH₂,

OH NH₂-(CH₂J₂-NH-CH₂-CH₂Oh,

NH₂-(CH₂J₂-NH-Ch₂-CH-CH₃,

OH NH₂-(CH₂J₃-NH-CH₃,

NH₂-(CH₂J₃-NH-CH₂-CH₂Oh,

NH₂-(CH₂J₃-NH-CH-^ , CH₃

NH₂-(CH₂J₃-N(CH₃J₂,

NH₂-(CH₂J₃-N(CH₂CH₂Oh).

NH₂-

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oder

oder eines anorganischen Säureadditionssalzes davon so lange kultiviert, bis durch den Organismus in dem Kulturmedium ein wesentlicher Anteil an gewünschtem Tallysomycin-Derivat produziert worden ist, und das gewünschte Tallysomycin-Derivat im wesentlichen frei von Neben- | produkten aus dem Kulturmedium isoliert. \
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichn. d. als Tallysomycin produzierender Stamm Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31158 oder ein Mutant davon verwendet wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 oder 25, dad. gek«.^ daß als Aminprecursor 1,4-Diaminobutan oder ein anorganisches Säureadditionssalz davon verwendet wird und man als Tallysomycin-Derivat das Tallysomycin S_1n, der Formel

CO-NH₂ NH₂ 0

N-H-C-NH-(CH₂J₄-NH₂

OH

isoliert.

G3Ö065/Ö915

M/21 130 - y_z 5 „
27. Arzneimittel, enthaltend in einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel mindestens eine Verbindung nach den Ansprüchen 1- 23, gegebenenfalls in Form eines Kupfer-Chelates.

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