DK151633B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af tallysomycinderivater - Google Patents

Description

DK 151633 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte tallysomycin B derivater betegnet S1b, S0. ....... S... med formlen 2b 14b 05 co-nh2 nh2 0 I ην->-^ΝΗ2 I«

0HYNi'NY^N/ I S

H=C HV^3°hAm3H °H

OH I ^ °H

15 HO 3^ hvori R betegner: 20 -NH-(CH2)3-NH2 for S1b -NH-(CH2)3-S+(CH3)2 for S2b -NH-(CH2)2-NH2 for S3b -NH-CH2-CHOH-CH2-NH2 for S4b -NH-(CH2)2-NH-CH2-CHOH-CH3 for S5b 25 -NH-(CH2)3-NH-CH2-CH2OH for Sgb -NH-(CH2)3-N(CH3)2 for S?b -NH-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2 for S8b -NH-(CH2)2-NH-CH2-CH2OH for Sgb -NH-(CH2)4-NH2 for Sl0b 30 -NH-(CH2)3-NH-CH3 for S11fa -NH-(CH2)3-nQd for S12b -nh-(ch2)3-n^) for S13b eller CHg 35 -NH-(CH2)3-NH-CHCH3-^>for S14b samt, såfremt R har den for S1b, S2b, Sgb, Sgb, Sl0b, S11b og

DK 151633B

2 t S14b an9'vne betydning, yderligere tallysomycin A derivater betegnet tallysomycin S1g/ S2g/ Sgg, Sga, S^Qa, S11g og S14g med formlen 0 o

05 m_,_I!-NH-(CH2)3-CH-CH2-S-R

X 8 „ Ν-ττΟ . nh2

J1' !! H n CH-CH-lisJ

h2/W fYYYVl Jh H3c ho^CHb l 10 ho^ J ιΓ3 Γ h2n oh 0H U-v* 15 (Λ«» hvori R betegner: -NH-(CH2)3-NH2 for S1a 20 -NH-(CH2)3-S+(CH3)2 for S2a -NH-(CH2)3-NH-CH2-CH2OH for Sga -NH-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2 for Sga -NH-(CH2)4-NH2 for S10g -NH-(CH2)3-NH-CHg for S11g eller 25 -NH-(CH2)3-NH-CH-CHCH3-<^~^for S14g eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf.

... De ovennævnte forbindelser kan eksistere i form af et kobber-30 chelat ell er på kobberfri form.

Fra USA patentskrift nr. 4.051.237, som svarer til dansk fremlæggelsesskrift nr. 141.372, er det kendt at fremstille glykopeptid-antibiotika kaldet Bu-2231 A og B ved dyrkning af stammer af Streptoalloteichus hindustanus. Efterfølgende arbejde har vist, at 35 Bu-2231 A og B (nu kaldet tallysomycin A og B) har følgende strukturer:

DK 151633 B

3 co-nh2 nh2 li

Λ 8 N JTC'NH‘(CH2 }3 -CH-CH2-C-NH

05 Η^,ΟοΗΟ^Κ S .n-CH^S NH2 (ψ

05 h3c hn » I o I H OH NH

χΙΡ"· i (CK

>£ v ^ K

OH I H2N oh 10

W^OH

HO T

0^ήΗ2 Tallysomycin A

ις CONH, NH2 η I hn-A^nh* " V « N-7rC-NH(CH,),-NH-(CH,).-NH, Λ 0 N-r< J 2 3 2 4 2 hjn'VS*0 v ΗγΛ“„λΗ3Η i oh /¾ V '1Ϊ7

OH I H*N 0H

y^A-0H

25 H0 nJL_. Tallysomycin B

U m2

De udviser antimikrobielle og antitumor egenskaber.

Fra USA patentskrifterne nr. 3.984.390 og 3.846.400 (og de danske fremlæggelsesskrifter nr. 123.605 og 130.249) er det kendt 30 at fremstille derivater af phleomycin og bleomycin ved at dyrke stammer af mikroorganismer, som er i stand til at producere phleomycin- eller bleomycin-antibiotika i et fermenteringsmedium i nærværelse af en aminprækursor til dannelse af nye phleomycin- eller bleomycin-derivater med en sidekædestruktur, som svarer til den 35 tilsatte amin.

Det har nu ifølge den foreliggende opfindelse vist sig, at ovennævnte hidtil ukendte derivater af tallysomycin B og A kan fremstilles ved en analog fremgangsmåde og udviser en overrasken-

DK 151633B

4 eller bakterier. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker en tallysomycinproducerende stamme af Strepto-alloteichus hindustanus i et vandigt næringsmedium i nærværelse af en amin-prækursor med formlen 05 1) nh2-(ch2)3-nh2 2) NH2-(CH2)3-siW)2

Cl0 3) NH2-(CH2)2-NH2 10 4) NH2-CH2-CHOH-CH2-NH2 5) NH2-(CH2)2-NH-CH2-CHOH-CH3

6) NH2-(CH2)3-NH-CH2-CH2OH

7) NH2-(CH2)3-N(CH3)2 8) NH2-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2

15 9) NH2-(CH2)2-NH-CH2-CH2OH

10) NH2-(CH2)4-NH2 11) nh2-(ch2)3-nh<:h3 12) NH2-(CH2)3-N^Jo 20 13) NH2-(CH2)3-N^> ch3 14) NH2-(CH2)3-NH-CHCH3-^~^ eller et uorganisk syreadditionssalt deraf, hvorpå det dannede tal-25 lysomycin B derivat eller, såfremt aminprækursoren har formlen 1, 2, 6, 8, 10, 11 eller 14, det dannede tallysomycin B derivat og/ eller det dannede tallysomycin A derivat, udvindes fra dyrkningsmediet, om ønsket i form af et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

30 Til udførelse af den foreliggende fremgangsmåde dyrkes altså en tallysomycin-producerende stamme af Streptoalloteichus hindustanus (som omhandlet i USA patentskrift 4.051.237), mest foretrukket stammen Streptoalloteichus hindustanus E 465-94, ATCC 31158 eller en mutant deraf, i et vandigt næringsmedium. Næringsmediet inde-35 holder en assimilerbar carbonkilde (fx glukose, ribose, galaktose, fruktose, mannose, sakkarose, laktose, opløselig stivelse eller glycerol) og en assimilerbar nitrogenkilde (fx fiskemel, soyabønnemel,

DK 151633B

5 bomuldsfrømel, majsstøbevæske, peptoner, kødekstrakt, jordnødde-mel, gæringsekstrakt eller ammoniumsalte). Uorganiske salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, magnesiumsulfat, calciumcarbonat, fosfat etc. tilsættes om nødvendigt. Sporelementer, såsom kobber, 05 mangan, jern, zink etc. sættes om ønsket til mediet eller kan tilføres som urenheder fra andre af mediets bestanddele.

Foruden de ovenfor beskrevne konventionelle næringsbestanddele sættes der til mediet en prækursor-aminforbindelse som defineret ovenfor i form af den frie base eller som et syreadditionssalt 10 deraf. I almindelighed anvendes prækursor-aminforbindelsen i form af en neutraliseret vandig opløsning. Prækursor-aminforbindelserne, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er anført nedenfor sammen med kodenavnet for det tilsvarende ta 11 y somy ci n p rod u kt: 15 Åmin

Tallysomycin

Kemisk navn Struktur slutprodukt * 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1,2-diaminoethan NH2-(CH2)2-NH-2 S3b 2 1.3- diaminopropan NH2-(CH2)3-NH-2 S^, Slb 3 1.4- diaminobutan NH2-(CH2)4-NH-2 S10a' S10b 4 1,3-diamino-2-hydroxy- NH2-CH2-CH0H-CH2-NH2 5 propan 6 N-(β-hydroxye thyl)- NH2-(CH2)2-NH-CH2-CH2OH ' Sgb 7 -1,2-diaminoethan 8 N-(β-hydroxypropy1)- ^2 " ^ CH2 ^ 2 _NH“ CH2 "CHOH-CH3 Sgb 9 -1,2-diaminoethan 10 N-methyl-l,3-diamino- NH2-(CH2)3-NH-CH3 Slla' Sllb 11 propan 12 N- (β-hydroxyethyl) - NH2 - ( CH2 ) 3 -NH-CH2-CH2OH S^, Sgb 13 -1,3-diaminopropan 14 N- (11 -phenylethyl) -1,3- NH2-(CH2)3-NH-CHCH3-^^ S^, 15 -diaminopropan 16 N,N-dimethyl-l,3- NH2-(CH2)3-N(CH3)2 S?b -diaminopropan

DK 151633B

6

Amin

Tallysomycin

Kemisk navn Struktur slutprodukt * 05 N,N-di(β-hydroxyethy1)- NH2-(CH2)3-N(CH2-CH2OH)2 S8a, Sgb -1,3-diaminopropan N- (3-aminopropyl) - 1^-(0^)3)-^ ^0 S12b -morpholin N-(3-aminopropyl)-2- MH2-(CH2)3~N^ ^ S13b

10 pipecolin CKL

3-aminopropyl-dimethyl NH2-(CH2)3-£> (CH3)2 S2a, S2b sulfoniumchlorid Cl® * Tallysomycinderivaterne navngives ved at tildele hver præ-15 kursor-amin et tal og dernæst betegne tallysomycinslutproduk- tet efter tallet for dets terminale amin samt bogstaverne a eller b afhængigt af, om det er et derivat af tallysomycin A eller B.

Fx er tallysomycin tallysomycin -B-derivatet med 1,4-di- aminobutan som terminal amin.

20

Aminerne, anvendt som frie baser eller som syreadditionssalte med mineralsyre, såsom HBr eller HCI, sættes fortrinsvis til mediet i en koncentration på ca. 0,05-0,4% (vægt/volumen), mere foretrukket ca. 0,1-0,2% (v/v), ved begyndelsen af fermenteringen, idet 25 dog gode resultater også kan opnås ved portionsvis tilsætning af aminopløsning under fermenteringens tidlige stadier.

Fermenteringen udføres ved at følge fremgangsmåden ifølge USA patent 4.051.237. Følgelig kan inkubationstemperaturen være enhver temperatur, ved hvilken en tallysomycinproducerende stamme 30 er i stand til at vokse, fx 20-54°C, men det foretrækkes at udføre fermenteringen ved 25-35°C, mest foretrukket ved 27-32°C. En neutral eller nær ved neutral begyndelses-pH-værdi, fx pH ca. 6-7, anvendes fortrinsvis i mediet, og produktion af antibiotiket udføres i almindelighed i et tidsrum på ca. 2 til ca. 10. dage. Sædvanligvis 35 opnås optimal produktion på 3-7 dage. Til fremstilling af relativt små mængder kan anvendes rystekolber og overfladedyrkning, men til produktion i større målestok foretrækkes submers aerob dyrkning i

DK 151633 B

7 i sterile tanke. Når man skal foretage tankfermentering, foretrækkes det at producere et vegetativt inokulum i et næringssubstrat ved at pode substratkulturen med en spore fra den producerende organisme. Nar et ungt aktivt vegetativt inokulum er blevet opnået, 05 overføres inokulet aseptisk til fermenteringstankmediet. Luften i tanke og kolber kan opnås ved at forcere luft gennem eller til fermenteringsmediets overflade. Omrøring i tankene kan opnås ved hjælp af en mekanisk tvangsomrører, og et antiskumningsmiddel, såsom svinefedtolie, kan tilsættes efter behov.

10 Produktion af det ønskede tallysomycinderivat i dyrkningsmedi et kan følges under fermenteringen ved papirskive-agar-diffusions-metoden under anvendelse af Mycobacterium smegmatis stamme M6-3 som testorganisme.

Efter at optimal substratstyrke er blevet opnået (bestemt fx 15 ved hjælp af den ovenfor omtalte prøvemetode), adskilles myceliet og uønskede rester fra fermenteringssustratet ved hjælp af konventionelle midler, såsom filtrering eller centrifugering. Den antibiotiske aktivetet findes i filtratet og kan udvindes derfra ved anvendelse af konventinel adsorptionsteknik, se fx J. Antibiotics 30(10): 20 779-788 (1977).

Ifølge en foretrukket udførelsesform adsorberes filtratet først på en kationbytterharpiks, fx en harpiks af den type, som er tilgængelig fra Rohm and Haas Company under varemærket AMBERLITE IRC-50 (NH^+ form). Harpiksen vaskes med vand, og tallysomycin-25 fraktionen elueres med vandig mineralsyre, fx 0,1 N HCI. Eluatet, som indeholder de aktive fraktioner, neutraliseres med vandig ammoniak og omrøres fortrinsvis med aktiveret carbon. Trækullet opsamles ved filtrering, vaskes med vand og elueres dernæst med vandig butanol (1:1 butanol:fortyndet HCI v/v) ved sur pH-værdi, 30 (fx pH 2). Det vandige lag af elueringsmidlet neutraliseres med basisk anionbytterharpiks og koncentreres i vakuum. Koncentreret eluat fra IRC-50-harpiksen (såfremt carbon-adsorptionstrinnet udelades) eller aktiveret carbon opløses dernæst i vand, adsorberes på en harpiks af DIAION HP-20-type (varemærke for en makroporøs 35 nonionisk adsorbent-harpiks sammensat af en styren-divinylbenzen-copolymer og tilgængelig fra Mitsubishi Chemical Co., Japan) og elueres med vand til dannelse af en blanding af rå tallysomyciner på 8

DK 151653 B

kobberchelat-form.

Adskillelse og rensning af de ønskede tallysomycinderivater, som dannes under den prækursorfødede fermentering, kan opnås ved adsorption af det ovenfor opnåede rå tallysomycinkompleks på 05 en kationbytterharpiks af modificeret dextranderivat, fx en modificeret polysakkarid-dextran af den type, som forhandles under varemærket CM-SEPHADEX C-25 af Pharmacia Fine Chemicals Inc. Tal-lysomycinderivatet eller -derivaterne elueres trinvis med vandig ammoniumformiatopløsning i koncentrationer varierende fra ca. 1 til 10 ca. 7%. Fraktioner indeholdende det samme derivat blandes, afsaltes ved adsorption ved aktiveret carbon (eluering med sur vandig butanol) og lyofiliseres til dannelse af renset tallysomycinderivat som et kobberchelat. Yderligere rensning kan om ønsket opnås ved konventionel kromatograferings- og/eller gelfiltrerings-teknik.

15 De omhandlede tallysomycinderivater har den egenskab at kun ne danne chelatforbindelser med kobber ligesom tallysomycin A og B, og de omhandlede hidtil ukendte derivater samt syreadditionssalte deraf kan derfor eksistere på en kobberkompleks form og en kobberfri form. De kobberfrie former af tallysomycinderivaterne kan 20 fremstilles ud fra de tilsvarende kobberkompleksformer ved hjælp af i og for sig kendte fremgangsmåder, såsom omhandlet i USA patentskrift 4.051.237 og britisk offentliggørelsesskrift nr. 2.001.962 A.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede tallysomycinderivater på fri baseform kan omdannes til farmaceutisk accep-25 table syreadditionssalte på konventionel måde. Eksempler på sådanne salte omfatter de ikke toksiske salte med organiske eller uorganiske syrer, såsom saltsyre, svovlsyre, fosforsyre, eddikesyre, myresyre, stearinsyre, maleinsyre, benzosyre, ravsyre og hydrogenbromidsyre.

De minimale inhibitoriske koncentrationer (MIC) af de omhand-30 lede semibiosyntetiske tallysomycinderivater bestemtes i forhold til fungi og gram-positive, gram-negative og syreresistente bakterier ved hjælp af den dobbelte agarfortyndingsmetode. Næringsagar anvendtes for bakterier og Sabouraud agar for fungi. Resultaterne er sammen med sammenligningerne med tallysomycin A og B vist i 35 nedenstående tabel.

Antimikrobiel aktiviet af tallysomycinderivater

DK 151633B

9

Tallyso- Staphylococcus Sarcina Bacillus Mycobacterium mycin aureus Smith lutea subtilis 607 05 _ _ PCI1001 PCI 219 _ A 0,1 0,05 <0,003 0,2 B 0,4 0,4 0,006 0,2 10 S1a 0,4 0,1 <0,003 0,012 S1b 1,6 1,6 <0,05 0,05 S2a 0,2 0,8 <0,05 <0,05 S2b 1,6 6,3 <0,05 0,2 S3b 0,8 1,6 0,013 0,05 15 S4b 0,8 3,1 0,006 0,003 S5b 6,3 12,5 0,025 0,2

Sga 0,8 1,6 0,03 0,4

Sgb 6,3 12,5 0,02 0,2 S?b 6,3 12,5 0,1 3,1 20 Sga 0,2 0,4 0,006 0,1

Sgb 0,4 0,8 0,013 0,1

Sgb 0,4 0,8 0,013 0,1 S1Qa 1,6 0,4 0,04 0,2 S1Qb 6,3 3,1 0,2 0,2 25 S11a 0,8 0,2 0,025 0,1 S11b 3,1 0,8 0,1 0,1 S12b 12,5 12,5 0,4 0,2 S13b 6,3 6,3 0,8 0,2 S14a 0,8 0,8 0,1 0,1 30 S14b 3,1 3,1 0,4 0,2 1

Antimikrobiel aktiviet af tallysomycinderivater

DK 151633B

10

Tallyso- Escherichia Proteus Candida Aspergillus mycin coli NIHJ mirabilis albicans fumigatus 05 _ _ A9554 I AM 4888 I AM 2593 A 0,05 0,4 12,5 1,6 B 0,2 0,2 6,3 0,8 10 S1a 0,1 0,4 3,1 0,8 S1b - 0,4 1,6 12,5 1,6 S2a <0,05 0,2 6,3 0,4 S2fc) 0,4 1,6 25 0,8 S3fc) 0,1 0,2 12,5 0,8 15 S4b 0,4 0,4 25 0,8 S5b 0,4 3,1 25 0,4 S6a 0,4 1,6 6,3 0,2

Sgb 0,4 3,1 25 0,8

Syb 0,4 6,3 >50 0,4 20 S8a 0,1 0,4 12,5 0,8

Sgb 0,2 0,8 >50 1,6

Sgb 0,1 0,8 25 1,6 S10g 0,4 0,8 3,1 1,6 S1Qb 0,8 3,1 12,5 6,3 25 S11a 0,1 0,2 1,6 0,8 S11b 0,2 1,6 12,5 6,3 S12b 1,6 50 >100 25 S13b 0,4 12,5 >100 12,5 S14a 0,2 3,1 50 3,1 30 SUb 0,4 25 >100 25

De relative antibakterielle styrker (med tallysomycin A som standard = 1000 pg/mg) for de omhandlede tallysomycinderivater bestemtes ved hjælp af papir-skive-agar-diffusionsmetoden under an-35 vendeisen af Mycobacterium smegmatis stamme M6-3 som testorganisme. Resultaterne er vist i efterfølgende tabel.

Antibakteriel styrke af tallysomycinderivater

DK 151633 B

11

Tallysomycin Antibakteriel styrke pg/mg 05 A 1.000 B 900 S-, 1.075 la S1fc) 1.000 S2a 350 10 S2b 300 S3b 725 S4b 405 S5b 500

Sc 460 6a 15 S6b 340 S,. 380 7b S8a 550 S8b 370 s9b 380 20 S1Qa 1.450 S10b ^,100 S11a 570 S11b 450 S12b 390 25 S13b 1.090 S14a Ί·300 5ι^ 1.090

Aktiviteten til profag induktion af lysogenisk bakterie E. coli 30 W1709 (λ) bestemtes i henhold til den af Lein et al. i Nature 196: 783-784 (1962) beskrevne fremgangsmåde. Plague-tælningen foretoges på agarpladen indeholdende testforbindelse (t) og kontrolplade (c). Et t/c forhold for plague-tælninger på mere end 3,0 defineredes som signifikant, og lysogenisk induktionsaktivitet (ILB-aktivitet) 35 blev udtrykt som den minimale inducerbare koncentration af testforbindelsen. Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

ILB-aktivitet af tallysomycinderivater

DK 151633 B

12

Tallysomycin ILB-aktivitet (pg/mg) 05 A 0,00125 B 0,01 S- 0,16 S2a °'31 10 S2b 0,63 S3b 0,31 S4b S,. 0,08

OD

S6a 0,02 15 S6b 0,08 S?b 0,08 SRa 0,005 £ S9b 0,16 20 S1Qa 0,16 S10b °'31 S11a 0,08 S11b 0,63 S12b 0,31 25 S13b 0,08 S14a °'01 S14b 0/04

Antitumoraktiviteten af tallysomycinderivaterne undersøgtes i 30 fire eksperimentelle tumorsystemer i mus. Lymfotisk leukæmia P388 og Lewis lungecarcinoma implanteredes intraperitonelat i BDF1 mus af begge køn ved en inokuiumstørrelse på henholdsvis 3 x 10 og 5 x 1Q3 celler pr. mus. Sarcoma 180 ascites tumor podedes intraperi-tonealt i dd-stamme mus af hankøn med 2,5 x 10 celler pr. mus.

35 Melanotisk melanoma B 16 implanteredes subkutant i BDF1 mus med 5 ' 5 x 10 celler pr. mus. 24 timer efter implanteringen af tumorceller administreredes graduerede doser af testforbindelserne til musene

DK 151633 B

13 intraperitonealt ved et injektionsvoiumen pi 0,2 ml pr. 10 g legemsvægt. Testforbindelserne blev indgivet en gang daglig i 9 dage (qd 1 -> 9 skema) med undtagelse af de med Lewis lungecarcinoma podede mus, som behandledes i 11 dag (qd ->11). Dødsfald eller overle-05 velse blandt de behandlede og ubehandlede (kontrol) dyr registreredes daglig under en observationsperiode pi 45 dage efter implan-teringen af tumorceller, og den gennemsnitlige overlevelsestid beregnet for hver af testgrupperne (T) og kontrolgrupperne (C). En T/C-værdi lig med eller større end 125% indikerer, at en signifikant 10 antitumoreffekt opnåedes over for leukæmia P388 og Lewis lungecarcinoma. Den aktuelle dosis, som giver en T/C-værdi på 125%, bestemtes ved lineær regressionsanalyse og defineredes som den effektive dosis 125 eller ED.^. Den effektive dosis 150 (ED^q) anvendtes til vurdering af antitumorvirkning over for sarcoma 180. I B16 15 melanoma-forsøget måltes tumorstørrelsen på 16. dagen efter tumorpodning, og den dosis, som gav 50% inhibering af tumorvækst (EDjjq), beregnedes ud fra regressionslinier. Antitumoraktiviteten af derivaterne er anført i den efterfølgende tabel.

20 Antitumoraktivitet (mg/kg/dag, ip) P388 S180 B16 Lewis lunge

Tallysomycin * (ED150) (ED150) 0¾) (ED125> 25 A (Cu-fri) 0,26 0,07 0,27 0,13 B (Cu-fri) 0,89 0,06 0,82 0,11 S1a 1,2 0,06 0,84 S1b 2,0 0,11 0,15 0,12 30 S2a >3,0 0,07 0,17 0,14 S2b 0,91 0,12 0,33 0,65 S3b 0,32 0,06 0,20 0,26 S4b >3,0 0,13 0,50 S5b 0,66 0,10 0,31 0,38 35 S6a 0,70 0,09 0,12 0,47 S6b 2,2 0,08 0,22 0,17 S7b 2,1 0,14 0,16

DK 151633B

14 P388 S180 B16 Lewis lunge

Tallysomycin * (ED15q) (ED15q) (ID^q) ^ED125^ 05 Sga 0,78 S8b 1,5 0,25 0,26 0,12

Sgb > 3,0 0,42 0,29 0,41 S1Qa 0,28 0,08 0,39 S1Qb - 0,03 0,59 10 S1Qb (Cu-fri) 0,47 0,002 0,75 0,21 S11a °'6° S1lb 0,28 0,20 0,70 0,32 S12b 1,30 0,06 1,30 S13b 0,70 0,33 0,23 15 S14a S14b 3,0 0,08 0,43 0,29 * Kobbercheleret form med mindre andet er anført.

20 Graduerede doser af testforbindelser administreredes intraperi- tonealt til grupper af dd-mus. Injektioner blev indgivet enten en gang eller en gang daglig i 9 på hinanden følgende dage. Dødsfald eller overlevelse blandt dyrene registreredes i 30 dage efter sidste dosis af testforbindelse til beregning af den individuelle eller mul- 25 tipie gennemsnitlige letale dosis (LD^q). Resultaterne er vist nedenfor.

30 35

Akut og subakut toksicitet af tallysomycinderivater

DK 151633 B

15 LD50 (mg/kg/dag, ip) 05 Tallysomycin * Individuel dosis Multipel dosis (qd 1 9) A (Cu-fri) 19 4,4 B (CU-fri) 46 6,8 10 S, 25 la S1b 19 S2a 25 S2fa 32 2,0 9 3b 19 15 S4b 13 S5b 46 4,0 S6a 15 S6b 30 S7b 30 20 S8a 42 S8b 30 S9b 32 S10a 27 S10b 27 25 S.«. (Cu-fri) 42 4,0 S11a 18 S11b 21 S12b 7 59 S13b 1 30 S14a S14b - 16 * Kobbercheieret form med mindre andet er anført.

35 Det teraputiske antitumor-indeks beregnedes for hvert derivat ud fra forholdet mellem toksicitet og antitumoraktivitet. Som vist i den efterfølgende tabel udviste flere af de omhandlede hidtil ukend

DK 151633B

16 te semi biosyntetiske tallysomycinderivater bedre terapeutiske indices end det naturligt opnåede tallysomycin A og B i visse af de undersøgte eksperimentelle tumorsystemer.

05 Teraputiske antitumor-indices af tallysomyconderivater

Terapeutiske antitumor-indices **

Tallysomycin * P388 S180 B16 Lewis lunge 10 A (Cu-fri) 73 271 70 146 B (Cu-fri) 52 767 56 418 S1g 21 357 30 S,^ 10 173 127 158

Ib S2g <8 357 147 179 15 S„. 35 267 97 49 2b S0. 59 317 95 73 3b 5.. <4 100 26 4b S5b 70 460 148 121

Se 21 167 125 32 6a 20 S6b 14 375 136 176 5.. , 14 214 188 /□ S8a 54 ---

Sgb 20 120 115 250

Sgb < 11 76 110 78 25 S1Qa 96 338 69 S10b “ 900 46 S1Qb (Cu-fri) 89 2100 50 200 S11a 30 ---

Sllb 75 105 30 66 30 S12b > 38 >833 >38 S13b 50 106 152 S14a S14b ‘ “ 1 * Kobbercheleret form med mindre andet er anført.

** Enkeltdosistoksicitet (LDgQ)/antitumoreffektiv dosis (ED125' ED150 eller *°50^' fOli 633 0 ·' / AtO. 198^ 17

Tallysomycin S ^ undersøgtes for nefrotoksicitet i en musemo-del under anvendelse af BU N-måling som slutpunkt og en lunge-hy-droxyprolin-model for pulmonal toksicitet (se Cancer Res. 38:787-791 (1978)). Toksiciteten af tallysomycin over for nyrer var ikke 05 større end for bleomycin ved ækvitoksiske doser. Tallysomycin bevirkede en forøgelse i lunge-hydroxyprotein, hvilket antyder pulmonal toksicitet. Hældningen af dosis-reaktionskurven var imidlertid bedre end for bleomycin, og hydroxyprotein-indholdet ved høje doser var reduceret i forhold til indholdet i dyr, som var be-10 handlet med bleomycin ved ækvitoksiske doser.

Som det fremgår af de foregående resultater, er de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede tallysomycinderivater værdifulde som antimikrobielle midler til inhibering af væksten af mikrobielle organismer, både bakterier og fungi, som er patogene 15 over for mennesker, dyr og planter. De er også værdifulde til inhibering af væksten af tumorer i mennesker eller pattedyr. Forbindelserne kan administreres på samme måde som kommercielt tilgængelig bleomycin, og optimale dosisstørrelser for et givet sæt betingelser kan bestemmes af fagmanden under anvendelse af konventionelle do-20 sisbestemmelsestests samt de ovenfor givne resultater.

Til fremstilling af farmaceutiske præparater anvendes en effektiv antimikrobiel eller tumorinhiberende mængde af et ifølge opfindelsen fremstillet tallysomycinderivat eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf i kombination med en inert farmaceutisk 25 bærer eller tilsvarende fortyndingsmiddel.

Mennesker eller dyr (fortrinsvis pattedyr), som lider af en mikrobiel infektion eller en malign tumor, kan behandles terapeutisk ved administrering af en effektiv antimikrobiel eller tumorinhiberende dosis af et ifølge opfindelsen fremstillet tallysomycinderivat eller 30 et farmaceutisk acceptabelt syrreadditionssalt deraf.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1 35 Fremstilling af S2g og S2b

En maltekstrakt-skråagar, som var podet med Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31158, inkuberedes en uge ved 38°C. Skråkul-

DK 151633B

18 turen anvendtes til podning af 100 ml spiringsmedium af følgende sammensætning i en 500 ml Erlenmeyer kolbe: glukose 1/5 % 05 gærekstrakt 0,2 polypepton 0,5 K2HP04 0,05

MgS04,7H20 0,05

CaCOg 0,5 10 pH-værdien indstilledes pi 7,2 før sterilisering i en autoklav. Podekulturkolberne inkuberedes ved 33°C i 48 timer på et rotationsrysteapparat, der kørte ved 230 opm. Den ovenfor opnåede podekultur overførtes til 100 ml fermenteringsmedium i en 500 ml Erlenmeyer 15 kolbe ved en inokulumstørrelse på 10% (v/v). Fermenteringsmediet indeholdt følgende bestanddele: sakkarose 2,5 % glukose 0,5 20 bomuldsfrømel (PHARMAMEDIA) 3,0 opl. al k. dest. remanens ("distiller's soluble") 3,0 (NH4)2S04 0,3 25 ZnS04,7H20 0,003

CuS04,H20 0,01

CaCOg 0,4

En neutraliseret vandig opløsning af 3-aminopropyldimethylsul-30 foniumchlorid sattes til fermenteringsmediet før sterilisering ved en koncentration pi 0,1% (vægt/vol.) som hydrochloridsalt. Mediets pH-værdi indstilledes på 7,0 før sterilisering. De podede fermenteringskolber inkuberedes ved 28°C i fem dage på et rotationsrysteapparat, der kørte ved 250 opm. Fermenteringsforløbet måltes ved 35 papirski ve-agarfortyndingsmetoden under anvendelse af en M.

smegmatis stamme M6-3 som testorganisme.

Fermenteringssubstratet indeholdende tallysomyciner S2a og

DK 151633B

19 S2b omrørtes med filterhjælpemiddel, og filtratet (20 liter) omrørtes med AMBERLITE IRC-50 (60% NH4+ form, 3,5 liter). Harpiksen vaskedes med vand, og aktiviteten elueredes dernæst med 0,2 N HCI (4 liter x 3). Det aktive eluat indstilledes på pH-værdi 6,0 og om-05 rørtes med aktiveret trækul (400 g). De på det aktiverede carbon adsorberede biologisk aktive komponenter elueredes ved omrøring tre gange med en blanding af n-butanol og vand, idet pH-værdien holdtes på 2,0 under elueringen. De forenede vandige eluater neutraliseredes og koncentreredes i vakuum til ca. 100 ml, og koncen-10 tratet kromatograferedes på en kolonne af DIAION HP-20 (1,2 liter).

Kolonnen udvikledes med vand til opsamling af blåfarvede tallysomy-cin-fraktioner. Inddampning af passende fraktioner gav en rå tally-somycinblanding (4,85 g), der kromatograferedes på en kolonne af CM-SEPHADEX 025 (330 ml), som udvikledes med en voksende 15 koncentration af ammoniumformiatopløsning. Tallysomycin S2b, S2a og B elueredes successivt med 2% HCOONH^, og tallysomycin A elueredes med 4% HCOONH4. Hver antibiotisk fraktion afsaltedes ved adsorption med aktiveret carbon efterfulgt af eluering med sur vandig n-butanol. Lyophilisering af det vandige eluat gav tallysomycin 20 S2a (156 mg) og S2b (570 mg) sammen med tallysomycin A (210 mg) og B (540 mg), alle på kobberchelat form.

Eksempel 2

Fremstilling af Sga og S6b 25 Fermenteringsproceduren fra eksempel 1 gentoges, bortset fra at der som prækursor-amin anvendtes N(p-hydroxyethyl)-1,3-diami-nopropan (HCI salt). Det vundne substrat (11 liter) filtreredes med filterhjælpemiddel. Filtratets antibiotiske aktivitet adsorberedes på AMBERLITE IRC-50 harpiks (60% NH4+ form, 2,4 liter) og elueredes 30 fra harpiksen med 0,1 N HCI. Eluatet indstilledes på pH-værdi 6,5 og ledtes dernæst gennem en kolonne af DIAION HP-20 (2 liter).

Kolonnen elueredes med vand. Fraktioner indeholdende tallysomycin-er koncentreredes i vakuum og lyofiliseredes til opnåelse af blåt fast stof (824 mg). Tallysomycinerne adskiltes ved kromatografering med 35 CM-SEPHADEX C-25 (200 ml) under anvendelse af vandig ammoniumformiatopløsning som elueringsmiddel. Tallysomycin Sgb elueredes med 2% HCOONH4, Sgg og B med 3% HCOONH4 og endelig A med 5%

DK 151633B

20 HCOONH4 opløsning. Hver fraktion behandledes med aktiveret trækul til afsaltning. Udbytterne af tallysomyciner pi kobber-chelat-form var: A 6I mg, B 31 mg, Sgg 201 mg og Sgb 288 mg.

05 Eksempel 3

Fremstilling af Sga og Sgb

Fermenteringsproceduren fra eksempel 1 gentoges, bortset fra at der som prækursor-amin anvendtes N,N-di(8-hydroxyethyl)-1,3-diaminopropan (HCI salt) i en koncentration pi 0,2% (v/v). Det 10 vundne substrat (10 liter) filtreredes. Tallysomycinkomponenterne i kulturfiltratet adsorberedes pi AMBERLITE IRC-50 (60% NH^+ form, 2,2 liter) og elueredes med foryndet HCI opløsning. Det aktive eluat neutraliseredes og førtes på kolonne af DIAION HP-20 (2 liter), som udvikledes med vand. De bioaktive fraktioner koncentreredes i va-15 kuum til opnåelse 1,16 g rå tallysomyciner. Det faste stof kromato-graferedes på en kolonne med CM-SEPHADEX C-25 (300 ml). Tally-somycin Sgb elueredes først fra kolonnen med 2% HCOONH4, Sga og B med 3% HCOONH^ og endelig A med 5% HCOONH^ opløsning. De hensigtsmæssige fraktioner blev afsaltet ved carbonadsorption. Ud-20 bytterne af tallysomyciner på kobber-chelatform var: A 184 mg, B 171 mg, Sga 63 mg og Sgb 248 mg.

, Eksempel 4

Fremstilling af S1Qa og S1Qb 25 Fermenteringsproceduren fra eksempel 1 gentoges bortset fra, at der som prækursor-amin anvendtes 1,4-diaminobutandihydro-chlorid. Fermenteringssubstratet (35 liter, pH 7,5) centrifugeredes til adskillelse af myceliekagen. Den således opnåede klare supernatant omrørtes med AMBERLITE IRC-50 harpiks (60% ΝΗ^+ form, 6 30 liter) i 30 minutter. Harpiksen vaskedes med to 30 liter portioner vand og elueredes dernæst med tre 10 liter portioner surt vand, idet pH-værdien holdtes under 2,0 under elueringen. Eluaterne forenedes, indstilledes på pH-værdi 7,8 og omrørtes med aktiveret trækul (800 g). Aktiviteten elueredes med en 1:1 blanding af n-35 butanol og surt vand (5 liter af hver, pH 2,0), og elueringen gentoges tre gange. De vandige lag forenedes, neutraliseredes med

DK 151633B

21 AMBERLITE IR-45 (OH-form) og koncentreredes i vakuum til 300 ml. Koncentratet førtes på en kolonne af DIAION HP-20 (3 liter), som udvikledes med vand. Eluatet bestemtes ved bioanalyse, og de bioaktive fraktioner koncentreredes til opnåelse af en blanding af 05 tallysomyciner som et blåt fast stof (6 g). Det faste stof kro-matograferedes på en kolonne af CM-SEPHADEX C-25 (300 ml), som forvasket med 1% HCOONH^ opløsning. Kolonnen udvikledes med stigende koncentrationer (1% ~ 3%) vandigt ammoniumformiatopløsning.

De første bioaktive fraktioner elueret med 3% HCOONH^ forenedes 10 (250 ml) og omrørtes med 30 g aktiveret trækul. Carbonen adskiltes, vaskedes med vand og elueredes to gange med en 1:1 blanding af n-butanol og surt vand (120 ml hver). De vandige eluater neutraliseredes med AMBERLITE IR-45 (OH-form) harpiks og inddampedes dernæst til opnåelse af et halvrent præparat af tallysomycin 15 (1,60 g). Prøven kromatograferedes igen på en kolonne af +AMBER- LITE XT-2 (240 ml), som udvikledes med vand. De bioaktive eluater forenedes, koncentreredes og lyofiliseredes til opnåelse af ren kobber-cheleret tallysomycin S.^ (1,25 g). Tallysomycin S^a og B elueredes med held ud fra CM-SEPHADEX kolonnen med 3% HCOONH^ 20 opløsning til opnåelse af kobber-chelerede tallysomycin S.^ (360 mg) og tallysomycin B (370 mg). En spormængde af tallysomycin A opnåedes fra 5% HCOONH^ eluat.

Eksempel 5 25 Ved anvendelse af i det væsentlige den i eksempel 1-4 be skrevne fremgangsmåde fremstilledes følgende semibiosyntetiske tal-lysomycinderivater ved amin-fødet fermentering: 30 % basisk anion-udskifter harpiks, der fås fra Rohm & Haas Co.,

USA

+ makroporøs, ikke-ionisk styren-divinylbenzen copolymeradsorp-tionsharpiks, finpartiklet, der fås fra Rohm % Haas Co., USA.

•35

DK 151633 B

22

Tallysomycin- Aminhydrohlorid Volumen af fer- Udbytte derivat- prækursor menterings- (mg) produkt forbindelse substrat (liter) 05 S- 1,3-diaminpropan 6,7 spor 13 S 11 11 70 ®ib S3b 1,2-diaminoethan 1,9 6 S., 1,3-diamino-2- 4b 10 hydroxy propan 8,5 17 S5b N-(p-hydroxypropyl)- 1,2-diaminoethan 5 32 S7b N,N-dimethyl-1,3- -diaminopropan 10 96 15 Sgb N-(p-hydroxyethyl)- -1,2-diaminoethan 10 286 N-methyl-1,3-i la diaminopropan 3,2 43 S11 b 20 ^12b N-(3-aminopropyl)- morpholin 2,2 94 S13b N-(3-aminopropyl)- 2-pipecolin 10 137 N-(l'-phenylethyl)- 25 1,3-diaminopropan 4 20 S " " 210 &14b

Eksempel 6

De kobberfri tailysomyciner svarende til de i eksemplerne 1-5 30 fremstillede derivater pi kobberchelatform kan opnås ved behandling med HgS i methanol i henhold til fremgangsmåden ifølge eksempel 1 til USA patentskrift 3.646.197.

De fysisk-kemiske egenskaber af de i eksemplerne 1-5 fremstillede tallysomycinderivater er vist i nedenstående tabel.

35

DK 151633B

23

Fysisk-kemiske egenskaber af nye tallysomycinderivater TCL (Rf)** HPLC++

Tallysomycin S-102 S-123 (retentionstid) 05 S1a 0,50 0,23 6'24" S1fc) 0,65 0,37 4'48" S2g 0,24 0,15 6'30" S2b 0,38 0,34 5Ί8" 10 S3b 0,59 0,51 4'47" S„. 0,66 0,40 4'47" S5fc) 0,50 0,58 4'54"

Sga 0,42 0,22 6Ί8" S6fc) 0,50 0,40 4‘42" 15 S?b 0,44 0,25 4'54"

Sga 0,56 0,40 6'24"

Sgb 0,70 0,54 4'48"

Sgb 0,56 0,48 4'52" S1Qa 0,43 0,24 6*20" 20 S1Qb 0,61 0,39 4‘47" S11a 0,26 0,16 S11fc) 0,49 0,35 4'47" S12b 0,49 0,60 4'47" S13b 0,46 0,36 5,37" 25 SUa 0,52 0,37 SUb 0,62 0,50 7Ό5" 30 35

DK 151633 B

24

Fysisk-kemiske egenskaber af nye tal I ysomyci nderivater H2O Analyse fundet

Tallysomycin λ. -,vnrn (E1-6^ C Η N

05 - -- - - S1a 242(126), 292(102) S1b 242(108), 290(94) 39,54 5,45 15,01 S2a 240(120), 290(108) 10 S2b 244,5(129) 292(104) 38,51 5,51 14,30 S3b 240(123), 291(112) S4b 242(120), 290(103) S5b 244(124), 290(102) 40,17 6,05 15,02

Sga 243(105), 291(83) 39,73 6,39 15,35 15 S6b 243(128), 291(103) 39,81 6,00 15,21 S?b 245(120), 290(96) 40,89 6,04 14,51

Sga 243(107), 191(85)

Sgb 243(114), 290(92) 40,73 6,18 14,79

Sgb 243(104), 290(87) 39,80 5,97 15,42 20 S1Qa 244(142), 292(112) 39,76 5,94 15,38 S1Qb 244(141), 292(116) 38,81 5,85 14,74

Slla 244(62), 292(53) S11b 244(112), 292(91) 40,16 5,48 15,04 S12b 245(74), 292(59) 34,98 5,09 13,04 25 S13b 243(142), 292(114) 39,14 5,85 13,63 S14g 243(102), 292(72) S14b 243(143), 292(109) 1 35

DK 151633B

25 ** TLC system S-102 anvender Kiesel gel gøp254 (Merck) plade og opløsningsmiddelsystem af methanol:vandig 10% ammoniumacetat (1:1 v/v); TLC system S-123 anvender Kisel gel 6OF254 (Merck) plade og opløsningsmiddelsystem af methanol: 10% ammoniumacetat: 05 10% ammoniumhydroxid (10:9:1 v/v).

Påvisning foretoges med dual-bølgelængde TLC scanner Schi-madzu GS-910) ved 290 nm.

++ Apparat: Waters Associates model ALC 204 med en U6K type 10 injektor.

Kolonne: Waters Associates pBondapak C18 (4 x 300 mm) forvasket med 0,5% EDTA-opløsning.

Mobil fase: CHgCISkHgO (3:7 v/v) indeholdende Waters Associates reagens PI C B-7.

15 Detektor: Model 440 uv detektor ved 254 nm.

p

Strømningshastigheder: 1,0 ml/min (tryk 56 kp/cm )

Injiceret prøvestørrelse: 1 μΙ 2 mg/ml opløsning.

20 25 1 35

Claims (3)

1. Analogifremgangsmide til fremstilling af tallysomycin B derivater betegnet S^, S2b ....... S14b med formlen 05 CO-NH, NH2 0 I hh^VMi. ' „ S „ λ 8 o t-jy Han'VS*0 o

10 HlC I oh >£? Ί& OH I ^ 0H HO X 0"^NH2 hvori R betegner: 20 -NH-(CH2)3-NH2 for S1fc) -NH-(CH2)3-S+(CH3)2 for S2b -NH-(CH2)2-NH2 for S3b -nh-ch2-choh-ch2-nh2 for s4b 25 -NH-(CH2)2-NH-CH2-CHOH-CH3 for S5b -NH-(CH2)3-NH-CH2-CH2OH for Sgb -NH-(CH2)3-N(CH3)2 for S?b -NH-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2 for Sgb -NH-(CH2)2-NH-CH2-CH2OH for Sgb 30 -NH-(CH2)4-NH2 for S1Qb -NH-(CH2)3-NH-CH3 for S11b -NH-(CH2)3-N^jO for S12b -NH-(CH2)3-h/~y for S13b eller 35 CHg _ -NH-(CH2)3-NH-CHCH3-^^ for S14b DK 151633B samt, såfremt R har den for S1b, S2fa, Sgb, Sgb, S.^, S^b og S^b angivne betydning, yderligere tallysomycin A derivater beteg-net tallysomycin S1a, S2a, S^, S^, S1Qa, S11a og S14a med form-len 05 CO-NHj NH2 0 0 n-_C-NH-(CH9)--CH-CH9-C-R ✓C O II I C i \ c. ΓΑ H S CH-CH^T^^ NH2 HtN'VS*0 0 HY^r"'T^'N/i Is HeC HN JL_ O I H OH 10 HCT*CH3 j ho^7^ Jih2c7^o7^ fid. v £7 OH I °H U0-^-OH 15 y-T^OH HO X n^NH2 hvori R betegner: 20 -NH-(CH2)3-NH2 for S1g -NH-(CH2)3-S+(CH3)2 for S2a -NH-(CH2)3-NH-CH2-CH2OH for SQa -NH-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2 for Sga 25 -NH-(CH2)4-NH2 for S1Qa -NH-(CH2)3-NH-CH3 for S11a eller -NH-(CH2)3-NH-CH-CHCH3->y^> for S14g 30 eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf, KENDETEGNET ved, AT man dyrker en tallysomycinproducerende stamme af Streptoalloteichus hindustanus i et vandigt næringsmedium i nærværelse af en amin-prækursor med formlen 35 1) NH2-(CH2)3-NH2

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT der som tallysomycinproducerende stamme anvendes Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31158 eller en mutant deraf.

2. NH2-(CH2)3-S®(CH3)2 C\& DK 151-633 B

3. NH2-(CH2)2-NH2 4. nh2-ch2-choh-ch2-nh2

5. NH2-(CH2)2-NH-CH2-CHOH-CH3

6. NH2-(CH2)3-NH-CH2-CH2OH 05 7) NH2-(CH2)3-N(CH3)2

8. NH2-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2

9. NH2-(CH2)2-NH-CH2-CH2OH

10. NH2-(CH2)4-NH2

11. NH0-(CH0)_-NH-CH0 2 2 3 3 10 12) NH^CH^-N^JD

13. NH2-(CH2)3-N^) CHg 14. nh2-(ch2)3-nh-chch3 O 15 eller et uorganisk syreadditionssalt deraf, hvorpå det dannede tal-lysomycin B derivat eller, såfremt aminprækursoren har formlen 1, 2, 6, 8, 10, 11 eller 14, det dannede tallysomycin B derivat og/ eller det dannede tallysomycin A derivat, udvindes fra dyrknings-20 mediet, om ønsket i form af et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT der som amin-prækursor anvendes 1,4-diaminobutan eller et uorganisk syreadditionssalt deraf, og at det udvundne tallysomycin-derivat er tallysomycin S10b med formlen 30 35 DK 151633 B CO-NH2 nh2 O Ihn^VNH2 Ν-η- C-NH-(CH2)4-NH2 Λ 0 H o «.av οΎνγνπ; sJ 05 v γΑ,,°„ΛΗ3Η I 0H H0—^ J iTj! 7$do V år{ OH [ HzN io V°^V0H V'T'A.-OH HO X 0"^NH2 15 20 25 30 35