NL8003970A - Tallysomycine-a-derivaat; tallysomycine-b-derivaat; werkwijze voor het bereiden van een tallysomycine- derivaat; farmaceutisch preparaat. - Google Patents

Description

V t j VO 576

Tallysomycine-A-derivaat; tallyscmycine-B-derivaat; werkwijze voor het bereiden van een tallysomycinederivaat; farmaceutisch preparaat.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe reeks semibio-synthetische tallysomycinederivaten welke voordelige antimicrobe en anti-tumoreigenschappen hebben.

Hoewel een aantal glycopeptide antibiotica gevonden zijn, 5 waarvan enkele ook werkzaam zijn bij de inhibitie van de groei van tumoren bij zoogdieren, blijft behoefte bestaan aan andere anti-microbe en anti-tumormicdelen. Een bijzondere behoefte bestaat voor anti-tumormiddelen die een verhoogde werking en/of breder spectrum ten opzichte van de momenteel beschikbare middelen bezitten of min-10 der ongewenste zij effecten vertonen. Een kort overzicht van de hg- langrijkere glycopeptide antibiotica wordt onderstaand gegeven.

De bleomycinen zijn in water oplosbare basische glycopepti-den, die bereid worden door fermentatie van Streptomyces vsrticillus.

Ze zijn het eerst beschreven door Umezawa et al., in J. Antibiotics 15 19A:200 (1966]; zie ook het Amerikaanse octrooischrift 3.681.491.

Het bleomycinecomplex is in verscheidene componenten waaronder bleomycins A^, A^, Ag en gescheiden. Het bleomycinecomplex wordt tegenwoordig in de handel gebracht voor behandeling van verschillends neomplasma’s bij de mens waaronder het schubcellencarcinoom, 20 lymfosarcoma, reticulumcelsarcoma, testiculair carcinoom en de ziek te van Hodgkin. Onlangs is een herziene structuur voor de bleomycinen gepubliceerd door H.Umezawa et al. in J. Antibiotics 31:801-304 ÜP78].

De fleomycinegraep antibiotica, verkregen uit fermentatie 25 van een andere stam van Streptomyces verticillus is beschreven door

Maeda et al. in J. Antibiotics: vol.A9, pag.82 - 85 (19563; vol.A12, pag.lll (1959); vol. A12, pag.285 - 289 (1959) en vol. A17, pag.194-199 (1964), Zoals bij het bleomycinecomplex, is fleomycine in een 8003970 - 2 - aantal componenten gescheiden, die in zowel Kopervrije als in koper-chelaatvorm kunnen voorkomen.

Zorbamycine en verwante antibiotica zorbonomycine-B en zorbonomycine-C zijn beschreven in J. Antibiotics 24(9): 543-557 5 (1971) en in het Britse octrooischrift 1.277.150. Deze antibiotica geïsoleerd uit fermentaties van Streptomyces bikiniensis var. zorbo-nensis zijn sterk verwant met de bleomycine*en fleomycinefamilies.

Een andere familie van de fleomycine-bleomycinegroep antibiotica is geïsoleerd uit de cultuurvloeistcf van een variant van 10 Streptomyces humidus en YA-56 genoemd. Een beschrijving van het YA- 56-complex en de actieve componenten YA-56X en YA-56Y is te vinden in J. Antibiotics 24(10): 727-731 (1971) en in J. Antibiotics 26: 77-63 (1973),

Het antibioticumcomplex XK 49 en de belangrijkste component 15 victomycine (ook wel XK 49-1-B-2 genoemd) wordt beschreven in J. Antibiotics 28: 358-371 (1975). Victomycine wordt geïsoleerd uit een SDorangien vormende actinomyceet, Streptosporangium violaceo-chromogenes HK 49, en schijnt te lijken op de bleomycinen en zorbo-nomycine B.

20 Het glycopeptide antibioticumcomplex Bu-2231 en de componen ten Bu-2231 A en B (verder tallysomycine en tallysomycine A en B genoemd) werd beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.051.237,- zie ook J. Antibiotics vol.30, pag.779 - 805 (1977) en vol. 31, pag. 667 - 674 (1978)). De tallomycinen worden geïsoleerd 25 uit de fermentatievleoistof van bepaalde StreptoallotBichus hindusta- nus stammen en vertonen sterke antimicrobe en anti-tumoractivitei-ten.

De bereiding van verschillende semibiosynthetische derivaten van fleomycine en bleomycine met de techniek van door voorlopers ge-30 voede fermentatie is beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 3.984.390 en 3.846.400. In deze procedure worden stammen van micro-organismen, die de fleomycine of bleomycine antibiotica kunnen produceren, gekweekt in een fermentatiemedium bij aanwezigheid van een aminevoorloper teneinde nieuwe fleomycine- of bleomycinederivaten 35 te verkrijgen met een zij ketenstructuur, die overeenstemt met het 800 3 9 70 - 3 - toegevoegde amine.

De gepubliceerde Britse octrooiaanvrage 2.001.962A beschrijft de bereiding van 3-£“[S)-1’-fenylethylamino_7propylamino-bleomycine (pepleomycine) als een bijzonder geprefereerd semibio-5 synthetisch bleomycinederivaat omdat het een sterke antitumor- werking combineert met een lage pulmonaire toxiciteit.

De uitvinding verschaft nu nieuwe semibiosynthetische derivaten van tallysomycine-A en -B alsmede een werkwijze voor de bereiding daarvan. Meer in het bijzonder verschaft de uitvinding tal-10 ' lysomycine-A-derivaten met formule 1 van het formuleblad, waarin R een van de groepen met de formules 3-9 voorstelt, alsmede tally-somycine-3-derivaten met formule 2 van het formuleblad, waarin R een van de groepen met de formules 3-15 voorstelt, alsmede farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezouten van dergelijke derivaten.

15 De bovenstaand vermelde verbindingen kunnen in de vorm van een ko- perchelaat of in de kopervrije vorm voorkomen.

Een bijzonder geprefereerde uitvoeringsvorm van de uitvinding is het tallysomycine-B-derivaat met de formule 17 van het formuleblad, tallysomvcine-S., genaamd.

10b 2Q Eerste onderzoeken met proefdieren laten zien dat tallysomy- cine-S^gk [waaronder zowel de kopervrije als de koperchelaatvormen en de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan) een uitstekende antitumorwerking tegen een breed spectrum van kwaadaardige tumoren heeft en tegelijkertijd minder ongewenste zijeffecten vertoont 25 [b.v. nefrotoxiciteit) dan de in de natuur voorkomende tallysomyci ne-A en -B.

Het Amerikaanse octrooischrift 4.051.237 beschrijft de bereiding en isolering van twee nieuwe glycopeptide antibiotica, die daar Bu-2231 A en B worden genoemd. In een daaropvolgend onderzoek 30 is aangetoond dat Bu-2231A en B (thans tallysomycine-A en -B ge noemd) de structuren met de formules 18 resp. 19 hebben.

De bovenstaand vermelde tallysomycinen zijn de belangrijkste componenten van de fermentatie van tallysomycine-producerende stammen van Streptoalloteichus hindustanus en isolatie volgens de ge-35 bruikelijke chromatografische procedures.

onn 7 ο 7A

- 4 -

Men heeft nu volgens de uitvinding gevonden dat de in het Amerikaanse octrooischrift 4.051.237 beschreven fermentatieproce-duire kan worden uitgevoerd bij aanwezigheid van bepaalde aminevoor-loperverbindingen teneinde nieuwe derivaten van tallysomycine-A 5 en -0 met waardevolle antimicrobe en antitumoreigenschappen te ver krijgen.

De algemene techniek van met aminevoorloper gevoede fermentatie, beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 3.984.390 en 3.Θ46.400, wordt volgens de onderhavige werkwijze toegepast. In 10 de onderhavige werkwijze wordt een aminevoorloperverbinding toege voegd aan het tallysomycinefermentatiemedium van het Amerikaanse octrooischrift 4.051.237 en tijdens de fermentatie in het eindstan-dige aminegedeelte van tallysomycine-A en/of -3 opgenomen onder vorming van nieuwe semibiosynthetische derivaten met een eindstan-15 dige aminezi-j keten die overeenstemt met de toegevoegde aminevoorlo per. Isolatie en zuivering van de aldus verkregen derivaten kan worden uitgevoerd volgens bekende chromatografische procedures, b.v. die beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.051.237.

Een meer uitgebreide beschrijving van de werkwijze wordt onder-20 staand gegeven alsmede in de nog volgende, ter toelichting gegeven voorbeelden.

Bereiding van de antibiotica:

Bij het uitvoeren van de onderhavige werkwijze wordt een tal-lysomycine producerende stam van Streptoalloteichus hindustanus 25 (zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.051.237), liefst de stam Streptoalloteichus hindustanus E 465-94, ATCC 31158 of een mutant daarvan, in een waterig voedingsmedium gekweekt. Het voedingsmedium bevat een assimileerbare koolstofbron (b.v. glucose, ribose, galactose, fructose, mannose, sucrose, lactase, oplosbaar 30 zetmeel of glycerol) en een assimileerbare stikstofbron (b.v. vis meel, sojabonenmee1, katoenzaadmeel, maisweekwater, peptonen, vlees-extract, pindabloem, gistextract of ammoniumzouten); anorganische zouten zoals natriumchloride, kaliumchloride, magnesiumsulfaat, calciumcarbonaat, fosfaten enz. worden zonodig toegevoegd. Sporen-35 elementen zoals koper, mangaan, ijzer, zink enz. worden aan het me- 8003970 * * - 5 - dium naar wens toegevoegd of Kunnen als verontreinigingen of bestanddelen van andere media worden toegevoerd.

Naast de bovenstaand beschreven gebruikelijke voedingsbestanddelen, wordt aan het medium een aminevoorloperverbinding als 5 onderstaand gedefinieerd toegevoegd in de vorm van de v ije base of een zuuradditiezout daarvan. In het algemeen wordt de aminevoor-loperverbinding in de vorm van een geneutraliseerde waterige oplossing toegepast. De aminevoorloperverbindingen die geschikt voor toepassing bij de uitvinding zijn, zijn onderstaand vermeld tezamen 10 met de codenaam van het overeenkomstige tallysomycineprodukt.

Amine

Chemische naam Structuur Tallysomycine- eindprcdukt (¾)

1.2- diaminoëthaan ΝΗ,,-(ΟΗ-) -NH- S

2 2 2 2 3b 15 1.3-diaminopropaan N^-CCH^^-N^ Slb 1.4-diaminobutaan NH -(Cl-L] -NH_ Sin , Sln.

2 2 4 2 lila lUD

1.3- diamino-2-hydroxy- NH -CH„.-Cn-CH -Nt-t„ S..

J J 2 2 , 2 2 40

propaan OH

N-C/i -hydroxyethy1)-1.2- NH -CD-y -NH-CH -CH20H Sgb 20 diaminoëthaan N- C/3-hydroxyethyl)-1.2- diaminoëthaan NH -CCH ) -NH-CH -CH-CH_ Se, 2 22 2 , 3 5b

OH

N-methyl-1.3-diamino- NH2-CCH2)g-NH-CH2 ^lla' ^llb 25 propaan N-C/3-hydroxyethyl]-1.3- NH—CCH2] -NH-CH -CH20H Sg , Sgb diaminopropaan N-(l'-fenylethylJ-1.3-di- NH^-CCH^-NH-CH-^ /) S , S14b aminopropaan CH^ 30 N.N-dimethyl-1.3-diamino- NH--CCH-) -NCD-L)» S_,

Cm Cm Ó O Cm t D

propaan

N.N-diC/3-hydroxyethylJ- NH -CCH_] -N(CH -CH„0H)_ S0 , S

' 2 2 3 2 2 2 8b 1.3- diaminopropaan _ N-C3-aminopropyl)-morfo- NH -CCH_3 -N Q S.„.

2 ,-2 3 v / 12P

35 line o η n 7 o 7 n -6- N-(3-aminopropyl)-2- NH^ - (CH^) 3 -N^~ ^ ^13b

pipecoline CHQ

3 sr\ 3-aminopropyl-dimethyl- NH2~(CH2)3»S t£,CCH3J2 S2a,S2b sulfoniumchloride Cl^ 5 (*] De tallysomycinederivaten worden benoemd door aan elke amine- voorloper een getal toe te kennen en vervolgens het tallysomy-cine-eindprodukt aan te duiden met het nummer van het eindstan-dige amine en de letter a of b alnaargelang het een derivaat van tallysomycine-A of -B is. Tallysomycine-S^^ is b.v. het 10 tallysomycine-B-derivaat dat 1.4-diaminobutaan als eindstandig amine draagt.

De als vrije baseverbindingen of als zuuradditiezouten met anorganische zuren zoals HBr of HC1 gebruikte aminen worden bij voorkeur toegevoegd aan het medium in een concentratie van ongeveer 15 0,05 - 0,4% (w/v), liefst ongeveer 0,1 - 0,2% (w/v), aan het begin van de fermentatie, hoewel goede resultaten ook kunnen worden bereikt door de amineoplossing gedurende de eerste stadia van de fermentatie in porties toe te voegen.

De fermentatie wordt uitgevoerd volgens de werkwijze welke 20 beschreven is in het Amerikaanse octrooischrift 4.051.237. Dienover eenkomstig kan de incubatietemperatuur elke temperatuur zijn waarbij een tallysomycine producerende stam kan groeien, b.v. 20 - 54°C, maar de fermentatie wordt bij voorkeur uitgevoerd bij 25 - 35°C, liefst 27 - 32°C. Een neutrale of nagenoeg neutrale aanvangs-pH 25 b.v. pH ongeveer 6-7, wordt bij voorkeur gebruikt in het medium, en de bereiding van het antibioticum wordt in het algemeen uitgevoerd gedurende ongeveer 2-10 dagen. Normaliter wordt een optimale produktie in 3 - 7 dagen verkregen. Voor de bereiding van betrekkelijk kleine hoeveelheden kunnen schudkolven en oppervlaktecultu-30 ren worden gebruikt, maar voor produktie op grote schaal gaat de voorkeur uit naar ondergedompelde aerobe culturen in steriele tanks. Wanneer tankfermentatie moet worden uitgevoerd, wordt bij voorkeur een vegetatief inoculum geproduceerd in een voedingsvloeistof door de vloeibare cultuur te enten met een spoor van het producerende 35 organisme. Wanneer een jonge actieve vegetatieve inoculum is ver- 800 3 9 70 * * - 7 -

Kregen, wordt het inoculum aseptisch overgebracht in het fermenta-tietankmedium. De beluchting in de tanks en kolven kan worden verkregen door lucht door of op het oppervlak van het fermenterende medium te dwingen. Agitatie in de tanks kan worden verkregen door 5 een mechanische raerder, en naar behoefte kan een antischuimmiddel zoals varkensreuzelolie, worden toegevoegd.

De bereiding van het gewenste tallysomycinederivaat in het cuituurmedium kan tijdens het verloop van de fermentatie worden gevolgd door de papierschijf-agardiffusiemethode onder toepassing 10 van Mycobacterium smegmatis stam MS-3 als testorganisme.

Isolatie en zuivering:

Nadat een optimale vloeistofsterkte is verkregen (zoals b.v. met de bovenstaand vermelde analysemethode vastgesteld), worden het mycelium en de onopgeloste resten van de fermentatievloeistof afge-15 scheiden met gebruikelijke middelen zoals filtratie of centrifuga- tie. De antibioticumwerking bevindt zich in het filtraat en kan daaruit worden gewonnen door g'ebruikelijke acsorptietechnisKen toe te passen, zie b.v. J. Antibiotics 30(10): 779 - 7S8 (1977).

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt het filtraat eerst ge-20 adsorbeerd op een kationenuitwisselingshars, b.v. een hars van het type dat verkrijgbaar is bij Rohm 3 Haas Company onder de merk-aanduiding Amberlite IRC-50 (NH4+-vorm). De hars wordt met water gewassen en de tallysomycinefracties met waterig anorganisch zuur, b.v. 0,1 N HC1, geëlueerd. Het eluaat dat de actieve fracties bevat, 25 wordt met waterige ammoniak geneutraliseerd en bij voorkeur met ge activeerde koolstof geroerd. De houtskool wordt door filtratie verzameld, met water gewassen en vervolgens met waterig butanol (1 : 1 butanol : verdund HC1 v/v) bij een zure pH (b.v. pH 2) geëlueerd.

De waterlaag van het elueermiddel wordt geneutraliseerd met een ba-30 sische anianenuitwisselingshars en onder verminderde druk geconcen treerd. Het geconcentreerde eluaat van het IRC-50 (wanneer de kool-stofadsorptietrap is weggelaten) of geactiveerde koolstof, wordt vervolgens in water opgelost, geadsorbeerd tot een hars van het DIAI0N HP-20 type (merknaam voor een macroporeuze, niet-ionische 35 adsorberende hars, samengesteld uit een styreen-divinylbenzeencopa- 800 3970 - 8 - lymeer, verkrijgbaar bij Mitsubishi Chemical Co., Japan] en geëlu-eerd met water, waarbij een mengsel van ruwe tallysomycinen in de koperchelaatvorm wordt verkregen.

Scheiding en 'zuivering van de gewenste tallysomycinederiva-5 ten, die tijdens de net voorloper gevoede fermentatie zijn gevormd, kunnen worden bewerkt door het verkregen ruwe tallysomycinecomplex te adsorberen op een gemodificeerde dextranderivaatkationenuitwisse-laar, b.v. een gemodificeerd polysaccharidedextran van het type, dat in de handel verkrijgbaar is onder de merknaam CM-Sephadex C-25 10 bij Pharmacia Fine Chemicals Ine. De tallysomycinederivaten worden (het tallysomycinederivaat wordt] trapsgewijze geëlueerd met een waterige ammoniumformiaatoplossing met concentraties die variëren van ongeveer 1-7%. Fracties die hetzelfde derivaat bevatten worden samengebracht, ontzout door actieve koolstofadsorptie Celueren 15 met zuur waterig butanol] en gelyofiliseerd, waarbij gezuiverd tally somycinederivaat als koperchelaat wordt verkregen. Een verdere zuivering kan desgewenst worden gerealiseerd met gebruikelijke chroma-tografische en/of gelfiltratietechnieken.

De tallysomycinederivaten volgens de uitvinding hebben de 20 eigenschap met koper een chelaat te vormen zoals ook tallysomycine- A en -B doen, als gevolg waarvan de nieuwe derivaten en hun zure additiszouten in de kopercomplexvorm of kopervrije vorm kunnen bestaan. De kopervrije vormen van de tallysomycinederivaten kunnen uit de overeenkomstige kopercomplexvormen worden bereid volgens be-25 kende procedures, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.051.237 en de gepubliceerde Britse octrooiaanvrage 2.001.962A.

De tallysomycine vrije base-derivaten volgens de uitvinding kunnen met bekende methoden worden omgezet in farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezouten. Voorbeelden van dergelijke zouten zijn 30 de niet-giftige zouten met organische of anorganische zuren zoals zoutzuur, zwavelzuur, fosforzuur, azijnzuur, mierezuur, stearinezuur, maleïnezuur, benzoëzuur, barnsteenzuur en waterstofbromide. Antimicrobe werking;

De minimum remmende concentraties CMIC] van de semibiosynthe-35 tische tallysomycinederivaten volgens de uitvinding werden bepaald 80039 70 - 9 - tegen fungi en gram-positieve, gram-negatieve en zuurbestendige bacteriën met behulp van de tweevoudige agarverdunningsmethode. Voedingsagar werd gebruikt voor bacteriën en Sabouraud-agar voor fungi. De resultaten zijn in onderstaande tabel in vergelijking 5 met tallysomycine A en B aangegeven.

800 39 70 - 10 - cn 3 r-t cn

rl 3Π rl +1 CD

Ö0 ID D _ _ _ U ÜB CM £DCOCOCD<3'COa3CO^rCVJC053-COCDCDCDCOCon

Qj^j ******************* ο,ες; MooMaoooooaooMMMcooca cn 3 <

< tp M

cn an

ID C O

TD (0 CD _

τ-ΙΟ'ί· D CO M D CO ID CO ID M D CD D

Ό -rl *»»»« . « > .,,.

CHS CMCOCOCMCODCMDOCODOCMOOCOCMMCM

IB H < M Μ (Μ H N [M CM ID rH ID CM M i-l

U OH A A

cn •rl cn rH 3 Ή

QJ _Q <tf- <3"CM,;t-COCMCDCM'J"MCOMCO,3,COCOCOMCMCD

*******************

OIhCD Ο Ο Ο Μ Ο r-lOOCOMCOCOOOOOCOOi—I

o -h cn a. S < (0 rl sz n

Ü X •Η M

Cl 2 D CD

CD OCMM<3-0«J‘M*r<ct-M*'3'M‘MCMM'vrcOMCM

f— ep_j ,*·,^^*************** com oaoaoaoooaaaaaaoooo o cn o -p UJ o (0 >

•H

U

CD 1 TJ CD 0) +> K

COO CM CD

•rl (0 CO M ID CD DO

ü J3 CMCMOOOCMOaCM'ï'CMMMMMCMCMMM

******************* £o5 oooooooooaacDooooaoo a > ·Η N/ Ni cn x o v v

> r-4 tH

(0 +j cn cn

3 rl CD PI CD CD CD CD D COCDCD D

CMMM OOODDDMOCMCDCM a M M <5- CM

(OM-ricM oooaaaoaaooMoaoacMOM

^ oom oooaooooooooooaaoaa ω o o u w vvv v c x cn x v yv^v •rl

j*C

P

CD

3 <0 M

c a cd ή o a JJ a CD M d __

ο O+0M □•S-rHCOOCDCOMDCOOO'^-COCOM-MCNttJ

odmq_ aoaMOCDMDCMMCMCNOOoaDoa

<r4 ι-H rH rH

ε •rl

-P

C I

< o

I—I

>l CD CD

_C3 3.C M^^CDCMCOCOCOCnOCOCOCM^^CDCDCOM

Q.ÜCD-P ,,,,,·<·>^ιη,,ι·>^·>'·> ·>

ID Ο Ο *rl OOOMOMOOCDOCDCDOOOMCDOO

p o 3 ε co o co cn

CD

c

H

o >1 ε a cn

3 - (Π O ID O

m caocnoooxicDoocaooaoMM

ID MMCMCMD^-DCDCDINQDCOCnMM M M

l·- <CdDDDCODDDDDDDCOCODDCOD

8003970 - 11 - LD r-i ^ * in μ π in

CM Ή CM

O O CD O

o co ui o

t—I i—1 t—I

*—t /\ A A

ÖO

rH

Q

> U m r-t ca « >

> O CM CH LH

^ Ln rH CM

c

CD

-μ (0 >

•H

U

03 TD CD t CM ·ί 03 > « · ·> C rH o o a

•H

ü >1 £

O cn >. rH [—1 CO -P

CM CM Ή CM ^ * * * * co a a a ο > ω c •Η

U

03 <f Ο Η f 0 ι » » * η α ο cd ο a μ a •Η £ •Η

+J

C

< ΙΓ) CO 0D Η % * * * μ ίο ο η

rH

in η ίο η * % * *

CM CD Ο PD

rH

JD n co JD

CM CD Μ" M· rH c—J r—1 rH

cn cn cn cn

SflO 7 9 70 - 12 -

De relatieve antibacteriële sterkten (tallysomycine A standaard = 1000 microgram/mg) van de tallysomycinederivatan werden bepaald met behulp van de papierschijf-agardiffusiemethode onder toepassing van Mycobacterium smegmatis stam M6-3 als analyse-orga-5 nisme. De resultaten staan in de volgende tabel.

Antibacteriële sterkte vanjtallysomyclne-derivaten

Tallysomycine Antibacteriële sterkte (y/mg) A 1000 B 900 10 Sn 1075 la S.. 1000 lb S2a 350 S2b 300 S3b 725 15 S4b 405

Seu 500 5b S6a 460 S6b 340 S_. 380 __ /ü 20 S. 550 8a S6b 370 S9b 380 S10a 1450 S10b 1100 25 S„ 570 11a

Sllb 450 S12b 390 S13b 1090 SMa 1300 S14b 1090

Antitumorwerking:

De activiteit van profaaginductie van lysogeen bacterium E_. coli W1709 ] werd bepaald volgens de methode, beschreven door Lein et al., in Nature 196: 783 - 784 (1962). De plaque-tel-35 ling werd uitgevoerd op de agarplaat, welke de testverbinding (t) 8003970 - 13 - bevatte en de vergelijkingsplaat Cc]. Een t/c-verhouding van de plaque-tellingen van meer dan 3,0 werd gedefinieerd als een significant niveau en de lysogene inductieactiviteit ClLB-activiteit] werd uitgedrukt met de minimaal induceerbare concentratie van de 5 testverbinding. De resultaten staan in onderstaande tabel.

ILB-activiteit van tallysomycine-derivaten 3

Tallysomycine ILB-activiteit (mcg/cm ) A 0,00125 B 0,01 10 ^la ^‘ ^

Slb °'31 S_ 0,31 2a S2b 0.63 S3b °·31 15 S4b S5b °'08 S6a °'02 , S6b °-0fl 5,, 0,08 7b 20 SQa 0,005 S8b °'02

S9b °'1S

S10a °'16 S10b °’31 25 SUa 0,08

Sllb °'63 S12b °'31 S13b °'08 S14a °'01 30 S14b 0,04

De antitumoractiviteit van de tallysomycinederivaten werd onderzocht in vier experimentele tumorsystemen in de muis. Lymfocy- tische leukemie P388 en Lewis longcarcinoom werden intraperitoneaal geïmplanteerd in BDF^ muizen van beide sexen met een inaculumafme- 35 ting van 3 x 10^ en 5 x 10^ cellen per muis. Sarcoma 180 ascites

flfl n X 0 7A

- 14 - tumor werd intraperitoneaal geënt in mannelijke dd-stam muizen 16 met 2,5 x 10 cellen per muis. Melanotisch melanoma B16 werd sub-cutaan geïmplanteerd in BDF^ muizen met 5 x 105 cellen per muis.

24 uren na de implantatie van de tumorcellen, werden gegradeerde 5 doses van de testverbindingen intraperitoneaal aan de muizen toege- 3 diend in een injectievolume van 0,2 cm per 10 g lichaamsgewicht.

De testverbindingen werden eenmaal per dag gedurende 9 dagen toegediend (qd 1 —> 9 schema] behalve voor de muizen die met Lewis long carcinoom werden geënt, welke muizen gedurende 11 dagen werden be-10 handeld Cqd 1 —> 11]. Het overlijden of overleven van de behandel de en niet-behandelde Cvergelijkings-] dieren werd dagelijks opgetekend gedurende de observatieperiode van 45 dagen na de implantatie van de tumorcellen, en de middenoverlevingstijd werd voor elk van de testgroepen CT] en vergelijkingsgroepen CC] berekend. Een 15 T/C-waarde van 125% of meer geeft aan dat een significant antitumor- effect tegen leukemie P388 en Lewis long carcinoom werd gerealiseerd. De feitelijke dosis die een T/C van 125% gaf, werd door lineaire regressieanalyse geschat en als effectieve dosis 125 of ED..„_ 12b gedefinieerd. De effectieve dosis 150 CED^^] werd gebruikt voor 20 de evaluatie van het antitumorsffect tegen Sarcoma 180. In de B15 melanoma-proef werd de tumorgrootte op de 16e dag na de tumorinen- ting gemeten, en werd de dosis die een 50% inhibitie van de tumor- groei CID,_g] uit regressielijnen berekend. De antitumorwerking van de derivaten is in de volgende tabel aangegeven.

25 Antitumoractiviteit Cmg/kg/dag, ip]

Tallysomicine (χ] P388 S180 B16 Lewis long _ (ED125] CED1503 ™5Q] (ED1253 A (Cu-vrij] 0,26 0,07 0,27 0,13 B (Cu-vrij] 0,89 0,06 0,82 0,11 30 Sn 1,2 0,07 0,84 la S_. 2,0 0,11 0,15 0,12 ïb S2a 3,0 0,07 0,17 0,14 S2b 0,91 0,12 0,33 0,65 S_. 0,32 0,06 0,20 0,26 3b 35 S4b 3,0 0,13 0,50 800 3 9 70 - 15 - S 0,66 0,10 0,31 0,38 5b S_ 0,70 0,09 0,12 0,47 6a 2,2 0,08 0,22 0,17 6b 2,1 0,14 0,15 5 Sfla 0.78 - S„. 1,5 0,25 0,26 0,12

OD

3,0 0,42 0,29 0,41 9b S,n 0,28 0,08 0,39 10a

SlQb - °'°3 °’59 10 Sin, (Cu-vrij) 0,47 0,02 0,75 0,21 10b

Slla °'6D · 5.. . 0,23 0,20 0,70 0,32 11b S10, 1,30 0,06 1,30 12b S.„. 0,70 0,33 0,23 130 15 S14a 5.. . 3,0 0,08 0,43 0,29 140 (*] Koperchelaatvorm csnzij anders vermeld.

Gegradeerde doses van testverbindingen werden intraperitone-aal toegediend aan groepen van dd-muizen. De injectie werd slechts 20 één Keer of eenmaal per dag gedurende 9 opeenvolgende dagen gegeven.

Het overlijden of overleven van de dieren werd gedurende 30 dagen na de laatste dosis van de testverbinding opgetekend, om de enkelvoudige of meervoudige midden-letale dosis CLD^) te berekenen.

De resultaten zijn onderstaand weergegeven.

25 Acute en subacute toxiciteit van tallysomycinederivaten

Tallysomycine LD„g (mg/kg/dag, ip] enkelvoudige dosis meervoudige dosis

Cqd 1 - 9] A (Cu-vrijJ 19 4,4 30 B (Cu-vrij3 46 6,3

Sla 25

Slb 19 S2a 25 S2b 32 2,0 35 33b 19 - 16 - S4b 13 S5b 46 4,0 S6a 15 S6b 30 5 S7b 30 38a 42 S6b 30 S9b 32 S10a 27 10 S10b 27 S10b ^Cu-vrij) 42 4,0

Slla 18

Sllb 21 S12b > 50 15 S13b 35 S14a ' S14b “ 16 (λ] koperchelaatvorm tenzij anders vermeld.

De antitumortherapeutische index werd voor elk derivaat be- 20 rekend uit de verhouding van toxiciteit en antitumoractiviteit.

Zoals in de volgende tabel is aangegeven, vertoonden verschillende van de nieuwe semibiosynthetische tallysomycinederivaten betere therapeutische indices dan de natuurlijk verkregen tallysomycinen A en B in enkele van de onderzochte experimentele tumorsystemen.

25 Antitumortherapeutische indices van tallysomycinederivaten

Tallysomycine(x) Antitumor-therapeutische indices (xx) _ P388 S180 B16 Lewis long A (Cu-vrij) 73 271 70 146 B (Cu-vrij) 52 767 56 418 30 S 21 357 30 S 10 173 127 158 lb 5 < 8 357 147 179 2a S 35 267 97 49 2b S 59 317 95 73 3b 35 S < 4 100 26 od o4b 8003970 - 17 -

Scu 70 460 148 121 5b S6a 21 167 125 32

Seu 14 375 136 176 5b S_. 14 214 188 7b 5 S6a 54-- 5.. 20 120 115 250 8b S0. *11 76 110 78 9b S.n 96 338 69 10a si0b - 900 46 10 S.n. CCu'-vrij ) 89 2100 50 200 lub 5.. 30--11a 5.. . 75 105 30 66 lib S._. >38 >833 >38 13b S.„. 50 106 152 13b 15 S14a --- . S14b

Cx) Koperchelaatverm tenzij anders vermeid (XX) enkelvoudige dosis toxiciteit CLDg^]/antitumor effectieve dosis (E01ZS, ed150 of id50) 20 Tallysomycine ^ werd geëvalueerd op nefrotoxiciteit in een muizenmodel, waarbij een BUN-meting als eindpunt werd gebruikt, en een longhydroxyprolinemodel voor pulmcnaire toxiciteit Czie Cancer Res. 35: 787 [1373)). Oe tallysomycine toxioiteit voor de nieren was niet groter dan die van bleomycine bij equitoxische 25 doses. Tallysomycine S1Qb veroorzaakte een toename van het long- hydroxyproline dat op pulmonaire toxiciteit duidt. De dosis respon-siehelling was echter vlakker dan wordt waargenomen met bleomycine en het hydroxyprolinegehalte bij hoge doses werd in vergelijking met dat bij dieren die met bleomycine met equitoxische doses waren 30 behandeld, verlaagd.

Zoals door de bovenstaand vermelde gegevens wordt aangetoond zijn de tallysomycinederivaten volgens de uitvinding nuttig als an-timicrobe middelen voor het tegengaan van de groei van microbe-organismen, zowel bacteriën als fungi, die pathogeen voor dierlijk 35 en plantenleven zijn. Ook zijn ze nuttig voor het tegengaan van de - 18 - groei van tumoren bij zoogdieren. De verbindingen Kunnen op dezelfde wijze worden toegediend als in de handel verkrijgbaar bleomycine, en optimale doseringsniveaus voor een bepaalde set omstandigheden Kunnen worden bepaald door de deskundigen onder toepassing van ge-5 bruikelijke proeven voor het bepalen van de dosering en de boven staand vermelde gegevens.

De uitvinding omvat farmaceutische preparaten die een effectieve antimicrobe of tumor belemmerende hoeveelheid van een tally-somycinederivaat volgens de uitvinding bevatten, of een farmaceu-1Q tisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan, in combinatie met een inerte farmaceutisch aanvaardbare drager of verdunningsmiddel.

Volgens een ander aspect van de uitvinding verschaft deze een werkwijze voor het therapeutisch behandelen van een dierlijke gastheer Cbij voorkeur zoogdier], die aangedaan is door een micro-15 be-infectie af door een kwaadaardige tumor, waarbij aan een derge lijke gastheer een effectieve antimicrobe of tumor belemmerende dosis van een tallysomycinederivaat volgens de uitvinding of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan, wordt toegediend.

20 De uitvinding wordt aan de hand van de voorbeelden nader toegelicht.

Voorbeeld I - S_ en S_.

- 2a 2 b

Een moutextractagarhelling die geënt was met Streptoallo-teichus hindustanus ATCC 31158 werd gedurende 1 week op 28°C gein- 3 25 cubeerd. De helling werd gebruikt om 100 cm van een ontkiemings- 3 medium met de volgende samenstelling in een 500 cm Erlenmeyerkolf te enten: glucose 1,5% gistextract 0,2 30 polypepton 0,5 K2HP04 0,05

MgSD4.7H20 0,05

CaCOg 0,5

De pH werd vóór sterilisatie in een autoclaaf op 7,2 ingesteld. De 35 entcultuurkolven werden gedurende 48 uren op 33°C geïncubeerd op 8003970 - 19 - een roterende schudmachine die met 230 omw./min werkte. De boven- 3 verkregen entcultuur werd overgebracht in 100 cm fermentatiemedium 3 in een 500 cm Erlenmeyerkolf met een inoculumgehalte van 10% (v/v). Het fermentatiemedium bevatte de volgende ingrediënten: 5 sucrose 2,5% glucose 0,5 PHARIWEDIA (katoen-zaadmeel) 3,0 "distiller’s soluble" 3,0 ίο cnh4)2so4 0,3

ZnS04.7H20 0,003

CuS04.5H20 0,01

CaC03 0,4

Een geneutraliseerde waterige oplossing van 3-aminopropyldimethyl-15 sulfoniumchloride werd voor sterilisatie aan het fermentatiemedium toegevoegd met een concentratie van 0,1% Cw/v) als het hydrochlori-dezout. Ge pH van het mengsel werd voor de sterilisatie op 7,0 ingesteld. De geënte fermentatiekolven werden gedurende 5 dagen op 28°C geïncubeerd op een roterende schudmachine die met 250 omw./min 20 werkte-. De fermentatievoortgang werd met papierschijf-agardiffusie- analyse, waarbij smegmatis stam ίΊ6-3 als testorganisme werd gebruikt, gevolgd.

De fermentatievloeistof, welke de tallysomycinen S2a en bevatte, werd met filtreerhulpmiddel geroerd en het filtraat (20 dm3) + 3 25 werd met Amberlite IRC-5Q (60% NH4 -vorm, 3,5 dm ) geroerd. De hars werd met water gewassen en vervolgens de activiteit geëlueerd met 3 0,2 N HC1 (3x4 dm ).Het actieve eluaat werd op een pH van 6,0 ingesteld en met actieve houtskool (400 g) geroerd. De op de actieve kool geadsorbeerde bioactieve componenten werden door driemaal met 30 een mengsel van n-butanol en water te roeren, geëlueerd, waarbij de pH gedurende de eluering op 2,0 werd gehouden. De gecombineerde waterige eluaten werden geneutraliseerd en onder verminderde druk geconcentreerd tot ongeveer 100 cm ; het concentraat werd chromato-grafisch behandeld op een kolom van DIAI0N HP-20 (1,2 dm3). De 35 kolom werd ontwikkeld met water waarbij blauw gekleurde tallysomyci- O η Λ 7 O 7 Λ - 20 - nefracties werden verzameld. Verdamping van de geschikte fracties gaf een ruw tallysomycinemengsel (4,85 g] dat chromatografisch be- 3 handeld werd op een kolom van CPI-Sephadex C-25 (330 cm ] waarbij ontwikkeld werd met een toenemende concentratie van een ammonium-5 formiaatoplossing. De tallysomycine S^, en B werden achtereen volgens geëlueerd met 2% HCOONH^ en tallysomycine A werd geëlueerd met 4% HCOONH^. Elke antibioticumfractie werd ontzout door actieve kool-adsorptie gevolgd door elueren met zuur waterig n-butanol. Lyofilisatie van het waterige eluaat gaf tallysomycine S (158 mg] 10 en S2b (570 mg] tezamen met tallysomycine A (210 mg] en B (540 mg], alle in de vorm van een koperchelaat.

Voorbeeld II - S_ en S_.

- Ba 6 b □e fermentatieprocedure van voorbeeld I werd herhaald, behalve dat N-(/3-hydroxyethyl]-1.3-diaminopropaan CHCl-zout] als amine- 3 15 voorloper werd gebruikt. De gewonnen vloeistof (11 dm ] werd met een filtreerhulpmiddel gefiltreerd. De antibioticumactiviteit in ' ht filtraat werd geadsorbeerd op Amberlite IRC-50 hars (60% IMH. - 3 4 vorm, 2,4 dm ] en uit de hars geëlueerd met 0,1 N HC1. Het eluaat werd op een pH van 6,5 ingesteld en vervolgens door een kolom van 3 20 DIAI0N HP-20 (2 dm ] geleid. De kolom werd met water geëlueerd.

Fracties die tallysomycinen bevatten werden onder verminderde druk geconcentreerd en gelyofiliseerd, waarbij 824 mg van een blauwe vaste stof werd verkregen. De tallysomycinen werden door CM-Sepha- 3 dex C-25 chromatografie (200 cm ] gescheiden, waarbij een waterige 25 ammoniumformiaatoplossing als elueermiddel werd toegepast. Tallyso mycine Sgb werd met 2% HCOONH^ geël-ueerd, Sga en B met 3% HCOOIMH^ en tenslotte A met 5% HC00NH4-oplossing. Elke fractie werd met actieve houtskool behandeld om te ontzouten. De opbrengsten aan tallysomycinen in koperchelaatvorm waren: A 61 mg, B 31 mg, S_ 201 mg, 03 30 en Sgb 288 mg.

Voorbeeld III - S„_ en SnL_ ' Ö3 Ou

De fermentatieprocedure van voorbeeld I werd herhaald, behalve dat N.N-di(/J-hydroxyethyl]-1.3-diaminopropaan (HCl-zout) als aminevoorloper gebruikt werd in een concentratie van 0,2% (w/v], 3 35 De gewonnen vloeistof (10 dm ] werd gefiltreerd. De tallysomycine- 8003970 - 21 - componenten in het cultuurfiltraat werden geadsorbeerd door Amber- + 3 lite IRC-50 (60% NH^ -vorm, 2,2 dm ] en geelueerd met een verdunde HCl-oplossing. Het actieve eluaat werd geneutraliseerd en aange- 3 bracht op een kolom van DIAION HP-20 (2 dm ] die met water werd 5 ontwikkeld. De bioactieve fracties werden onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij 1,16 g ruwe tallysomycinen werden verkregen. De vaste stof werd chromatografisch behandeld op een kolom van 3 CM-Sephadex C-25 (300 cm ). Tallysomycine SD. werd eerst uit de ko-

OU

lom geelueerd met 2% HCGDNH^, S^ en 8 met 3% HC00NH4 en daarna A

10 met een 5% HCOONH^-oplossing. De betreffende fracties werden ont- zout door kooladsorptie. De opbrengsten aan tallysomycinen in koper- chelaatvorm waren: A 184 mg, 8 171 mg, 63 mg, en 243 mg.

Voorbeeld IV - Sin en Sin, - 10a 10b

De fermentatieprocedure van voorbeeld I werd herhaald, benal-15 ve dat 1.4-diaminobutaandihydrochloride als aminevoorloperverbin- ' ding werd toegepast. De fermentatievloeistof (35 dm , pH 7,5) werd gecentrifugeerd cm de myceliumkoek af te scheiden. De heldere bovenstaande vloeistof die aldus werd verkregen, werd met Amberlite IRC-+ 3 50 hars (60% NH -vorm, 6 dm ) gedurende 30 minuten geroerd. De ^ 3 20 hars werd met twee porties water van 30 dm gewassen en vervolgens 3 met drie porties aangezuurd water van 10 dm geelueerd, waarbij de pH tijdens het elueren beneden 2,0 werd gehouden. De eluaten werden gecombineerd, op een pH van 7,3 ingesteld en met actieve houtskool (800 g) geroerd. De activiteit werd geelueerd met een 1 : 1 mengsel 3 25 van n-butanol en zuur water (elk 5 dm , pH 2,0) en de elutie werd driemaal herhaald. De waterlagen werden gecombineerd, geneutraliseerd met Amberlite IR-45 (0H-vorm,· een basische anionuitwisselings-hars, die verkrijgbaar is bij Rohm & Haas Company, V.S.v.A.) en 3 onder verminderde druk tot 300 cm geconcentreerd. Het concentraat 3 30 werd aangebracht op een kolom van DIAION HP-20 (3 dm )die met water werd ontwikkeld. De elutie werd door bioanalyse gevolgd en de bioactieve fracties werden geconcentreerd, waarbij een mengsel van tallysomycinen als blauwe vaste stof (6 g) werd verkregen. De vaste stof werd chromatografisch behandeld op een kolom van CM-Sephadex 35 C-25 (300 cm^), welke vooraf gewassen was met een 1%’s HCDONH^-op- pnn 7 o 7ft - 22 - lossing. Ds Kolom werd ontwikkeld met toenemende concentraties (1% ongeveer 3%) van een waterige ammoniumformiaatoplossing. De eerste bioactieve fracties, die geëlueerd waren met 3% HCODNH^, werden gecombineerd (250 cm ] *'en met 30 g actieve houtskool ge-5 roerd. De kool werd afgescheiden, met water gewassen en tweemaal geëlueerd met een 1 : 1 mengsel van -n-butanol en aangezuurd water 3 (elk 120 cm ]. De waterige eluaten werden geneutraliseerd met Amtserlite IR-45 (OH-vorm) hars en vervolgens verdampt, waarbij semizuiver tallysomycine werd verkregen (1,60 g]. Het monster 10 werd opnieuw chromatografisch behandeld op een kolom van Amberlite XT-2 (240 cm j een macroporeuze, niet-ionische styreen-divinylben-zeencopolymeeradsorptiehars, van fijne deeltjeskwaliteit, verkrijgbaar bij Rohm 5 Haas Company V.S.v.A.} die met water werd ontwikkeld. De bioactieve eluaten werden gecombineerd, geconcentreerd en 15 gelyofiliseerd, waarbij zuiver tallysomycine in koperchelaat- vorm werd verkregen (1,25 g], Tallysomycine S en B werden met iua succes geëlueerd uit de CH-Sephadex-kolom met een 3%’s HCQ0NHd-oplossing waarbij tallysomycine S^a (360 mg] en tallysomycine B (370 mg] in koperchelaatvorm werden verkregen. Tallysomycine A 20 werd in een sporenhoeveelheid verkregen uit een 5% HCOONH^-eluaat.

Voorbeeld V

Het in hoofdzaak dezelfde procedure als beschreven in de voorbeelden I - IV werden de volgende semibiosynthetische tallyso- mycinederivaten door met amine gevoede fermentatie bereid.

25 Tallysomycine- Aminehydrochloridevoorloper Fermenta- Opbrengst derivaatprodukt tievloei- (mg] stof _ _ volume(dm^) _ S 1.3-diaminopropaan 6,7 spoor S-. 6,7 70 lb 30 S-. 1.2-diaminoëthaan 1,9 6 3b S^b 1.3-diamino-2-hydroxypropaan 8,5 17 S^b N-(/3-hydroxypropyl]-1.2-di- 5 32 aminoëthaan S^b N.N-dimethyl-1.3-diaminopropaan 10 96 35 Sgb IM-C/3 -hydroxyethyl]-1.2-diami- 10 286 noëthaan 8803970 «' » - 23 - S^a l\l-methyl-1.3-diaminopropaan 3,2 43 S,,. " 3,2 259 lib N-i3-aminopropyl)marfoline 2,2 94 S13b N-(3-aminopropyl]-2-pipecoline 10 137 5 ^I4a N-(l’-fenylethyl)-1.3-diamino- 4 20 propaan S14b " 4 210

Voorbeeld VI

De kopervrije tallysomycinen, die overeenstemmen met de 10 in de voorbeelden I - V bereide derivaten in koperchelaatvorm, kon den worden verkregen door volgens de werkwijze van voorbeeld I van het Amerikaanse octrooischrift 3.346.197 te behandelen met in methanol.

De fysisch-chemische eigenschappen van de in de voorbeelden 15 I - V bereide tallysomycinederivaten zijn in onderstaande tabel weergegeven.

Fysisch-chemische eigenschappen van nieuwe tallysomycinederivaten

Tallysomycine TLC CR_p] ** HPLC *** 20 _ S-102 S-123 Cretentietijd) S, 0,50 0,23 6'24” la S-. 0,65 0,37 4'48” lb S_ 0,24 0,15 6'30" S2fa 0,38 0,34 5118” 25 S3b 0,59 0,51 4’49" S„. 0,66 0,40 4’47" 4b

Sc. 0,50 0,58 4’54” 5b S. 0,42 0,22 6’18” oa

Sc, 0,50 0,40 4r42 ” 6b 30 S?b 0,44 0,25 4’54” SQ Q,56 0,40 6’24” □a

Sab 0,70 0,54 4’48"

Sgb 0,56 0,48 4'52" S1Qa 0,43 0,24 6’20” 35 S1Qb 0,61' 0,39 4’47” ftfl-n*0 7n - 24 -

Sllfl 0,27 0,16 5.. . 0,49 0,35 4'47" lib S._. 0,49 0,60 4’47" 12b S._. 0,46 0,36 5'37" 13b 5 S.. 0,52 0,37 1^3 S14b 0,62 0,50 7’05”

Fyslsch-chemische eigenschappen van nieuwe tally-somycineberivaten 10 Tallysomycine Analyse gevonden

^ nm (Ε?·° 3 C Η N

max 1 cm

Sla 242(1263, 292 (1023 5.. 242(1083, 290(943 39,54 5,45 15,01 lb 15 S„ 240(1203, 290(1083 2a S2b 244,5(1293, 292(1043 38,51 5,51 14,30 S-. 240(1233, 291(1123 3b S„, 242(1203, 290(1033 4b S_, 244(1243, 290(1023 40,17 6,05 15,02 5b 20 Sga 243(1053, 291(833 39,73 6,39 15,35 S6b 243(1283, 291(1033 39,81 6,00 15,21 S_. 245(1203, 290(963 40,89 6,04 14,51 7b SD 243(1073, 291(853 08 S_. 243(1143, 290(923 40,73 6,18 14,79 OD x 25 S_. 243(1043, 290(873 39,30 5,97 15,42 9b S1n 244(1423, 292(1123 39,76 5,94 15,58 10a

Sin, 244(1413, 292(1163 38,81 5,85 14,74 10b

Slla 244(623, 292(533 5.. . 244(1123, 292(913 40,16 5,48 15,04 lib 30 S.„. 254(743, 292(593 34,98 5,09 13,04 12b S._. 243(1423, 292(1143 39,14 5,85 13,63 13b S14a 243(1023, 292(723 5.. . 243(1433 , 292(1093 14b 35 xx TLC-systeem S-102 gebruikte kiezelgel 60F (Merck3 plaat en 2b 4 800 3 9 70 - 25 - oplosmiddelsysteem van methanol : waterig 10% ammoniumacetaat Cl : 1 v/v)j TLC-systeem S-123 gebruikte kiezelgel 60F_C/, (Merck) plaat en oplosmiddelsysteem van methanol : 10% ammoniumacetaat : 10% ammoniumhydroxyde CIO : 9 : 1 v/v). De detectie werd uitge-5 voerd met een Dual-golflengte TLC-aftaster CShimadzu GS-910) bij 290 nm.

XXX Apparatuur: Waters Associates Model ALC 204 met een type U6K injector.

Kolom: Waters Associates yBondapak C^g (4 x 300 mm) vooraf ge-10 wassen met 0,5% EDTA-oplossing.

Mobiele fase: CH_CN:H 0 C3:7 v/v) bevattende Waters Associates O L* reagens PIC B-7

Detector: Model 440 uv detector bij 254 nm 3 „ 2

Vloeisnelheden: 1,0 cm /min Cdruk 5S kgf/cm ) 3 3 15 Geïnjecteerde monsterhoeveelheid: 1 yc1m van 2 mg/cm oplossing.

De uitvinding kan technisch worden toegepast.

800 39 70

Claims (27)

1. Tallysomycine-A-derivaat met formule 1 van het formuleblad, waarin R de groep met een van de formules 3 - 9 is, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

2. Verbinding volgens conclusie 1, tallysomycine S^a genaamd, 5 waarin R de groep met formule 3 is, of een farmaceutisch aanvaard baar zuuradditiezout daarvan.

3. Verbinding volgens conclusie 1, genaamd tallysomycine S , έ3 waarin R de groep met formule 4 is, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

4. Verbinding volgens conclusie 1, tallysomycine Sc genaamd, waarin R de groep met formule 5 is, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

5. Verbinding volgens conclusie 1, tallysomycine S_ genaamd, 03 waarin R de groep met formule 6 is, of een farmaceutisch aanveord-15 baar zuuradditiezout daarvan.

6. Verbinding volgens conclusie I, tallysomycine S1Qa genaamd, waarin R de groep met formule 7 is, of een farmaceutisch aanvaard baar zuuradditiezout daarvan.

7. Verbinding volgens conclusie 1, tallysomycine S genaamd, 113 20 waarin R de groep met formule 8 is, of een farmaceutisch aanvaard baar zuuradditiezout daarvan.

8. Verbinding volgens conclusie 1, tallysomycine S14a genaamd, waarin R de groep met formule 9 is, of een farmaceutisch aanvaard baar zuuradditiezout daarvan.

9. Tallysomycine B-derivaat met formule 2 van het formuleblad waarin R een groep met een van de formules 3-16 is, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

10 NH2-(CH2)4-NH2, NH2-CH2-CH-CH2-NH2, QH NH2-(CH2Ï2-NH-CH2-CH OH, NH -CCH } -NH-CH -CH-CH ,

10. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine genaamd, waarin R de groep met formule 3 voorstelt, of een farmaceutisch aan- 30 vaardbaar zuuradditiezout daarvan.

11. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine genaamd, waarin R de groep met formule 4 voorstelt, of een farmaceutisch aan- 8003970 - 27 - vaardbaar zuuradditiezout daarvan.

12. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine genaamd, waarin R de groep met formule IQ voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

13. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine genaamd, waarin R de groep met formule 11 voorstalt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

14. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine S5b genaamd, waarin R de groep met formule 12 voorstelt, of een farmaceutisch 10 aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

15 GH nh2-cch2)3-nh-ch3, NH -(CH2]3-NH-CH2-CH20H, nh2-(ch2j3-nh-ch-<2>

15. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine Sg^ genaamd, waarin R de groep met formule 5 voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

16. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine genaamd, 15 waarin R de groep met formule 13 voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

17. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine Sg^ genaamd, waarin R de groep met formule 6 voorstelt, of een farmaceutisch * aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan. 20

18· Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine Sg^ genaamd, waarin R de groep met formule 14 voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

19. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine genaamd, waarin R de groep met formule 7 voorstelt, of een farmaceutisch 25 aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

20 CH3 nh2-(ch2)3-n(ch332, NH2-CCH2)3-NCCH2CH20H)2, /~\ NH_-(CH_] -N 0 2 2 3 >>_, 25 nh2-cch2j3 -O of CH3 NH2-(CH2)3-S®tCH3)2, Cl w 30 of een anorganisch zuuradditiezout daarvan, totdat een aanzienlijke hoeveelheid van het gewenste tallysomycinederivaat door genoemd organisme in het cultuurmedium is geproduceerd, en het gewenste tallysomycinederivaat uit het cultuurmedium nagenoeg zonder mede-gepro-duceerde materialen wordt gewonnen.

20. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine ^ genaamd, waarin R de groep met formule 6 voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

21. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine genaamd, 30 waarin R de groep met formule 15 voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

22. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine S10. genaamd, lou waarin R de groep met formule 16 voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

23. Verbinding volgens conclusie 9, tallysomycine genaamd, 800 3 9 70 - 28 - waarin R de groep met formule 9 voorstelt, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan.

24. Werkwijze voor het bereiden van een tallysomycinederivaat volgens een of meer van de conclusies 1 - 23, waarbij een tallyso-5 mycine producerende stam van Streptoalloteichus hindustanus gekweekt wordt in een waterig voedingsmedium bij aanwezigheid van een amine-voorloperverbinding met de formule NH2-CCH2yNH2, NH2-(CH2)3-NH2,

25. Werkwijze volgens conclusie 24, waarbij de tallysomycine pro- 800 3 9 70 - 29 - ducerende stam Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31158 of eon mutant daarvan is.

26. Werkwijze volgens conclusie 24 of 25, waarbij de aminevoor- loperverbinding 1.4-diaminobutaan is of een anorganisch zuuradditie- zout daarvan, en het gewonnen tallysomycinederivaat het tallysomy- cine S1n, met formule 17 is. lub

27. Farmaceutisch preparaat met antimicrobe en/of antitumor-werking, omvattende een verbinding volgens een of meer van de conclusies 1 - 23. 8003970