FI67876C - Foerfarande foer framstaellning av antimikrobiellt och antitumoert verkande derivat av tallysomycin a och tallysomycin b - Google Patents

Description

|·α£^·Ί FBI tt«KUULUTUSJULKAISU s n an s

l J (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT O/O/O

C (45) Patentti myönnetty 10 C6 1935-Patent oeddelat (51) Kv.lk.4/lnt.Ci.* C 12 P 19/58, C 07 H 15/26 SUOMI —FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansökning 802198 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 09.07.80 {Fh * * (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 09.07.80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig ] Q] g-|

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksi panon ja kuul.julkaisun pvm.- _

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 28.02.85 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prioritet 13.07-79 USA(US) 057528 Toteennäytetty-Styrkt (71) Bristol-Myers Company, 3^5 Park Avenue, New York, New York 10022, USA(US) (72) Takeo Miyaki, Yokohama, Osamu Tenmyo, Yokohama, Masataka Konishi,

Yokohama, Hiroshi Kawaguchi, Tokyo, Japani-Japan(JP) (7*0 Oy Kolster Ab

(5^) Menetelmä antimikrobisesti ja kasvainten vastaisesti vaikuttavien tailysomysiini A;n ja tailysomysiini B:n johdannaisten valmistamiseksi - Förfarande för framställning av antimikrobiel1t och anti-tumört verkande der ivat av tallysomycin A och tallysomycin B

Tämä keksintö koskee uusien semibiosynteettisten tallysomysii-nijohdannaisten valmistusta, joilla on edullisia antimikrobisia ja kasvaintenvastaisia ominaisuuksia.

Vaikka tunnetaankin joukko glykopeptidiantibiootteja, joista joillakin on estovaikutusta imettäväisten kasvainten kasvuun, niin kuitenkin on olemassa edelleen tarve kehittää uusia antimikrobisia ja kasvaintenvastaisia aineita. Erityisen tarpeellisia ovat kas-vaintenvastaiset aineet, joilla on parantunut aktiviteetti ja/tai laajempi vaikutusspektri kuin nykyisin tunnetuilla aineilla ja lisäksi vähemmän ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Seuraavassa esitetään lyhyt katsaus tärkeimpiin glykopeptidiantibiootteihin.

Bleomysiinit ovat vesiliukoisia glykopeptidejä, joita tuotetaan fermentoimalla lajia Streptomyces verticillus. Ne on ensimmäisenä kuvanneet Umezawa et ai., J. Antibiotics 19A:200 (1966), ks. myös US-patentti 3 681 491. Bleomysiinikompleksi on erotettu useaksi 2 67876 komponentiksi, joita ovat A^, A^, A,. ja B^. Bleomysiinikompleksia markkinoidaan käytettäväksi erilaisia ihmisen neoplasmoja vastaan, joita ovat mm. levyepiteelisolusarkooma, lymfosarkooma, retikkeli-solusarkooma, kivessarkooma ja Hodgkin'in tauti. H. Umezawa et ai., J. Antibiotics 31: 80-1-804 (1978), ovat julkaisseet bleomysiinien korjatun rakenteen.

Fleomysiiniantibioottiryhmän, joita antibiootteja saadaan fermentoimalla toista Streptomyces verticillus-kantaa, ovat esittäneet Maeda et ai., J. Antibiotics, voi. A9, 82-85 (1956); voi. A12, 111 (1959); voi. A12, 285-289 (1959); voi. A17, 194-199 (1964).

Kuten bleomysiinikompleksi myös fleomysiini on jaettu useaksi komponentiksi, jotka voivat esiintyä sekä kuparivapaina että kupari-kelatoituina muotoina.

Zorbamysiini ja sen lähisukuiset antibiootit zorbonomysiini B ja C on esitetty julkaisussa J. Antibiotics 24(8): 543-557 (1971) ja GB-patenttijulkaisussa 1 277 150. Nämä antibiootit, jotka on eristetty Streptomyces bikiniensis var. zorbonensis-viljelmistä, ovat lähisukuisia bleomysiini- ja fleomysiiniantibiooteille.

Eräs fleomysiini-bleomysiiniryhrnään kuuluva antibioottiryhmä on eristetty Streptomyces himidus-viljelmästä, ja sille on annettu nimitys YA-56. YA-56 kompleksi ja sen aktiiviset komponentit YA-56X ja YA-56Y on kuvattu julkaisussa J. Antibiotics 24(10): 727-731 (1971) ja J. Antibiotics 26 : 77-83 (1973) .

Antibioottikompleksi XK 49 ja sen pääkomponentti viktomysiini (nimitetään myös XK 49-1-B-2:ksi) on esitetty julkaisussa J. Antibiotics 28: 358-371 (1975). Viktomysiini eristettiin sporangeja muodostavasta aktinomykeetista Streptosporangium violaceochromogenes MK 49, ja se näyttää olevan samankaltainen bleomysiinien ja zoebonomysiini B:n kanssa.

Glykopeptidiantibioottikompleksi Bu-2231 ja sen komponentit Bu-2231 A ja B (tästä lähtien niistä käytetään nimityksiä tallyso-mysiini ja tallysomysiini A ja B) on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 051 237, ks. myös J. Antibiotics, voi. 30, 779-805 (1977) ja voi. 31, 667-674 (1978). Tallysomysiinit eristettiin tiettyjen Strepto-alloteichus hindustanus kantojen fermentointiliemestä, ja niillä on osoitettu olevan vahvaa antimikrobista ja kasvaintenvastaista aktiviteettia .

Il 67876 US-patenteissa 3 984 390 ja 3 846 400 on esitetty erilaisten fleomysiinin ja bleomysiinin semibiosynteettisten johdannaisten valmistus fermentoimalla prekursorien läsnäollessa. Tässä menetelmässä mikro-organismeja, jotka pystyvät tuottamaan fleomysiiniä tai bleomysiiniä, viljellään fermentointiväliaineessa amiiniprekursorin läsnäollessa, jolloin saadaan uusia fleomysiini- tai bleomy-siinijohdannaisia, joiden sivuketjussa on lisätyn amiinin rakenne. GB-hakemusjulkaisussa 2 001 962 A on esitetty 3-/”(S)-1 '-fenyyli-etyyliamino/propyyliaminobleomysiinin (pepleomysiini) valmistus, joka bleomysiinijohdannainen on erityisen edullinen semibiosyn-teettinen bleomysiinijohdannainen, koska sille on ominaista vahva kasvaintenvastainen aktiviteetti ja samalla vähäinen keuhkomyrky1-lisyys.

Tämän keksinnön kohteena on täten menetelmä uusien semibio-synteettisten tallysomysiinijohdannaisten valmistamiseksi. Näitä ovat tallysomysiini A:n johdannaiset, joilla on kaava: 0 0

C0-nh2 NH2 il H

I hn_A/NH2 c-nh-(ch2)3-ch-ch2-c-r N^N 0 n n—NH? NN ., 0 11 I 5 i

Η,Ν T Γ 0 1 ” T H (1H

V γΛ»Λ,Η o

IKL 0 H ferV

Γ H,N OH

OH

HO X

0"vnh2 Ia jossa R on -NK-(CH2)3-NH2 -nh-(ch2)3-s®(ch3)2 -nh-(ch2)3-nh-ch2-ch2oh -nh-(ch2)3-n(ch2ch2oh)2 -NH-{CH2)4-NH2 -NH-(CH2)3-NH-CH3

tai .NH.(CH2)3-NH-CHhQ

ch3 4 67876 ja tallysomysiini B:n johdannaiset, joilla on kaava: CO-NH2 NHj 0

A 0 0 *,-AJ

H3C hn » I 0 1 H OH

HC; CH3 Q

>£v

OH I H*N 0H

y-'-'v-^-oH

ho x 0'vnh2 Ib jossa R on: -NH-(CH2)3-NH2 -nh-(ch2)3-s®(ch3)2 -nh-(ch2)2-nh2 -nh-ch2-ch-ch2-nh2

OH

-nh-(ch2)2-nh-ch2-(jh-ch3

OH

-NH-(CH2)3-NH-CH2-CH20H

-NH-(CH2)3’N(CH3)2 -NH-(CH2)3-N(CH2CH2OH)2

-NH-(CH2)2-NH-CH2-CH2OH

-NH-(CH2)4-NH2 -NH-(CH2)3-NH-CH3 -ΝΗ-ίΟΗ,ϊ,-Ν^Ο 2 1 \_f -NH-(CH2)3-rQ tai CH3

-nh-(ch2)3-nh-ch^Q

K

5 67876 sekä näiden johdannaisten farmaseuttisesti hyväksyttävät happoaddi-tiosuolat. Edellä mainitut yhdisteet voivat olla kuparikelaatteina tai kuparivapaina muotoina.

Erityisen edullinen keksinnön mukainen yhdiste on tallysomy-siini B:n johdannainen, jolla on kaava: C0-NH2 nh2 0

Chx n ! H—jt-C-NH-(CH2)4-NH2 xl H S CH-CH-O^

H>c hYn^h!°hAhj 0 0H

? 1* jj tallysomysiini S,n, I I h2n oh OH 2 U.Q---^·0Η HO J? o-^nh2

Alustavat koe-eläimillä suoritetut tutkimukset osoittavat, että tallysomysiini S10tj:llä (sekä kuparivapaana että kuparikelatoi-tuna ja farmaseuttisesti hyväksyttävinä suoloina) on erittäin vahva laajaspektrinen kasvaintenvastainen aktiviteetti monia pahanlaatuisia kasvaimia vastaan ja samalla huomattavasti vähäisemmät ei-toivotut sivuvaikutukset (esim. munuaismyrkyllisyys) kuin ilman prekursoria saaduilla tallysomysiini A:11a ja B:llä.

US-patenttissa 4 051 237 on kuvattu kahden uuden glykopepti-diantibiootin valmistus ja eristäminen, joille antibiooteille annettiin nimet Bu-2231 A ja B. Myöhemmät tutkimukset osoittivat, että Bu-2231 A:11a ja B:llä (joista nykyisin käytetään nimityksiä tallysomysiini A ja B) on seuraavat rakennekaavat: 67876 6 ί0-^ Γ2 νη, 8 8

Lhn-^'V'""2 n__C-NH-(CH, ).-ch-ch7-c-nh X 0 o «,vv nh2 <X 3

«.n-Vv» «VYVirTt'H

v γΛίΛί I (ch2)4 » Ani

v‘0'^-^’0H tallysomysiini A

ho R

0"xNH2 C0-NH2 NH2 o

Chn-^VNH2 N-rC-NH(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2 X 0 „ 0 ilHT^ •'^ΧΤΧΓΓ2 "^£v izt Γ i h2n oh

OH I

tallysomysiini B

y-'-'X^OH

HO A

0- NH2

Edellä mainitut tallysomysiinit ovat tallysomysiiniä tuottavan kannan Streptoalloteichus hindustanus viljelyssä saadut pääasialliset komponentit, ja niiden eristäminen voidaan suorittaa tavanomaisin kromarografiamenetelmin.

Nyt on havaittu, että keksinnön mukaisesti suorittamalla US-patentin 4 051 237 mukainen fermentointiprosessi tiettyjen amiini-prekursorien läsnäollessa saadaan uusia tallysomysiini A:n ja B:n 67876 7 johdannaisia, joilla on arvokkaita antimikrobisia ja kasvainten-vastaisia ominaisuuksia.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä noudatetaan US-patenttien 3 984 390 ja 3 846 400 yleisesti esittämää amiiniprekursoria käyttävää fermentointimenetelmää. Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä amiiniyhdistettä lisätään US-patenttijulkaisun 4 051 237 esittämään tallysomysiini-fermentointiliemeen, jolloin se fermentoinnin kuluessa liittyy tallysomysiini A:n ja/tai B:n pääteasemassa olevan amiiniryhmään, jolloin saadaan uusia semibio-synteettisiä johdannaisia, joissa on amiinipäätteinen sivuketju, joka vastaa prekursoriamiinia. Näin saatujen johdannaisten eristäminen ja puhdistaminen voidaan suorittaa tavanomaisin kromatografia-menetelmin, joita on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 051 237. Seu-raavassa esitetään menetelmän yksityiskohtaisempi kuvaus ja sitä valaisevia esimerkkejä.

Esillä olevan keksinnön menetelmä suoritetaan viljelmällä vesipitoisessa viljelyväliaineessa tallysomysiiniä tuottavaa Streptoalloteichus hindustanus-kantaa (joka on kuvattu US-patentti-julkaisussa 4 051 237), edullisesti kantaa Streptoalloteichus hindustanus E 465-94, ATCC 31158. Viljelyväliaine sisältää assimiloituvaa hiilen lähdettä (esim. glukoosi, riboosi, galak-toosi, fruktoosi, mannoosi, sakkaroosi, laktoosi, liukoinen tärkkelys tai glyseroli) ja assimiloituvaa typen lähdettä (esim. kala-jauho, soijapapujauho, puuvillasiemenjauho, maissinliuotusliemi, peptonit, lihauute, maapähkinäjauhe, hiivauute tai ammoniumsuolat), ja tarvittaessa epäorgaanisia suoloja, kuten natriumkloridia, kalium-kloridia, magnesiumsulfaattia, kalsiumkarbonaattia, fosfaatteja jne. Haluttaessa lisätään hivenaineita, kuten kuparia, mangaania, rautaa, sinkkiä jne, tai niitä tulee viljelyliemeen muiden aineosien epäpuhtauksina.

Edellä kuvattujen, tavanomaisten viljelyväliaineen aineosien lisäksi väliaineeseen lisätään seuraavassa määriteltyä prekursori-amiiniyhdistettä vapaana emäksenä tai happoadditiosuolana. Prekursori-amiiniyhdistettä käytetään yleensä neutraloidun vesiliuoksen muodossa. Seuraavassa on lueteltu esillä olevassa keksinnössä käytettäviksi sopivat prekursoriamiiniyhdisteet sekä vastaavan tallysomysiini johdannaisen koodinimi: 8 67876

Kemiallinen nimi Amiini Rakenne Tallysomysiini- lopputuote x 1.2- diaminoetaani NH^-(CH2)2~^^2 S 3b 1.3- diaminopropaani N^-(CH^)3^^2 ^la’ ^lb 1.4- diaminobutaani NH2-()4^^2 ^10a’ ^ 1 Ob 1,3-diamino-2-hydroksi- NH -CH9-(JH-CH9-NH9 S,, propaani 2 2 | d d

OH

N- ( (b -hydroksietyyli) - 1.2- diaminoetaani NH^-(CH2) CH2-CH2OH Sgb N-( (b -hydroksipropyyli)- 1.2- diaminoetaani NH2~(CH2)2-NH-CH2-CH-CH3 S5b

OH

N-metyyli-1,3-di- NH2-(CH2)3-NH-CH3 ^lla’ ^llb aminopropaani N- (fb -hydroksietyyli) - NH?-(CH?)3-NH-CH2-CH20H Sga, Sgb 1.3- diaminopropaani ^ c ^ N- (1 ’-fenyylietyyli) - NH9-(CH9) .-NH-CH-(f=^ S,. , S14b 1.3- diaminopropaani 2 2' 3 1 |4a 140 CH3 Ν,Ν-diraetyyli-l, 3-di- NH2"(CH2)3-N(CH3)2 Syb aminopropaani N,N-di (/¾-hydroksi- NH,-(CH9),-N(CH--CH?OH)? ’ S8b etyyli)-1,3-diaminopro- d d o pääni N- (3-aminopropyyli) - NH9-(CH9 )-,-(/^0 $12b morfoliini d do \—/ N-(3-aminopropyyli)-2- NH2-(CH2)2“^^ / ^13b

pipekoliini CH

3-aminopropyyli-dime- NH9-(CH9)3-S (OH-)- S2a» S2b

tyylisulfoniumkloridi L

67876 9 x) Tallysomysiinijohdannaisille on annettu nimet prekursori-amiiniyhdisteelle annetun numeron mukaan, jolloin tallysomysiini-lopputuotteella on terminaaliamiinin numero ja kirjain a tai b riippuen siitä, onko kyseessä tallysomysiini A:n tai B:n johdannainen. Esimerkiksi tallysomysiini on tallysomysiini B:n johdan nainen, jonka pääteasemassa oleva amiini on 1,4-diaminobutaani.

Vapaina emäksinä tai happoadditiosuoloina, jossa happona on mineraalihappo, kuten HBr tai HC1, käytetyt amiinit lisätään viljelyväliaineeseen edullisesti pitoisuuteen noin 0,05-0,5 % (paino/tilavuus), edullisemmin noin 0,1-0,2 % (paino/tilavuus) fermentoinnin alussa, vaikkakin hyviä tuloksia saadaan myös lisäämällä amiiniliuosta annoksittain fermentoinnin varhaisessa vaiheessa.

Fermentointi suoritetaan noudattaen US-patenttijulkaisussa 4 051 237 kuvattua menetelmää. Inkubaatio voidaan siten suorittaa missä tahansa lämpötilassa, jossa tallysomysiiniä tuottava kanta pystyy kasvamaan, esim. 20-54°C:ssa, edullisesti fermentointi suoritetaan 25-35°C:ssa ja edullisimmin 27-32°C:ssa. Viljelyväliaineen lähtö-pH on edullisesti lähes neutraali, esim. noin 6-7, ja antibiootin tuottaminen kestää yleensä noin 2-10 vrk. Tavallisesti optimituotto saadaan 3-7 vrk:ssa. Suhteellisen pienten määrien tuottamiseen voidaan käyttää ravistuspullo- ja pintaviljelmiä, mutta suuressa mittakaavassa tuotanto tapahtuu edullisesti submersisti aerobisena viljelmänä steriileissä tankeissa. Tankkifermentointia varten tuotetaan mielellään vegetatiivinen ymppi ravintoliemessä ymppäämällä ravintoliemi tuotantoon käytetetyn organismin itiöillä. Kun on saatu nuori vegetatiivinen ymppi, se siirretään aseptisesti fermentointitankkiväliaineeseen. Tankkien ja pullojen ilmastus voidaan suorittaa puhaltamalla ilmaa fermentointiväliaineen lävitse tai pinnalle. Tankkien sekoitukseen voidaan käyttää mekaanisia sekoittimia ja viljelyväliaineeseen voidaan tarvittaessa lisätä vaahdonestoainetta, kuten laardiöljyä.

Halutun tallysomysiini-johdannaisen muodostumista viljely-väliaineessa fermentoinnin kuluessa voidaan seurata paperikiekko-agardiffuusiomenetelmällä, jossa koe-organismina on Mycobacterium smegmatis kanta M6-3.

Kun viljelyliemen antibioottinen teho on saavuttanut optimi- 10 67876 arvonsa (määritetty esim. edellä kuvatulla kokeella), huovasto ja liukenemattomat jäännökset erotetaan fermentointiliemestä tavanomaisin keinoin, kuten suodattamalla tai linkoamalla. Antibiootti-aktiviteetti on suodoksessa, ja se voidaan saada talteen siitä tavanomaisella adsorptiotekniikalla; ks. esim. J. Antibiotics 30 (10) : 779-788 (1977).

Edullisessa suoritusmuodossa suodos ensin adsorboidaan kationirvaihtajahartsille, esimerkiksi sen tyyppiselle hartsille, jota Rohm & Haas Company markkinoi tavaramerkillä Amberlite IRC-50 (NH^+-muoto). Hartsi pestään vedellä, ja tallysomysiinifraktiot eluoidaan vesipitoisella mineraalihapolla, esim. 0,1-n HCl:llä. Eluaattifraktiot, jotka sisältävät antibioottiaktiivisuutta, neutraloidaan vesipitoisella ammoniakilla ja edullisesti niitä käsitellään aktiivihiilellä. Hiili suodatetaan pois, pestään vedellä ja eluoidaan sitten vesipitoisella butanolilla (butanoli:laimea HC1, 1:1 tilav./tilav.) happamessa pH:ssa (esim. pH 2). Eluentin vesi-kerros neutraloidaan emäksisellä anionivaihtajahartsilla ja konsentroidaan tyhjössä. IRC-50:stä saatu (hiiliadsorptiovaihe voidaan jättää suorittamatta) tai aktivoidusta hiilestä saatu konsentroitu eluaatti liuotetaan sitten veteen, liuos adsorboidaan Diaion HP-20 hartsille (tavaramerkki, makrohuokoinen, ioniton adsorbenttihartsi, joka koostuu styreeni-divinyylibentseenikopolymeerista, tuottaja: Mitsubishi Chemical Co., Japani) ja eluoidaan vedellä, jolloin saadaan seoksena epäpuhtaita tallysomysiinejä kuparikelaatteina.

Prekursoria käyttävässä fermentoinnissa muodostuneiden haluttujen tallysomysiinijohdannaisten erottaminen ja puhdistaminen voidaan suorittaa adsorboimalla saatu raaka tallysomysiinikompleksi kationiseen ioninvaihtajaan,joka on modifioitu dekstraanijohdannainen, esimerkiksi modifioidulle polysakkaridekstraanille, jota myy Pharmacia Fine Chemicals Inc. tavaramerkillä CM-Sephadex C-25. Tallysomysiini johdannainen tai -johdannaiset eluoidaan vaiheittain vesipitoisella ammoniumformiaattiliuoksella, jonka konsentraatio vaihtelee välillä 1-7 %. Samaa johdannaista sisältävät fraktiot yhdistetään, niistä poistetaan suola aktiivihiiliadsorptiolla (eluointi happopitoisella vesi-butanoliseoksella) ja ne lyofilisoidaan, jolloin saadaan puhdasta tallysomysiinijohdannaista kuparikelaatin muo- 67876 11 dossa. Lisäpuhdistus voidaan haluttaessa suorittaa tavanomaisella kromatografia- ja/tai geelisuodatustekniikalla.

Keksinnön mukaiset tallysomysiinijohdannaiset pystyvät muodostamaan kelaatteja kuparin kanssa samoin kuin tallysomysiini A ja B, ja siten nämä uudet johdannaiset ja niiden happoadditiosuolat voivat olla joko kuparikompleksien muodossa tai kuparivapaina. Kuparivapaita tallysomysiinijohdannaisia voidaan valmistaa vastaavista kuparikompleksimuodoista tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4 051 237 ja GB-hakemusjulkaisussa 2 001 962 kuvatuilla menetelmillä.

Keksinnön mukaiset tallysomysiinijohdannaiset, jotka ovat vapaina emäksinä, voidaan muuttaa tavanomaisin menetelmin farmaseuttisesti hyväksyttäviksi happoadditiosuoloiksi. Esimerkkejä tällaisista suoloista ovat myrkyttömät, orgaanisten ja epäorgaanisten happojen, kuten kloorivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, etikka-hapon, muurahaishapon, steariinihapon, maleiinihapon, bentsoehapon, meripihkahapon ja bromivetyhapon suolat.

Antimikrobinen aktiviteetti

Keksinnön mukaisten semibiosynteettisten tallysomysiinijohdannaisten minimiestoväkevyydet (MIC) määritettiin sieniä ja gram-positiivisia ja gram-negatiivisia sekä happoja kestäviä bakteereja vastaan kaksinkertaisella agarlaimennusmenetelmällä. Bakteereilla käytettiin ravintoagaria ja sienillä Saboraudagaria. Tulokset nähdään seuraavassa taulukossa, jossa vertailuna on myös tallysomysiini A: 11a ja B:llä saadut arvot.

Tallysomysiinijohdannaisten antimikrobinen aktiviteetti 12 67876

Staphylococcus Sareina Bacillus Myco-Tallyso- aurejjs lutea subtil is bacterium mysiini Smith PCI1001 PCI 219 607 A 0,1 0,05 <0,003 0,2 B 0,1» 0,U 0,006 0,2

Sla 0.1» 0,1 <0,003 0,012 S1b 1,6 1,6 <0,05 <0,05 S2a 0,2 0,8 <0,05 <0,05 S2b 1,6 6,3 <0,05 0,2 S3b 0,8 1,6 0,013 0,05 S4b 0,8 3,1 0,006 0,003 S5b 6,3 12,5 0,025 0,2 ς 0,8 1,6 0,03 0,1» oa

Sgb 6,3 12,5 0.02 0,2 S7b 6,3 12.5 0,1 3,1

Sga 0,2 0,1» 0,006 0,1 S8b 0,1» 0,8 0,013 0,1

Sgb 0,1» 0,8 0,013 0,1 S]0a 1,6 O.u 0,01» 0,2 S1Qb 6,3 3,1 0,2 0.2

Slla 0,8 0,2 0,025 0,1 sllb 3,1 0,8 0,1 0,1 S12b 12,5 12,5 O.U 0,2 S13b 6,3 6,3 0,8 0.2 S14a 0,8 0,8 0,1 0,1 S14fc) 3.1 3,1 0.1» 0,2

Tallysomysiinijohdannaisten antimikrobinen aktiviteetti 13 67876

Escherichia Proteus Candida Aspergillus TaTTyso- coli mirabii is albicans fumigatus mysiini NIHJ A9554 IAM 4888 IAM 2593 A ' , 0,05 0,U 12,5 1,6

B

0,2 0,2 6,3 0,8

Sla 0,1 O.U 3,1 0,8

Slb o.U 1,6 12,5 1,6

S2a <0,05 0,2 6,3 o.U

S2b O.U 1,6 25 0,8 S3b 0.1 0.2 12,5 0,8 S4b 0,U O.U 25 0,8

S5b O.U 3,1 25 0,U

Sc 0,U 1,6 6,3 0,2 oa S6b o,U 3,1 25 0,8

S7b 0,U 6,3 >50 0,U

S8a 0,1 0,U 12,5 0,8 s8b 0,2 0,8 >50 1,6 S9b 0,1 0,8 25 1,6 S10a o.U 0,8 3,1 1,6 S10b 0,8 3,1 12,5 6,3 S-j-jg 0,1 0,2 1,6 0,8

Sllb 0,2 1,6 12,5 6,3 S12b 1,6 50 >100 25 S-,3b O.U 12,5 >100 12,5 S]4a 0.2 3,1 50 3,1 S14b 0,U 25 >100 25 14 67876

Tallysomyslinijohdannaisten suhteellinen antibakteerinen teho (tallysomyslini A-standardi = 1Q00 ^ug/mg) määritettiin paperi-kiekko-agar-diffuusiomenetelmällä käyttäen koe-organismina Mycobacterium smegmatis kantaa M6-3. Tulokset nähdään seuraavassa taulukossa.

Tallysomysiinijohdannaisten antibakteerinen teho

Antibakteerinen Tallysomysiini teho (u/mq) Ä 1 000 B 900 sia 1 075 slb 1 000 s2a 350 S2b 300 S3b 725 S4b k°5 S5b 500

e hSO

^6a S 3^0 ^6b C 380 a7b r 550 b8a e 370 ^8b c 380 59b c 1 ^50 HOa ς 1 100 b10b S 570 b11a S U50 *11 b S12b 390 si3b 1 090 S14a sHb 1 390 15 67876

Kasvaintenvastäinen aktiviteetti

Lysogeenisen bakteerin E. coli W17Q9 (X) profaagi-induk-tioaktiviteetti määritettiin Lein'in et ai., Nature 196: 783-784 (1962) esittämällä menetelmällä. Plakkiluku määritettiin koe-yhdistettä (t) sisältävillä agarlevyillä ja kontrollilevyillä (c). Plakkiluvun t/c-suhde yli 3,0 määriteltiin merkitseväksi lysogeenisen induktioaktiviteetin tasoksi (ILB-aktiviteetti), ja se ilmoitettiin koeyhdisteen minimi-indusoivana konsentraationa. Tulokset nähdään seuraavassa taulukossa.

Tailysomysiinijohdannaisten ILB-aktiviteetti 67876 16

Tallysomysiini ILB-aktivi- _ teetti ixg/m 1) A 0,00125 B 0,01 sla °·16 S,b 0,31 S2a 0,31 S2b 0,63 S3b °’31 S4b S5b 0,08 S 0.02 ^6a S6b °’°8 S7b °'°8

So 0,005 ^8a S 0,02 58b s o, 16 *9b s o, 16 noa s o, 31 b10b s]la °·08

Sllb °·63 S12b °'31· S,3b 0.08 S14a °'01

SHb °'oU

9 17 67876

Tallysomysiinijohdannaisten kasvaintenvastaista aktiviteettia tutkittiin hiirillä neljällä eri kasvainsysteemillä. Lym-fosyyttinen leukemia P388 ja Lewis-keuhkokarsinooma intraperitoneaa-lisesti kumpaakin sukupuolta oleviin BDF,-hiiriin, jolloin edellis- 5 , 1 5 tä istutettiin 3 x 10 solua ja jälkimmäistä 5 x 10 solua hiirtä kohti. Sarkooma 180 askiittikasvainsoluja istutettiin intraperito- 16 neaalisesti urospuolisiin dd-kannan hiiriin 2,5 x 10 solua hiirtä kohti. Melanoottista melanoomaa B16 istutettiin subkutaanisesti 5 BDF^-hiiriin 5 x 10 solua hiirtä kohti. 24 tuntia kasvainsolujen istutuksen jälkeen hiirille annettiin intraperitoneaalisesti as-teettain suurenevina annoksina koeyhdisteitä injektiotilavuuden ollessa 0,2 ml/10 g kehon painoa. Koeyhdisteitä annettiin kerran vrkrssa 9 vrk:n ajan (qd 1 9 ohjelma) paitsi hiirille, joihin oli tartutettu Lewis-keuhkokarsinooma, jotka saivat koeyhdisteitä 11 vrk (qd 1 -* 11). Käsiteltyjen ja käsittelemättömien eläinten elossa pysyminen ja kuoleminen merkittiin muistiin päivittäin ajanjaksona 45 vrk kasvainsolujen istutuksesta lähtien, ja kullekin koeryhmälle (T) ja kontrolliryhmälle (C) laskettiin keskimääräinen hengissäpy-symisaika. Vähintään 125 %:n T/C-arvo osoittaa, että koeyhdisteellä on merkitsevää kasvaintenvastaista aktiviteettia leukemia P388:n ja Lewis-keuhkokarsinooman suhteen. Annos, jolle T/C on 125 % arvioitiin lineaarisella regressioanalyysillä, ja sitä merkittiin tehokkaaksi annokseksi 125 eli ED^25* Sarkooma 180:n suhteen käytettiin arvioitua tehokasta annosta 150 · Bl6-melamooma-ko- keessa mitattiin kasvainnaisen koko 16 vrk istutuksen jälkeen, ja 50-%risen kasvaimen kasvun estovaikutuksen aikaansaama annos (IDj.q) laskettiin regressiokäyristä. Koeyhdisteiden kasvaintenvas-täiset aktiviteetit on esitetty seuraavassa taulukossa.

Kasvaintenvastainen aktiviteetti (mg/kg/vrk, ip) 67876 18 P388 SI 80 B16 Lewis-keuhko

TaHysomysllni x (EPlzs) (EDnil) (1Dsa) (£°u5) A (Cu-vapaa) 0,26 0,07 0,27 0,13 B (Cu-vapaa) 0,89 0,06 0,82 0,11

s]a 1,2 0,07 0,8U

S1b 2,0 0,11 0,15 0,12

S2a >3,0 0,07 0,17 0,lU

S2b 0,91 0,12 0,33 0,65 S3b 0,32 0,06 0,20 0,26 S4b >3,0 0,13 0,50

Sc. 0,66 0,10 0,31 0,38 00

Sga 0,70 0,09 0,12 0,1+7 S6b 2,2 0,08 0,22 0,17 S?b 2,1 0,lU 0,16 S8a 0,78

Sgb 1,5 0,25 0,26 0,12 >3,0 0-,1+2 0,29 0,1+1 s1Qa 0,28 o,08 0,39 S10b - °’03 °·59 S1Qb (Cu- vapaa O.hT 0,02 0,?5 0,21 slla °·60

Sllb 0,28 0,20 0,70 0,32 S]2b 1,30 0,06 1,30 S]3b 0,70 0,33 0,23 SKa - 5 14b 3,0 0,08 0,1+3 0,29 x kuparikelatoitu muoto, jollei muuta ilmoiteta 67876 19

Koeyhdisteitä annettiin asteittain suurenevina annoksina intraperitoneaalisesti ryhmälle hiiriä. Injektio annettiin vain kerran tai kerran päivässä yhdeksänä peräkkäisenä päivänä. Eläinten hengissä pysyminen tai kuoleminen merkittiin muistiin 30 vrk viimeisen annoksen jälkeen, ja tuloksista laskettiin yhden tai useamman injektion keskimääräinen kuolettava annos (LD^q). Tulokset nähdään seuraavassa taulukossa.

Tallysomysiinijohdannaisten akuutti ja subakuutti myrkyllisyys LD5Q (mg/kg/vrk. ip)

Tallysomysiini x yksi annos Useampi annoa(qd 1 A (Cu- vapaa) ig ^ ,U

B (Cu- vapaa) i+6

Sla 25

5lb W

S2a « S2b 32 2,0 S3b 19 S4b 13

s5b « M

s6a 15 S6b 30 S 7 b 30 3 8a k2 S8b 30 S9b 32 S10a 21 S10b 23

S,Ob (Cu- vapaa) u2 k.O

67876 20 LD50 (rcg/kg/ vrk,ip)

Tallysomy siini x Yksl_annQs η^^·,· annns (qd 1 -» 9) S11 a 18 S11b 21 s12b >5° S13b 35 s14a S14b - 16 x kuparikelatoitu muoto, jollei muuta ilmoiteta

Kunkin johdannaisen kasvaintenvastainen terapeuttinen indeksi laskettiin myrkyllisyyden ja kasvaintenvastaisen aktiviteetin suhteesta. Kuten seuraavasta taulukosta voidaan todeta, monilla uusista semibiosynteettisistä tallysomysiinijohdannaisista on joissakin kasvainkoesysteemeissä parempi terapeuttinen indeksi kuin ilman prekursoria saaduilla tallysomysiini A:lla ja B:llä.

Tallysomysiinijohdannaisten kasvaintenvastainen terapeuttinen indeksi

Kasvaintenvastainen terapeuttinen indeksi xx

Tallysomysiini χ £388 SI 80 B16 . Lewis-keuhko A (Cu-vapaa) 73 271 ^ 3-46 B (Cu-vapaa) 52 767 5o 4i8 1 21 357 30 I 8 $lb 10 173 127 158 S2a <8 357 147 179 S2b 35 267 97 49 S3b 59 317 95 73 S4b <1 190 26

XX

67876 21

Kasvaintenvastainen terapeuttinen indeksi

Tai 1 ysomy siini x SI80 B16_ Lewis -keuhko

Sr, 70 U60 1U8 121 5b S6a 21 167 125 32 S-, 1*4 375 136 176 6b ς iL 21U 188 /b S8a 5t s 20 120 115 250 8b c <11 76 110 78 ^9b S10ä 96 338 69 s,ob - 900 U6 S10b (Cu-vapaa) 89 2100 50 200 ς 30 Ί13 S 75 105 30 66 I ib S,0. >38 >833 >38 1 Zb S 50 106 152 13b S14a S14b x kuparikelatoitu muoto, jollei muuta ilmoiteta xx yhden annoksen myrkyllisuus (LD^q)/kas vain tenvas-taisesti tehokas annos (EDi25 EI>150 tai ID50^ 22 67876

Tallysomysiini S]_Qb:n munuaismyrkyllisuus tutkittiin hiirillä käyttäen BUN-mittausta loppupisteenä sekä keuhkomyrkylli-syys käyttäen keuhko-hydroksiproliini-mallia (ks. Cancer Res.

35:787 (1978). Tallysomysiini siQb:n munuaismyrkyllisyys ei ekvi-toksisina annoksina ollut suurempi kuin bleomysiinin. Tallysomysiini aiheutti keuhkojen hydroksiproliinin lisääntymistä, mikä viittaa keuhkomyrky11isyyteen. Annosvastekäyrä oli kuitenkin loivempi kuin bleomysiinillä, ja suurilla annoksilla koe-eläinten hydroksiproliinimäärä oli pienempi kuin eläimillä, joita käsiteltiin ekvitoksisilla bleomysiiniannoksi11a.

Kuten edellä olevista koetuloksista voidaan päätellä, niin keksinnön mukaiset tallysomysiinijohdannaiset ovat käyttökelpoisia antimikrobisia aineita, jotka estävät sellaisten mikro-organismien sekä bakteerien että sienien kasvua, jotka ovat patogeenisiä eläimille ja kasveille. Niitä voidaan myös käyttää imettäväisten kasvainten kasvun estämiseen. Yhdisteitä voidaan antaa lääkkeeksi samalla tavalla kuin kaupallisesti saatavissa olevaa bleomysiiniä, ja optimiannostuksen kussakin tapauksessa voi alan asiantuntija määrätä käyttäen tavanomaisia annoksen määrittämiseen käytettyjä kokeita ja edelle esitettyjä koetuloksia.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

67876 23

Esimerkki 1 - Sn ja S~, - 2a J 2b

Mallasagarvinoviljelmä ympättiin Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31158 - kannalla, ja viljelmää inkuboitiin viikon ajan 28°C:ssa. Vinoviljelmällä ympättiin 100 ml 500 ml:n erlen-meyerissä olevaa siemenviljelyväliainetta, jolla oli seuraava koostumus: glukoosi 1,5 % hiivauute 0,2 polypeptoni 0,5 K2HP04 0,05

MgS04.7H20 0,05

CaC03 0,5

Ennen viljelyväliaineen sterilointia sen pH säädettiin arvoon 7,2. Siemenviljelmiä inkuboitiin 33°C:ssa 48 tuntia kierto-ravistimessa (230 r/min). Saatua siemenviljelmää siirrettiin 100 ml:aan 500 ml:n erlenmeyrissä olevaa fermentointiväliainetta käyttäen 10 % (tilav./tilav.) ymppiä. Fermentointiväliaineella oli seuraava koostumus: sakkaroosi 2,5 % glukoosi 0,5 "Pharmamedia" 3,0 (puuvillasiemenjauhe) 3,0 liukeneva tislaamo-jäte 3,0 (NH4)2S04 0,3

ZnS04.7H20 0,003

CuS04-5H20 0,01

CaC03 0,4

Ennen fermentointiväliaineen sterilointia siihen lisättiin 0,1 % (paino/tilav.) neutraloitua 3-aminopropyylidimetyylisulfonium-kloridin hydrokloridisuolan vesiliuosta. Ennen sterilointia pH säädettiin arvoon 7,0. Ympättyjä fermentointipulloja inkuboitiin 28°C:ssa 5 vrk kiertoravistimessa (250 r/min). Fermentaation edistymistä seurattiin paperikiekkoagardiffuusiokokeella käyttäen koe-organismina M. smegmatis kantaa M6-3.

67876 24

Tallysomysiini S2a - ja S21;)-pitoiseen fermentointiliemeen sekoitettiin suodatusapuainetta ja suodosta ( 20 1) sekoitettiin Amberlite IRC-50:n (60 % NH^+ -muodossa, 3,5 1) kanssa. Hartsi pestiin vedellä, ja sitten aktiivinen aine eluoitiin 0,2-n HCl:llä (3x4 1). Eluaatin pH säädettiin arvoon 6,0, ja eluaattia sekoitettiin aktiivihiilen (400 g) kanssa. Aktiivihiileen adsorboituneet bioaktiiviset komponentit eluoitiin sekoittamalla hiiltä kolme kertaa n-butanolin ja veden seoksen kanssa, jolloin eluoitaessa pH pidettiin arvossa 2,0. Yhdistetty vesipitoinen eluaatti neutraloitiin ja haihdutettiin tyhjössä noin 100 mlrksi, ja saatu konsentraat-ti kromatografoitiin Diaion HP-20-hartsia (1,2 1) sisältävällä kolonnilla. Kolonni kehitettiin vedellä, jolloin saatiin sinisiä tallysomysiinifraktioita. Haihduttamalla sopivat fraktiot saatiin epäpuhdasta tallysomysiiniseosta (4,85 g), joka kromatografoitiin CM-Spehadex C-25-hartsia (330 ml) sisältävässä kolonnissa kasvava-konsentraatioisella ammoniumformiaattiliuoksella. Tallysomysiini ^2b' ^2a -^a B e^uoivat peräkkäin 2-%:isella HCOONH^-liuoksella ja tallysomysiini A eluoitui 4-%:isella HCOONH4-liuoksella. Kustakin antibioottifraktiosta poistettiin suola adsorboimalla aktiivi-hiilelle ja eluoimalla sitten happopitoisella n-butanoli-vesiseok-sella. Lyofilisoimalla vesieluaatit saatiin tallysomysiini S2a:ta (156 mg) ja S^rtä (570 mg) sekä tallysomysiini A: ta (210 mg) ja B:tä (540 mg), jotka kaikki olivat kuparikelaatteina.

Esimerkki 2 - Sc ja S,,

Esimerkin 1 fermentaatio toistettiin käyttämällä kuitenkin prekursoriamiinina N-[A -hydroksietyyli)-1,3-diaminopropaania (HCl-suola). Saatu viljelyliemi (11 1) suodatettiin käyttäen suo-datinapuainetta. Suodoksen antibioottiaktiivisuus adsorboitiin Amberlite IRC-50-hartsille (60 % NH4+-muodossa, 2,4 1) ja eluoitiin hartsilta 0,1-n HCl:llä. Eluaatin pH säädettiin arvoon 6,5, ja eluaatti laskettiin Diaion HP-20-kolonnin lävitse (2 1 hartsia). Kolonni eluoitiin vedellä. Tallysomysiiniä sisältävät fraktiot konsentroitiin tyhjössä ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin sinistä kiinteätä ainetta (824 mg). Tallysomysiinit erotettiin toisistaan kromatografoimalla CM-Sephadex C-25:ä (200 ml) sisältävällä kolonnilla ja eluoimalla 67876 25 ammoniumformiaatin vesiliuoksella. Tallysomysiini Sg^ eluoitui 2- %:isella HCOONH^-liuoksella, Sga ja B eluoituivat 3-%:isella HCOONH^-liuoksella ja lopuksi A 5-%:isella HCOONH^-liuoksella. Kutakin fraktiota käsiteltiin suolan poistamiseksi aktiivihiilellä. Kuparikelatoituja tallysomysiinejä saatiin seuraavasti: A 61 mg, B 31 mg, Sga 201 mg ja Sg^ 288 mg.

Esimerkki 3 - SQa ja Sgb

Esimerkin 1 fermentaatio toistettiin käyttämällä kuitenkin prekursoriamiinina N,N-di(β-hydroksietyyli)-1,3-diaminopropaania (HCl-suola) 0,2 % (paino/tilav.). Saatu viljelyliemi suodatettiin. Viljelysuodoksessa olevat tallysomysiinikomponentit adsorboitiin Amberlite IRC-50-hartsille (60 % NH4+-muodossa, 2,2 1) ja eluoitiin laimealla HCl-liuoksella. Aktiivinen eluaatti neutraloitiin ja vietiin Diaion HP-20 (2 1) sisältävään kolonniin, joka eluoitiin vedellä. Bioaktiiviset fraktiot konsentroitiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,16 g epäpuhtaita tallysomysiinejä. Ne kromatografoitiin CM-Sephadex C-25 (300 ml) sisältävässä kolonnissa. Ensin eluoitui tallysomysiini Sg^ 2-%:isella HCOONH^-liuoksella, sitten Sga ja B

3- %:isella HCOONH4“liuoksella ja lopuksi A 5-%:isella HCOONH^-liuoksella. Kuparikelatoitujen tallysomysiinien saannot olivat: A 184 mg, B 171 mg, Sga 63 mg ja Sg^ 248 mg.

Esimerkki 4 - S^Qa ja

Esimerkin 1 fermentaatio toistettiin käyttämällä kuitenkin prekursoriamiinina 1,4-diaminobutaanidihydrokloridia. Fermentoitu liemi (35 1, pH 7,5) lingottiin huovastokakun erottamiseksi. Saatua kirkasta päällä olevaa nestettä sekoitettiin Amberlite IRC-50 hartsin (60 % NH4+-muodossa, 6 1) kanssa 30 minuuttia. Hartsi pestiin kahdella 30 litran erällä vettä ja eluoitiin sitten kolmella 10 litran annoksella happopitoista vettä, jolloin eluoinnin aikana pH pidettiin arvossa 2,0. Eluaatit yhdistettiin, pH säädettiin arvoon 7,8 ja eluaattiin sekoitettiin aktiivihiiltä (800 g). Aktiivianne eluoitiin n-butanolin ja happopitoisen veden seoksella (5 1 kumpaakin, pH 2,0), ja eluointi toistettiin kolme kertaa. Vesikerrokset yhdistettiin, neutraloitiin Amberlite IR-45 hartsilla 67876 26 (OH-muoto, anioninen ioninvaihtohartsi, jota tuottaa Rohm & Haas Co., USA) ja konsentroitiin tyhjössä 300 mlrksi. Konsentraatti vietiin Diaion HP-20 (2 1) hartsia sisältävään kolonniin, joka kehitettiin vedellä. Eluointia seurattiin biokokeella, ja bioaktiiviset fraktiot konsentroitiin, jolloin saatiin sinisenä kiinteänä aineena (6 g) tallysomysiinien seosta. Kiinteä aine kromatogra-foitiin CM-Sephadex C-25 (300 ml) hartsia sisältävässä kolonnissa, joka oli esikäsitelty l-%:isella HCOONH4-liuoksella. Kolonni eluoitiin kasvavia määriä ammoniumformiaattia (1 % —»3 %) sisältävillä vesiliuoksilla. Ensimmäiset 3-%:isella HCOONH.-liuoksella 4 eluoöut bioaktiiviset fraktiot yhdistettiin (250 ml), ja niitä sekoitettiin aktiivihiilen (30 g) kanssa. Hiili erotettiin, pestiin vedellä ja eluoitiin kahdesti n-butanolin ja happopitoisen veden 1:1 seoksella (120 ml kumpaakin). Vesipitoiset eluaatit neutraloitiin Amberlite IR-45 (OH-muoto)-harsilla ja haihdutettiin sitten kuiviin, jolloin saatiin puolipuhdasta tallysomysiini (1,60 g). Se kromatografoitiin uudelleen Amberlite XT-2 hartsilla (240 ml, tuottaja Rohm & Haas Co., USA. Makrohuokoinen, ioniton styreeni-divinyylibentseenikopolymeeri-adsorptiohartsi, hieno raekoko) käyttäen eluointiin vettä. Bioaktiiviset eluaatit yhdistettiin, konsentroitiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin puhdasta kuparikelatoitua tallysomysiini S^g^ttä (1,25 g). Tallysomysiini S10a 3a B eluoitu;i-vat peräkkäin CM-Sephadex-kolonnista 3-%:isella HCOONH^-liuoksella, jolloin saatiin kuparikelaattina tallysomysiini S10a:ta (360 mg) ja tallysomysiini B:tä (370 mg). Eluoitaessa 5-%:isella HCOONH^-liuoksella saatiin jälkiä tallysomysiini A:sta.

Esimerkki 5

Olennaisesti samalla menetelmällä kuin esimerkeissä 1-4 valmistettiin seuraavat semibiosynteettiset tallysomysiinijohdannaiset käyttämällä amiiniprekursorifermentaatiota.

67876 27

Tallysomysiini- Araiinihydrokloridi- Fermentaatio- Saanto (mg) johdannainen prekursoriyhdiste liemen tila vuus (1) 1,3-diaminopropaani g η jälkiä

Sla 70 blb ς 1,2-diaminoetaani 1,9 6 ^3b ς 1,3-diamino-2-hydroksi- 8,5 17 ^4b propaani c 32

Sr. N- (/3 -hydroksipropyyli) - J

1,2-diaminoetaani S N,N-dimetyyli-l,3-diami- ^ 7t> nopropaani 236 N-(β -hydroksietyyli)-1, 2-diaminoetaani r 3 2 S-|-ja N-metyyli-1,3-diamino- ' propaani

Sllh " 259 11b „ 7 ? 94 S,„. N-(3-aminopropyyli)morfo- 12d liini . 10 <37 ^13)3 N- (3-aminopropyyli) -2- pipekoliini 4 20 ^14a N-(1’-fenyylietyyli)-1,3- diaminopropaani „ S c u H4b

Esimerkki 6 Käsittelemällä esimerkeissä 1-5 saatuja kuparikelatoituja tallysomysiini johdannaisia I^Sillä metanolissa siten kuin LJS-pa-tentin 3 646 197 esimerkissä 1 on kuvattu, saatiin vastaavat kuparivapaat tallysomysiinijohdannaiset.

Esimerkeissä 1-5 valmistettujen tallysomysiinijohdannaisten fysikokemialliset ominaisuudet on esitetty seuraavassa taulukossa.

67876 28

Uusien tallysomysiinijohdannaisten fysikokemialliset ominaisuudet___ TLC HPLC++

Tai 1 ysomysiini S-102 S-123 (Viipymisaika ) S-| 0,50 0,23 6'2h" S-j b 0,65 0,37 U'Ue" S2a 0,2U 0,15 6'30" S25 0,38 0,3U 5'18" s3b 0,59 0,51 fc'U9" S4b 0,66 0,Uo U'l*7" S 0,50 0,58 U'5U" 5b S. 0,U2 0,22 6'18"

Del S., 0,50 0,U0 U'Us" 6b S7b 0,UU 0,25 *4'5^"

Sga 0,56 0,i<0 6'2U"

Sgb 0,70 0,5U U'U8"

Sgb 0,56 0,U8 k'32" S1Qa 0,U3 0,2U 6120" S1Qb 0,6l 0,39 i*'U7" S1]a 0,27 0,16

Sllb 0,^9 0,35 S12b 0,U9 0,60 h’U7" s13b 0,146 0,36 5'37" S14a 0.52 0,37 S14b 0,62 0,50 7-05" 67876 29

Uusien tallysomysiinijohdannaisten fysikokemialliset ominaisuudet __ ,H2°„m ,rl* \ Anal. saatu

Tallysomysiini Xmax C H N

Sla 21*2(126), 292(102) slb 2U2(108), 290(9**) 39,51» 5,1*5 15,01 s2a 2Uo(120), 290(108) s2b 2l»l*.5(129),292(10U) 38,51 5,51 lU.30 S3b 21*0(123), 291(112) S4b 21*2(120), 290(103)

Scu 2UU(12U), 290(102) U0.17 6,05 15,02 5b S6a 21*3(105), 291(83) 39,T3 6,39 15.35 S6b 21*3(128), 291(103) 39,81 6,00 15,21 S7b 21*5(120), 290(96) 1*0,89 6,oU il»,51

Sga 21*3(107), 291(85) s8b 21*3(111*), 290(92) 1*0,73 6,18 li*,79 S9b 21*3(101*), 290(87) 39,80 5,97 15,1*2 S1Qa 2UU(iU2), 292(112) 39.76 5,91* 15,58 S1n. 2l*U(lUi), 292(116) 38,81 5.85 li*.71* lub S]la 2UU(62), 292(53) S]lb 2UI*(112), 292(91) 1*0,16 5,1*8 15.01*

S12b 21*5(71*), 292(59) 31*, 98 5,09 13.0U

Sj3b 2l*3(ll*2), 292(111*) 39,li* 5,85 13,63 S14a 21*3(102), 292(72) S 2l*3(ll*3), 292(109) 4b 67876 30 xx Ohutkerroskromatografiasysteemissä S-102 käytettiin Kieselgel 60F2^^~levyja (Merck) ja liuotinsysteeraiä metanoli : 10-%:inen ammoniumasetaattivesiliuos (1:1 tilav./tilav.); TLC-systeemissä S-123 käytettiin Kieselgel öOF^^^-levyjä (Merck) ja liuotinsysteemiä metanoli: 10-%:inen ammoniumasetaatti:10-%:inen ammoniumhydroksidi (10:9:1 tilav./tilav.). Toteaminen suoritettiin Dual-aaltopituus TLC ilmaisijalla (Shimadzu GS-910) aaltopituudella 290 nm.

++ Laitteisto: Waters Associates Model ALC 204 ja tyyppiä U6K oleva injektori. Kolonni: Waters Associates pBondapak C^g (4 x 300 mm), esipesty 0,5-%:isella EDTA-liuoksella. Liikkuva faasi: CHgCt^I^O (3:7 tilav./tilav.), joka sisälsi Waters Associates reagenssia PIC B-7.

Ilmaisija: Model 440 UV detektori, aaltopituus 254 nm. Virtausnopeus: 1,0 ml/min (paine 5500 kPa). Injektoitu näytekoko: 1 ui liuosta, joka sisälsi 2 mg/ml.

Tätä keksintöä voidaan soveltaa teollisesti.

Claims (3)

67876 31

1. Menetelmä antimikrobisesti ja kasvainten vastaisesti vaikuttavan, kaavan (Ia) mukaisen tallysomysiini A johdannaisen 0 0 CO-NH2 NH2 „ Il Chn^VNH2 n__C-NH-(CH2)3-CH-CH2-C-R n' N ° o fi ij NH2 oHY^rNY^a/ ' H,C HN " I 0 1 H 0H

3 HCf^CHj 0 (la) I i h2n oh OH Υ-'Τ^-οη HO A. 0' NH2 jossa R on -NH-(CH2)3-*^Η2 -nh-(ch2)3-s®(ch3)2 -nh-(ch2)3-nh-ch2-ch2oh -nh-(ch2)3-n(ch2ch2oh)2 -MH-(CH2)4-NH2 -NH-(CH2)3-NH-CH3 tai -nh-(ch2)3-nh-ch-Q ch3 sekä kaavan (Ib) mukaisen tallysomysiini B johdannaisen 67876 32 CO-NH2 NH2 0 Sr Λ'™2 «τί·» rs h o HiN'W o"VrV»/e'i sJ H3C HN " 1 O 1 H OH V^n^WhotN:h3 „ OH | H2N 0H Υ-^Τ^-ΟΗ HO X 0"xNH2 jossa R on -NH-(CH2)3-NH2 -nh-(ch2)3-s0(ch3)2 -nh-(ch2)2-nh2 -NH-CH,-CH-CH,,-NH, l \ li OH -NH-(CH2)2-NH-CH2-(jH-CH3 OH -nh-(ch2)3-nh-ch2-ch2oh -nh-(ch2)3-n(ch3)2 -NH-(CH2)3-N(CH2CH20H)2 -NH-(CH2)2-NH-CH2-CH20H -NH-{CH2)4-NH2 -HH-(CH2)3-NH-CH3 -NH-(CH0)tN/ 'o ά 6 \_/ -NH-(CH2)3-nP tai CH3 -mi- (ch2) 3-nh-ch— ΓΗ 3 33 67876 tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi viljelemällä tallysomysiiniä tuottavaa Strepto-alloteichus hindustanus kantaa vesipitoisessa ravintoväliaineessa, tunnettu siitä että viljely suoritetaan amiiniprekursori-yhdisteen läsnäollessa, jolla on kaava: nh2-(ch2)2-nh2, nh2-{ch2)3-nh2, nh2-(ch2)4-nh2, NH2-CH2-CH-CH2-NH2, OH NH?-(CH2)2-NH-CH2-CH2OH, NH2-(CH2)2-NH-CH2-CH-CH3, OH NH2-(CH2)3-NH-CH3, NH2-(CH2)3-NH-CH2-CH2OH, nh2-(ch2)3-nh-ch^) , ch3 NH2-(CH2)3-N(CH3)2, Nh2~(ch2)3“n(CH2CH20H)2 * NH2-(ch2)3-\3> , s Z"”'v tai NH2-(CH2)3-N)_) C»3 nh2-(ch2)3-s®(ch3)2, Cl0 tai tällaisen prekursoriyhdisteen epäorgaanisen hapon kanssa muodostelman suolan läsnäollessa, kunnes organismi on muodostanut vil-jelyväliaineeseen olennaisen määrän haluttua tallysomysiinijohdannaista, ja haluttu tallysomysiinijohdannainen otetaan talteen vil-jelyväliaineesta olennaisesti puhtaassa muodossa. 67876 34

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että tallysomysiiniä tuottava kanta on Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31158.

3. Patenttivaatimuksen Ί tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amiiniprekursoriyhdiste on 1,4-di-aminobutaani tai sen epäorgaanisen hapon kanssa muodostama suola, ja saatu tallysomysiinijohdannainen on tallysomysiini S10fc), jolla on kaava; CO-NH, NH2 g [ hn^v/nh2 II A s o njC.Nh.(ch2)4.Nh2 H^i'VS50 0 Η<Υ~Υ'Ιγ^Ν-'|Η" HjC γλίλ;! oh >£V Ί& OH I H2N 0H V-o*^Y*OH y^v^-oH HO X 0'vNH2 35 Patentkrav: 6 7 8 7 6