HU192741B

HU192741B - Process for producing new neplanocin antibiotics

Info

Publication number: HU192741B
Application number: HU79TO1102A
Authority: HU
Inventors: Masaru Otani; Satoshi Yaginuma; Masatoshi Tsujino; Naoki Muto; Tetsu Saito; Tadashiro Fujii
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1979-04-12
Publication date: 1987-07-28
Also published as: SU906388A3; DK149313C; NL7903318A; SE7903672L; CA1128882A; GB2021582B; DE2954197C2; IT1115245B; DK149313B; CH641804A5; SE443576B; DK177079A; DE2917000A1; IT7922957A0; MX5788E; DE2917000C2; ES480384A1; FR2426688B1; NL182231C; FR2426688A1

Description

A találmány tárgya eljárás új neplanocin antibiotikumok előállítására. Az új antibiotikumok növények patogén mikroorganizmusai növekedését gátolják, valamint daganatellenes hatásuk van. Részletesebben kifejtve, a találmány tárgya olyan eljárás az új neplanocin antibiotikumok előállítására, amely magába foglalja a neplanocinokat termelő, Actinomycetales rendbe tartozó Ampullariella A 11 079 mikroorganizmus törzs (deponálási száma PERM-P 4494) táptalajon tenyésztését és az új neplanocin antibiotikumok elkülönítését.

Adenin-szerkezetű antibiotikumokat ismertet a 4 138 562 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

A találmány szerinti neplanocin antibiotikumok szerkezete az (I) általános képlettel szemléltethető - ebben a képletben X hidroxil- vagy aminocsoport és Z (a) vagy (b) általános képletű csoport, és ezekben a csoportokban Y oxigénatom (-O-) vagy vegyértékkötós.

A képletből egyértelmű sztereokémiái következtetéseket nem lehet levonni.

A találmány szerinti új neplanocin antibiotikumok magukba foglalják az A-, C- és D-neplanocinokat és a B- és P-neplanocinokat.

A neplanocin A gyengén bázisos anyag, és a kővetekező tulajdonságai vannak:

(1) Elemi összetétel:

talált: C=49,96%, H=5,00%, N=26,43%, számított: C=50,19%, H=4,97%, N=26,60%, (2) Molekulasúlya tömegspektrumelemzésból számítva: 263.

(3) Molekulaképlete: C11H13N5O3.

(4) Olvadáspontja: termikus elemzéssel meghatározva: 216 °C.

(5) Fajlagos forgatóképessége: ({£)d^m= =-157 °C (c=0,45%, vízben).

(6) Ultraibolya abszorpciós spektrum (14 χ/ml), vízben: lásd az

1, ábrát: >ux=263 mu, Εΐαό*⁼602,1;

pH-nál: λ«χ=26ΐ mu, Ei«ⁿ=566,4 (hidrokloridként);

pH-nál: λ·ω=263 πιμ, Eic»^lx=595,0.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (Kbr):

lásd a 2. ábrát. Abszorpciós sávok 3360, 3200, 2920, 1640, 1600, 1570, 1480, 1415, 1370, 1330, 1300, 1250, 1205, 1160, 1115, 1080, 1050, 1005, 910, 850, 790,

730 cnrMiél.

(Ő) Magmágneses rezonancia spektrum: lásd a 3. ábrát (DSS belső standard, deutérium-dintetilszulfoxidban, 100 MHz).

(9) Oldhatóság:

Oldható: vízben; dimetilszulfoxidban, dimetilformamidban, ecetsavban és vizes acetonban.

Oldhatatlan: etilacetátban, kloroformban, benzolban, hexánban.

(10) Szinreakció:

Pozitív: káliumpermanganát elszintelenítés, per jódét oxidálás és ánizsaldehid.

Negatív: vas(III)-klorid, ninhidrin, anilinftalát, Molisch- és Fehling-próba.

(11) Kémhatás: gyengén bázisos.

(12) Színe: fehér tűkristályok.

(13) Rf-értéke kovasavgélen (Tokyo Kaséi

Co., f-kovasavgél):

6:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-víz;

Rf=0,36;

: 0,5 : 2 arányú n-butanol-tömény ammónia-víz: Rf=0,27;

: 1 : 1 arányú n-propanol-tőmény ammónia-víz: Rf=0,41; 10 : 1 arányú aceton-viz: Rf=0,34;

: 2 : 1 arányú etilacetát-metanol-víz:

Rf=0,21;

: 2 : 1 arányú kloroform-metanol-ecetsav: Rf=0,17, (14) Szerkezeti képlete: lásd az (IA) általános képletet.

A neplanocin A biológiai tulajdonságai a következők:

(1) Növények patogén gombéinak növekedését gátló hatása:

A neplanocin a 100 γ/ml koncentrációjú oldata agar lemezen a Helminthosporium oryase M 0306 tenyészeten 18,9 ram átmérőjű gátlási zónát mutat.

(2) Daganatellenes hatás:

Murine leukémia L-1210 daganat 10® sejtjét Intraperitoneálisan egerekbe oltottuk be, és a beoltás után egy nappal 5 napon át, naponta egyszer intraperitoneálisan csoportonként 0,16 mg/kg, 0,32 mg/kg, 0,63 mg/kg, 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, illetve 5,0 mg/kg neplanocin A-t adtunk, be. Kontrollcsoportként 10 egeret használtunk, és minden egyes kezelt csoportban 7 egér volt. Az eredményeket a 4. ábrán szemléltetjük. A megfigyelés 15. napján a kontrollcsoportnál megfigyelt átlagos túlélési időtartam 7,4 nap volt. A kontrollcsoporttal összehasonlítva a kezelt csoportoknál az élettartam meghosszabbodását figyeltük meg; azaz a 0,16 mg/kg adaggal kezelt csoportnál 158%; a 0,32 mg/kg adaggal kezelt csoportnál 170%-os volt az élettartam meghosszabbodása; a 2,5 mg/kg-os adaggal és az 5,0 mg/kg-os adaggal kezelt csoportokban halálozást nem tapasztaltunk.

Az L-1210 daganatsejtekhez hasonlóan az Ehrlich ascites daganatsejtekkel, a Sarcoma-180, a P-388 leukémia sejtekkel beoltott egereknek és a Yeshida szarkóma sejtekkel beoltott patkányoknak a neplanocin A beadása után az élettartamuk meghosszabbodását figyeltük meg.

(3) Heveny toxicitás:

LD50 (50% halálozást okozó adag): 137,3 mg/kg egereknek (intraperitoneálisan beadva).

Halálozást nem figyeltünk meg akkor, ha 14 napon át intraperitoneálisan 5 mg/kg/nap mennyiséget adtunk be.

Irányelvek és adagolás:

A heveny leukémia kezelésére a gyógyszert fiziológiás nátriumklorid-oldatban old3 va, naponként 5-20 mg mennyiségben 7 napon át naponta egyszer adjuk be. A neplanocín A-t hatásosan lehet a krónikus leukémia, a gyomor-bélrendszer rákja, tüdőrák, méhrák, emlőrák és a rosszindulatú nyirok leukémia kezelésére használni.

A neplanocin A-t ásványi savakkal vagy szerves savakkal alkotott, fiziológiailag elviselhető sói alakjában, például hidrokloridként, acetátként, tartarátként, citrátként vagy szukcinátkónt is lehet alkalmazniA neplanocin C gyengén bázisos anyag, és a következő fizikai-kémiai tulajdonságai vannak:

(1) Elemi összetétele:

talált: C=47,59%, H=4,64%, N=25,10%;

számított: C=47,31%, H=4,66%, N=25,09%.

(2) Molekulasúlya (töraegspektrum elemzésből számítva): 279; (tetraacetil-neplanocin C=447).

(3) Molekulasúly képlete: CuHi3Hs0'4.

(4) Olvadáspontja (termikus elemzéssel meghatározva): 226 °C (bomlik).

(5) Fajlagos forgatóképessége:

(oc)d²¹=-43,6° (c=0,67, vízben).

(6) Ultraibolya abszorpciós spektruma: (16 í/ml) vízben: Xeax=263mu, Eicm^lx=538,9 (lásd az 5. ábrát);

pH-nái: λ«βχ=259 mju, £10.^=510,8: (hidrokloridként), pH-nál: Xmax=263 mg, Eicb^1x=534,4.

(7) Infravörös abszorpciós spektruma (KBr): lásd a 6. ábrát. Abszorpciós sávok: 3450-3100, 2920, 2740, 2680, 1680, 1630, 1600, 1560, 1500, 1460, 1420, 1380, 1360, 1330, 1300, 1240, 1200, 1170, 1100, 1050, 1020, 960, 920, 900, 880, 830, 780, 720, 680 cm^-1.

(8) Magmágneses rezonancia spektruma: lásd a 7. ábrát; (belső standard DSS, deutérium-dimetílszulfoxidban, 100 MHz).

(9) Oldhatóság:

Oldható: vízben, dimetilszulfoxidban, dimetilformamidban.

Oldhatatlan: etilacetátban, kloformban, benzolban, hexánban.

(10) Szinreakció:

Pozitív: káliumpermanganát elszíntelenítés, perjodát és Tollens reakciók. Negatív: vas(III)-klorid, ninhidrin, ánízsaldehid és Molisch-reakcióba.

(11) Kémhatás: gyengén bázisos.

(12) Színe: fehér (színtelen lemezes kristályok).

(13) Rf-értéke (kovasavgél vékonyrétegen, Tokyo Kaséi Co., kovasavgél-f):

6:1:1 arányú n -butanol-ecetsav-víz: Rf-0,33;

: 0,5 : 2 arányú n-butanol-tőmény ammóniua-viz: Rf=0,19;

: 1 : 1 arányú n -propanol-tömény ammónia-víz: Rf=0,30;

: 1 arányú aceton-víz: Rf=0,43;

: 2 : 1 arányú etilacetát-nietanol-viz: Rf=0,27;

: 2 : 1 arányú kloroform-nietanoi-ecetsav: Rf=0,20.

(14) Szerkezeti képlet (lásd az (IC) általános képletet].

A neplanocin C biológiai tulajdonságai a következők:

(1) Növények patogén gombái növekedését gátló hatása: 100 u/ml koncentrációjú oldatban, 7 mm átmérőjű papírkorong: Helminthosporium oryzae N Ö’3O6: 31,4 mm gátlási zóna;

Cladosporium herbarum M 4278: 14,0 mm gátlási zóna;

Alternaria kikuchisna M 4588: 12,0 mm gátlási zóna.

(2) Heveny toxicitás:

LD5Q (50% halálozást okozó adag):

mg/kg (intraperitoneálisan egereknek beadva).

A neplanocin C-t ásványi vagy szerves savakkal alkotott fiziológiailag elfogadható sói alakjában, például hidrokloridként, acetátként, tartarátként, citrátként vagy szukcinátként lehet alkalmazni.

(3) Daganatellenes hatás:

A neplanocin C 0,8 Ίί/ml koncentrációban ir vitro tökéletesen meggátolja az L-5.178 Y muri ne leukémia sejttenyészet. növekedését.

A neplanocin C élettartamot meghosszabbító hatása 10 mg/kg mennyiségben murine leukémia L-1210 ellen intraperitoneálisan beadva, 131% kezelt/kontroll csoport.

A neplanocin D fizikai-kémiai tulajdonságai a következők:

(1) Elemi összetétele: C=49,70%; H=4,64%;

N=21,20%.

(2) Molekulasúlya tömegspektrum elemzésből számítva: 264.

(3) Molekulaképlete: C11H12N4O4.

(4) Olvadáspontja: 236-237 °C.

(5) Fajlagos forgatóképessége:

(oc)d²³=-145° (c=0,6%, vízben).

(6) Ultraibolya abszorpciós spektruma: vízben (lásd a 8. ábrát): Xnax=251 ιυμ, Eioⁿ=479;

savas vízben: Xmax=251 mu, Ei_Cbi^1x=453; (hidrokloridként), alkálikus vízben: λ««=256 ηΐμ,

Ei«^lx=508, (7) Infravörös abszorpciós spektruma (KBr): lásd a 9. ábrát. Abszorpciós sávok: 3420-3120, 2940-2880, 1680, 1580, 1545, 1510, 1440, 1390, 1305, 1210, 1110, 1075, 1040, 1000, 990, 975, 900, 845, 780 cm’¹.

(3) Maginágneses rezonancia spektruma: lásd a 10. ábrát; (belső standard DBS. deulerium-dímetilszulfoxidban. 100 MHz).

(9) Oldhatóság:

Oldható: vízben, dimetilszulfoxidban, dimetilfonnamidban, ecetsavban és piridinben.

Oldhatatlan: etilacetátban, kloroformban, benzolban és hexánban.

(10) Színreakció:

Pozitív: káliumpermanganát elszlntelenítés és perjodát oxidáció.

Negatív: ninhidrin, Fehling-reakció és vas(III)-klorid.

(11) Színe: fehér túkristályok.

(12) Rf-értéke (kovasavgélen, Tokyo Kaséi Co., Kovasavgél-f):

6:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-víz: Rf=0,27;

: 0,5 : 2 n-butanol-tömény ammónia-viz: Rf=0,07;

: 1 : 1 arányú n-propanol-tömény-víz: Rf=0,18;

: 1 arányú aceton-viz: Rf-0,33.

(13) Kémiai szerkezete: lásd az (ID) általános képletet.

A neplanocin D akut toxicitásának meghatározásakor, egereknek intraperitoneálisan 100 mg/kg neplanocin D-t beadva, halálozást nem figyeltük meg.

A neplanocin B fizikai-kémiai tulajdonságai a követekezők:

(1) Elemi összetétele: C=47,44%; H=4,63%;

N=25,07%.

(2) Molekulsulya (tőmegspektrum elemzésből számítva): 279.

(3) Molekulaképlete: C11H13N5O4.

(4) Olvadáspontja: 269-272 °C (bomlik), (5) Fajlagos forgatóképessége:

(cc)d²⁴=-3,5^o (c=1,0%, dimetilszulfoxidban).

(6) Ultraibolya abszorpciós spektruma: vízben: lásd a 11. ábrát. Xeax=262 mp, Eice^lx=530,4;

savas vízben (egy csepp 0,1 n sósavval): hidrokloridként λ·βχ=259 mp,

Eic.^l*=506,7;

lúgos vízben (egy csepp 0,1 n nátriumhidroxiddal): X«ax=263 nip, Eica^IX=522,2.

(7) Infravörös abszorpciós spektruma (KBr):

lásd a 12. ábrát. Abszorpciós sávok:

3380, 3280, 3100, 2920, 2880, 2740, 1700,

1610, 1570, 1520, 1480, 1420, 1380, 1350,

1300, 1250, 1220, 1170, 1160, 1100, 1080,

1030, 1020, 980, 970, 870, 840, 790, 730, 710 cm^-1.

(8) Magmégneses rezonancia spektruma: lásd a 13. ábrát; (belső standard DSS, deutérium-dimetilszulfoxidban, 100 MHz) (9) Olhatóság:

Oldható: vízben, dimetilszulfoxídban. Olhatatlan: etilacetátban, kloroformban, benzolban és dimetiléterben.

(10) Színreakció:

Gyengén pozitív: káliumpermanganát elszintelenítés.

Negatív: ninhidrin, Molisch-reagens és ánizsaldehid.

(11) Kémhatása: gyengén bázisos.

(12) Színe: fehér (fehér lemezes kristályok).

(13) Rf-értéke (kovasavgél-f, Tokyo Kaséi Co.,):

6:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-viz: Rf=Ö,42;

: 0,5 : 2 arányú n-butanol-tömény ammónia-vÍ2: Rf=0,27;

: 1 : 1 arányú n-propanol-tömény ammónia-víz: Rf=0,41;

: 1 arányú aceton-viz: Rf=0,48.

(14) Szerkezeti képlete: lásd az (IB) általános képletet.

A neplanocin F-nek a következő fizikai-kémiai tulajdonságai vannak:

(L) Elemi összetétele: C=48,74%; H=4,83%;

N=25,71% (kristályvizet tartalmaz).

(2) Molekulasúlya: (tömegspektrumelemzésból számítva): 263.

(3) Molekulaképlete: C11H13N5O3.I/2 H2O.

(4) Olvadáspontja: 223 °C (bomlik).

(5) Fajlagos forgatóképessége:

(oc)d²¹=-6,6° (c=0,8%, vízben).

(6) Ultraibolya abszorpciós spektrum: vízben (lásd a 14. ábrát): λ·ω=263 mp, Eicn^ix=548,7;

savas vízben (egy csepp 0,1 n sósavval): hidrokloridként Xma*=260 mp,

Eic»«=527,l;

lúgos vízben (egy csepp 0,1 n nátriumhidroxiddal): Xbuu£=263 mp, Ei_CB ⁿ=531,8.

(7) Infravörös abszorpciós spektrum (KBr):

lásd a 15. ábrát. Abszorpciós sávok: 3320, 3210, 2920, 1650, 1610, 1580, 1480, 1420, 1380, 1340, 1310, 1270, 1220,' 1180, 1110, 1070, 1020, 980, 900, 840, 800,

730 cnH-nél.

(8) Magmégneses rezonancia spektrum (lásd a 16. ábrát): (belső standard DSS, deutérium-dimetilszulfoxidban, 100 MHz).

(9) Oldhatóság:

Oldható: vízben, dimetilszulfoxidban és ecetsavban.

Oldhatatlan: etilacetátban, kloroformban benzolban és dietiléterben.

(10) Színreakció:

Pozitív: káliumpermanganát elszintelenités.

Negatív: vas(IIl)-klorid, ninhidrin és Foohling-reagnes.

(11) Kémhatás: gyengén bázisos.

(12) Színe: fehér (fehér túkristályok).

(13) Rf-értéke: kovaeavgél-f, Tokyo Kaséi. Co,,):

6:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-víz: Rf=0,51;

: 0,5 : 2 arányú n-butanol-tömény ammónia-víz: Rf=0,43;

: 1 : 1 arányú n-propanol-t.ömény ammónia-víz: Rf=0,59;

: 1 arányú aceton-viz: Rf=0,48.

(14) Kémiai szerkezete: lásd az (IF) általános képletet.

A neplanocin B és F biológiai tulajdonságai a következők:

(1) Akut toxieitás:

A neplanocin B-t vagy F-et egereknek intraperitoneálisan 100 mg/kg mennyiségben beadva, halálozást nem figyeltünk meg.

(2) Sejtnövekedést gátló hatás:

19274L

Egerek L-5178 Y limforaa sejttenyészetét a neplanocin B 0,8 γ/ml, a neplanocin F 20 ϊ/ml koncentrációban gátolta.

(3) Daganatellenes hatás:

A neplanocin B élettartamot meghosszab- ; bitó hatása 50 mg/kg mennyiségben murino leukémia L 1210 ellen intraperitoneálisan beadva 142% volt a kezelt/kontroll csoport vonatkozásában.

(4) További hatékonyság: j

A neplanocin B-nek depresszióellenes hatása van.

A neplanoclnokat termelő mikroorganizmust a Japánban levő Niigate-ken-i hagymamezők talajából izoláltuk, és ez a mikro- l organizmus az Ampullariella genusba tartozik.

Az Ampullariella sp. A 11 079 törzsnek nevezett mikroorganizmus tipus-tőrzsét a Japánban levő Institute fór Microbial Industry and Technology Intézetben tartós megőrzésre 2 FERM-P 4494 Jelzéssel letétben helyeztük.

Az Ampullariella sp. A 11 079 PERM-P 4494 törzsnek a kővetkező rendszertani tulajdonságai vannak:

I. Morfológiai jellemzők: 2

Szervetlen sókat és keményítőt tartalmazó agar táptalajon 30 °C-on 10-15 napig tenyésztve, a következőket figyeltük meg:

Az A 11 079 törzs 0,5-0,8 mikron átmérőjű görbe és elágazó aljzat-micéliumot és í

1. Szénforrásc kevés némileg éretlen Iégmicéliumot képez,

Az aljzat-rnicéliumon fejlődő sporangíofor tartalmazza a hengeres vagy köteges alakú és 5-15 x 15-25 mikron méretű sporangiumokat. Sok sporangiutn-spóra a sporangiumon belül párhuzamos láncokként rendeződik. A sporangium-spórák vízben poláris ostornyal&b segítségével mozognak, és 0,5-1,0 x 1,0-2,0 mikron méretű pálcika alakjuk van.

II. A diamino-pimelinsav összetétele:

A teljes sejtelemzéssel meghatározott diamino-pimelinsav mező- és hidroxi-típusú.

III. Tenyésztési jellemzők különféle táptalajokon:

A különféle táptalajokon 30 °C-on 20 napig inkubált tenyészeteken megfigyelt tenyésztési jellemzőket az 1. táblázatban foglaltuk össze. Légmicéliumot nem figyeltünk meg, kivéve a szervetlen sókat és keményítőt tartalmazó agar táptalajon és a zabliszt-agar táptalajon megfigyelt csekély, éretlen légmicélium fejlődést.

A színjelzéseket a táblázatban a Container Corporation of America által közölt .Color Harmony Manrial* 4. kiadás, 1958. szerint adjuk meg.

IV. Fiziológiai tulajdonságok:

A fiziológiai tulajdonságokat a következőkben szemléltetjük.

hasznosítása:

Szénforrás	Hasznosítás	Szénforrás	Hasznosítás
L-arabinóz	+	szalicin	+
D-xilóz	+	D-galaktóz	+
D-glükóz	+	glicerin	+
D-fruktóz	+	L-szorbóz	-
D-mandÓ2	+	trehalóz	+
D-mannit		oc-melibióz	-
mozit	-	D-ribóz	-
L-ramnóz	+	maltóz	+
szacharóz	+	melezitóz	-
β-laktóz	-	D-cellobióz	+
raffinóz	-	D-szorbit	-
cellulóz	-	dulcit	-
keményítő	+

1. Táblázat: Tenyésztési jellemzők különféle táptalajokon
Táptalaj	Növekedés	Sporangium	Aljzat-micélium színe Oldható pigment
Szacharóz-nitrát agar ’	gyenge-közepes	kevés	gyöngyházrózsaszín (3ca) vllágossárga dinnyeszin (3ca)	nincs
Glükóz-aszparagin agar	közepes-gyenge	kevés	bembuszszín (2fb) gyöngyházrózsaszín (3ca),	nincs
Glicerin-aszparagin agar	gyenge-közepes	nincs	bammbuszszin (2fb) gyögyházrózsaszin (3ca)	nincs
Szervetlen sók-keményítő agar	jó-közepes	jó	borostyénkőszín (31c) pasztell narancsszín	nincs

(4 ic)

Táptalaj	Növekedés	Sporangium	Aljzat-micélium színe Oldható pigment
Tirozin agar	jó-közepes	nincs	világos borostyánkőszín	nincs
			(3ic)
Zabliszt agar	jó	közepes	borostyánkószín	nincs
			(31c) élénk kukorica-
			sárga (31a)
Élesztő-maláta	jó-közepes	gyenge	topázszln (3ne)	halvány
agar	kissé ráncos		borostyánkószín (3pe)	borostyán-
				kőszín (3pe)
Glükóz-élszetó-	közepes-jó	nincs	fahéjszín (31e)	aranybarna
kivonat agar				(3pg-3pi)
(28.sz. Waksman
táptalaj) *
Glicerin-nitrát agar	közepes	nincs	színtelen-bambuszszin	nincs
(l.sz. Waksman			(2fb)
táptalaj) *
Glükóz-nitrát	gyenge-közepes	nincs	színtelen-bambuszszin	nincs
agar (l.sz. Waksman			(2fb)
táptalaj) *
Tápagar	gyenge	nincs	világos borostyánkőszín	aranybarna
			(3íc) - fahéjszin (31e)	(3pg)
Emerson agar	jó-közepes	nincs	fahéjszin (31e)	aranybarna
(28.sz. Waksman			teveszín (31e)	(3pg-3pi)
táptalaj) *
Bennett agar	jó-közepes	nincs	borostyánkószín (3pe)	halvány-
(30.sz. Waksman			topázszin (3ne)	aranybarna
táptalaj) *				(3pg)
Pepton-Czapek	közepes-jó	kevés	világos borostyánkőszín	halvány
agar			(3ic) -borostyánkószín	aranybarna
			(31c)	(3pg)
Élesztökivonat	közepes-jó	kevés	borostyánkószín (31c-3nc) nincs
Czapek agar
Tirozin agar ****	gyenge	nincs	világos cserszínu (3gc)	szegfübarna
			égetett kőagyagszín	(3pl)
			(3ec)
Pepton-élesztő	közepes-jó	nincs	világos borostyánkőszín	sötét
vas agar			(3ic)	gyömbérbar-
				na (4pl)
Kazein agar ****	jó	nincs	teves2Ín (3ic)	szegfűbarna
			fahéjszin (3le)	(3pl)
* Waksman, S.A.,	.The Actinomycetes, 2. 11	079 mikroorganizmusnak az	, elágazó aljzat·

kötet, 327-334 (1961), Willien and Wilkins 45 Co.

** J. Elisha Mitchell, Sci. Sox. 73, 54 (1963) *** J Virol. 3 210 (1969) **** J. Bacteriol. 69, 147 (1955).

2. Tenyéezhómérséklet: 10-45 °C.

Lefölözött tejre gyakorolt hatás: pozitív peptonizálás és koagulálás. Melanin termelés: tirozin agar táptalajon negatív; pepton-élesztő-vas aga^r táptalajon pozitív.

Keményítő hidrolízis: pozitív.

Cellulóz hidrolízis: negatív.

Kazein hidrolízis: pozitív Zselatin elfolyósítás: pozitív.

Tirozin elbontás: negatív.

Xantin elbontás: negatív,

Hipoxantin elbontás: negatív. Kénhidrogén termelés: negatív.

Nitrát redukálás: negatí

3.

4.

5.

6.

7.

8. 9.

10.

11.

12.

13.

A fenti rendszertani adatok szerint az A 65

-micéliumon fejlődött sporangiumokat hordozó sporangioforja van, a sporangium hengeres vagy köteges alakú, a sporangíum-spórák a sporangíumon belül párhuzamos láncokként rendeződnek, a pálcika alakú sporangiuni-spórákon poláris ostornyaláb és mozo-diaminopimelinsav van, ezért az Actinoplanaceae családbeli nemek meghatározására szolgáló Bergey’s Manual of Deterrainative Bacteriology. B. kiadás, 707-708. old (1974) mű szerint ez a mikroorganizmus az Ampullarietla nemhez tartozik. Ezért ezt a mikroorganizmust Ampullariella sp. A 11 079-nek nevezzük.

A találmány tárgya eljárás a nepianocin A, -C, -D új antibiotikumok és ezek származékai, a neplanocin-B és -F előállítására.

A találmány további tárgya eljárás olyan nepianocin antibioLikum csoport előállítására, amelyek növények patogén gombái, daganatsejtek és hasonlók ellen hatékonyak.

A kővetkezőkben a találmány a mellékelt rajzokra hivatkozva részletesebben írjuk le.

A rajzok a kővetkezők:

1. ábra: a neplanocin A ultraibolya abszorpcióspektruma.

2. ábra: a neplanocin A infravörös abszorpciós spektruma.

3. ábra: a neplanocin A magmágneses rezonanciaspektruma.

4. ábra: a neplanocin A-nak az L-1210 leukémiás egerekre gyakorolt hatása.

5. ábra: a neplanocin C ultraibolya abszorpcióspektruma.

6. ábra: a neplanocin C infravörös abszorpcióspektruma.

7. ábra: a naplanocin C magmágneses rezonanciaspektruma.

8. ábra: a neplanocin D ultraibolya abszorpcióspektruma.

9. ábra: a neplanocin D infravörös abszorpcióspektruma.

10. ábra: a neplanocin D magmágneses rezonancispektru ma.

11. ábra: a neplanocin B ultraibolya abszorpcióspektruma.

12. ábra: a neplanocin B infravörös abszorpcióspektruma.

13. ábra: a neplanocin B magmágneses rezonanciaspektrum.

14. ábra: a neplanocin F ultraibolya abBzorpcióspektruma.

15. ábra: a neplanocin F infravörös abszorpcióspektruma,

16. ábra: a neplanocin F magmágneses rezonanciaspektruma.

A találmány értelmében a neplanocinokat például úgy állítjuk elő, hogy alkalmas táptalajra beoltjuk az Ampullariella sp. A 11 079 FERM-P 4494 sz. törzset. A mikroorganizmus tenyésztését különbözőképpen, például szintetikus vagy természetes táptalajon, folyadék vagy szilárd táptalajon való tenyésztéssel hajthatjuk végre. Az ipari előállítás céljára előnyös a folyékony táptalajon való tenyésztés. A neplanocin antibiotikumokat termelő mikroorganizmosok tenyésztésére a táptalaj alkotórészeiként asszimilálható szénforrásokat, asszimilálható nitrogénforrásokat, szervetlen sókat és egyebeket használhatunk. Az alkalmazható szénforrások közül például megemlítjük a glükózt, szacharózt, glicerint, oldható keményítőt, melaszt stb. Asszimilálható nitrogénforrásként peptont, kukoricalekvárt, szóqalisztet, húskivonatot, rizskorpát, kazeinhidrolizétumot, nitrátokat, ammóniusót stb. használhatunk. Szervetlen sót, például nátriumkloridot, kálium-, magnézium-, vas(II)- vagy mangánfoszfátot szintén alkalmazhatunk. A táptalajhoz habzást gátló szert, például szilikonolajat vagy szójababolajat is hozzáadhatunk.

A folyékony tenyésztéshez a süllyesztett, levegőztetett tenyésztést előnyösen alkalmazhatjuk. Ebben az esetben a mikroorgaR nizmusok számára legkedvezőbb tenyésztési hőmérsékletet kell választani, ez előnyösen 25-30 °C. A tenyésztés időtartama a körülményektől függ, és általában 2-4 nap lehet. A tenyésztés folyamán a közeg pll-jál előnyösen semleges és gyengén savas között, kell tartani.

Az így kapott fermentlé tartalmazza a neplanocin antibiotikumokat. Ezek elkülönítését a mikroorganizmusok anyagcseretermékeiről használt, szokásos elkülönítési vagy elválasztási módszerekkel hajtjuk végre. Mivel a neplanocinok gyengén bázisos anyagok, ezeket alkalmas adszorbenseken való adszorheáltatással, majd alkalmas oldószerrel való kioldással lehet elkülöníteni. Az adszorbensek közül például megemelitjük a2 aktívszenet, a kationcseréló gyantákat és az aktív alumíniumoxidot vagy kovasavgélt.

Az eluáló oldószert a használt adszorbenstől függően kell kiválasztani, például vízzel elegyedő szerves oldószereket, így vizes metanolt, vizes acetont vagy vizes dioxánt, vagy savas, lúgos vagy sótartalmú oldatokat hasznáhatunk.

Ezenkívül a neplanocinokat az anyag gyengén bázisos természetét alapján különíthetjük el, és tisztíthatjuk. Az antibiotikumokat például kationcseréló gyantán (ilyen például a Rohm and Haas Co., USA cég által Amberlite vagy a DOW Chem. Co. USA cég állal Powex 50 IRC-50 kereskedelmi néven forgalombahozott kationcserélő gyanta) adszorbeáljuk, és alkalmas savas, lúgos vagy sós oldattal eluálhatjuk.

Az antibiotikumok elkülönítésére, eluálásra és tisztításra előnyösen az adszorbens és az ioncserélő gyanta kombinációját alkalmazhatjuk. A tenyészet szüredéket az antibiotikum adszorbeálására például Amberlite IR-120 (kereskedelmi név) kationcserélő gyantára visszük fel, alkalmas alkálikus oldószerrel, például 3,7 n vizes ammónia-oldattal eluálva, a hatékony frakciót kapjuk, és miután ezeket semleges vagy gyengén lúgos kémhatásra állítottak be, az antibiotikumokat aktívszénen adszorbeáljuk, majd 70%-os metanollal eluáljuk. Az eluált oldatot Amberlite IRA-410 (kereskedelmi név) anioncserélő gyantán adszorbeáljuk, és vízzel ismét eluáljuk, hogy a hatékony frakciókat összegyűjtsük. Az egyesített frakciókat bepárolva, nyers terméket kapunk, ezt végül kovasavgélen adszorpciós kromatográfiával tisztítjuk. A további tisztítást átkristályositással hajtjuk végre. Az egyes anyagok tisztaságát úgy ellenőrizzük, hogy meghatározzuk, egyetlen olvadáspontot, papirkromatog ráfiéval, vékony réteg-kromatográfia val és papír-elektroforézíssel 263 πΐμ-nál ultraibolya fényben egyetlen foltot mutat-e.

A következő példák a találmányt közelebbről szemléltetik, de terjedelmét semmiképpen nem korlátozzák. A hőmérsékleti adatokat, Celsius-fokban adjuk meg.

1. példa

2% glükózt, 2% keményítőt, 1% élesztőkivonatot, 1% kazein-hidrolizátomot és 0,2% kalciumkarbonátot tartalmazó 100 ml 6,5 pH—jú vizes táptalajt 500 ml-es lombikba töltve, 120 °C-on 15 percig sterilizáljuk. Két ilyen lombikot Ampullariella sp. A 11 079 FERM-P 4494 sz. törzs ferde tenyészetéből egy kacsnyival beoltunk, és rázás közben 30 °C-on inkubáljuk. Az inkubált folyékony táptalajt 4 nap múlva 20 liter, ugyanilyen sterilizált táptalajt tartalmazó 30 literes fermentorba töltjük, és percenként 300 fordulattal keverve és percenként 20 liter levegővel levegőztetve, 48 óra hosszat 30 °C-on tenyésztjük.

Az igy inkubált tenyészetet 4% glükózt, 1% szójalisztet, 0,4% húskivonatot, 0,4% peptont, 0,1% élesztőkivonatot, 0,25% nátriumkloridot és 0,1% kalciumkarbonátot tartalmazó 6,5 pH-jú 200 liter folyékony táptalajra töltjük, és percenként 180 fordulattal keverve és percenként 130 liter levegővel levegőztetve, 30 °C-on 40 óra hosszat tenyésztjük. A mintegy 200 liter térfogatú tenyésztett folyékony táptalajt szűréssel elválasztjuk, és a micéliumtömeget vízzel mossuk. A szüredéket és a mosófolyadékot egyesítve, körülbelül 140 liter víztiszta szüredéket kapunk (hatékonysága neplanocin A-ként számítva 57 mcg/ml).

2. példa

Az 1. példa szerint előállított szüredéket 20 liter, hidrogénalakban levő Amberlite IR-120 kereskedelmi nevű kationcserélő gyantát tartalmazó oszlopra töltve az anyagot adszorbeáljuk és 100 ml vízzel mossuk. 3,7 n ammónia-oldattal eluálunk, és az első 30 liter eluátumot kiöntjük. A következő 90 liter eluátumot összegyűjtjük, pH-ját 6 n sósavval 8-ra állítjuk be, majd 4 liter aktívszenet tartalmazó oszlopon vezetjük át, vízzel mossuk, és 90 liter, 70%-os vizes metanollal eluálunk. Az így kapott eluátomot csökkentett nyomáson bepárolva, 1,5 liter sűrítményt kapunk. A sűrítményt 10 liter hidroxid alakban levő Amberlite IRA-410 kereskedelmi nevű ioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük fel, vízzel eluáljuk, és az eluátum pH-ját 4 n sósavval 7-re állítjuk be. Az eluátomot vákuumban bepárolva, a terméket hűtés közben leválasztva és szűréssel elválasztva, 41,8 g nyers neplanocin A-t kapunk (tisztasága körülbelül 12%).

A 41,8 g nyers neplanocin A-t kevés vízben oldjuk, és 6,3 x 40 cm méretű, 10 : 0,2 : 1 arányú n-butanol 28%-os ammónia-víz eleggyel nedvesített 2 liter kovasavgélt tartalmazó oszlopra visszük fel, majd ugyanilyen oldószereleggyel eluálunk. 150 ml-es frakciókat szedünk, és mindegyik eluátumot frakcionáljuk; a hatékony terméket a 24-52. sz. frakcióban találjuk. Ezeket a frakciókat egyesítve, vákuumban bepároljuk, és a maradékot hűtés közben állni hagyjuk.

A kivált csapadékot szűréssel elválasztva, 2,6 g nyers, kristályos neplanocin A-t kapunk. Kitermelés 32%.

A nyers neplanocin A-t 60 ml forró vízben oldjuk, és az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A kivált fehér tűkristályokat szűréssel elválasztva, 2,01 g neplanocin A kristályokat kapunk. Kitermelés 25,2%.

3. példa

Az 1. példa szerint előállított és neplanocin C-re számított 300 mcg/ml hatékonysága, 140 liter szüredéket a termék adszorbeálására Amberlite IR-120 kereskedelmi elnevezésű hidrogénalakban levő kationcserélő gyantát tartalmazó 20 literes oszlopon vezetjük át, és mintegy 100 liter vízzel mossuk. 3,7 n vizes ammóniaoldattal eluálunk, és az első 20 iter eluátumot kiőntjük. Az ezután következő 100 liter eluátumot összegyűjtjük, pH-ját tömény sósavval 8-ra állítjuk be, majd oszlopban levő 4 liter aktivszénen vezetjük át, vízzel mossuk, és 70 liter 70%-os metanollal eluláljuk. Az igy kapott eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva, 1,5 liter sűrítményt kapunk. A sűrítményt fagyasztva szárítással, 83,6 g, 29,5% tisztaságú, poralakú nyers termék marad vissza.

g poralakú nyers terméket vízzel telített n-butanolban oldjuk, és az oldatot 2 liter kovasavgéllel töltött és n-butanollal nedvesített 8,3 x 40 cm méretű oszlopra visszük fel, majd 10 : 0,2 : 1 arányú n-butanol-tömény ammónia-víz oldószereleggyel eluáljuk. 150 ml-es frakciókat szedünk, és mindegyik eluátumot frakcionáljuk. Hatékony terméket az 53-108. számú frakcióban találunk. Ezeket a frakciókat egyesítjük, bepároljuk, és a maradékot alacsony hőmérsékleten állni hagyjuk. A kivált csapadékot szűréssel elválasztva, fehér kristályok alakjában 18,2 g neplanocin C-t kapunk. Tisztasága 96%. Kitermelés 41,6%.

Ezt a terméket forró vízben oldva és az oldatot szobahőmérsékleten állni hagyva, a színtelen lemezes kristályok alakjában kivált neplanocin C-t szűréssel elválasztva, tiszta neplanocin C-t kapunk.

4. példa

Az 1. példa szerint előállított szüredékhez 3,6 kg porított aktívszenet adunk, -10 percig keverjük, majd az aktivszenet szűréssel eltávolítjuk, és vízzel alaposan mossuk. Az eluálást 70%-os metanollal hajtjuk végre. 40 liter eluátumot vákuumban szárazra párolva, neplanocin D-t tartalmazó 80 g poralakú nyers terméket, kapunk.

A 80 g nyers terméket oszlopba töltött és 10 : 1 : 1 arányú n-propanol-tömérty ammónia-víz eleggyel nedvesített 6 liter kovasavgélre visszük fel, majd ugyanilyen oldószerkeverékkel eluélunk. Minden egyes 600 g eluátumot frakcionálunk, és a 20-37, számú frakciókban találjuk a neplanocin D-t. Ezeket a frakciókat elegyítjük, vákuumban 30 ml-re bepároljuk, és a maradékot hűtés közben állni hagyjuk. A kivált csapadékot szűréssel elválasztva, 460 mg nyers, kristályos neplanocin D-t kapunk.

A nyers termékként kapott 460 mg kristályokat 3 ml forró vízben oldjuk, és 1850 ml Sephadex G-15-tel töltött és vízzel nedvesített oszlopra visszük fel, majd vízzel eluáljuk. Mindegyik 100 ml-es eluátumot frakcionáljuk, a 15. és 16. számú frakciókat egyesítjük, és a 200 ml oldatot 20 ml-re pároljuk be. A bepárlási maradékot szobahőmérsékleten állni hagyva, fehér tűkristályok alakjában 314 mg neplanocin D vélik ki.

5. példa

Az 1, példa szerinti eljárásban kapott és neplanocin B-ként számított 50 mcg/ml hatékonyságú, 140 liter szüredéket hidrogén alakban levő Amberlite IR-120 kationcserélő gyantát tartalmazó 20 literes oszlopra viszszük fel, hogy az anyagot adszorbeáljuk, majd 100 liter vízzel mossuk. Az eluálást 3,7 n vizes ammóniaoldattal hajtjuk végre, és az első 30 liter eluátumot kiöntjük, A következő 90 liter eluátumot egyesítjük, pH-ját 6 n sósavval 8-ra állítjuk be, majd aktívszepet tartalmazó 4 literes oszlopra visszük fel, vízzel mossuk, és 90 liter, 70%-os metanollal eluáljuk. Az így kapott eluátumot 500 ml-ye bepárolva, alacsony hőmérsékleten állni hagyjuk. A kivált terméket elválasztva és szárítva, 5,1 g nyers neplanocin B-t kapunk. Tisztasága 60%. Kitermelés 44%.

6. példa

Az 5. példában kapott 5,1 g neplanocin B-t 8,3 x 40 cm méretű, 2 liter kovasavgéít tartalmazó és 10 : 0,5 arányú aceton-víz eleggyel nedvesített oszlopra visszük fel. 80 ml-es frakciókat szedünk, és mindegyiket frakcionáljuk. A 16-24. számú frakciókat egyesítjük. £zeket az aktív anyagot tartalmazó frakciókat alacsony hőmérsékleten állni hagyva, 2,57 g neplanocin B fehér lemezes kristályokként válik ki. Kitermeléés 32,8%.

elválasztjuk, vízzel mossuk, és a szüredéket és a mosóvizet egyesítjük, igy 140 liter, 1,5 mcg/ml hatékonyságú oldatot kapunk.

Ezt az oldatot 20 liter hidrogénalakban levő Amberlite IR-120 kationcserélő gyanta oszlopon vezetjük át, és 100 liter vízzel mossuk, 3,7 n vizes ammóniaoldattal eluélunk, és az első 30 liter eluátumot kiöntjük. Az ezutáni 90 liter eluátumot egyesítjük, pH-ját 6 n sósavval 8-ra állítjuk be, majd aktívszenet tartalmazó 4 literes oszlopra töltjük, vízzel mossuk, és 90 liter 70%-os vizes metanololdattal eluáljuk. Az így kapott eluátumot 500 ml-re bepárolva és a maradékot fagyasztva szárítva, 31,2 g nyers neplanocin F-et kapunk. Tisztasága 0,5%.

8. példa

A 7. példa szerint előállított 31,2 g nyers neplanocin F port 10 : 0,2 : 1 arányú n-butanol-28%-os vizes ammónia-oldat-viz eleggyel nedvesített 800 ml kovasavgéít tartalmazó oszlopra visszük fel, és ugyanezzel az oldószerkeverékkel eluélunk. 150 ml-es frakciókat szedünk, ezeket egyenként frakcionáljuk, és az 5-10. számú frakciókat egyesítjük, majd vákuumban bepároljuk. A maradékként kapott sűrítményt olyan kovasavgéít tartalmazó 240 ml-es oszlopra visszük fel, amely kovasavgéít előzetesen 10 : 2 : 0,2 arányú kloroform-metanol-ecetsav oldószerkeverékkel nedvesítünk, é6 az eluálást ugyanilyen összetételű oldószereleggyel végezzük. 20 ml-es frakciókat szedünk, mindegyiket frakcionáljuk, és a 67-120. számú frakciókat egyesítjük. Ezeket az egyesített frakciókat bepárolva és a maradékot szárítva, 108 mg kristályos, nyers neplanocin F-et kapunk. Kitermelés 51%.

9. példa

A 8. példa eljárása szerint kapott. 108 mg kristályos nyers neplanocin F-et vízzel nedvesített 186 ml Sephadex G-15 oszlopra visszük fel, és vízzel eluáljuk. 10 ml-es frakciókat szedünk, és mindegyik eluátumot frakcionáljuk. A 22-27. számú frakciókat egyesítve, 5 ml-re bepároljuk. Az igy kapott bepárlási maradékot hűtőkamrában állni hagyjuk, hogy a neplanocin F fehér tűkristályok alakjában kiváljon. A kivált csapadékot szűréssel elválasztva és szárítva, 87 mg kristályos neplanocin F-et kapunk, kitermelés 41%.

7. példa

A mikroorganizmus tenyésztését az 1. példa szerint végezve, körülbelül 200 liter fermentlevet kapunk. A sejttőmeget szűréssel

Claims

1. Eljárás az (I) általános képletű neplanocín-antibiotikumok és fiziológiailag elfogadható sóik előállítására - ebben a képlel10 ben

X hidroxil- vagy anionicsoportot és Z (a) vagy (b) általános képletű csoportot jelent, és ezekben a csoportokban Y oxigénatom vagy vegyértékkótésazzal jellemezve, hogy az említett neplanocin antibiotikumokat termelő, Ampullariella a 11 079 mikroorganizmus törzset - deponálási száma FERM-P 4494 - asszimilálható szenet és nitrogént, valamint egyéb tápanyagokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük, a kapott antibiotikum elegyet a fermentléből elkülönítjük, kívánt esetben komponenseire szétválasztjuk, kívánt esetben bármely komponenst fiziológiailag elfogadható sójává átalakítjuk. (Elsőbbsége: 1979. április 12.)

2. Eljárás az (IA) képletű neplanocin A antibiotikum és fiziológiailag elfogadható sói előállítására azzal jellemezve, hogy az említett antibiotikumot termelő, Ampullariella A 11 079 mikroorganizmus törzset - deponálási száma FERM-P 4494 - asszimilálható szenet és nitrogént, valamint egyéb tápanyagokat tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd a fermentléből az antibiotikumot elkülönítjük, kívánt esetben fiziológiailag elfogadható sójává átalakítjuk. (Elsőbbsége: 1978. májuk 25.)

3. Eljárás az (IC) képletű neplanocin C antibiotikum és fiziológiailag elfogadható sói előállítására azzal jellemezve, hogy az említett antibiotikumot termelő, Ampullariella A 11 079 mikroorganizmus törzset - deponálási száma FERM-P 4494 - asszimilálható szenet és nitrogént, valamint egyéb tápanyagokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük, majd a fermentléből az antibiotikumot elkülönítjük, kívánt esetben fiziológiailag elfogadható sójává átalakítjuk. (Elsőbbsége: 1978. augusztus 10.)

4. Eljárás az (ID) képletű neplanocin D antibiotikum és fiziológiailag elfogadható sói előállítására azzal jellemezve, hogy az említett antibiotikumot termelő, Ampullariella A 11 079 mikroorganizmus törzset - deponálási száma FERM-P 4494 - asszimilálható szenet és nitrogént, valamint egyéb tápanyagokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük, majd a fermentléből az antibiotikumot elkülönítjük, kívánt esetben fiziológiailag elfogadható sójává átalakíthatjuk. (Elsőbbsége: 1979. január 29.)

5. Eljárás az (IB) képletű neplanocin B és/vagy az (IF) képletű neplanocin F anti— ? biotikum és fiziológiailag elfogadható sói ^a előállítására azzal jellemezve, hogy az említett antibiotikumokat termelő, Ampullariella A 11 079 mikroorganizmus törzset - deponálási száma FERM-P 4494 - aszimilálható szenet és nitrogént, valamint egyéb tápanyagokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük, majd a fermentléből a két antibiotikum elegyét vagy valamelyik antibiotikumot elkülönítjük, kívánt esetben a kapott elegyet komponenseire lg szétválasztjuk, kívánt esetben bármelyik komponenst fiziológiailag elfogadható sójává átalakítjuk. (Elsőbbsége: 1979. február 23.)

6. Eljárás hatóanyagként (I) általános képletű neplanocin-antibiotikumot vagy fiziológiailag elfogadható sóját - ebben a képletben X és Z az 1. igénypontban megadott jelentésű - tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított

25 hatóanyagot a gyógyszerkészitésben szokásos hordozó-, hígító-, töltő- és/vagy egyéb segédanyaggal együtt kikészítjük. (Elsőbbsége: 1979. április 12.)

7. Eljárás hatóanyagként (IA) képletű

30 neplanocin A-t vagy fiziológiailag elfogadható sóját tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti eljárással előállított hatóanyagot a gyógyszerkészitésben szokásos hordo35 zó-, hígító-, töltő- és/vagy egyéb segédanyaggal együtt kikészítjük. (Elsőbbsége: 1978. május 25.)

8. Eljárás hatóanyagként (IB) képletű neplanocin B-t vagy (IF) képletű neplanocin

40 F-et vagy fiziológiailag elfogadható sójukat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti eljárásai előállított hatóanyagot a gyógyszerkészítésben szokásos hordozó-, hi45 gitó-, töltő- és/vagy egyéb segédanyaggal együtt kikészítjük. (Elsőbbsége: 1979. február 23.)