CH641804A5

CH641804A5 - Antibiotische neplanocine.

Info

Publication number: CH641804A5
Application number: CH490879A
Authority: CH
Inventors: Masaru Otani; Satoshi Yaginuma; Masatoshi Tsujino; Naoki Muto; Tetsu Saito; Tadashiro Fujii
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1979-05-25
Publication date: 1984-03-15
Also published as: SU906388A3; DK149313C; NL7903318A; SE7903672L; CA1128882A; GB2021582B; DE2954197C2; HU192741B; IT1115245B; DK149313B; SE443576B; DK177079A; DE2917000A1; IT7922957A0; MX5788E; DE2917000C2; ES480384A1; FR2426688B1; NL182231C; FR2426688A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue antibiotische Neplanocine, welche hemmende Wirkung auf für Pflan-zenpathogene Mikroorganismen sowie eine Antitumorwir-kung aufweisen, und auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue antibiotische Neplanocine und ein Herstellungsverfahren für dieselben, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Neplanocine erzeugender Actinomycetes Ampullariella sp. A11079 FERM-P No. 4494 in einem Nährmedium gezüchtet wird und die neuen antibiotischen Neplanocine aus dem Kul- • turmedium isoliert werden. Die vorliegende Erfindung um-fasst ferner Neplanocin-D-Derivate, welche abgeleitet sind von Neplanocin-D.

Die neuen antibiotischen Neplanocine der vorliegenden Erfindung bestehen aus Neplanocin-A, -C, -D und dessen Derivaten, -B und -F.

Neplanocin-A ist eine schwach basische Substanz, welche folgende physikochemische Eigenschaften aufweist:

(1) Elementaranalyse:

gefunden: C 49,96%, H 5,00%, N 26,43%

berechnet: C 50,19%, H 4,97%, N 26,60%.

(2) Molekulargewicht:

(berechnet aus der Massenspektrumanalyse): 263.

(3) Bruttoformel: Cn Hi3N503.

(4) Schmelzpunkt:

(bestimmt durch thermale Analyse): 216 °C.

(5) Spezifische Drehung:

W D = -157° (c = 0,45%, H20).

(6)Ultraviolett-Absportionsspektrum: (14 y/ml)

in Wasser: siehe Fig. 1

A,max = 263 mjx, e]^0 = 602,1 1 cm

1 0/

bei pH 3: Ä,max = 261 mjx, Et = 566,4

1 cm bei pH 10: A,max = 263 m|i, e| ^ = 595,0.

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr): siehe Fig. 2. Absorptionsbanden bei 3360,3200,2920,1640,1600,

1570,1480,1415,1370,1330,1300,1250,1205,1160,1115, 1080,1050,1005,910,850,790,730 cm-'.

(8) Kernmagnetresonanzspektrum:

siehe Fig. 3 (interner Standard-DSS, in Deuterium Dime-thylsulfoxid, 100 MHz).

(9) Löslichkeit:

Löslich in: Wasser, Dimethylsulfoxid, Dimethylform-amid, Essigsäure und wässerigem Aceton.

Unlöslich in: Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Hexan.

(10) Farbreaktionen:

Positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat, Periodat-oxidation und Anisaldehyd.

Negativ: Ferrichlorid, Ninhydrin, Anilinphthalat, Molisch und Fehling.

(11) Natur: schwach basisch.

(12) Farbe: weisse Kristallnadeln.

(13) Rf-Werte (Silicagel, Tokyo Kasei Co.,

Silicagel f):

n-Butanol: Essigsäure: Wasser (6 :1: 1) Rf = 0,36 n-Butanol: konzentrierter wässeriger Ammoniak: Wasser (10: 0,5 : 2) Rf = 0,27

n-Propanol: konzentrierter wässeriger Ammoniak:Wasser (10:1 : l)Rf=0,41

Aceton : Wasser (10:1) Rf=0,34 Äthylacetat : Methanol : Wasser (10 : 2:1) Rf = 0,21 Chloroform : Methanol : Essigsäure (10 :2 : 1)

Rf=0,17.

(14) Chemische Struktur:

nh oh oh

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin-A sind die folgenden:

(1) Wachstumshemmende Wirkung auf für Pflanzen pa-thogene Pilze:

Eine 100 y/ml Lösung von Neplanocin-A auf einer Agar-Platte mit Helminthosporium oryzae M 0306 zeigt eine wachstumshemmende Zone von 18,9 mm Durchmesser.

(2) Antitumor-Wirksamkeit:

Tumorzellen von Murine leukemia L-1210 (106 Zellen) wurden intraperitoneal Mäusen eingeimpft und 1 Tag nach der Impfung wurde Neplanocin-A (je 0,16 mg/kg, 0,32 mg/kg, 0,63 mg/kg, 1,25 mg/kg und 5,0 mg/kg) intraperitoneal einmal täglich während 5 Tagen verabreicht. 10 Mäuse für die Kontrollgruppe und 7 Mäuse in jeder behandelten Gruppe wurden verwendet. Das Resultat ist in Fig. 4

4

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

641 804

dargestellt. Am 15. Tag der Beobachtung betrugen die durchschnittlichen Überlebungstage für die Kontrollgruppe 7,4 Tage. Eine Verlängerung der Lebensspanne im Vergleich mit der Kontrollgruppe wurde für die mit dem Mittel behandelten Gruppen beobachtet, und zwar 158% für die Gruppe mit 0,16 mg/kg, 170% für die Gruppe mit 0,32 mg/kg, keine Todesfälle wurden bei Verabreichung von 2,5 mg/kg und 5 mg/kg beobachtet.

Wie mit den L-1210-Tumorzellen wurde auch eine bemerkenswerte Lebensverlängerung bei Mäusen mit Ehrlich-Asci-tes-Tumor, Sarcoma-180, P-388-Leukämie und Ratten mit Yoshida-Sarcoma, wenn Neplanocin-A verabreicht wurde.

(3) Akute Toxizität:

LD50:13,7 mg/kg (i.p. Mäuse).

Es wurden keine Todesfälle beobachtet, wenn während 14 Tagen 5 mg/kg/Tag intraperitoneal verabreicht wurden.

Gebrauchsanweisung und Dosierung:

Für die Therapie von akuter Leukämie wird das Mittel intravenös verabreicht in einer Dosierung von 5 bis 20 mg/Tag, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, einmal täglich während 7 Tagen. Das Neplanocin-A wird auch wirksam für die Therapie von chronischer Leukämie, Gastroentero-Carci-nomen, Lungen-Carcinomen, Uterus-Krebs, Brustkrebs und maligner lymphatischer Leukämie verwendet.

Neplanocin-A kann in Form von physiologisch annehmbaren Salzen mit Mineralsäuren oder organischen Säuren, z.B. als Hydrochlorid, Acetat, Tartrat, Citrat oder Succinat, verwendet werden.

Neplanocin-C ist eine schwachbasische Substanz, welche die folgenden physico-chemischen Eigenschaften aufweist:

(1) Elementaranalyse:

gefunden: C 47,59%, H 4,64%, N 25,10%

berechnet: C47,31%, H4,66%, N25,09%.

(2) Molekulargewicht (berechnet auf der Massenspektral-Analyse): 279 [Tetraacetyl-Neplanoci-C: 447].

(3) Bruttoformel: CnH^NsO^

(4) Schmelzpunkt: (bestimmt durch Thermal-Analyse): 226 °C (Zersetzung). ~,

(5) Spezifische Drehung: [<x] = 43,6° (c=0,67%, H20).

D

(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: (16 y/ml)

1 0/

in Wasser: X max = 263 m(i, E j cm = 538,9 (s. Fig. 5) bei pH 3: A.max = 259 mji, eJ ^ =510,8

bei pH 10: k max=263 mn, E j = 534,4.

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr):

siehe Figur 6.

Absorptionsbanden bei 3450 bis 3100,2920,2740,2680, 1680,1630,1600,1560,1500,1460,1420,1380,1360,1330, 1300,1240,1200,1170,1100,1050,1020,960,920,900,880, 830,780,720,680 cm-'.

(8) Kernmagnetresonanzspektrum: s. Fig. 7 (interner Standard-DSS, in Deuterium Dimethylsulfoxid, 100 MHz).

(9) Löslichkeit:

Löslich in: Wasser, Dimethylsulfoxid, Dimethyl-formamid.

Unlöslich in: Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Hexan.

(10) Farbreaktionen:

Positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat, Periodat und Tollens.

Negativ: Ferrichlorid, Ninhydrin, Anisaldehyd und Molisch.

(11) Natur: schwach basisch.

(12) Farbe: weiss (farblose Kristallplatten).

s (13) Rf-Werte (Silicagel-Fleckenfilm, Tokyo Kasei Co., Silicagel f): n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6:1:1) Rf = 0,33; n-Butanol : konzentrierter wässeriger Ammoniak-: Wasser (10 : 0,5: 2) Rf=0,19; n-Propanol : konzentrierter wässeriger Ammoniak (10 : 1 : I) Rf = 0,30; Aceton : Wasser io (10 : 1) Rf=0,43; Äthylacetat : Methanol : Wasser (10 : 2 : 1) Rf=0,27; Chloroform : Methanol : Essigsäure (10:2: l)Rf= 0,20.

(14) Chemische Struktur:

15

20

h0-h2c oh oh

35

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin-C sind die folgenden:

(1) Wachstumshemmende Wirkung auf für Pflanzen pa-thogene Pilze:

100 y/ml-Lösung, Papierscheibe von 7 mm Durchmesser;

40 Helminthosporium oryzae M 0306 : 31,4 mm Inhibitionszone

Cladosporium herbarum M 4278 : 14,0 mm Inhibitionszone Alternaria kikuchiana M 4588 : 12,0 mm Inhibitionszone

(2) Akute Toxizität:

45 LD50: 55 mg/kg (i. p., Mäuse)

Neplanocin-C kann in Form von physiologisch annehmbaren Salzen mit Mineralsäuren oder organischen Säuren verwendet werden, z.B. als Hydrochlorid, Acetat, Tartrat, Citrat oder Succinat.

50 (3) Antitumor-Wirksamkeit:

Neplanocin-C hemmt das Wachstum einer murineleukä-mischen Zellkultur von L-5178Y in einer Konzentration von 0,8 y/ml in vitro vollständig.

Neplanocin-C weist eine Lebensverlängerungswirkung

55 von 131 % gegenüber der Kontrolle bei Murin-leukemia L-1210 auf, wenn es intraperitoneal in einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht wird.

Neplanocin-D weist die folgenden physicochemischen Eigenschaften auf:

(1) Elementaranalyse: C 49,70%, H 4,64%, N 21,20%.

(2) Molekulargewicht: (berechnet auf der Massenspektralanalyse): 264.

(3) Bruttoformel: C11H12N4O4.

(4) Schmelzpunkt: 236 bis 237 °C.

(5) Spezifische Drehung:

60

65

r i 23 M D

= —145° (c=0,6%, H20).

641 804

6

(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

1%

in Wasser: siehe Fig. 8, X max=251 mji, E j cm = 479

(5) Spezifische Drehung: [a]

24 D

-3,5

(c= 1,0%), Dimethylsulfoxid).

(6)Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

1%

in saurem Wasser: X max=251 mu, E, =453

1 cm

1%

in alkalischem Wasser: Ä,max = 256mu, E, =508

" 1 cm

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr):

siehe Fig. 9.

Absorptionsbanden bei 3420 bis 3120,2940 bis 2880, 1680,1580,1545,1510,1440,1390,1210,1110,1075,1040, 1000,990,975,900,845,780 cm-'.

(8) Kernmagnetresonanzspektrum: s. Fig. 10 (interner Standard-DSS, in Deuterium Dimethylsulfoxid, 100 MHz).

(9) Löslichkeit:

Löslich in: Wasser, Dimethylsulfoxid, Dimethylform-amid, Essigsäure und Pyridin.

Unlöslich in: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Hexan.

(10) Farbreaktionen:

Positiv: Entfernung von Kaliumpermanganat und Peri-odatoxidation.

Negativ: Ninhydrin, Fehling und Ferrichlorid.

(11) Farbe: weisse Kristallnadeln.

(12) Rf-Werte (Silicagel, Tokyo Kasei Co., Silicagel f): n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6:1:1) Rf=0,27; n-Buta-nol : konzentrierter wässeriger Ammoniak : Wasser

(10: 0,5 : 2) Rf=0,07; n-Propanol : konzentrierter wässeriger Ammoniak : Wasser (10 : 1:1) Rf=0,18; Aceton : Wasser (10:1) Rf=0,33.

(13) Chemische Struktur:

= 530,4

ho-h2c

10

1%

in Wasser: siehe Fig. 11, X max=262 m|i, E j cm in saurem Wasser (1 Tropfen 0,1 N HCl):

X max=259 mu, eJ ^ = 506,7 ^ 1 cm in alkalischem Wasser (1 Tropfen 0,1 N NaOH):

X max=263 mu, e! % = 522,2.

1 cm '

15

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr):

siehe Fig. 12.

Absorptionsbanden bei 3380,3280,3100,2920,2880, 2740,1700,1610,1570,1520,1480,1420,1380,1350,1300, 20 1250,1220,1170,1160,1100,1080,1030,1020,980,970,870, 840,790,730,710 cm"1.

(8) Kernmagnetresonanzspektrum: siehe Fig. 13, (interner Standard DSS, in Deuterium Dimethylsulfoxid, 100 MHz).

(9) Löslichkeit:

Löslich in: Wasser, Dimethylsulfoxid.

Unlöslich in: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Äthyläther.

(10) Farbreaktionen:

Schwach positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat. Negativ: Ninhydrin, Molisch und Anisaldehyd.

(11) Natur: schwach basisch.

(12) Farbe: weiss (weisse Kristallplatten).

(13) Rf-Werte (Silicagel f, Tokyo Kasei Co.) : n-Butanol-: Essigsäure : Wasser (6:1:1) Rf=0,42; n-Butanol : kon-

35 zentrierter wässeriger Ammoniak : Wasser (10 : 0,5 : 2) Rf=0,27; n-Propanol : konzentirerter wässeriger Ammoniak : Wasser (10 : 1: 1) Rf=0,41; Aceton : Wasser (10 : 1) Rf=0,48.

(14) Chemische Struktur:

nh2

25

30

40

45

50

55

oh oh

Die akute Toxizität von Neplanocin-D ist die folgende:

Es wurde kein Todesfall beobachtet, wenn 100 mg/kg Neplanocin-D interperitoneal an Mäuse verabreicht wurden.

Neplanocin-B weist die folgenden physicochemischen Eigenschaften auf:

(1) Elementaranalyse: C 47,44%, H 4,63%, N 25,07%.

(2) Molekulargewicht: (berechnet auf der Massen-spektrumanalyse): 279.

(3) Bruttoformel: CnH^^C^

(4) Schmelzpunkt: 269 bis 272 °C (Zersetzung).

hoh2c

60

Neplanocin-F weist die folgenden physicochemischen Eigenschaften auf:

65 (1) Elementaranalyse:

C 48,74%, H 4,83%, N 25,71% (enthält Kristallwasser). (2) Molekulargewicht (berechnet aus der Massenspektrumsanalyse): 263.

7

641804

(3) Bruttoformel: C, 1H|3N502.2 H20

(4) Schmelzpunkt: 223 °C (Zersetzung).

21

(5) Spezifische Drehung: [a] ^ = — 6,6 (c=0,8%, H20).

(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: . 0,

in Wasser: siehe Fig. 14 X max = 263 mu, E, 0 = 548,7 6 ^ 1 cm in saurem Wasser (1 Tropfen 0,1 N HCl):

X max = 260 mu, e! ^ = 527,1 r 1 cm in alkalischem Wasser (1 Tropfen 0,1N NaOH):

X max = 263 mji, eÎ ^ =531,8.

^ 1 cm

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr):

siehe Fig. 15.

Absorptionsbanden bei 3320,3210,2920,1650,1610, 1580,1480,1420,1380,1340,1310,1270,1220,1180,1110, 1070, 1020,980,900,840,800,730 cm'1.

(8) Kernmagnetresonanzspektrum: siehe Fig. 16.

(interner Standard DSS, in Deuterium Dimethylsulfoxid,

100 MHz).

(9) Löslichkeit:

Löslich in: Wasser, Dimethylsulfoxid und Essigsäure. Unlöslich in: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Äthyläther.

(10) Farbreaktionen:

Positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat.

Negativ: Ferrichlorid, Ninhydrin und Fehling.

(11) Natur: schwach basisch.

(12) Farbe: weiss (weisse Kristallnadeln).

(13) Rf-Werte (Silicagel f, Tokyo Kasei Co.) : n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6: 1 : 1), Rf= 0,51 n-Butanol : konzentrierter wässeriger Ammoniak : Wasser (10:0,5 : 2)

Rf = 0,43; n-Propanol : konzentrierter wässeriger Ämmo-niak : Wasser (10:1:1) Rf = 0,59; Aceton : Wasser (10 : 1) Rf= 0,48.

(14) Chemische Struktur:

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin-B und -F sind die folgenden:

(1) Akute Toxizität: Es wurden keine Todesfälle beobach-5 tet, wenn 100 mg/kg Neplanocin-B oder-F intraperitoneal an Mäuse verabreicht wurden.

(2) Hemmende Wirkung auf das Zellwachstum:

Das Wachstum von Mäuse-Lymphoma-Zellkultur L

5178 Y wurde bei Konzentrationen von Neplanocin B von 0,8 io y/ml und von Neplanocin-F von 20 y/ml gehindert.

(3) Antitumor-Wirksamkeit:

Neplanocin-B weist eine Lebensverlängerungswirkung von 142% im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle gegen Murin-Leukemia L-1210 auf, wenn es intraperitoneal in einer 15 Dosis von 50 mg/kg verabreicht wird.

(4) Weitere Wirksamkeit:

Neplanocin-B weist eine antidepressive Wirksamkeit auf.

Neplanocine erzeugende Mikroorganismen wurden aus 20 einer Bodenprobe isoliert, welche einem Zwiebelfeld in Niiga-ta-ken, Japan, entnommen wurde, und sie gehören zur Gattung Ampullariella. Der Stamm wurde als Ampullariella sp! A 11079 bezeichnet und in der Sammlung des Institute for Microbial Industry and Technolgy, Japan, unter der Num-25 mer FERM-P No. 4494 hinterlegt.

Ampullariella sp. A 11079 FERM-P No. 4494 weist folgende taxonomische Kennzeichen auf:

[I] Morphologische Eigenschaften:

30 Beobachtungen auf anorganische Salze - Stärke - Agar-medium bei 30 °C während 10 bis 15 Tagen Züchtung ergaben folgendes:

Der Stamm A 11079 erzeugt ein gebogenes (curved) und 35 verzweigtes Substratmycelium, 0,5 bis 0,8 (i Durchmesser, und ein schwaches unreifes Luftmycelium.

Auf dem Mycélium gewachsenes Sporangiophor weist Sporangien auf und die Form der Sporangien ist zylindrisch 40 oder flaschenförmig und ihre Grösse beträgt 5 bis 15 x 10 bis 25 fi. Manche Sporangiosporen sind in parallelen Ketten innerhalb des Sporangiums angeordnet.

45 Die Sporangiosporen sind beweglich mit Hilfe eines Büschels polarer Geissein in Wasser und sind stabförmig mit einer Grösse von 0,5 bis 1,0 x 1,0 bis 2,0 |i.

[II] Zusammensetzung der Diaminopimelinsäure:

so Die durch Analyse der ganzen Zelle nachgewiesene Diaminopimelinsäure ist vom Meso- und Hydroxy-Typus.

[III] Züchtungscharakteristiken auf verschiedenen Medien:

55 Die Beobachtung der Züchtungscharakteristiken auf verschiedenen Medien bei 30 °C während 20 Tagen ist in Tabelle I zusammengestellt. Es wurde kein Luftmycelium beobachtet, mit Ausnahme einer schwachen Bildung von unreifen Luft-mycelien auf anorganische Salze-Stärke-Agarmedium und « aufHafermehl-Agarmedium.

Die Angabe der Farbe erfolgt aufgrund der Angaben in «Color Harmony Manuel», vierte Ausgabe, 1958, veröffentlicht durch Container Corporation of America.

641804

Tabelle I:

Züchtungscharakteristiken auf verschiedenen Medien

Medium

Saccharose-Nitrat-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

Glycerin-Asparagin-Agar anorganische Salze-Stärke-Agar

Tyrosin-Agar

Hafermehl-Agar Hefe-Malz-Agar

Glucose-Hefeextrakt-Agar (Waksman-MediumNo. 28)*

Glycerin-Nitrat-Agar (Waksman-MediumNo. 1)*

Glucose-Nitrat-Agar (Waksman-Medium No. 1)*

Nähragar

Emerson's-Agar (W aksman-Medium No.28)*

Bennett's-Agar (Waksman-Medium No.30)*

Peptone Czapeck's -Agar

Hefeextrakt-Czapeck's-Agar

Tyrosin-Agar****

Pepton-Hefe-Eisen-Agar

Casein-Agar ****

Wachstum schwach bis mittel mittel bis schwach schwach bis mittel gut bis mittel schwach bis mittel gut gut bis mittel leicht wellig mittel bis gut

•mittel schwach bis mittel schwach gut bis mittel gut bis mittel mittel bis gut mittel bis gut schwach mittel bis schwach gut

Sporan- Farbe des Substratmyceliums gium wenig hellrose (3ca) bis hell-melonengelb (3ea)

wenig bambus (2fb) bis perlrose (3ca)

kein bambus (2fb) bis perlrose

(3ca)

gut bernstein (31c) bis pastell orange (4ic)

kein hellbernstein (3ic)

mittel bernstein (31c) bis leuchtend maisgelb (31a)

schwach topas (3ne) bis bernstein (3pe)

kein Zimt (3 le)

kein farblos bis bambus

(2fb)

kein farblos bis bambus

(2fb)

kein hellbernstein (3ic) bis zimt(31e)

kein zimt(31e)bis kamel (3ie)

kein bambus (3pe) bis topas (3ne)

wenig hellbernstein (3ic) bis bernstein (31c)

wenig bernstein (3 lc-3nc)

kein hellbraun (3gc) bis krebs (3ec)

kein hellbernstein (3ic)

kein kamel(3ie) bis zimt (3 le)

Lösliches Pigment kein kein kein kein kein kein schwach bernsteinfarbig (3pe)

goldbraun (3pg-3pi)

kein kein goldbraun (3pg)

goldbraun (3pg-3pi)

hellgoldbraun (3pg)

hellgold-brauch (3pg)

kein gewürznelkenbraun (3pl)

dunkelgewürz-brauch (4pl)

gewürznelkenbraun (3pl)

*Waksman, S.A., «The Actinomycetes», Band 2,1961, Seiten 327 bis 334, Wiliams & Wilkins Co.

**J. Elisha Mitchell, Sei. Soc., 79,54 (1963)

*** J. Virol., 3,210(1969)

**** J. Bacteriol., 69,147 (1955).

[IV] Physiologische Eigenschaften:

Die physiologischen Eigenschaften sind die folgenden:

(1) Verwertung von Kohlenstoffquellen:

641 804

(+: positiv, —

: negativ)

Kohlenstoff

Verwer

Kohlenstoff

Verw quelle tung quelle tung

L-Arabinose-

+

Salicin

+

D-Xyllose

+

D-Galactose

+

D-Glucose

+

Glycerin

+

D-Fructose

+

L-Sorbose

-

D-Mannose

+

Trehalose

+

D-Mannit

+

a-Melibiose

Inosit

-

D-Ribose

L-Rhamnose

+

Maltose

■

Saccharose

+

Melezitose

-

ß-Lactose

-

D-Cellobiose

+

Raffinose

—

D-Sorbit

-

Cellulose

-

Dulcit

-

Stärke

+

15

(2) Wachstumstemperaturen: 10 bis 45 °C.

(3) Wirkung auf Magermilch: Peptonisierung und Koagulation beide positiv.

(4) Melaninerzeugung: aufTyrosin-Agarmedium: negativ. Auf Pepton-Hefe-Eisen-Agarmedium: positiv.

(5) Stärkehydrolyse: positiv.

(6) Cellulosehydrolyse: negativ.

(7) Caseinhydrolyse: positiv.

(8) Gelatineverflüssigung: positiv.

(9) Tyrosinzersetzung: negativ.

(10) Xanthinzersetzung: negativ.

(11) Hypoxanthinzersetzung: negativ.

(12) H2S-Bildung: negativ.

(13) Nitratreduktion: negativ.

Aufgrund der obigen taxonomischen Daten, wobei der Stamm A 11079 Sporangien tragende Sporangiophore aufweist, welche auf verzweigtem Substratmycelium wachsen, und zylindrische oder flaschenförmige Sporangien, Sporangiophore angeordnet in parallelen Ketten innerhalb des Spo-rangiums, stabförmige Sporangiophore mit buschigen, polaren Geissein und Mesodiaminopimelinsäure aufweisen, gehört dieser Stamm zur Gattung Ampulariella, wie sich aus «key to the genera of family Actinoplanaceae» in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, Seiten 707 bis 708 ableiten lässt. Dieser Stamm wird daher als Ampullariella sp. A 11079 bezeichnet.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung der neuen Antibiotika Neplanocin-A, -C, -D und dessen Derivate, -B und -F.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung einer Neplanocin-Antibiotikagruppe, welche aktiv ist gegen pflanzenpathogene Pilze, Tumorzellen oder dergleichen.

Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert, in welchen:

Fig. 1 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Neplanocin-A,

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Neplanocin-A,

Fig. 3 ein Kernmagnetresonanzspektrum von Neplanocin-A,

Fig. 4 die Wirkung von Neplanocin-A auf an Leukämie L-1210 erkrankten Mäusen,

Fig. 5 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Nepla-nocin-C,

Fig. 6 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Neplanocin-C,

Fig. 7 das Kernmagnetresonanzspektrum von Nepla-nocin-C,

Fig. 8 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Neplanocin-D,

5 Fig. 9 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Neplanocin-D,

Fig. 10 das Kernmagnetresonanzspektrum von Neplanocin-D,

Fig. 11 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Nepla-10 nocin-B,

Fig. 12 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Neplanocin-B,

Fig. 13 das Kernmagnetresonanzspektrum von Neplanocin-B,

Fig. 14 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Nepla-nocin-F,

Fig. 15 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Neplano-cin-F, und

Fig. 16 das Kernmagnetresonanzspektrum von Neplano-20 cin-F darstellen.

Gemäss der vorliegenden Erfindung werden die Neplanocine nach dem in Patentanspruch 10 definierten Verfahren erhalten z.B. durch Züchtung eines Stammes Ampullariella sp. A 11079 FERM-P No. 4494 in einem geeigneten Nährmedium. Die Zächtung des Mikroorganismus kann auf verschiedenen Wegen erfolgen, z.B. in einem synthetischen Medium oder in einem natürlichen Medium, in flüssiger oder fester Kultur. Bei einer industriellen Erzeugung wird ein flüssiges Medium bevorzugt. Für die Zusammensetzung des Mediums können assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere für die Züchtung antibiotischer Neplanocine erzeugender Mikroorganismen geeignete Stoffe verwendet werden. Beispiele von Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Glycerin, lösliche Stärke, Melassen und dergleichen. Als assimilierbare Stickstoffquellen eignen sich Pepton, Maiseinweichflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Fleischextrakt, Reiskleie, Caseinhydrolysat, Nitrate, Ammoniumsalze und dergleichen. Ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid, Calcium-, Magnesium-, Eisen- oder Mangansulfat, kann ebenfalls verwendet werden. Gegebenenfalls kann ein Schaumverhinderungsmittel, wie z.B. ein Siliconöl oder Sojabohnenöl, zugesetzt werden.

Bei einer flüssigen Kultur wird submerse, belüftete Kultur 45 vorgezogen. In diesem Fall ist die Züchtungstemperatur derart ausgewählt, dass sie für den Mikroorganismus ein Optimum darstellt, das üblicherweise bei 25 bis 30 °C der Fall ist. Die Züchtungsdauer kann von den gewählten Bedingungen abhängen und beträgt im allgemeinen 2 bis 4 Tage. Das pH so des Mediums während der Züchtung wird bevorzugt neutral bis schwach sauer gehalten.

Das derart erhaltene Kulturmedium enthält antibiotische Neplanocine. Die Isolierung der antibiotischen Neplanocine kann nach üblichen Isoliermethoden oder Trennungsmetho-55 den für Mikroorganismenmetaboliten erfolgen. Da die Neplanocine schwach basische Substanzen sind, können sie durch Adsorption an geeignete Adsorbiermittel, gefolgt durch Eluierung mit einem entsprechenden Lösungsmittel isoliert werden. Beispiele geeigneter Adsorbentien sind Aktiv-60 kohle, Kationenaustauscherharz, aktives Aluminiumoxid oder Silicagel. Das Eluierungslösungsmittel kann nach dem jeweiligen Adsorbiermittel gewählt werden, z.B. eignen sich mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, wie wässeriger Methanol, wässeriges Aceton oder wässeriges Dioxan, 65 oder saure, alkalische oder Salzlösungen. Die Neplanocine können ferner aufgrund der schwachbasischen Natur der Substanzen isoliert und gereinigt werden. So können die Antibiotika an Kationenaustauscherharze, wie «Amberlite

30

35

40

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10

IRC-50» (Marke von Rohm and Haas Co., USA) oder «Dowex 50» (Marke von Dow Chemical Co., USA) adsorbiert und mit einer geeigneten sauren, alkalischen oder Salzlösung eluiert werden.

Eine Kombination von Adsorptionsmittel und Ionenaustauscherharz kann bevorzugt für die Isolierung, Eluierung und Reinigung der Antibiotika verwendet werden.

Beispielsweise wird das Kulturfiltrat über ein Kationenaustauscherharz «Amberlite IR-120» geleitet, um die Antibiotika zu adsorbieren, mit einer alkalischen Lösung, wie z.B. 3,7N wässerigem Ammoniak, eluiert, um die aktive Fraktion zu erhalten, und nachdem das pH dieser Fraktion auf neutral bis schwach alkalisch eingestellt worden ist, werden die Antibiotika an Aktivkohle adsorbiert, gefolgt von einer Eluierung mit 70%igem Methanol. Das derart erhaltene Eluat wird an ein Anionenaustauscherharz «Amberlite IRA-410» adsorbiert und wiederum mit Wasser eluiert, um die aktiven Fraktionen zu erhalten. Die kombinierten Fraktionen werden konzentriert, um das rohe Material zu erhalten, und schliesslich gereinigt durch Silicagelchromatographie. Die weitere Reinigung erfolgt durch Umkristallisation. Die Reinheit als einzelne Substanz kann dadurch überprüft werden, dass nur ein einziger Schmelzpunkt oder ein einziger Punkt auf dem Papierchromatogramm, der Dünnschichtchromatographie und der Papierelektrophorese bei 263 mjA Ultraviolettlicht vorhanden ist.

10

Neplanocin-A kann ebenfalls aus Neplanocin-D über Neplanocin-D-Derivate wie folgt hergestellt werden:

Die drei Hydroxygruppen im Cyclopentenring von Neplanocin-D werden durch Umsetzung mit Benzoylchlorid geschützt. Eine Hydroxygruppe in der Adenin-Struktur von Neplanocin-D wird durch Umsetzung mit zum Beispiel Phos-phorpentasulfid in eine Mercaptogruppe umgewandelt, worauf die Schutzgruppe der Hydroxygruppe entfernt wird, um Neplanocin-D-Derivat der Formel III zu erhalten. Die Me-thylierung dieser Verbindung mit Hilfe von Methyliodid ergibt Neplanocin-D-Derivat der Formel IV. Das Neplanocin-D-Derivat der Formel IV wird mit methanolischem Ammoniak behandelt, um Neplanocin-A zu ergeben.

Ferner werden die drei Hydroxygruppen im Cyclopentenring von Neplanocin-D zum Schutz acetyliert durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid, worauf die erhaltene Verbin-20 dung durch Umsetzung mit Thionylchlorid in das Neplano-cin-D-Derivat der Formel [3] umgewandelt wird.

Das Neplanocin-D-Derivat der Formel [3] kann durch Behandlung mit methanolischem Ammoniak in Neplano-25 cin-A umgewandelt werden.

Diese Reaktionen können wir folgt dargestellt werden:

(1)

Benzoylchlorid hoh2c

)h oh Neplanocin-D

BzOH2C

OBz OBz (i)

h0h2c oh oh Neplanocin-D-Derivat (III)

Il

641804

CV

hohpc methanolisches Ammoniak

Neplanocin-A

Neplanocin-D-Derivat (IV)

(2)

Neplanocin-D —

acoh2c oac OAc Neplanocin-D-Derivat [3]

Neplanocin-A

Die physico-chemischen Eigenschaften von Neplanocin-D-Derivaten sind die folgenden:

(HI)

Molekulargewicht (berechnet aus der Massenspektrum-analyse) 280

Neplanocin-D-Derivate (IV)

294

Bruttoformel Cn H]2N403S C12H]4N403S

Schmelzpunkt 260-262 °C 177-178°C (Zers)

55

spezifische Drehung

60

(iii)

Neplanocin-D-Derivate (iv)

[a]g =-141,7

Ultra violett-

Absorptionsspek- 226 mp. trum (in H20) 324 m|i

65

(c=0,7, H20

222 mn 288 mn 295 mjx

Der Mikroorganismus FERM-P 4494 wurde am 16. Mai 1978 im Fermentation Research Institute, Agency of Indu-

641 804

strial Science and Industry, Inage, Chiba City, Japan, und unter der Nummer NRRL11451 am 21. März 1979 im Agricul-tural Research Service, Culture Collection Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt.

Beispiel 1

100 ml eines wässerigen Mediums (pH 6,5), welches 2% Glucose, 2% Stärke, 1% Hefeextrakt, 1% Caseinhydrolysat und 0,2% Calciumcarbonat (alles Gewichtsprozente) enthielt, wurden in einen 500 ml -Kolben eingefüllt und bei 120 °C während 15 Minuten sterilisiert. In zwei Kolben von diesem Medium wurde je eine Oese voll der Schrägkultur von Ampullariella sp. A 11079 FERM-P No. 4494 geimpft und bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet. Nach 4 Tagen wurde das Kulturmedium in 20 Liter desselben sterilisierten Mediums in einem 30 Liter Fermentierkolben übertragen und bei 30 °C mit einer Bewegung von 300 Touren pro Minute und einer Belüftung von 20 Liter/Minuten während 48 Stunden kultiviert.

Das derart erhaltene Kulturmedium wurde in 200 Liter wässeriges Medium (pH 6,5) übertragen, welches 4 Gewichtsprozent Glucose, 1 Gewichtsprozent Sojabohnenpulver, 0,4 Gewichtsprozent Fleischextrakt, 0,4 Gewichtsprozent Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,25 Gewichtsprozent NaCl und 0,1 % Calciumcarbonat enthielt, und bei 30 °C mit einer Umdrehung von 180 Touren pro Minute und einer Belüftung von 130 Liter/Minute während 40 Stunden kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe (etwa 200 Liter) wurde filtriert und das Mycélium mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden vereint, wobei etwa 140 Liter klares Filtrat mit einer Wirksamkeit von 57 mcg/ml als Neplanocin-A erhalten wurden.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 erhaltene Filtrat wurde über eine Säule aus 20 Liter Kationenaustauscherharz «Amberlite IR-120» (H+-Typus) geleitet, um das Material zu adsorbieren und die Säule mit 100 Liter Wasser gewaschen. Die Eluierung erfolgte mit 3,7 N wässeriger Ammoniaklösung, wobei das erste Eluat (30 Liter) verworfen wurde. 90 Liter der folgenden Fraktion wurden gesammelt, durch Zusatz von 6N HCl auf pH 8 eingestellt, dann durch eine Säule aus 4 Liter Aktivkohle geleitet, diese mit Wasser gewaschen und anschliessend mit 90 Liter 70%iger Methanollösung eluiert. Das derart erhaltene Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und ergab 1,5 Liter eines Konzentrates. Dieses Konzentrat wurde über eine Säule aus 10 Liter «Amberlite IRA-410» (OH_-Typus) geleitet und mit Wasser eluiert und das Eluat durch Zusatz von 4N HCl auf pH 7 eingestellt. Das Eluat wurde sodann im Vakuum konzentriert, das Material unter Kühlung ausgefällt und der Niederschlag filtriert, wobei 41,8 g rohes Neplanocin-A (Reinheit etwa 12%) erhalten wurden.

Das rohe Neplanocin-A (41,8 g) wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und über eine Säule aus 2 Liter Silicagel (8,3 x 40 cm) geleitet, welche mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : 28%igem wässerigem Ammoniak : Wasser (10: 0,2:1) bepackt worden war, und anschliessend mit demselben Lösungsmittelgemisch eluiert. Je 150 ml des Eluates wurden fraktioniert, und die aktiven Fraktionen wurden in den Fraktionen No. 24 bis 52 gefunden. Diese aktiven Fraktionen wurden gesammelt, im Vakuum konzentriert und unter Kühlung stehen gelassen.

Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und ergab 2,6 g rohes kristallines Neplanocin-A (Ausbeute: 32%).

Das rohe Neplanocin-A wurde in etwa 60 ml heissem Wasser gelöst und bei Zimmertemperatur stehen gelassen.

Die ausgeschiedenen weissen Kristallnadeln wurden abfiltriert und ergaben 2,01 g Kristalle von Neplanocin-A. (Ausbeute: 25,2%).

Beispiel 3

Das Filtrat (140 Liter, Wirksamkeit 300 mcg/ml als Neplanocin-C), welches nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten worden war, wurde über eine Säule aus 20 Liter Kationenaustauscherharz «Amberlite IR-120» (H+-Typus) geleitet, um das Material zu adsorbieren, und die Säule mit etwa 100 Liter Wasser gewaschen. Die Eluierung erfolgte mit 3,7N wässerigem Ammoniak, wobei die ersten 20 Liter des Eluates verworfen wurden. Die folgenden 100 Liter des Eluates wurden gesammelt, durch Zusatz von konzentrierter Salzsäure auf pH 8 eingestellt, dann durch eine Säule aus 4 Liter Aktivkohle geleitet, wieder mit Wasser gewaschen und anschliessend mit 70 Liter 70%iger Methanollösung eluiert wurde. Das derart erhaltene Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert auf 1,5 Liter. Dieses Konzentrat wurde gefriergetrocknet und ergab 83,6 g eines rohen Pulvers. (Reinheit: 29,5%).

83 g Des rohen Pulvers wurden in mit Wasser gesättigtem n-Butanol gelöst und über eine Säule aus 2 Liter Silicagel (8,3 x 30 cm) geleitet, welche mit n-Butanol gepackt worden war, und anschliessend mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : konzentrierter wässeriger Ammoniak : Wasser (10 : 0,2 : 1) eluiert. Es wurden Fraktionen von 150 ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen wurden in den Fraktionen No. 53 bis 108 gefunden. Diese aktiven Fraktionen wurden vereint, konzentriert und bei niederer Temperatur stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, und ergab 18,2 g Neplanocin-C als weisse Kristalle. (Reinheit: 96%; Ausbeute: 41,6%).

Diese Kristalle wurden in heissem Wasser gelöst und bei Zimmertemperatur stehen gelassen, wobei das Neplanocin-C als farblose Kristallplatten ausgeschieden wurden, welche abfiltriert wurden, um reines Neplanocin-C zu erhalten.

Beispiel 4

Zu dem Filtrat, welches nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurden 3,6 kg Aktivkohlenpulver zugesetzt. Nach Rühren während 40 Minuten wurde die Aktivkohle abfiltriert und gut mit Wasser gewaschen. Die Eluierung erfolgte mit 70%iger Methanollösung. 40 Liter des Eluates wurde im Vakuum zur Trockene verdampft und ergaben 80 g rohes Pulver, welches Neplanocin-D enthielt.

Die 80 g rohes Pulver wurde über eine Säule aus 6 Liter Silicagel, welche mit n-Propanol : konzentriertem wässerigem Ammoniak : Wasser (10:1:1) gepackt worden war, geleitet und anschliessend mit demselben Lösungsmittelgemisch eluiert. Je 600 g des Eluates wurden fraktioniert, und Neplanocin-C wurde in den Fraktionen No. 20 bis 37 gefunden. Diese aktiven Fraktionen wurden vereint, in Vakuum auf 30 ml konzentriert und unter Kühlung stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, wobei 460 mg rohes kristallines Neplanocin-D erhalten wurden.

Die 460 mg rohe Kristalle wurden in 3 ml heissem Wasser gelöst und über eine Säule aus «Sephadex G-15» (1850 ml, gepackt mit Wasser) geleitet, welche mit Wasser eluiert wurde. Je 100 ml des Eluates wurden fraktioniert, die Fraktionen No. 15 und 16 (200 ml) vereint und unter vermindertem Druck auf 20 ml konzentriert, welche bei Zimmertemperatur stehen gelassen wurden. 314 mg des ausgeschiedenen Neplanocin-D wurden in Form weisser Kristallnadeln erhalten.

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5

10

15

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25

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50

55

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Beispiel 5

(1) 376 mg Neplanocin-D wurden in 10 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und bei 55 °C stark gerührt. 0,9 ml Benzoylchlorid wurden sodann tropfenweise zu der Lösung zugesetzt und das Gemisch während 2 Stunden bei 60 bis 65 °C gerührt.

Anschliessend wurde die Lösung während 2 Stunden bei 40 bis 45 °C gehalten und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. 10 ml Wasser wurden unter Rühren zugesetzt, und nach 25 Minuten wurde das Gemisch unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft. Das trockene Material wurde in 30 ml Chloroform gelöst, dreimal mit je 10 ml IN HCl, dann zweimal mit IN Natriumbicarbonatlö-sung und schliesslich zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Die Chloroformschicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und anschliessend konzentriert, wobei 747 mg schwach crème-farbige Verbindung (I) erhalten wurden. (Ausbeute: 91%).

Die physico-chemischen Eigenschaften der Verbindung (I) waren die folgenden:

r t 23 _

M D

199° (c=0,6, Methanol)

323m»<E'°l

= 327,5)

Nach dem Abdestillieren des Methanols wurden etwa 50 ml Wasser zugesetzt und das pH durch Zusatz von Essigsäure auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äthylacetat extrahiert und die wässerige Schicht kon-5 zentriert, wobei Neplanocin-D-Derivat (III) als Kristallnadeln erhalten wurden. Die Umkristallisation erfolgte aus heissem Wasser und ergab 110 mg Neplanocin-D-Derivat (III). Ausbeute: 44,3 %.

Die physico-chemischen Eigenschaften des Neplanocin-io D-Derivates (III) waren die folgenden:

Spezifische Drehung: unmöglich zu messen infolge Änderungen bei der Messung

Bruttoformel: CnH^N^S Molekulargewicht: 280 (Massenspektrum) i5 Schmelzpunkt: 260 bis 262 °C (Zersetzung)

UV-Spektrum in H20:

226 mn(E^° =388,6)

i cm

20

= 968,0)

Bruttoformel: C32H24N4O7

Molekulargewicht: 576 (Massenspektrum)

Schmelzpukt: 116 bis 117 °C Ultraviolett-Absorptionsspektrum:

X. max=232 mu, E?% =704 1 cm

Rf-Wert (Chloroform:Methanol = 10:1) Rf=0,53

(2) 735 mg der im obigen Absatz (1) erhaltenen Verbindung (I) und 1,0736 g Phosphorpentasulfid, gelöst in 19 ml Pyridin, wurden tüchtig gerührt und 0,19 ml Wasser tropfenweise zu dem Gemisch zugesetzt.

Nach Erhitzen am Rückfluss während 4 Stunden unter Rühren wurde das Reaktionsgemisch gekühlt und im Vakuum konzentriert, wobei ein braunes öliges Material erhalten wurde. Dieses ölige Material wurde unter Rühren in siedendes Wasser gegossen und das Gemisch während 30 Minuten weitergerührt, wobei eine gelbliche Substanz erhalten wurde. Diese wurde filtriert, um den Niederschlag zu sammeln, der mit einem Gemisch aus Äthanol : Äther (1 :1) und anschliessend mit Äther gewaschen und schliesslich getrocknet wurde, wobei 561 mg der Verbindung (II) in einer Ausbeute von 74,3% erhalten wurden.

Die physico-chemischen Eigenschaften der Verbindung (II) sind die folgenden:

[a] d = - 286,9 (c = 0,6, CHC13)

Bruttoformel: C32H24N406S

Molekulargewicht: 592

Schmelzpunkt: 235 bis 239 °C (Zersetzung unter Schäumen)

UV-Spektrum (in Methanol):

232mu(EÎ% =858,5)

1 cm

25

Rf-Wert (Propanol: konzentrierter wässeriger Ammoniak:

Wasser= 10 :1 : l)Rf=0,21.

Beispiel 6

Zu 37 mg des in Beispiel 5 erhaltenen Neplanocin-D-De-30 rivâtes (III), gelöst in 0,3 ml 0,4N NaOH, wurden 0,009 ml Methyljodid zugesetzt und bei Zimmertemperatur während 10 Minuten geschüttelt. Anschliessend wurden 0,05 ml 0,4N NaOH zugesetzt und ferner 0,009 ml Methyljodid, das Gemisch wiederum geschüttelt und bei Zimmertemperatur ste-35 hen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 10 ml Wasser zugesetzt, das Gemisch sodann im Vakuum auf 2 ml eingeengt und diese über eine Säule aus «Sephadex G-15» (1,4 x 49 Cm) geleitet. Die Eluierung erfolgte mit Wasser, und es wurden Fraktionen von je 3 g Eluat gesammelt. Die Fraktionen No. 40 17 bis 19 wurden vereint, konzentriert und gekühlt und ergaben 35 mg kristallines Neplanocin-D-Derivat (IV). Ausbeute 90%.

Die physico-chemischen Eigenschaften von Neplanocin-D-Derivat (IV) waren die folgenden:

45

50

55

[a]

23 D

= —141,7 (c=0,7, H20)

Bruttoformel: Ci2Hi4N403 S Molekulargewicht: 294 (Massenspektrum) Schmelzpunkt: 177 bis 178 °C UV-Spektrum in Wasser:

222mn,(E}°^n =415,8)

288 m|i, (E

1% 1 cm

295 m n, (E

1% 1 cm

= 676,3)

= 670,7)

Rf-Wert (Chloroform : Methanol —10 : 1) Rf — 0,82. Rf-Wert (Propanol: konzentrierter wässeriger Ammo-

(3) 525 mg der gemäss Absatz (2) erhaltenen Verbindung niak;

(II) wurden in 31 ml wasserfreiem Methanol gelöst. 0,62 ml Wasser : 10 : 1: 1) Rf = 0,42 frisch zubereiteter 2N Lösung von Natriummethylat in Me- 65

thanol wurden zugesetzt und das Gemisch unter Rühren wäh- Beispiel 7

rend 2 Stunden am Rückfluss erhitzt, um die Benzoylgruppe Synthese von Neplanocin-A aus Neplanocin-D-Derivat zu entfernen. (IV):

641804

14

50 mg Neplanocin-D-Derivat (IV), hergestellt nach demselben Verfahren wie in Beispiel 6 beschrieben, gelöst in 1,5 ml methanolischem Ammoniak (Sättigung bei 0 °C), wurden in einem Rohr versiegelt und während 7 Stunden auf 146 bis 148 °C erhitzt. Nach der Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde der Rückstand in 3 ml heissem Wasser gelöst und anschliessend gekühlt, wobei 33 mg Neplanocin-A als Kristallnadeln erhalten wurden. Ausbeute: 74%.

Beispiel 8

(1) Zu 1,14 g Neplanocin-D, gelöst in 12 ml wasserfreiem Pyridin, wurde 1 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Dann wurden 30 ml n-Hexan zugesetzt und das Gemisch in Eiswasser gekühlt, wobei 1 g der Verbindung [2] als Kristalle erhalten wurden.

(2) 1 g der Verbindung [2] wurde mit 25 ml einer Chloroformlösung, welche 0,8 ml Thionylchlorid und 0,4 ml Dime-thylformamid enthielt, versetzt und das Gemisch bei Zimmertemperatur während 3 Stunden am Rückfluss gelassen. Das Chloroform wurde sodann unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde unter Rühren in 100 ml Eiswasser gegossen. Die Extraktion erfolgte mit 100 ml Chloroform, welches sodann mit NaHC03 und Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet wurde. Das Neplanocin-D-Derivat [3] wurde nach dem Trocknen im Vakuum erhalten.

Beispiel 9

Herstellung von Neplanocin-A aus Neplanocin-D-Deri-vat [3]:

Zu dem in Beispiel 8 erhaltenen Neplanocin-D-Derivat [3] wurden in einem versiegelten Stahlrohr 35 ml gesättigter methanolischer Ammoniak zugesetzt und das Gemisch während 5 Stunden bei 100 °C reagieren gelassen. Nach dem Kühlen wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene verdampft, wobei ein kristallines Pulver erhalten wurde, welches durch Chromatographie über eine Silicagelsäule gereinigt wurde und 286 mg Neplanocin-A ergab. Die physikalischchemischen Eigenschaften waren identisch mit denen des in Beispiel 7 erhaltenen Neplanocin-A.

Beispiel 10

Das nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltene Filtrat (140 Liter, Potenz etwa 50 mcg/ml als Neplanocin-B) wurde über eine Säule aus 20 Liter Kationenaustauscherharz «Amberlite IR-120» (H+-Typus) geleitet, um das Material zu adsorbieren, und die Säule sodann mit 100 Liter Wasser gewaschen. Die Eluierung erfolgte mit 3,7N wässerigem Ammoniak, wobei die ersten 30 Liter des Eluates verworfen wurden. 90 Liter des folgenden Eluates wurden gesammelt, durch Zusatz von 6N HCl auf pH 8 eingestellt,

dann über eine Säule aus 4 Liter Aktivkohle geleitet, diese mit Wasser gewaschen und anschliessend mit 90 Liter 70%igem Methanol eluiert. Das derart erhaltene Eluat wurde auf 500 ml eingeengt und das Konzentrat bei niederer Temperatur stehen gelassen, wobei ein Niederschlag ausgeschieden wurde. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet und ergab 5,1 g rohes Neplanocin-B (Reinheit etwa 60%, Ausbeute 44%).

Beispiel 11

5,1g des in Beispiel 10 erhaltene Neplanocin-B wurden über eine Säule aus Silicagel (8,3 x 40 cm, 2 Liter) geleitet, welche mit einem Gemisch aus Aceton : Wasser (10 :0,5) ge-5 packt worden war, und mit demselben Lösungsmittel eluiert. Je 80 g des Eluates wurden gesammelt und die Fraktionen No. 16 bis 24 vereint. Diese aktiven Fraktionen wurden bei niederer Temperatur stehen gelassen, wobei Neplanocin-B als weisse Kristallplatten ausgeschieden wurden. Es wurden 10 2,57 g kristallines Neplanocin-B erhalten. Ausbeute: 32,8%.

Beispiel 12

Die Kultur wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchge-15 führt, wobei eine Kulturmasse von etwa 200 Liter erhalten wurde, welche filtriert wurde, wonach die Zellen mit Wasser gewaschen wurden. Das Filtrat und das Waschwasser wurden vereint und ergaben 140 Liter (Potenz: etwa 1,5 mcg/ml).

Diese Lösung wurde sodann über eine Säule aus 20 Liter 20 Kationenaustauscherharz «Amberlite IR-120» (H+-Typus) geleitet, um das Material zu adsorbieren, und die Säule mit etwa 100 Liter Wasser gewaschen. Die Eluierung erfolgte mit 3,7N wässerigem Ammoniak, wobei die ersten 30 Liter des Eluates verworfen wurden. 90 Liter des folgenden Eluates 25 wurden gesammelt, durch Zusatz von 6N HCl auf pH 8 eingestellt, dann über eine Säule aus 4 Liter Aktivkohle geleitet, welche mit Wasser gewaschen und anschliessend mit 90 Liter 70%igem wässerigem Methanol eluiert wurde. Das derart erhaltene Eluat wurde konzentriert und 500 ml, welche gefrier-30 getrocknet wurden und 31,2g eines rohen Neplanocin-F ergaben. (Reinheit etwa 05, %).

35 Beispiel 13

Das in Beispiel 12 erhaltene rohe Neplanocin-F-Pulver (31,2 g) wurde über eine Säule aus Silicagel (800 ml), welche mit einem Gemisch aus n-Butanol: 28%igem wässerigem Ammoniak : Wasser (10: 0,2 :1) gepackt worden war, gelei-40 tet und mit demselben Lösungsmittelgemisch eluiert. Je 150 ml des Eluates wurden gesammelt und die Fraktionen No. 5 bis 10 vereint und im Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wurde über eine Silicagelsäule (240 ml), welche zuvor mit einem Gemisch von Chloroform : Methanol : Essigsäure 45 (10: 2:0,2) gepackt worden war, geleitet und die Säule mit demselben Lösungsmittelgemisch eluiert, wobei Fraktionen von 20 g gesammelt wurden. Die Fraktionen No. 67 bis 120 wurden vereint, eingeengt und getrocknet, wobei rohe Kristalle von Neplanocin-F (108 mg, Ausbeute: 51 %) erhalten so wurden.

Beispiel 14

108 mg der in Beispiel 13 erhaltenen rohen Kristalle von Neplanocin-F wurden über eine Säule aus «Sephadex G-15» 55 (186 ml), welche mit Wasser gepackt worden war, geleitet und die Säule mit Wasser eluiert. Je 10 g des Eluates wurden gesammelt und die Fraktionen No. 22 bis 27 vereint und auf 5 ml konzentriert, worauf das Konzentrat in einem kalten Raum stehen gelassen wurde, um das Neplanocin-F als weisse 60 Kristallnadeln auszufällen. Der Niederschlag wurde filtriert und getrocknet und ergab 87 mg kristallines Neplanocin-F. (Ausbeute: 41%).

C

5 Blatt Zeichnungen

Claims

641 804

PATENTANSPRÜCHE 1. Antibiotische Neplanocine der Formel x

als Verbindung nach Patentanspruch 1. 3. Neplanocin-C der Formel

15

20

ho-h2c in welcher

X die NH 2-, OH-, SH- oder SCH3-Gruppe oder ein Chloratom,

R Wasserstoff oder eine Benzoyl- oder Acetyl-Schutz-gruppe für die OH-Gruppe und Z eine Gruppe der Formel ro— h2c oh oh als Verbindung nach Patentanspruch 1. 25 4. Neplanocin-D der Formel

35

in welcher Y -O- oder eine Doppelbindung darstellt und R dieselbe Bedeutung wie oben aufweist, oder eine Gruppe 40

oh hoh2c hoh2c h oh als Verbindung nach Patentanspruch 1. 5. Neplanocin-D-Derivat der Formel in welcher Y dieselbe Bedeutung wie oben aufweist, darstellt. 2. Neplanocin-A der Formel 50

hoh2c

55

60

65

h0-h2c h oh oh oh

3

641804

als Verbindung nach Patentanspruch 1. 6. Neplanocin-D-Derivat der Formel

SCH.

H0H9C

OH ÖH

als Verbindung nach Patentanspruch 1. 7. Neplanocid-D-Derivat der Formel

AcOH7C

als Verbindung nach Patentanspruch 1. 9. Neplanocin-F der Formel

10

15

HOH2C

25

als Verbindung nach Patentanspruch 1.
10. Verfahren zur Herstellung von Neplanocinen der Formel

30

35

OAc OAc in welcher Ac eine Acetylgruppe bedeutet, als Verbindung « nach Patentanspruch 1.
8. Neplanocin-B der Formel

50

in welcher X die NH2- oder OH-Gruppe und Z eine Gruppe der Formel

HOH2C—j

55

60

65

HO—H2C

oder eine Gruppe der Formel

641804

oh in welchen Y -O- oder eine weitere Bindung darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Neplanocin erzeugender Mikroorganismus, welcher zum Genus Ampullariella gehört, in einem Nährmedium, bestehend aus assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Substanzen, gezüchtet wird und das Neplanocin-A, -C, -D, -B und -F aus der Kulturmasse isoliert wird.
11. Verfahren nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Neplanocine erzeugende Mikroorganismus Ampullarilla sp. A 11079 FERM-P No. 4494 ist.