DE3027326A1

DE3027326A1 - Neue cleomycin-antibiotika und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3027326A1
Application number: DE19803027326
Authority: DE
Inventors: Akio Fujii; Mamoru Kunishima; Yasuhiko Muraoka; Tomohisa Takita; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1979-07-19
Filing date: 1980-07-18
Publication date: 1981-02-12
Also published as: US4326054A; GB2054591A; JPS5625197A; FR2461716B1; DE3027326C2; IT1145379B; CA1150168A; IT8049278A0; GB2054591B; JPS643879B2; FR2461716A1

Description

Die Erfindung betrifft Cleomycin-Antibiotika, die zu der Ehleomycin-Bleomycin-Gruppe gehören. Diese Substanzen haben antitumorale und antimikrobielle Aktivitäten und sie sind alc chemotherapeutische Mittel zur Behandlung von Krebs und bakteriellen Infektionen geeignet.

Als Antibiotika, die zu der Fhleomycin-Bleomycin-Gruppe gehören, sind die folgenden Substanzen bekannt: Bleomycine, welche auf bekannte Weise aus einem flüssigen Kulturmedium von Streptomyces verticillus gewonnen werden [Umezawa et al. "Journal of Antibiotics», 12,210 (1966)]; Bleomycine, welche unter Verwendung eines Kulturmediums gewonnen werden, das mit einer Aminoverbindung als Vorläufer vermischt worden ist (US-PSen 3 846 400 und 4 195 018); Bleomycine, die in der DE-OS 2 828 933 beschrieben werden; Bleomycine, die am endständigen Aminstickstoff N-substituiert sind (US-PS 3 922 262); Phleomycine, die durch Streptomyces verticillus 843-1 ATCC 21890 hergestellt worden sind [Umezawa et al. "Journal of Antibiotics", 2, ⁸² (1956)]; Zorbamycin, hergestellt durch Streptomyces bikiniensis var. zorbonesis [Argoudelis et al. "Journal of Antibiotics", 24, 543 (1971)]; die Substanz YA-56, die durch Streptomyces humidus var. antitumoris hergestellt worden ist [Purumai et al. "Journal of Antibiotics", gh, 727 (1971)]; Tallysomycin, hergestellt durch ein Aktinomyzetikum Streptoalloteichus [Kawaguchi et al. "Journal of Antibiotics", ^O, 779 (1977)]; Platomycin, hergestellt durch ein Aktinomyzetikum Streptosporangium violaceochromogenes sub sp. globophilum [Takazawa et al. «Journal of Antibiotics", 28, 366 (1975)]; « Zorbonomycin, hergestellt durch Streptomyces bikiniensis

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var. zorbonensis [Argoudelis et al. "Journal of Antibiotics", 24, 543 (1971)]; und Victomycin, hergestellt durch Streptosporangium violaceochromogenes [Kawamoto et al. "Journal of Antibiotics", 28, 358 (1975)].

Als Ergebnis ausgedehnter Untersuchungen betreffend neue Antibiotika der Ehleomycin-Bleomycin-Gruppe wurden nun bestimmte Verbindungen, nämlich Cleomycine, aufgefunden, welche die Partialstruktur:

H _H Il

HO ^ I ^ CH

anstelle der Threoningruppe in der Partialstruktur:

N * C »

CH CH₂ N rr ^-

HO ^CH₃ ^CH₂^^S^

im Bleomycinskelett aufweisen. Es wurde weiterhin festgestellt, daß diese Verbindungen antitumorale und antimikrobielle Aktivitäten haben.

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Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Ultraviolettabsorptionskurve von 3-[(S)-1'-Fhenyläthylamino]-propylaminocleomycin (Verbindung Nr. 33), Hydrochlorid (Kupfer enthaltende Form) in destilliertem Wasser;

Fig. 2 die Ultraviolettabsorptionskurve von 3-fN-Methyl-N-(3-aminopropyl)J-aminopropylaminocleomycin (Verbindung Nr. 20), Hydrochlorid (kupferfreie Form) in 0,1N-SaIζsäure;

Fig. 3 die Ultraviolettabsorptionskurve von 3-[(S)-1'-Phenyläthylamino]-propylaminocleomycin (Verbindung Nr. 33), Hydrochlorid (kupferfreie Form) in 0,1N-Salzsäure;

Fig. 4 die Infrarotabsorptionskurve, bestimmt nach der Kaliumbromidtablettenmethode, von 3-[N-Methyl-N-(3-aminopropyl)]-aminopropylaminocleomycin (Verbindung Nr. 20), Hydrochlorid (Kupfer enthaltende Form);

Fig. 5 die Infrarotabsorptionskurve, bestimmt nach der Kaliumbromidtablettenmethode, von 3-[(S)-1'-Phenyläthylaminoj-propylaminocleomycin (Verbindung Nr. 33), Hydrochlorid (Kupfer enthaltende Form);

Fig. 6 die Infrarotabsorptionskurve, bestimmt nach der Kaliumbromidtablettenmethode, von 3-[N-Methyl-N-(3-aminopropyl)]-aminopropylaminocleomycin (Verbindung Nr. 20), Hydrochlorid (kupferfreie Form);

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Fig. 7 und 8 die Infrarotabsorptionskurve, bestimmt nach der Kaliumbromidtablettenmethode, und die Protonen-NMR-Kurve (in D₂O) von 3-[(S)-1'-Phenyläthylamino]-propylaminocleomycin (Verbindung Nr. 33), Sulfat (kupferfreie Form).

Gegenstand der Erfindung sind daher neue Cleomycine der allgemeinen Formel:

H NH,

.CH_x NH

y ²

(I)

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worin R für einen endständigen Aminorest des Cleomycins steht. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser Cleomycine.

Die erfindungsgemäßen Cleomycine können dadurch erhalten werden, daß man einen cleomycinerzeugenden Stamm, der zur Gruppe der Actiomyceten bzw. Strahlpilze gehört, Streptomyces verticillus in ein Medium inokuliert, zu welchem erforderlichenfalls ein aliphatisches primäres Amin mit zwei oder mehreren basischen Gruppen zugesetzt worden ist, den Stamm kultiviert bzw. züchtet, um ein Cleomycin der obigen Formel I herzustellen, und danach das Cleomycin aus dem Medium gewinnt.

Der Mikroorganismus zur Verwendung für die Erfindung ist ein Actinomycetum Streptomyces verticillus, das als Stamm bekannt ist, welcher dazu imstande ist, Bleomycin-Antibiotika zu erzeugen [Umezawa et al. "Journal of Antibiotics", 19. 200, (1966)], wobei jeder beliebige Stamm, der zu dieser Art gehört, verwendet werden kann. Ein typischer Stamm ist z.B. Streptomyces verticillus Collection Nr. NK 68-144 (ATCC Nr. 31307). Es ist weit bekannt, daß die Fähigkeit zur Erzeugung von Antibiotika von Actinomyceten natürlich oder künstlich verändert werden kann. Somit kann auch ein mutierter Stamm von Streptomyces verticillus mit einer höheren Fähigkeit zur Erzeugung von Cleomycin verwendet werden, wobei dieser in bekannter Weise beispielsweise durch Einwirkung von Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen oder von mutationsinduzierenden Mitteln hergestellt werden kann. Die für die Erfindung geeigneten cleomycinerzeugenden Stämme schließen naturgemäß solche Stämme ein, die natürlich oder künstlich mutiert worden sind.

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Bei dem erfindungsgemäßen Kultivierungsprozeß werden als Nährmittel für das Kulturmedium entsprechende Kombinationen von Materialien verwendet, die aus Kohlenstoffquellen, wie Stärke, Stärkesirup, Glucose, Mannose, Lactose, Maltose, Saccharose, Inosit, Mannit, Glycerin, Molassen und organischen Säuren, anorganischen oder organischen Stickstoffquellen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Harnstoff, Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, entfettetes Sojabohnenmehl, Fischmehl, Kasaminosäure (vertrieben von Difco Co.) und Aminosäuren, und anorganischen Salzen, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphaten, Calciumcarbonat, Zinksulfat und Rupfersulfat, ausgewählt werden.

Cleomycine können zufriedenstellenderweise durch Kultivierung des obengenannten Stamms in dem beschriebenen Medium hergestellt werden. Jedoch werden gewöhnlich mehrere Arten von Cleomycin mit verschiedenen endständigen Aminoresten, wie z.B. 3-S,S-Dimethylmercaptopropylaminocleomycin, 4-Guanidinobutylaminogleomycin und 3-(4-Aminobutylamino)-propylaminocleomycin, gebildet. Um die Erzeugung eines gewünschten CIeomyeins je nach den Notwendigkeiten zu fördern, kann ein aliphatisches primäres Amin mit zwei oder mehreren basischen Gruppen im Molekül zusätzlich zu den oben beschriebenen Nährquellen zugesetzt werden. So kann z.B. ein aliphatisches Amin mit zwei oder mehreren basischen Gruppen im Molekül (nachstehend der Einfachheit halber als Aminoverbindung abgekürzt) zu dem Kulturmedium in einer geeigneten Menge, z.B. von 0,01 bis 1 Gew.-?6, zugesetzt werden. Entsprechende Untersuchungen haben gezeigt, daß während der Biosynthese der Cleomycine durch einen

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cleomycinerzeugenden Stamm die obengenannte Aminoverbindung von den Cleomycinen aufgenommen und in den endständigen Aminorest überführt wird. Nach dieser Methode können verschiedene Arten von Cleomycin durch Veränderung der Art der zugesetzten Aminoverbindung hergestellt werden. Weiterhin ist die selektive Erzeugung einer gegebenen Art von Cleomycin durch Zugabe einer geeigneten Menge einer Aminoverbindung möglich. Dies ist von großem technischen Vorteil. Hinsichtlich der zuzusetzenden Aminoverbindung· bestehen keine besonderen Beschränkungen, vorausgesetzt, daß sie ein aliphatisches primäres Amin mit zwei oder mehreren basischen Gruppen im Molekül ist. Beispiele für solche Aminoverbindungen sind Aminoverbindungen der allgemeinen Formel:

X-R₁₁- NH₂ (II)

worin R₁₁ für Alkylen oder eine Gruppe der Formeln:

- R₁₂ - Y₁ - R₁ -i - oder - R^p "" ^i ~ ^I ^ ~ ^2 ~ ^14

steht (worin R-ip» R-i^ ^un<^· R-ia jeweils Alkylen bedeuten und Y₁ und Y₂ jeweils eine Gruppe der Formel -N- [worin R₁ für

Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe steht) oder eine Gruppe der Formeln ~^N\ _/ ⁱjr^odeg\ / bedeuten) «Hinsicht-

lich von X bestehen keine besonderen Begrenzungen, voraus gesetzt, daß es sich um eine basische Gruppe handelt, beispielsweise der Formeln:.

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R ^M

^-⁶ H /

, -N R_ , -NH-C-NH., , -N

^{3 2}V

--O

κ--Q .-ο .-α—-Q

-N 0,-1

H H

(worin IL die gleiche Bedeutung wie oben angegeben, hat, R₂, R-z und Rg jeweils für eine niedere Alkylgruppe stehen und R/ und R,- jeweils für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe stehen). Als Beispiele für Alkylen in den Aminogruppen können die folgenden Gruppen angegeben werden: -

CH- CH-

I ³ I ³

-(CHg)₂- , -CH- , -(CHg)₃- , -CH₂CH- , -

CH₀ CH^ CH₀

I 3 ι 3 ,3

-CH₂CH₂CH- , -CH₂CHCH₂- , -(CHg)₅- , -(CHg)--CH- ,

-CH₂CHCH₂- , -(CHg)₆- , -(CHg)₈- und -(CHg)₂-CH-(CHg)₂-,

Als Beispiele für niedere Alkylgruppen können die folgenden Gruppen angegeben werden: Methyl, Äthyl, Propyl, Butyl, Pentyl und Hexyl. Als Beispiele für Alkylgruppen können neben den obengenannten niederen Alkylgruppen die Gruppen Heptyl, Octyl etc. genannt werden. Diese nie-

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deren Alkylgruppen und Alkylgruppen können auch Substituenten enthalten, wie eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe, z.B. eine Methoxy-, Äthoxy-, Propoxy-, Butoxy- und Octoxygruppe, eine Phenylgruppe (die eine niedere Alkylgruppe enthalten kann). Beispiele für Aminoverbindungen und Cleomycine, die durch Kultivierung in Gegenwart der genannten Aminoverbindung erhalten werden, sind in Tabelle I zusammengestellt.

Bei dem Kultivierungsverfahren sind das Kultivierungsver-' fahren in flüssigem Medium und insbesondere das Tauchkultivierungsverfahren technisch anwendbar. Bei der Kultivierung sind eine Temperatur von 20 bis 40°C und ein pH-Wert von nahezu neutral zweckmäßig. Cleomycine werden in dem Medium nach 2- bis 10-tägiger Kultivierung in flüssigem Medium erzeugt und sie sammeln sich darin an. Die Kultivierung wird abgebrochen, wenn die Konzentration von Cleomycin in dem flüssigen Medium ein Maximum erreicht. Dann wird das Mycel abfiltriert und aus dem Filtrat wird das angestrebte Produkt isoliert und gereinigt.

Cleomycine haben die Eigenschaft, daß sie mit Kupfer(II)-ionen Komplexe bilden (nachstehend als "Kupfer enthaltende Form" abgekürzt). An erster Stelle werden aus dem Filtrat des Kulturmediums Cleomycine in dieser Kupfer enthaltenden Form isoliert, die leicht in die kupferfreien Cleomycine umgewandelt werden können (letztere werden nachstehend als "kupferfreie Form" bezeichnet).

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Tabelle I

Nr.	Name der zugesetzten Amlno- verbindung	Name des Cleomycins und Formel des endständigen Aminorestes
1	3-Aminopropyl-dlmethy.l-sulfonlum- bromid > H.ydrobromide	3-s,s-Dimethylmercaptopropylamino- cleomycin Cl · (CH₃)₂-S-(CH₂)3-NH-
2	Agmatin sulfat	ij-G'-ianidinobutylaminocleomycin NH NH₂-C-NH-(CH₂)J₁₁-NH-
3	1,2-Diaminoäfchan·	2-Aminoäthylaminocleomycin NH₂-(CH₂)₂-NH-
i\|	1,3-Diaminopropan	3-Aminopropylaminocleomycin NH₂-(CH₂J₃-NH-
5 '	1, i\|-Di ami nob ut an	4-Aminobutylaminocleomycin NH₂-(CH₂)^-NH-

CO hO CD

Fortsetzung Tabelle I

O (O

6	S permldin	3- (.^--Aminobuty lamino )propylamino- cleomycin NH₂- CCH₂) jj-NH- (CH₂) 3-NH-
7	N,N-Dimethy1-1,2-diaminoäthan	2-N,N-Dimethylamino äthylaminocleomyein CH__V ^öJ N-(CH₉)p-NH- CH₃^ ^d
8	NjN-Diäthyl-l^j-diaminoäthan	2-N,N-Diäthylaminoäbhlaminocleomycin CpHp-v * ° ^N-(CHp)₀-NH- C₂H/
9	N,N-Dimethy1-1,3-diaminopropan	3-N,N-D imethylaminopropylaminocleomyein CH^_x ⁰ /N-(CHp) o-NH- ^CH3
10	N,N-Diäthy1-1,3-diaminopropan	3-N, N-i)iäthy laminopropylaminoc leomy ein CpH(-\. ^d ° ^N-(CHp)^-NH- C₂H/ ³

OO CD

Fortsetzung Tabelle I

ο ο σ> -α

co ca

11	N-n-Buty1-Ν'-(.3-aminopropy I)- 1,3-dlaminopropan	3-(3-n-Butylaminopropylamino )- propylaminocleomycin ^{M y} J^ N- (CH₉) -J-NH-(CHp K-NH- _H ^ ^i s*
12	N-(2-Hydroxypropyl)-l,2-dlamino- äthan	2-(2-Hydroxypropylamino) äthylamino- cleomycin CH-,CH(OH)-CH„\ ^J / N-(CH₉)p-NH- H^
13	N-(3-Aminopropyl)piperazin	S-il-PiperazinyDpropylaminocleomycin /—\ N N-(CH„)o-NH- \ / 2 j
14	N-(1-Phenyläthy1)-N'-(3-amino- propyl)-l,3-diaminopropan	3-C3-(1-Phenyläthylamino)propylamino]- propylaminocleomycin Z^-VcH(CHo)N. ^s=^/ ^J ^N-(CHp)₅-NH-(CH₅)O-NH- H /^ ^J * ^J
15	1,2-Diaminopropan	2-Aninopropylaminocleomycin NH₂-CH(CH₃)-CH₂-NH-

oo

CD CT)

Fortsetzung Tabelle I

u> O O O

to

16	N-Methy1-1,3-diamlnopropan	S-Methylaminopropyläminocleomycin CIU \ ^J ^N-(CHp)-j-NH-	I
17	N-n-Butyl-1,3-diaminopropan	S-n-Butylaminopropylaminocleomycin ^H ^y ^N-(CH_?)_-NH-
18	3-Aninopropyl-trimethylammonlum - Chlorid	3-(NjN,N-Trimethylamino)propylamino- cleomycin Cl · (CH,)_qN-(CHp)o-NH-
19	N-[3-CN,N-DLmethylamino)propyl]- 1,3-dlaminopropan	3-C3-(N,N-Dimethylamino)propyl]- propylaminocleomycin (CH₃)₂N-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-NH-
20	N,N- BLs(3-amlnopropyl)methyl- amin	3-[N-Methy1-N-(3-aminopropyl)]amino- propylaminocleomycin OH₃ NH₂-(CH₂)₃-N-(CH₂)₃-NH-

VO I

CD KJ

OJ K)

Fortsetzung Tabelle I

ο ο ο»

21	N-(3-AmIno-l-methylpropyI)-1,3- diaminopropan	3- (3-Mino-l-methylpropylamino) - propylamines leomycin NH₂-(CH₂J₂-CH(CH₃)-NH-CCH₂)₃-NH-
22	N-(3-Aminopropyl)pyrrolidin	3-(l-iyrrolidinyl)propylaminocleomycin r~^N-(CH₂)3-NH- ·
23	' N-(3-A^iinopropyl) piperidin	3- ELperidinopropylaminocleomycin /~~V-(CH₂) ₃-NH-
24	N-(3-Aminopropyl)morpholin	S-MDrpholinopropylaminocleomycin 0 N-(CH₂)3"NH-
25	N-(2-Aminoäthy1)piperazin	2-(l- ELperazinyl) äbhylaminocleomycin N N-(CH_n)5-NH-
26	N-[3-(l-Pyrrolidinyl)propyl]- 1,3-diaminopropan.	3-C3-(l-Eyrrolidinyl)propylamino]- propylaminocleomycin I N-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-NH-

Fortsetzung Tabelle I

27

N- (3-Hperizinopropy 1 )-l, 3-diaminopropan 3-(3-Piperizinopropylamino)propy1-aminocleomycin

28

N-(3-Morpholinopropyl)-l,3-diaminopropan 3-(3-Morpholinopropylamino)propy1-amlnocleomycin

O N-(CH₂)₃-NH-(CH₂) -NH-

29

N,N-Bl.s(3-aminop%Opyl)piperazin 3-[^-(3-Aminopropyl)piperazin-l-yl]-propylaminocleomycin

NH ₂-(CH

N-(CH ₂)₃-NH-

30

N-(3-Hydroxypropy1)-1,3-diaminopropan. 3-(3-Hydroxypropylamino)propylaminocleomycin

HO-

N- (CH₀ K-NH-2

31

N-(3- Ifethoxypropyl)-l,3-dlaminopropan 3-(3-M2thoxypropylamino)propylaminocleomycin

CHoO-

N-(CH₂)₃-NH-

Fortsetzung Tabelle I

ο ο σ>

CO CJt

32	N-B enzy1-1,3-diaminopropan	3-Benzylaminopropylamiriocleojnycin ^N=^{/ X} N- CCH₉) --NH- _H/ * *
33	Ν-[ (s)-l '-Phenyl äthyl]-l, 3- diaminopropan	3-[Cs)-I'-Phenylathylamino]propy1- aminocleomycin ^V CH(CHo)_n ^=S ² ^N-(CH₂) _q-NH-
3¹»	m- Xy Iy le η diamin	m-Aminomethylbenzylamlnocleomycin ^CH₂-NH- NH₂-CH₂-K__/
35	p-X yIylendiamin	p-Aminomethylbenzylaminocleomycin NHp-CHp-^y- CH₂-NH-
36	N-Cy clohexy 1-1,3-diaminopropan	3-Cyclohexylaminopropylaminocleomycin fn\— NH-C CH₂ )₃-NH-

Fortsetzung Tabelle I

37	N-(3-Cyclohexylaminopropy1)-l,3- diaminopropan.	-.	3-(.3-Cyclohexylaminopropylam±no)- propylaminocleomycin \Üj- NH-(CH₂) ₃~NH-CCH₂) ₃-NH-	I
38	N-(2-Furfury1)-1,3-diaminopropan	3-(2-Furfurylamino)propylaminocleomycin 1 _ol>— CH₂-NH- (CH₂) ₃-NH-
39	4-Plperidylmethylamin	H-Piperidylmethylaminocleomycin HN ^ ^-CH₂-NH-
HO	2-(4-Imidazolyl)äthylamin	2-(i\|-lTnidazolyl)äthylaminocleomycin H f*ll 1 U (CH₂J₂-NH-
ill	N-[2-(2-Pyridyl)äthyl]- 1,3-diaminopropan	3-[2-(2-Pyridyl)äthylamino]propylamino- cieomycin Cj₁JL- CH₂CH₂-NH- (CH₂) 3"NH-

Fortsetzung Tabelle I

	N-(6-Hydroxyhexyl)-l,3-diamino- propan	3-(6-Hydroxyhexy lamino )propylamino- cleomycin HO-CCHp).. ^d ^ö > N-(CH₂),-NH-
ή 3	N- (3-A.mlnopr opy I)-1,3-diamlno- propan	3- (3- .Aninopropylamino )propylamino- cleomycin NH₂-(CH₂)₃-NH-(CH₂)3"NH-
	N-(3-Aminopropyl)-l.6-diamino- hexan	3-(6-Aminohexylamino)propylamino- cleomycin NH₂-(CH₂)g-NH-(CH₂)₃~NH-
*5	N-(3-Benzylaminopropy1)-l,3- diaminopropan	3-(3-B enzylaminopropylamino)propy1- aminocleomycin ^A-CH_2x V=/ ^C ; N- (CH ₀ )--NH-(CH₉) o-NH-
lJ6	N-(3-Aminopropy1)-N- (3-benzylaminopropyl)- methylamin	3-CN-Me thy1-N-(3-benzylaminopropyl)]- aminopropylcleomycin ( VCH_?\ I ³ \=/ ^c .N-(CH₉)--N-(CH₉) --NH- _H/ ι ^i

Zur Gewinnung und Reinigung der Cleomycine sind alle bekannten Methoden anwendbar, die für Bleomycine verwendet werden, welche in physikalischen und chemischen Eigenschaften den Cleomycinen analog sind. Dies geschieht, wie nachfolgend beschrieben wird, durch eine geeignete Kombination von bekannten Flüssigchromatographietechniken. So wird z.B. das Filtrat des Kulturmediums durch eine Säule geleitet, welche mit einem schwach sauren Kationenaustauscherharz, z.B. Amberlite IRC-50 (H⁺-Form, von Rohm & Haas Co.) gepackt ist, um die angestrebte Substanz zu * adsorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird das Adsorbat mit verdünnter Salzsäure eluiert. Die Fraktionen, die eine Aktivität gegenüber einem Testmikroorganismus Mycobacterium smegmatis ATCC 607 zeigen, werden gesammelt und mit Natriumhydroxid neutralisiert. Sodann wird zum Entsalzen durch eine Säule geleitet, die mit einem Adsorptionsharz vom makronetzförmigen Typ, z.B. Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas Co.) bepackt ist, um die angestrebte Substanz zu adsorbieren. Nach dem Waschen, der Säule mit - · Wasser wird das Adsorbat mit wäßrigem Methanol, das mit Salzsäure angesäuert worden ist, eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, mit einem schwach basischen Anionenaustauscherharz, z.B. Dowex 44 (OH"-Form von Dow Chem. Corp.), neutralisiert und sodann bei vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Hierdurch wird ein entsalztes rohes bräunliches Pulver erhalten. Dieses wird in Methanol oder wäßrigem Methanol aufgelöst und die Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit neutralem Aluminiumoxid gepackt ist, wobei das gleiche Lösungsmittel verwendet wird. Bei der Elution mit dem gleichen Lösungsmittel wie oben werden bläulich-grüne Fraktionen erhalten. Diese werden eingeengt und zu einem Pulver zur Trockene eingedampft. Das Pulver wird in destilliertem Wasser aufgelöst und

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durch eine Säule von Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals Inc.) geleitet. Nach der Elution mit destilliertem Wasser werden gelbe färbende Stoffe eliminiert und es werden blaue Fraktionen erhalten. Diese werden erneut in destilliertem Wasser aufgelöst und durch eine Säule geleitet, die mit CM-Sephadex C-25 (Na⁺-Form, Pharmacia Fine Chemicals Inc.) gepackt ist, wobei destilliertes Wasser verwendet wird. Blaue Fraktionen, die Cleomycine enthalten, werden gewonnen, indem mit einer wäßrigen Lösung, die Natriumchlorid enthält, in einer solchen Weise eluiert wird, daß die Natriumchloridkonzentration in dem Elutionsmittel allmählich bis zu 1 Mol/l erhöht wird. Wenn zwei oder mehrere Arten von Cleomycinen gebildet werden, dann werden diese bei dem obengenannten Prozeß abgetrennt und gesondert gewonnen. Diese Fraktionen werden auf die beschriebene Weise entsalzt, wobei Amberlite ΧΑΌ-2 verwendet wird, und lyophilisiert. Auf diese Weise wird ein rohes blaues Pulver, das Cleomycin enthält, erhalten.

Übliche cleomycinerzeugende Stämme erzeugen Bleomycine als Nebenprodukt. Das durch die oben beschriebenen Reinigungsstufen erhaltene Cleomycinpulver ist daher mit dem Bleomycin mit dem gleichen endständigen Aminorest wie derjenige von Cleomycin verunreinigt. Es wurden daher ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um gereinigtes Cleomycin zu erhalten, das von Bleomycin frei ist.

Als Ergebnis wurde ein Flüssigchromatographieverfahren entwickelt, bei dem eine Säule verwendet wird, die mit einem Adsorptionsharz vom makronetzförmigen Typ, z.B. Amberlite XAD-2 oder Diaion HP-40 (Mitsubishi Chemical Co.) gepackt ist, oder eine Säule, die mit chemisch gebundenem Siliciumdioxid, das im Handel für die Umkehrphasenchroma-

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tographie verwendet wird, z.B. LiChroprep (E. Merck Inc.), Type RP 8 oder Type RP 18 oder PrepPak 500/C 18 Cartridge (Waters Assoc. Inc.) gepackt ist.

Cleomycin hat eine stärkere Affinität für das obengenannte Packmaterial im Vergleich zu Bleomycin, das den gleichen endständigen Aminorest hat. Demgemäß gestattet die Entwicklung durch ein geeignetes Lösungsmittelsystem die Eliminierung von Bleomycin, wobei dieses früher als das Cleomycin eluiert wird. So wird beispielsweise eine wäßrige Lösung des obengenannten rohen Pulvers auf eine Säule aufgegossen, die mit einem Harz, z.B. Amberlite XAD-2, gepackt ist. Durch Entwicklung mit destilliertem Wasser oder wäßrigem Methanol wird das Bleomycin früher eluiert und eliminiert. Das späte Eluat, das Cleomycin enthält, wird gewonnen, konzentriert und lyophilisiert, wodurch ein reines Cleomycin (Kupfer enthaltende Form) in Form eines blauen amorphen Pulvers erhalten wird. Wenn das Zwischeneluat, das sowohl Cleomycin als auch Bleomycin enthält, in die obengenannte Säule zurückgeführt wird, um erneut der Adsorption und Elution unterworfen zu werden, (dieses Vorgehen wird nachstehend als "Zurückführung" bezeichnet) dann kann eine weitere Menge von reinem Cleomycin gewonnen werden. Die ZurückfUhrung kann, wie erforderlich, wiederholt werden.

Die Methanolkonzentration des obigen Elutionsmittels wird zweckmäßigerweise entsprechend der Hydrophobizität des zu erzeugenden Cleomycins erhöht. Im allgemeinen kann eine geeignete Konzentration von weniger als 80% (Volumen/ Volumen) ausgewählt werden. Die Trennwirkung kann gesteigert werden, wenn man zu dem Elutionsmittel ein Salz, wie Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumsulfat, Ammonium-

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sulfat, Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumacetat, Ammoniumformiat, Natriumeitrat, Natriumdihydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat, zusetzt oder wenn man eine Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure oder Zitronensäure, zum Zwecke der pH-Einstellung zusetzt.

Das beschriebene Verfahren ist anwendbar, wenn andere Typen von Packmaterialien, z.B. das obengenannte chemisch gebundene Siliciumdioxid bzw. die oben erwähnte chemisch gebundene Kieselsäure, verwendet werden. Die gemessenen Retentionszeiten bei der Umkehrphasen-Flüssigchromatographie von Cleomycinen (Kupfer enthaltende Form), die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind, sind in Tabelle II zusammengestellt.

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Tabelle II

Verbindung Nr. Retentionszeit (min)

(gleich wie in Lösungsmittel 1 Lösungsmittel 2

Tabelle I)

6 11 12 13 14 18 19 20 21 24 26 28 31 32 33 37 40 41 42 43 44 45 46

Fußnote: Chromatographische Säule: chemisch gebundenes Siliciumdioxid

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	9,44
	14,61
	6,47
	6,64
	8,23
	7,39
8,52	14,78
	7,91
	11,65
14,95	>30
	8,47
	9,90
	7,38
	8,30
	9,97
	11,55
	11,23
7,90	14,67
15,54	>30
21,22	>30
11,40	18,65
	10,93
12,13	22,41
9,30	20,00
	6,41
	7,45
10,24	21,61
13,50	>30

Mlcrobondapack C 18 (4 mm χ 300 mm, Waters Assoc. Inc.)

Lösungsmittel 1: wäßrige Lösung (enthaltend Λ% Kaliumacetat und 0,5% Essigsäure): Methanol = 65 : 35 Volumen/Volumen

Lösungsmittel 2: Die gleiche wäßrige Lösung wie oben:

Methanol = 70 : 30 Volumen/Volumen.

Das so erhaltene Cleomycin (Kupfer enthaltende Form) wird nach bekannten Methoden, beispielsweise unter Verwendung von EDTA (US-PS 3 929 993) von Kupfer befreit, wodurch die kupferfreie Form erhalten wird.

Nachstehend wird ein Beispiel für diese Methode gegeben: Die Kupfer enthaltende Form von Cleomycin wird in destilliertem Wasser aufgelöst und die Lösung wird auf eine Säule aufgegossen, die mit Amberlite XAD-2 gepackt ist, um die gelösten Stoffe zu adsorbieren. Die Säule wird nacheinander mit einer wäßrigen Lösung, enthaltend 2% Natrium-" chlorid und 5% Äthylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz, (nachstehend als "EDTA.Na2" bezeichnet), mit einer wäßrigen Lösung, enthaltend 2% Natriumchlorid, zur Entfernung von überschüssigem EDTA.Na₂, und mit destilliertem Wasser gewaschen. Sodann werden durch Elution mit einem sauren wäßrigen Methanol, z.B. 0,02N-SaIzsäure-Methanol (1 : 4 Volumen/Volumen), die Fraktionen gesammelt, die ein Ultraviolettabsorptionsmaximum nahe der Wellenlänge 290 m 11 haben. Das gesammelte Eluat wird unter Verwendung von Dowex 44 (0H~-Form) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, unter vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch die kupferfreie Form von Cleomycinhydrochlorid als fahles gelblich-weißes amorphes Pulver erhalten wird. Wenn beispielsweise verdünnte Schwefelsäure anstelle der

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genannten verdünnten Salzsäure verwendet wird, dann wird das angestrebte Produkt in Form des Sulfats erhalten. Ein nicht-toxisches Salz von Cleomycin mit einer beliebigen, jedoch pharmazeutisch annehmbaren Säure kann in der Weise erhalten werden, daß die in der oben beschriebenen Elutionsstufe verwendete Säure entsprechend ausgewählt wird.

Die Ultraviolettabsorptionsspektren der Cleomycine (Kupfer enthaltende Form), die erfindungsgemäß hergestellt worden sind, haben Maxima in der Nähe der Wellenlängen 292 mu und 243 mu, die sehr nahe an denjenigen der Bleomycine liegen. Die genannten Spektren (nachstehend als Ultraviolettabsorptionsspektren vom Bleomycintyp bezeichnet) unterscheiden sich im Vergleich mit denjenigen der Antibiotika, die zu der Ehleomycin-Bleomycin-Gruppe gehören, eindeutig von den Spektren der Phleomycine, Zorbamycine und der Substanz YA-56.

Zersetzungsprodukte gemäß Tabelle III werden erzeugt, wenn" die Cleomycine mit 6N-Salzsäure 24 h bei 105°C hydrolysiert werden. Wie aus Tabelle III ersichtlich wird, haben die Cleomycine im Gegensatz zu den Bleomycinen das Merkmal, daß sie kein L-Threonin erzeugen. Bezüglich dieses Punkts ergeben im Vergleich zu den anderen Antibiotika mit Ultraviolettabsorptionsspektren vom Bleomycintyp TaI-lysomycin und Platomycin L-Threonin, bilden jedoch keine 2^t-(2-Aminoäthyl)-2,4^l-bithiazol-4-carbonsäure und sie unterscheiden sich daher eindeutig von den Cleomycinen. Auch Zorbonomycine unterscheiden sich eindeutig davon, da sie ß-Hydroxy-L-valin erzeugen, obgleich sie kein L-Threonin bilden. Bei den Victomycinen beträgt der Schwefelgehalt nur 1,98%, während Cleomycine eine Schwefel enthaltende Aminosäure, 2'-(2-Aminoäthyl)-2,4'-bithiazol-4-carbonsäure,

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als Bestandteil enthalten und der Schwefelgehalt, selbst bei dem Cleomycin mit dem kleinsten Schwefelgehalt, so viel wie etwa k% beträgt. Victomycine haben die obengenannte Schwefel enthaltende Aminosäure nicht und sie sind daher von Cleomycinen unterscheidbar.

Tabelle III

Produkt der säurekatalysierten Cleomycin Bleomycin Hydrolyse

1. L-Threonin - +

2. ß-Amino-ß-(A—amino-ö-carboxy-5-methylpyrimidin-2-yl)-propionsäure + +

3. ^Amino^-hydroxy^-methyl-

n-pentansäure + +

4. ß-Hydroxy-L-histidin + +

5. ß-Amino-L-alanin + +

6. 2'-(2-Aminoäthyl)-2,4'-bithiazol-4-carbonsäure + . +

7. endständiges Amin + +

Weiterhin wurden die 'c-NMR- und Protonen-NMR-Spektren von repräsentativen Cleomycinen, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, gemessen. Auf der Basis dieser Ergebnisse und der chemischen Eigenschaften wurde die chemische Struktur von Cleomycin untersucht und es wurde bestätigt, daß sie die neue Struktur gemäß der vorstehend angegebenen Formel I darstellt.

Die Protonen-NMR-Spektren wurden von Cleomycinproben in schwerem Wasser bei einer Frequenz von 100 MHz unter Verwendung von Tetramethylsilan als externem Standard gemessen. Ein breites Signal, welches den Cleomycinen

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gemeinsam ist und 4 Protonen entspricht, wurde bei einer chemischen Verschiebung S von etwa 1,2 (ppm) beobachtet. Dieses Signal wurde der Methylengruppe (4 und 5) in der Partialstruktur der neuen Formel:

(III)

HO

zugeordnet.

Es wurde festgestellt, daß diese Partialstruktur durch die obengenannte Hydrolyse zu 1-Amino-2-butanon durch Spaltung des Cyclopropanrings und Decarboxylierung zersetzt wird.

1 ^

Die -^C-NMR-Spektren der Cleomycine wurden bei einerFrequenz von 25,2 MHz in schwerem Wasser gemessen, wobei Dioxan als interner Standard verwendet wurde. Als typisches Beispiel werden die Spektren von 3-[(s)-1'-Phenyläthylaminoj-propylaminocleomycin wie folgt angegeben: Als Signale, die für Cleomycine gemeinsam und ihrer Grundstruktur zuordenbar sind, wurden die folgenden 51 Signale beobachtet, die von Kohlenstoffatomen ausgingen: (£) 178,0, 176,9, 172,1, 172,0, 171,0, 169,8, 168,5, 166,1, 165,4, 163,8, 163,1, 158,7, 153,0, 149,3, 147,6,

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137,6, 135,4, 125,7, 119,9, 118,6, 113,1, 99,0, 98,3, 75,4, 75,2, 74,4, 73,8, 71,2, 70,0, 69,2, 68,8, 67,9, 65,6, 61,8, 61,2, 60,4 (x2), 57,8, 56,3, 53,3, 46,3, 47,7, 43,6, 40,9, 39,9, 32,9, 15,6, 12,7 (x3) und 11,7. Weiterhin wurden als Signale (6), die dem endständigen Aminorest zuordenbar sind, 136,2, 130,3, 130,1 (x2), 128,3 (x2), 59,0, 45,3, 37,0, 26,3 und 19,3 beobachtet. Das heißt, es wurden insgesamt 62 Signale, die von Kohlenstoffatomen ausgingen, beobachtet. Diese Werden urden bezüglich der Signale von Bleomycinen analysiert, die in der Literatur angegeben werden [Naganawa et al. "Journal of Antibiotics"., _3_0, 388 (1977)]. Die Ergebnisse bestätigten die Formel Bezüglich der Partialstrukturformel III wurde die folgende Zuordnung gemacht.

172,1 (1), 56,3 (3), 60,4 (2), 12,7 x 2 (4 und 5), wobei die Zahlen in Klammern die Positionszahlen der entsprechenden Kohlenstoffatome angeben.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von typischen Cleomycinen sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Typische Beispiele von biologischen Aktivitäten, die bei Cleomycinen (kupferfreie Form) gemessen wurden, werden nachstehend angegeben.

(1) Antimikrobielle Aktivität:

Ein Vergleich wurde mit den relevanten Bleomycin-Antibiotika durchgeführt. Die relative antimikrobielle Aktivität (u/mg) gegen Mycobacterium smegmatis ATCC 607 wurde nach der Agarplattenzylindermethode gemessen, wobei Bleomycin A₂ als Standard (1000 u/mg) verwendet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

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Tabelle IV-1

Physikalische und chemische Eigenschaften

Verbindung (Kupfer enthaltende Form)

(vgl. Tabelle I)

Cleomycin Nr. 1 Cleomycin Nr. 2
Hydrochlorid Hydrochlorid

(1) Aussehen

(2) Löslichkeit

(3) Farbreaktion

^ (4) Molekularformel und Molekularer» gewicht

u, (5) Schmelzpunkt (Zers.) (⁰C)

(6) Ultraviolettabsorptionsmaxima (in destilliertem Wasser)

Wellenlänge mu (molekularer Extinktionskoeffizient ε) blaues amorphes Pulver

löslich in Wasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Methanol

dto.
dto.

positiv bei Dragen dorf f-, Ehrlich-, Pauly-, Rydon-Smith- Reagentien	wie in der letzten Spal te; zusätzlich positiv gegenüber Sakaguchi- Reagenz	I
^C56^H83^N17^S3°21^Cl2^Cu	^C56^H84^N20°21^S2^Cl2^Cu	Ul
1561,01	1571,97	I
205 bis 208	197 bis 201
292 (1,81 χ 10^)	292 (1,89 χ 10⁴)

243 (2,25 x 10⁴)

243 (2,34 χ 10⁴)

CO K) CTJ

Fortsetzung Tabelle IV-1

(7) Zirkulardichroismus

(in destilliertem Wasser)

(°), Wellenlänge λ (mu )

(8) Dünnschichtchromatographie, Rf-Wert (vgl. Fußnote 1)

(9) relative elektrophoretisch^ Mobilität, Rm-Wert (Rm von L-Alanin = 1) (vgl. Fußnote 2)

O	230	43	5	0	230	79
+27000	253	VJl	+25000	253	64
-14000	312	-13000	312
+ 4100	565	+ 4200	565
- 1700	678	- 1700	678
(D o,	(D 0,
(2) 0,	(2) 0,

0,88

0,82

Fußnote 1 (a) Silicagel 6OF 254 (Merck Inc.), Methanol-10% wäßriges Ammoniumacetat-10% wäßriges Ammoniak (10:9:1 VoI./VoI.)

(b) Avicel SF (RMC Corp.). n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15s10:3:12 Vol./Vol.)

Fußnote 2: Avicel SF, Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25:75:900 Vol./Vol.), 800 V, 15 min

Fortsetzung Tabelle IV-1

	Cleomycin Nr. 11 Hydrochlorid	Cleomycin Nr. 20 Hydrochlorid	Cleomycin Nr. 33 Hydrochlorid
	dto.	dto.	dto.
	dto.	dto.	dto.
	wie bei Cleomycin Nr. 1	wie bei Cleomycin Nr. 1. Zusätzlich positiv gegen über Ninhydrin-Reagenz	wie bei Cleomycin Nr. 2
σ	Cg₁HQgN₁gO₂₁S₂Cl₃Cu 1665,57	^58^90^19^21S₂Cl₃Cu 1623,49	^C62^H88^N18°21^S2^Cl2^Cu 1620,06
ο	189 bis 192,	• 193 bis 195	203 bis 205
α»	292 (1,83 x 10⁴)	292 (1,91 x 10⁴)	292 (1,90 χ 1(T)
	243 (2,25 x 10⁴)	243 (2,35 x 10⁴)	243 (2,32 χ 10⁴)
3793

ο fOCM moo ΚΜΓ\ν- VOt-CVl CM tO ΙΓ\νΟ v_^w>^ v.^w CO 00 Ιίλ

C^- O- CO

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+ 1 + I ^ v^

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KMTVT- VOt^

CMCMtO ITv VO

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O O OO ·>·»·» OO OO O O τ-Ο O irwf OO tOT- <^n ^-^. VOt- t-CM CM I + I w w +

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Tabelle IV-2

Physikalische und chemische Eigenschaften

(1) Aussehen

(2) Löslichkeit

(3) Farbreaktion

Molekularformel und Molekulargewicht

Schmelzpunkt (Zers.) (⁰C)

Ultraviolettabsorptionsmaxima (in 0,1N-NCl)

Wellenlänge, mu (molarer Extinktionskoeffizient ε)

(6)

Verbindung (kupferfreie Form) (vgl. Tabelle I) Cleomycin Nr. 1 Cleomycin Nr. 2 HydroChlorid Hydrochlorid

fahl-gelblich-weißes
amorphes Pulver

löslich in Wasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Methanol

dto.

positiv gegenüber Dragen-wie in der letzten Spaldorff-, Ehrlich-, Pau-Iy-» Rydon-Smith- und
Ninhydrin-Reagentien

^C56^H85^N17^S3°21^C12

1499,47
182 bis 185

290 (1,67 x 10⁴)

240 (2,17 x 10⁴)
(Schulter)

te; zusätzlich positiv gegenüber Sakaguchi-Reagenz

^S2^C12 1510,44 185 bis 188

(1,63

290

240 (2,19 x (Schulter)

10⁴) ⁴

Fortsetzung Tabelle IV-2

230
290
320

-15000 (; + 2500 (290. - 500 (320,

(7) Zirkulardichroismus -16000
(in 0,1N-HCl) + 2600

W²J (°) Wellenlänge Amu - 700
λ /

(8) DUnnschichtchromatographie (1) 0,39 (1) 0,69 Rf-Wert (vgl. Fußnote 1) _{(2) 0>42 (2)} _Q^_Q

(9) relative elektrophoretische
Mobilität, Rm-Wert (Rm von

_o L-Alanin = 1) (vgl. Fußnote 2) 1,00 0,98

ο Fußnote 1: (a) Silicagel 60 F 254 (Merck Inc.), Methanol-10% wäßriges Ammoniumacetat- ι °» 10% wäßriges Ammoniak (10:9:1 Vol.-/Vol.) 4>

"^ (b) Avicel SF (FMC Corp.). n-Propanol-Pyridin-Esslgsäure-Wasser

° (15:10:3:12 Vol./Vol.) '

«o Fußnote 2: Avicel SF, Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25:75:900 Vol./Vol.), 800 V, w 15 min

Fortsetzung Tabelle IV-2

Cleomycin Nr. 11 Hydrochlorid	Cleomycin Nr. 20 Hydrochlorid
dto.	dto.
dto.	dto.
wie bei Cleomycin Nr. 1	wie bei Cleomycin
^C61^H98^N19°21^S2^C13	^C58^H92^N19°21^S2^C13
1604,04	1561,96
172 bis 175	* 193 bis 195
290 (1,64 χ 10⁴)	289 (1,69 x 10⁴)
240 (2,10 χ 10⁴) (Schulter)	240 (2,19 x 10⁴) (Schulter)

Cleomycin Nr. Hydrochlorid

O O Oi

dto.

löslich in Wasser, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid

wie bei Cleomycin Nr.

^C62^H90^N18°25^S3

1583,68 189 bis 290 (1,62 χ 10⁴)

240 (2,09 x 10⁴) (Schulter)

ooo
kvcjvcm

CVJ(M KV

v-^ ο ο i>-

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OJ VO v-O O O ·> ·· ·» OOO O O V-

n
incvj ^-^ '-^

v- v-CVj

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	Tabelle V
Verbindlang Nr.	antimikrobielle Aktivität
(vgl. Tabelle I)	(u/mg)
1	1320
2	3262
3	2760
4	2150
5	1935
6	3575
11	7942
12	2280
13	980
14	11420
18	878
19	2004
20	2273
21	2620
24	800
26	3590
28	1715
31	1869
32	6977
33	10949
37	14784
40	1147
41	6068
42	4806
43	2790
44	3520
45	8400
46	7660

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(2) Aktivität gegenüber kultivierten HeLa-S,-Zellen:

Die 50^-Hemmkonzentration (LD₅₀) wurde bei einem Testcleomycin (Nr. 33) und bei Bleomycin Ap als Referenzverbindung anhand der prozentualen Wachstumshemmung, gemessen bei HeLa-S,-Zellen, bestimmt, nachdem die Zellen in Gegenwart der einzelnen Verbindungen kultiviert worden waren. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt .

Tabelle VI

Verbindung (kupferfrei, Hydrochlorid) ^50 ^PsM^-)

Bleomycin A₂ (Referenzverbindung) 0,73

Cleomycin Nr. 33 0,77

Aus den oben angegebenen Ergebnissen wird ersichtlich, daß die Cleomycine eine antimikrobielle Aktivität haben, die in keiner Weise derjenigen der Referenzverbindung Bleomycin Ap unterlegen ist. Hinsichtlich der Anti-HeLa-Aktivität hat Cleomycin Nr. 33, ein repräsentatives Cleomycin, eine Aktivität, die nahezu gleich derjenigen von Bleomycin A₂ ist, welche Verbindung derzeit zur klinischen Behandlung von schuppigem Zellkarzinom verwendet wird. Diese Ergebnisse weisen auf die Eignung von Cleomycinen als Chemotherapeutikum zur Behandlung von bakteriellen Infektionen oder von Krebs hin.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von 3-C(s)-1'-EhenyläthylaminoJ-propylaminp cleomyc in

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Stufe A: Streptomyces verticillus NK 68-144 (ATCC 31307), kultiviert in einem Agarsehrägmedium, wurde in ein Impfmedium (pH 7,0) inokuliert, das 2% Glucose, 0,3% Natriumchlorid, 0,75% Pepton und 0,75% Fleischextrakt enthielt. Es wurde 24 h lang bei 27°C eine Schüttelkultur durchgeführt, wodurch eine Impfkultür erhalten wurde. Ein Produktionskulturmedium (120 1, pH 7,0), enthaltend 10% Stärkesirup, 1% Glucose, 5% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellflüssigkeit, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Zinksulfat (Heptahydrat), 0,05% Kupfersulfat (Pentahydrat) und 0,2% Natriumnitrat, wurde in einem Edelstahltank mit einer Kapazität von 200 1 sterilisiert und mit 2,5 Vol.-% der oben beschriebenen Impfkultür inokuliert. Danach wurden 0,1%, bezogen auf das Medium, von N-[(s)-1'-PhenyläthylJ-1,3-dimainopropan zugesetzt. Nach187-stündiger Kultivierung bei 27⁰C unter Belüftung und Rühren wurde die Kultivierung abgebrochen und das Medium wurde unter Verwendung eines Filterhilfsmittels filtriert, wodurch 115 1 KuI-turfiltrat erhalten wurden. Nach der Einstellung des pH-Werts mit Salzsäure auf 7,0 wurde das Material durch eine 7-1-Säule geleitet, die mit Amberlite IRC-50 (H⁺-Form) gepackt war, um die angestrebte Substanz zu adsorbieren. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Adsorbat mit 0,5N-Salzsäure eluiert. Die Fraktionen, die gegenüber Mycobacterium smegmatis ATCC 607 aktiv waren, wurden gesammelt und mit IN-Natriumhydroxifllösung neutralisiert.

Sodann wurde das Material durch eine 2-1-Säule geleitet, die mit Amberlite XAD-2 gepackt war, um die angestrebte Substanz zu adsorbieren. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Adsorbat mit einem Gemisch aus 0,01N-SaIζsäure und Methanol (1 : 4 Vol./Vol.) eluiert, um aktive Fraktionen

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302732δ

zu sammeln. Die gesammelten Fraktionen wurden mit Dowex (OH~-Form) neutralisiert, eingedampft und unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde mit Methanol extrahiert. Der in Methanol lösliche Teil wurde durch eine 400-ml-Säule geleitet, die mit neutralem Aluminiumoxid gepackt war, wobei Methanol verwendet wurde, das 20% (Vol./ Vol.) Wasser enthielt. Durch Elution mit dem obengenannten Lösungsmittel wurden bläulich-grüne Fraktionen gesammelt und bei vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst und durch eine 2-1-Säule geleitet, die mit Sephadex G-25 gepackt war. Das Adsorbat wurde mit destilliertem Wasser eluiert. Blaue Fraktionen wurden gesammelt und durch eine 2-1-Säule geleitet, die mit CM-Sephadex C-25 (Na⁺-Form) gepackt war, um die angestrebte Substanz zu adsorbieren. Das Adsorbat wurde mit wäßriger Natriumchloridlösung in einer solchen Weise eluiert, daß die Natriumchloridkonzentration in dem Elutionsmittel allmählich auf 1 Mol/l erhöht wurde. Die blauen Fraktionen, die bei Natriumchlorid-' konzentrationen von etwa 0,45 Mol/l herausflossen, wurden gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden auf die oben angegebene Weise entsalzt, wobei Amberlite XAD-2 verwendet wurde, worauf zur Trockene eingedampft wurde. Auf diese Weise wurden 11,7 g eines rohen blauen Pulvers erhalten.

10 g des obengenannten blauen Pulvers wurden in destilliertem Wasser aufgelöst und die resultierende Lösung wurde in eine Säule von Amberlite XAD-2 (Volumen 1,4 1) eingegossen, welche zuvor mit einem Entwicklungslösungsmittel, nämlich einem Gemisch aus 0,02 Mol/l wäßriger Essigsäure-Methanol (75 : 25 Vol./Vol.), ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Die Säule wurde mit dem obengenannten Lösungs-

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mittels entwickelt. Die Bleomycin enthaltenden Fraktionen, die früher mittels eines Ultraviolettdetektors festgestellt wurden, wurden eliminiert. Die spaten Eluatfraktionen, die die angestrebte Substanz enthielten, wurden gewonnen und die Zwischenfraktionen wurden zurückgeführt. Dieses Entwicklungsvorgehen wurden 7-mal wiederholt. Die Fraktionen, die die angestrebte Substanz enthielten, wurden in jedem Zyklus gewonnen. Alle gewonnenen Fraktionen wurden miteinander kombiniert und mit 1N-Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Das Material wurde, wie oben beschrieben, entsalzt, wobei Amberlite XAD-2 verwendet wurde,, unter vermindertem Druck konzentriert und schließlich lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 3,2 g des Hydrochlorids des angestrebten Produkts (Kupfer enthaltende Form) als blaues amorphes Pulver erhalten.

Die Ultraviolettabsorptionsmaxima und die antimikrobielle Aktivität dieses Produkts waren wie folgt:

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

Wellenlänge mn (^El „_m> ⁱⁿ destilliertem ^{r Ί} ^cm Wasser)

292 (117)

243 (143)

antimikrobielle Aktivität: 11300 u/mg (Fußnote: Die antimikrobielle Aktivität wurde bestimmt, indem Bleomycin A₂ als 1000 u/mg genommen wurde und indem Mycobacterium smegmatis ATCC 607 als Testbakterium verwendet wurde. Danach wurde das Gleiche durchgeführt).

Stufe B: 3g des Kupfer enthaltenden Produkts, erhalten in der vorhergegangenen Stufe A, wurden in 50 ml destil-

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liertem Wasser aufgelöst. Zur Entfernung des Kupfers wurde die Lösung in eine Säule (500 ml) von Amberlite XAD-2 eingegossen. Die Säule wurde nacheinander mit 1 1 einer wäßrigen Lösung, enthaltend 2% Natriumchlorid und 5% EDTA.Ka₂, mit 1 1 einer 2%igen wäßrigen Natriumchloridlösung und mit 1 1 destilliertem Wasser gewaschen. Sodann wurde das Adsorbat mit einem Gemisch aus 0,0211-Schwefelsäure-Methanol (1 : 4 Vol./Vol.) eluiert und die Fraktionen mit einem Absorptionsmaximum um die Wellenlänge von 290 mη herum wurden gesammelt. Die gesammelte Lösung wurde mit einem Anionenaustauscherharz Dowex 44 (OH"*-Form) auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und sodann bei vermindertem Druck konzentriert und lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 2,6 g des angestrebten Produkts (Sulfat in kupferfreier Form) als fahles gelblich-weißes amorphes Pulver mit einer Ausbeute von 90% erhalten.

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

^m? ^(E1^%cm' ⁱⁿ 0,1N-HCl) 290 (102)

240 (Schulter) (132) antimikrobielle Aktivität: 10949 u/mg.

Beispiel 2 Herstellung von 3-[N-Methyl-N-(3-aminopropyl)]-aminopropylaminocleomycin

Stufe A: Die Kultivierung in flüssigem Medium, wie in Stufe A des Beispiels 1 beschrieben, wurde durchgeführt, wobei, bezogen auf das Medium, 0,1% N,N-Bis-(3-aminopropyl)-Diethylamin als -Aminoverbindung zugesetzt wurden.

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Aus dem-FiItrat des kultivierten Mediums wurden 13,2 g eines rohen blauen Pulvers in der gleichen Weise wie in Stufe A des Beispiels 1 erhalten. 5 g des rohen Pulvers wurden in destilliertem V/asser aufgelöst und die Lösung wurde in eine Säule (Volumen 1 l) von Amberlite XAD-2 eingegossen. Durch Entwickeln mit destilliertem Wasser wurde der größte Teil des Bleomycins eluiert und ein kleiner Teil des Bleomycins zusammen mit der angestrebten Substanz blieb auf dem Harz zurück. Das Entwicklungslösungsmittel wurde zu einem Gemisch aus Ο,ΟΙΝ-Salzsäure-Methanol (1 : 4 Vol./Vol.) abgeändert, um die angestrebte Substanz zu eluieren. Das Eluat wurde mit 0,1N-Natriumhydroxid neutralisiert und das Methanol wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde erneut der oben beschriebenen Chromatographie unterworfen, um das Bleomycin zu entfernen. Die erhaltenen Fraktionen, die die angestrebte Substanz enthielten, wurden unter vermindertem Druck konzentriert und sodann lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 1,2 g des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in Kupfer enthaltender Form) als blaues amorphes Pulver erhalten.

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

mn (9? , in destilliertem Wasser)

292 (118)

243 (145)

antimikrobielle Aktivität: 2300 u/mg

Stufe B: 1g des Produkts in der Kupfer enthaltenden Form, erhalten in der vorhergegangenen Stufe A, wurde in 20 ml

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destilliertem Wasser aufgelöst und, wie in Stufe B des Beispiels 1 beschrieben, von Kupfer befreit. Auf diese Weise wurden 702 mg des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in kupferfreier Form) als fahles gelblich-weißes amorphes Pulver mit einer Ausbeute von 73% erhalten.

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

mu (E^_m, in 0,1N-HCl)

/ I CIQ

289 (108)

240 (Schulter) (14O) antimikrobielle Aktivität: 2273 u/mg.

Beispiel 3 Herstellung von 3-[N-Methyl-N-(3-aminopropyl)}· aminopropylaminocleomycin

100 mg des in der Stufe A des Beispiels 2 erhaltenen rohen Pulvers wurden in 5 ml destilliertem Wasser aufgelöst und die Lösung wurde in eine Säule von LiChroprep RP-8 (25 mm χ 310 mm) eingegossen, die zuvor mit einem Entwicklungsmittel, nämlich einem Gemisch aus Λ% wäßriger Ammoniumacetatlösung-Methanol (87,5 : 12,5 Vol./Vol.), ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Entwicklungslösungsmittel bei einer Fließgeschwindigkeit von 4,25 ml/min 7 h lang bei Raumtemperatur entwikkelt. Das frühere Eluat, das Bleomycin enthielt, wurde eliminiert und das nachfolgende Eluat, das die angestrebte Substanz enthielt, wurde gewonnen. Es wurde auf die gleiche Weise unter Verwendung von Amberlite XAD-2, wie in Stufe A des Beispiels 1 beschrieben, entsalzt, konzen-

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triert und lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 38 mg des angestrebten Produkts (HydroChlorid in Kupfer enthaltender Form) als blaues amorphes Pulver erhalten.

Beispiel 4 Herstellung von 4-Guanidinobutylaminocleomycin

Stufe A: Ein Produktionskulturmedium, wie in Stufe A des Beispiels 1 beschrieben, wurde in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben in Mengen von jeweils 110 ml eingegeben. Es wurde sterilisiert und mit 5 Vol.-% der Impfkultür, die in dem gleichen Beispiel genannt wurde, inokuliert. Sodann wurden als Aminoverbindung 0,5% Agmatinsulfat zugesetzt.

100 der oben erwähnten Proben wurden hergestellt und 8 h bei 27° C unter Verwendung eines Drehschüttlers kultiviert. Danach wurden die kultivierten Proben kombiniert und filtriert, wodurch 8,5 1 Filtrat als Kulturbrühe erhalten wurden.

Das Filtrat wurde in der gleichen Weise, wie in Stufe A des Beispiels 1, behandelt, wodurch 1,2 g eines rohen blauen Pulvers erhalten wurden. 200 mg des rohen Pulvers wurden in 5 ml destilliertem Wasser aufgelöst und die Lösung wurde in eine PrepPak-500/C18-Patrone (5,7 cm χ 30 cm) eingegossen, die zuvor mit einem Gemisch aus einer wäßrigen Lösung, enthaltend 1% Kaliumacetat und 0,5% Essigsäure-Methanol (7 : 3 Vol./Vol.), ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Sodann wurde unter Verwendung einer Hoengeschwindigkeits-Flüssigchromatographie-Vorrichtung für präparative Zwecke die Entwicklung durchgeführt, indem das gleiche Mischlösungsmittel, wie oben erwähnt, mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/min 80 min bei Raumtemperatur durch-

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geleitet wurde. Während dieser Entwicklung wurde eine dreimalige Zurückführung durchgeführt und Fraktionen der angestrebten Substanz wurden gewonnen. Die gewonnene Lösung wurde unter Verwendung von Amberlite XAD-2 wie in Stufe A des Beispiels 1 entsalzt, konzentriert und lyophilisiert. Auf diese Weise wurden 80 mg des angestrebten Produkts (HydroChlorid in Kupfer enthaltender Form) als blaues amorphes Pulver erhalten.

Die Ultraviolettabsorptionsmaxima und die antimikrobiell Aktivität dieses Produkts waren wie folgt:

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

mil (e] __, in destilliertem ¥asser) / ι cm

292 (120)

243 (152)

antimikrobiell Aktivität: 3350 u/mg.

Stufe B: 70 mg Produkt in der Kupfer enthaltenden Form, erhalten in der vorhergegangenen Stufe A, wurden in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst und, wie in Stufe B des Beispiels 1 beschrieben, von Kupfer befreit. Auf diese Weise wurden 60 mg des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in kupferfreier Form) als fahles gelblich-weiBes amorphes Pulver mit einer Ausbeute von 89% erhalten.

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

mp (^Εϊ*αα» 0,1N-HCl)

290 (109)

240 (Schulter) (146)

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antimikrobielle Aktivität: 3262 u/mg.

Beispiel 5 Herstellung von 3-S,S-Dimethylmercaptopropylamino· cleomycin

Stufe A: Die Kultivierung in flüssigem Medium, wie in Stufe A des Beispiels 4 beschrieben, wurde unter Zugabe von, auf das Medium bezogen, 0,1% 3-Aminopropyldimethylsulfoniumbromid.Hydrobromid als Aminoverbindung durchgeführt.

Aus dem Filtrat der Kulturbrühe wurden 1,6g eines rohen blauen Pulvers in der gleichen Weise, wie in Stufe A des Beispiels 1 beschrieben, erhalten. Durch Behandlung von 200 mg des rohen Pulvers auf die gleiche Weise, wie im Beispiel 4 beschrieben, wurden 76 mg des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in Kupfer enthaltender Form) als blaues amorphes Pulver erhalten.

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

Λ θ/

mu (E_-1 ^/0__, in destilliertem Wasser) / ι cm

292 (117)

243 * (145) antimikrobielle Aktivität: I36O u/mg.

Stufe B: 70 mg des Produkts in der Kupfer enthaltenden Form, erhalten in der vorhergegangenen Stufe A, wurden in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst und, wie in Stufe B des Beispiels 1 beschrieben, von Kupfer befreit. Auf diese

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Weise v/urden 61 mg des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in kupferfreier Form) als fahles gelblich-weißes amorphes Pulver in einer Ausbeute von 91 % erhalten.

Die Ultraviolettabsorptionsmaxima und die antimikrobielle Aktivität des Produkts waren wie folgt:

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

nyi (Eltern' ⁱⁿ 0,1N-HCl)

290 (112)

240 (Schulter) (146)

antimikrobielle Aktivität: 1320 u/mg.

Beispiel 6 Herstellung von 3-S,S-Dimethylmercaptopropylaminocleomycin

Die Kultivierung in flüssigem Medium, wie in Stufe A des Beispiels 1 beschrieben, wurde ohne Zugabe irgendeiner Aminoverbindung durchgeführt.

Aus dem Filtrat des kultivierten Mediums wurden 6,7 g des angestrebten Produkts, 3,7 g 4-Guanidinobutylaminocleomycin und 320 mg 3-(4-Aminobutylamino)-propylaminocleomycin jeweils als rohes blaues Pulver durch die gleiche Behandlung wie in Stufe A des Beispiels 1 erhalten. Durch Behandlung von 200 mg des rohen Pulvers des angestrebten Produkts in der gleichen Weise, wie im Beispiel 4 beschrieben, wurden 68 mg des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in Kupfer enthaltender Form) als blaues amorphes Pulver erhalten.

Beispiel 7 Herstellung von 4-Guanidinobutylaminocleomycin Das angestrebte Produkt (Hydrochlorid in Kupfer enthalten-

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der Form) wurde erhalten, indem 200 mg des rohen Pulvers des angestrebten Produkts, das im Beispiel 6 erhalten worden war, in der gleichen Weise, wie im Beispiel 4 beschrieben, behandelt wurden.

Beispiel 8 Herstellung von 3-(4-Aminobutylamino)-propylaminocleomycin

Stufe A: 70 mg des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in Kupfer enthaltender Form) wurden erhalten, indem 200 mg des rohen Pulvers des angestrebten Produkts, erhalten im Beispiel 6, in der gleichen Weise, wie im Beispiel 3 beschrieben, behandelt wurden.

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

mu (E-I „m» ⁱⁿ destilliertem Wasser) / ι cm

292 (119)

243 (146)

antimikrobielle Aktivität: 3520 u/mg.

Stufe B: Durch Entfernung des Kupfers aus 50 mg des Kupfer enthaltenden Produkts, das in der vorhergegangenen Stufe A erhalten worden, in der gleichen Weise, wie in Stufe B des Beispiels 1 beschrieben, wurden 38 mg des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in kupferfreier Form) als fahles gelblich-weißes amorphes Pulver mit einer Ausbeute von 79% erhalten.

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Ultraviolettabsorptionsmaxima:

mil (e]^/0 ,'in 0,1N-HCl)

290 (98)

240 (Schulter) (128)

antimikrobielle Aktivität: 3575 u/mg.

Beispiel 9, Herstellung von 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylaminocleomycin

Stufe A: Die Kultivierung in flüssigem Medium, wie in Stufe A des Beispiels 1 beschrieben, wurde unter Zugabe von, auf das Medium bezogen, 0,1% N-n-Butyl-N^!-(3-aminopropyl)-1,3-diaminopropan als Aminoverbindung durchgeführt.

Aus dem Filtrat des kultivierten Mediums wurden 8,3 mg eines rohen blauen Pulvers auf die gleiche Weise wie in Stufe A des Beispiels 1 erhalten. Durch Behandlung von 5 g des rohen Pulvers auf die gleiche Weise, wie in Stufe A des Beispiels 2 beschrieben, wurden 740 mg des angestreb-' " ten Produkts (Hydrochlorid in Kupfer enthaltender Form) als blaues amorphes Pulver erhalten.

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

mil (E_{1 cm}, in destilliertem Wasser)

292 (111)

243 (136)

antimikrobielle Aktivität: 8130 u/mg.

Stufe B: In 20 ml destilliertem Wasser wurden 700 mg des Kupfer enthaltenden Produkts, erhalten in der vorher-

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gegangenen Stufe A, aufgelöst und das Produkt wurde von Kupfer wie in Stufe B des Beispiels 1 befreit. Auf diese Weise wurden 525 mg des angestrebten Produkts (Hydrochlorid in kupferfreier Form) als fahles gelblich-weißes amorphes Pulver mit einerAusbeute von 78% erhalten.

Ultraviolettabsorptionsmaxima:

m^ (^E1^%cm» ⁱⁿ °»

290 (103)

240 (Schulter) (132)

antimikrobielle Aktivität: 7942 u/mg.

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Claims

PATENTANWÄLTE

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER ■ DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELEX O5-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

2640 WK/rm

ZAIDAN HOJTJnT BISEIBUTSU KAGAKU KENKYU KAI Tokyo / Japan

Neue Cleomycin-Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung

Patentansprüche 1. Neue Cleomycin-Antibiotika der allgemeinen Formel:

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NH,

O=C

N.

N N

^CH

I

NH,

_P ^/ V

° CH-H

I³I Ii

Q HO CH N C

O CH C ^XCH NH

Ii

CH

CH HO

CH

^ΧίΓ"ί^Ν ο Π

A_n'

CH,

CH_n

HOCH,

OH

^xc⁷| c—"ο

IHi ;

OH H 1 H

Il

C-R

c I ο Ι

0H| H

O NH₀

^0H

worin R einen endständigen Aminorest des Cleomycins "bedeutet, sowie nicht-toxische Salze davon.

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2. Cleomycin-Antibiotika und nicht-toxische Salze davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R einen endständigen Aminorest der allgemeinen Formel:

X-R₁₁ -NH-

bedeutet, in der R₁₁ für Alkylen oder eine Gruppe der allgemeinen Formeln:

- Y₁ - R₁₃ - oder - R₁₂ - Y₁ - R₁₃ - Y_£ -

steht (wobei ^R-]£» ^R13 ^¹*^{10 R}i4 Jeweils eine Alkylengruppe bedeuten und Y₁ und Y₂ jeweils eine Gruppe der allgemeinen Formel -N- /wobei R₁ für Wasserstoff oder eine niedere

Alkylgruppe steht/ oder eine Gruppe der Formel -N^ N-

oder ~\j bedeuten) und X für eine Gruppe der Formel:

NH

■■ 1 I

₉ -NH-C-NH_p , -N ,

~^ΝΓ~) ' "^Nv_y° * ~\_/^N~^Rl * ^₁J ' "Π

■0 «- O

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steht (wobei R^ die oben angegebene Bedeutung hat, R₂, R, und Rß jeweils für eine niedere Alkylgruppe stehen und R^ und Rc jeweils für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe stehen).
3. Cleomycin-Antibiotika und nicht-toxische Salze davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Gruppierung aus der Gruppe (CH,)₂-S-(CH₂K-NH-,

NH

CH-,-(CH₂) -N-(CH₂) ₃-NH-, and ^-CH (CH₃)-NH-(CH₂) ₃"NH-
4. 3-S,S-Dimethylmercaptopropylaminocleomycin.
5. 4-Guanidinobutylaminocleomycin.
6. 3-(3-n-Butylaminopropylamino)-propylaminocleomycin.
7. 3-[N-Methyl-N-(3-aminopropyl)]-aminopropylaminocleomycin.
8. 3-C(S)-1'-Hienyläthylamino J-propylaminocleomycin.
9. Verfahren zur Herstellung von neuen Cleomycin-Antibiotika, dadurch gekennzeichnet , daß man einen cleomycinerzeugenden Stamm von Streptomyces verti-

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cillus in ein Kulturmedium inokuliert, den Stamm kultiviert und Cleomycine der allgemeinen Formel:

NH₀

²

O=C H

I

HoO. N

NH,

,CH. ,NH,

N N

CH. H

I³I II

HO CH N 'C

C O CH C CH NH

CH- I I I I ! I

N C CH O C CH

¹CH N CH. HO ι

CH,

CH

C C HOCH,/ / O

OH

H'

C. .C-CH₂OH

OH H

I O I

OH I H

O NH.

^0H

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ORlGiNAL INSPECTED

in der R für einen endständigen Aminorest der Cleomycine steht, gewinnt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Kulturmedium verwendet, das ein aliphatisches primäres Amin mit zwei oder mehreren basischen Gruppen im Molekül enthält.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als cleomycinerzeugenden Stamm Streptomyces verticillus NK 68-144 (ATCC 31307) verwendet.

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