DE2954197C2

DE2954197C2 -

Info

Publication number: DE2954197C2
Application number: DE2954197A
Authority: DE
Inventors: Masaru Otani; Satoshi Yaginuma; Masatoshi Tsujino; Naoki Muto; Tetsu Tagata Shizuoka Jp Saito; Tadashiro Mishima Shizuoka Jp Fujii
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-05-25
Filing date: 1979-04-26
Publication date: 1990-09-27
Anticipated expiration: 1999-04-27
Also published as: DK177079A; NL182231B; FR2426688A1; ES480384A1; FR2426688B1; MX5788E; DE2917000C2; IT1115245B; DK149313B; SE7903672L; CA1128882A; NL182231C; SE443576B; NL7903318A; HU192741B; DE2917000A1; SU906388A3; DK149313C; GB2021582A; GB2021582B

Description

Gegenstand des Stammpatents 29 17 000 ist 1β-(6-Amino-9H- purin-9-yl)-4-hydroxymethyl-4-cyclopenten-2α,3α-diol (Ne planocin A) der Formel:

und ein Herstellungsverfahren, bei dem man neplanociner zeugende Actinomyceten Ampullariella sp. A 11079 FERM-P. Nr. 4494 in einem Nährmedium kultiviert und daraus das antibiotische Neplanocin A isoliert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind mit Neplanocin A nahe verwandte Neplanocine, nämlich Neplanocin-C, -D, -B und -F, sowie ihre Gewinnung aus dem gemäß dem Verfahren des Stammpatents erhaltenen Kulturmedium.

Die Erfindung betrifft weiterhin Neplanocin-D-derivate, die sich von Neplanocin D ableiten und ihre chemische Synthese.

Die Erfindung betrifft auch diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel.

Neplanocin C ist eine schwach basische Substanz mit den fol genden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Elementaranalyse:
gefunden: C 47,59% H 4,64% N 25,10%
berechnet: C 47,31% H 4,66% N 25,09%
(2) Molekulargewicht (berechnet aus der massenspektros kopischen Analyse): 279 (Tetraacetylneplanocin C: 447)
(3) Molekularformel: C₁₁H₁₃N₅O₄
(4) Schmelzpunkt: (bestimmt durch thermische Analyse): 226°C (Zers).
(5) spezifische Drehung: [α] = -43,6° (c=0,67%, H₂O)
(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum: (16 γ/ml)
in H₂O: λ _max=263 mµ, E=538,9 (gemäß Fig. 1)
bei pH 3: λ _max=259 mµ, E=510,8
bei pH 10: λ _max=263 mµ, E=534,4.
(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Fig. 2.
Absorptionsbanden bei 3450 bis 3100, 2920, 2740, 2680, 1680, 1630, 1600, 1560, 1500, 1460, 1420, 1380, 1360, 1330, 1300, 1240, 1200, 1170, 1100, 1050, 1020, 960, 920, 900, 880, 830, 780, 720, 680 cm^-1.
(8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum: gemäß Fig. 3 (interner Standard DSS, in Deuteriumdimethylsulf oxid, 100 MHz).
(9) Löslichkeit:
Löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid
Unlöslich; Äthylacetat, Chloroform, Benzol, Hexan.
(10) Farbreaktion:
positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat, Perjo dat und Tollens.
negativ: Eisen(III)-chlorid, Ninhydrin, Anisalde hyd und Molisch.
(11) Natur: schwach basisch
(12) Farbe: weiß (farblose, plättchenförmige Kristalle)
(13) Rf-Wert (Silicagel-Fleckenfilm, Tokyo Kasei Co., Silicagel f):
n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1); Rf= 0,33
n-Butanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 0,5 : 2); Rf=0,19
n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 1 : 1); Rf=0,30
Aceton : Wasser (10 : 1); Rf=0,43
Äthylacetat : Methanol : Wasser (10 : 2 : 1); Rf= 0,27
Chloroform : Methanol : Essigsäure (10 : 2 : 1); Rf=0,20
(14) Chemische Struktur:

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin C sind wie folgt:

(1) Wachstumshemmende Aktivität auf pflanzenpathogene Pilze:
100 γ/ml-Lösung, Durchmesser der Papierscheibe 7 mm;
Helminthosporium oryzae M 0306: 31,4 mm (Hemmzone)
Cladosporium herbarum M 4278: 14,0 mm (Hemmzone)
Alternaria kikuchiana M 4588: 12,0 mm (Hemmzone)
(2) Akute Toxizität:
LD₅₀: 55 mg/kg (i. p., Mäuse)
Neplanocin C kann in Form eines physiologisch annehmbaren Salzes einer Mineralsäure oder organischen Säure, z. B. als Hydrochlorid, Acetat, Tartrat, Citrat oder Succinat, verwen det werden.
(3) Antitumoraktivität:
Neplanocin C hemmt vollständig das Wachstum einer Mausleukä mie-Zellkultur von L-5178Y bei einer Konzentration von 0,8 γ/ml in vitro.
Neplanocin C hat einen lebensverlängernden Effekt von 131% bei B/K (behandelt/Kontrolle) gegen Mausleukämie L-1210, wenn es intraperitoneal mit einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht wird.

Neplanocin D hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigen schaften:

(1) Elementaranalyse: C 49,70%, H 4,64%, N 21,20%
(2) Molekulargewicht (errechnet aus der massenspektrosko pischen Analyse): 264
(3) Molekularformel: C₁₁H₁₂N₄O₄
(4) Schmelzpunkt: 236 bis 237°C
(5) spezifische Drehung: [α] = -145° (c=0,6%, H₂O)
(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
in Wasser: gemäß Fig. 4, λ _max = 251 mµ, E = 479
in saurem Wasser: λ _max = 251 mµ, E = 453
in alkalischem Wasser: λ _max = 256 mµ, E = 508
(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Fig. 5.
Absorptionsbanden bei 3420 bis 3120, 2940 bis 2880, 1680, 1580, 1545, 1510, 1440, 1390, 1305, 1210, 1110, 1075, 1040, 1000, 990, 975, 900, 845, 780 cm^-1.
(8) NMR-Spektrum: gemäß Fig. 6
(interner Standard DSS, in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz)
(9) Löslichkeit:
Löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Essigsäure und Pyridin
Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Hexan
(10) Farbreaktion:
positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat und Perjo datoxidation
negativ: Ninhydrin, Fehling und Eisen(III)-chlorid.
(11) Farbe: weiße nadelförmige Kristalle
(12) Rf-Wert (Silicagel, Tokyo Kasei Co., Silicagel f): n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1), Rf= 0,27
n-Butanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 0,5 : 2); Rf=0,07
n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 1 : 1); Rf=0,18
Aceton : Wasser (10 : 1); Rf=0,33
(13) Chemische Struktur:

Die akute Toxizität von Neplanocin D ist wie folgt:

Keine Todesfälle wurden bei einer intraperitonealen Verab reichung von 100 mg/kg Neplanocin D an Mäusen festgestellt.

Neplanocin B hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigen schaften:

(1) Elementaranalyse: C 47,44%, H 4,63% N 25,07%
(2) Molekulargewicht (errechnet aus der massenspektros kopischen Analyse): 279
(3) Molekularformel: C₁₁H₁₃N₅O₄
(4) Schmelzpunkt: 269 bis 272°C (Zers.)
(5) spezifische Drehung: [α] = -3,5° (c=1,0%, Dimethyl sulfoxid)
(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
in H₂O: gemäß Fig. 7, λ _max = 262 mµ, E = 530,4
in saurem Wasser: λ _max = 259 mµ, E = 506,7 (ein Tropfen von 0,1N-HCl)
in alkalischem Wasser: λ _max = 263 mµ, E = 522,2 (ein Tropfen von 0,1N-NaOH)
(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Fig. 8
Absorptionsbanden bei 3380, 3280, 3100, 2920, 2880, 2740, 1700, 1610, 1570, 1520, 1480, 1420, 1380, 1350, 1300, 1250, 1220, 1170, 1160, 1100, 1080, 1030, 1020, 980, 970, 870, 840, 790, 730, 710 cm^-1
(8) NMR-Spektrum: gemäß Fig. 9
(interner Standard DSS, in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz)
(9) Löslichkeit:
Löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid,
Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Äthyläter
(10) Farbreaktion:
leicht positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat
negativ: Ninhydrin, Molisch und Anisaldehyd
(11) Natur: schwach basisch
(12) Farbe: weiß (weiße plattenförmige Kristalle)
(13) Rf-Wert (Silicagel f, Tokyo Kasei Co.):
n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1), Rf= 0,42
n-Butanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 0,5 : 2); Rf=0,27
n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 1 : 1); Rf=0,41
Aceton : Wasser (10 : 1); Rf=0,48
(14) Chemische Struktur:

Neplanocin F hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigen schaften:

(1) Elementaranalyse: C 48,74%, H 4,83% N 25,71% (ent hält Kristallisationswasser)
(2) Molekulargewicht (errechnet aus der massenspektros kopischen Analyse): 263
(3) Molekularformel: C₁₁H₁₃N₅O₃·½ H₂O
(4) Schmelzpunkt: 223°C (Zers.)
(5) spezifische Drehung: [α] = -6,6° (c=0,8%, H₂O)
(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
in H₂O: gemäß Fig. 10, g _max = 263 mµ, E = 548,7
in saurem Wasser (ein Tropfen von 0,1N-HCl): λ _max = 260 mµ, E = 527,1 in alkalischem Wasser (ein Tropfen von 0,1N-NaOH): λ _max = 263 mµ, E = 531,8
(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr): gemäß Fig. 11
Absorptionsbanden bei 3320, 3210, 2920, 1650, 1610, 1580, 1480, 1420, 1380, 1340, 1310, 1270, 1220, 1180, 1110, 1070, 1020, 980, 900, 840, 800, 730 cm^-1
(8) NMR-Spektrum: gemäß Fig. 12
(interner Standard DSS, in Deuteriumdimethylsulfoxid, 100 MHz)
(9) Löslichkeit:
Löslich: Wasser, Dimethylsulfoxid und Essigsäure
Unlöslich: Äthylacetat, Chloroform, Benzol und Äthyläther
(10) Farbreaktion:
positiv: Entfärbung von Kaliumpermanganat
negativ: Eisen(III)-chlorid, Ninhydrin und Fehling
(11) Natur: schwach basisch
(12) Farbe: weiß (weiße nadelförmige Kristalle)
(13) Rf-Wert (Silicagel f, Tokyo Kasei Co.):
n-Butanol : Essigsäure : Wasser (6 : 1 : 1), Rf= 0,51
n-Butanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 0,5 : 2); Rf=0,43
n-Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 1 : 1); Rf=0,59
Aceton : Wasser (10 : 1); Rf=0,48
(14) Chemische Struktur:

Die biologischen Eigenschaften von Neplanocin-B und -F sind wie folgt:

(1) Akute Toxizität:
Keine Todesfälle wurden bei intraperitonealer Verabreichung von 100 mg/kg Neplanocin-B oder -F an Mäuse beobachet.
(2) Zellwachstumshemmende Aktivität:
Das Wachsum einer Maus-Lymphoma-Zell-L-5178Y-Kultur wurde bei einer Konzentration von Neplanocin B 0,8 γ/ml bzw. Nepla nocin F 20 γ/ml gehemmt.
(3) Antitumoraktivität:
Neplanocin B hat einen lebensverlängernden Effekt von 142% bei B/K (behandelt/Kontrolle) gegen Mausleukämie L-1210, wenn es intraperitoneal mit einer Dosis von 50 mg/kg ver abreicht wird.
(4) Weitere Aktivität:
Neplanocin B hat eine antidepressive Aktivität.

Ein neplanocinerzeugender Mikroorganismus wurde aus einer Erdprobe isoliert, die in einem Zwiebelfeld in Niigata-ken, Japan, gesammelt worden war. Der Mikroorganismus gehört zur Gattung Ampullariella. Der Stamm wird als Ampullarielle sp. A 11079 bezeichnet und er wurde beim Institute für Mirco bial Industry and Technology, Japan, unter der Hinterle gungsnummer FERM-P Nr. 4494 hinterlegt.

Die taxonomischen Eigenschaften von Ampullariella sp. A 11079 FERM-P Nr. 4494 sind im Stammpatent angegeben.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

100 ml des wäßrigen Mediums (pH 6,5), enthaltend 2% Gluco se, 2% Stärke, 1% Hefeextrakt, 1% Caseinhydrolysat und 0,2% Calciumcarbonat, wurden in einen 500-ml-Kolben gegeben und 15 min bei 120°C sterilisiert. In zwei Kolben mit diesem Medium wurde eine Schleife voll einer Schrägkultur von Ampullariella sp. A 11079 FERM-P. Nr. 4494 inokuliert und es wurde bei 30°C eine Schüttelkultur vorgenommen. Nach 4 Tagen wurde das Kulturmedium in 20 l des gleichen sterilisierten Mediums, wie oben beschrieben, in einen 30- l-Standgefäßfermentator gegeben und es wurde bei 30°C unter Rühren mit 300 Upm und Belüftung mit 20 l/min 48 h lang kultiviert. Das so kultivierte Medium wurde in 200 l eines wäßrigen Mediums (pH 6,5) übertragen, das 4% Glucose, 1% Sojabohnenpulver, 0,4% Fleischextrakt, 0,4% Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,25% NaCl und 0,1% Calciumcarbonat enthielt. Es wurde 40 h lang bei 30°C unter Rühren mit 180 Upm und Belüften mit 130 l/min kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe (etwa 200 l) wurde filtriert und die Mycelien wurden mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwas ser wurden kombiniert, wodurch etwa 140 l eines klaren Fil trats erhalten wurden (Aktivität 57 mcg/ml als Neplanocin A).

Das Filtrat (140 l, Aktivität 300 mcg/ml als Neplanocin C) wurde durch eine Säule mit 20 l eines Kationenaustauscher harzes Amberlite® IR-120 (H⁺-Typ) (Warenzeichen) geleitet, um das Material zu adsorbieren. Es wurde mit etwa 100 l Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3,7N-wäßrigem Ammoniak, wobei das primäre Eluat (20 l) verworfen wurde. 100 l des folgenden Eluats wurden gesammelt, durch Zugabe von konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und sodann durch 4 l Aktivkohle in einer Säule geleitet. Es wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit 70 l einer 70%igen Methanollösung eluiert. Das erhaltende Eluat wurde bei vermindertem Druck konzentriert, wodurch 1,5 l eines Konzentrats er halten wurden. Dieses Konzentrat wurde gefriergetrocknet, wo durch 83,6 g eines rohen Pulvers erhalten wurden (Reinheit 29,5%).

83 g des rohen Pulvers wurden in wassergesättigter n-Butanol lösung aufgelöst und auf 2 l Silicagel in einer Säule (8,3×40 cm) aufgegeben, die mit n-Butanol gepackt war. Danach wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : konzentriertem wäßrigem Ammoniak : Wasser (10 : 0,2 : 1) eluiert. Je weils 150 ml des Eluats wurden fraktioniert und Aktivfraktio nen wurden in den Fraktionen Nr. 53 bis 108 gefunden. Die ge nannten Aktivfraktionen wurden gesammelt, konzentriert und bei niedriger Temperatur stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, wodurch 18,2 g Neplanocin C in Form von weißen Kristallen erhalten wurden (Reinheit 96%, Ausbeute 41,6%).

Das Produkt wurde in heißem Wasser aufgelöst und bei Raum temperatur stehen gelassen, wodurch das Neplanocin C in Form von farblosen plättchenförmigen Kristallen ausfiel, die abfiltriert wurden. Auf diese Weise wurde reines Nepla nocin C erhalten.

Beispiel 2

Das wie im Beispiel 1 erhaltene Filtrat wurde mit 3,6 kg pulverförmiger Aktivkohle versetzt. Nach 40minütigem Rüh ren wurde die Aktivkohle durch Filtration gesammelt und gründlich mit Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 70%iger Methanollösung. 40 l Eluat wurde im Vakuum getrock net, wodurch 80 g rohes Pulver, das Neplanocin D enthielt, erhalten wurden.

Die 80 g rohes Pulver wurden auf 6 l Silicagel in einer Säule aufgegeben, die mit n-Propanol : konzentriertes wäß riges Ammoniak : Wasser (10 : 1 : 1) bepackt war. Danach wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jeweils 600 g des Eluats wurden fraktioniert. Neplanocin D wurde in den Fraktionen Nr. 20 bis 37 festgestellt. Die Aktivfraktio nen wurden gesammelt, im Vakuum auf 30 ml konzentriert und unter Kühlen stehen gelassen. Der Rückstand wurde durch Fil tration gesammelt, wodurch 460 mg rohres kristallines Nepla nocin D erhalten wurden.

Die 460 mg rohe Kristalle wurden in 3 ml heißem Wasser auf gelöst und auf eine Säule von Sephadex® G-15 (1850 ml, mit Wasser gepackt) aufgegeben. Sodann wurde mit Wasser eluiert. Jeweils 100 ml des Eluats wurden fraktioniert und die Eluat fraktionen Nr. 15 und 16 (200 ml) wurden gesammelt. Sie wur den bei vermindertem Druck auf 20 ml konzentriert und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Es wurden 314 mg ausgefälltes Neplanocin D als weiße nadelförmige Kristalle erhalten.

Beispiel 3 Neplanocin-Derivat gemäß Anspruch 3 (Neplanocin-Derivat III)

(1) 376 mg Neplanocin D, gelöst in 10 ml wasserfreiem Py ridin, wurden gründlich bei 55°C gerührt. 0,9 ml Benzoyl chlorid wurden tropfenweise zugegeben und es wurde 2 h bei 60 bis 65°C gerührt. Danach wurde die Lösung 2 h bei 40 bis 45°C gehalten und über Nacht bei Raumtemperatur stehen ge lassen. 10 ml Wasser wurden unter Rühren zugesetzt und nach 25 min wurde die Lösung unter vermindertem Druck in einer Abdampfvorrichtung zur Trockene eingedampft. Das getrockne te Material wurde in 30 ml Chloroform aufgelöst, dreimal mit 10 ml 1N-HCl und zweimal mit 1N-Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Danach wurde es zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen.

Die Chloroformschicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsul fat entwässert und konzentriert, wodurch 747 mg einer hell cremefarbenen Verbindung (I) erhalten wurden (Ausbeute 91%).

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung (I) sind wie folgt:

[α] = -199° (c = 0,6, Methanol)
Molekularformel: C₃₂H₂₄N₄O₇
Molekulargewicht: 576 (Massenspektrum)
Schmelzpunkt: 116 bis 117°C
Ultraviolettabsorptionsspektrum: λ _max = 232 mµ, E = 704
Rf-Wert (Chloroform : Methanol = 10 : 1); Rf=0,53

(2) 735 mg der oben erhaltenen Verbindung (I) und 1,0736 g Phosphorpentasulfid, gelöst in 19 ml Pyridin, wurden gründ lich miteinander verrührt. Es wurden tropfenweise 0,19 ml Wasser zugesetzt. Nach 4-stündigem Erhitzen am Rückfluß wur de das Reaktionsgemisch abgekühlt und im Vakuum konzentriert, wodurch ein braunes öliges Material erhalten wurde. Dieses ölige Material wurde in siedendes Wasser unter Rühren gegos sen. Es wurde 30 min lang weitergerührt, wodurch eine gelb liche Substanz erhalten wurde. Diese wurde filtriert, um den Niederschlag zu sammeln, mit einem Gemisch aus Äthanol : Äther (1 : 1) gewaschen, mit Äther weiter gewaschen und ge trocknet, wodurch 561 mg der Verbindung (II) (Ausbeute 74,3%) erhalten wurden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung (II) waren wie folgt:

[α] = -286,9 (c = 0,6, CHCl₃)
Molekularformel: C₃₂H₂₄N₄O₆S
Molekulargewicht: 592
Schmelzpunkt: 235 bis 239°C (Zersetzung unter Schaumbildung)
UV-Spektrum (in Methanol):232 mµ (E = 858,5)323 mµ (E = 327,5)
Rf-Wert (Chloroform : Methanol = 10 : 1); Rf=0,82

(3) 525 mg der unter (2) erhaltenen Verbindung (II) wurden in 31 ml wasserfreiem Methanol aufgelöst. 0,62 ml frisch-her gestellte 2N-Lösung von natriummethylat in Methanol wurden zu gesetzt und es wurde 2 h lang unter Rühren am Rückfluß er hitzt, um die Benzoylgruppe zu entfernen.

Nach dem Abdestillieren des Methanols wurden etwa 50 ml Was ser zugesetzt und der pH-Wert wurde durch Zugabe von Essig säure auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde zweimal mit 20 ml Äthylacetat extrahiert und die wäßrige Schicht wurde konzen triert, wodurch Neplanocin-D-derivat (III) in Form von nadel förmigen Kristallen erhalten wurde. Die Umkristallisation er folgte aus heißem Wasser, wobei 100 mg Neplanocin-D-derivat (III) erhalten wurden (Ausbeute 44,3%).

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Neplanocin-D- derivats (III) sind wie folgt:

spezifische Drehung: wegen Meßschwankungen unmöglich zu messen
Molekularformel: C₁₁H₁₂N₄O₃S
Molekulargewicht: 280 (Massenspektrum)
Schmelzpunkt: 260 bis 262°C (Zers.)
UV-Spektrum in H₂O:226 mµ (E = 388,6)324 mµ (E = 968,0)
Rf-Wert (Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser = 10 : 1 : 1); Rf=0,21.

Beispiel 43 Neplanocinderivat gemäß Anspruch 4 (Neplanocinderivat IV)

Zu 37 mg Neplanocin-D-deriat (III), erhalten im Beispiel 5, gelöst in 0,3 ml 0,4N-NaOH, wurden 0,009 ml Methyljodid ge geben. Es wurde 10 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurden 0,05 ml 0,4N-NaOH zugesetzt und es wurden wei tere 0,009 ml Methyljodid zugegeben. Dann wurde erneut ge schüttelt und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 10 ml Wasser gegeben und das Gemisch wurde im Vakuum auf 2 ml konzentriert. Es wurde auf eine Säule von Sephadex G-15 (1,4×49 cm) aufgegeben. Die Elution erfolgte mit Wasser, wobei jeweils 3 g Eluat fraktioniert wurden. Die Fraktionen Nr. 17 bis 19 wurden gesammelt, konzentriert und abgekühlt, wodurch 35 mg kristallines Neplanocin-D-derivat (IV) erhalten wurden (Ausbeute 90%).

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Neplanocin-D- derivat (IV) sind wie folgt:

[α] = -141,7 (c = 0,7, H₂O)
Molekularformel: C₁₂H₁₄N₄O₃S
Molekulargewicht: 294 (Massenspektrum)
Schmelzpunkt: 177 bis 178°C
UV-Spektrum in Wasser:222 mµ (E = 415,8)288 mµ (E = 676,3)295 mµ (E = 670,7)
Rf-Wert (Propanol : konzentriertes wäßriges Ammoniak : Wasser = 10 : 1 : 1); Rf=0,42.

Beispiel 5

Das Filtrat (140 l, Aktivität etwa 50 mcg/ml als Neplanocin B), erhalten nach der Verfahrensweise des Beispiels 1, wurde durch eine Säule mit 20 l Kationenaustauscherharz Amberlite® IR-120 (H⁺-Typ) geleitet, um das Material zu adsorbieren. Es wurde mit etwa 100 l Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3,7 N-wäßrigem Ammoniak, wobei das primäre Eluat (30 l) ver worfen wurden. 90 l des folgenden Eluats wurden gesammelt, mit 6N-HCl auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und sodann auf eine Säule mit 4 l Aktikohle aufgegeben. Es wurde mit Wasser gewaschen und danach mit 90 l 70%igem wäßrigen Methanol eluiert. Das so erhaltene Eluat wurde konzentriert, wodurch 500 ml eines Konzentrats erhalten wurden, das bei niedriger Temperatur stehen gelassen wurde, um das Material auszufäl len. Der Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wodurch rohes Neplanocin B erhalten wurde (5,1 g, Reinheit etwa 60%, Ausbeute 44%).

Rohes Neplanocin B (5,1 g) wurde auf eine Säule mit Silicagel (8,3×40 cm, 2 l) aufgegeben, die mit einem Gemisch aus Aceton : Wasser (10 : 0,5) bepackt war. Es wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jeweils 80 g des Eluats wurden fraktioniert und die Frak tionen Nr. 16 bis 24 wurden kombiniert. Die Aktivfraktionen wurden bei niedriger Temperatur stehen gelassen, wodurch Neplanocin B in Form von weißen plättchenförmigen Kristal len ausfiel. Es wurden 2,57 g kristallines Neplanocin B er halten (Ausbeute 32,8%).

Beispiel 6

Die Kultivierung wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, wo durch etwa 200 l Kulturmasse erhalten wurden. Diese wurde filtriert und die Zellen wurden mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden kombiniert, wodurch 140 l erhalten wurden (Aktivität etwa 1,5 mcg/ml).

Die Lösung wurde durch eine Säule mit 20 l Kationenaustau scherharz Amberlite® IR-120 (H⁺-Typ) geleitet, um das Mate rial zu adsorbieren. Es wurde mit etwa 100 l Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 3,7N-wäßrigem Ammoniak, wobei das primäre Eluat (30 l) verworfen wurde. 90 l des folgenden Eluats wurden gesammelt. Es wurde durch Zugabe von 6N-CHl auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und sodann wurde die Lö sung auf eine Säule mit 4 l Aktivkohle aufgegeben. Es wurde mit Wasser gewaschen und sodann mit 90 l 70%igem wäßrigem Methanol eluiert. Das so erhaltene Eluat wurde konzentriert, wodurch 500 ml eines Konzentrats erhalten wurden, das gefrier getrocknet wurde, wodurch 31,2 g rohes Neplanocin F erhalten wurden (Reinheit eta 0,5%).

Rohes Pulver von Neplanocin F (31,2 g) wurde auf eine Säule von Silicagel (800 ml) aufgegeben, die mit einem Gemisch aus n-Butanol : 28%iges wäßriges Ammoniak : Wasser (10 : 0,2 : 1) bepackt war. Sodann wurde mit dem glei chen Lösungsmittelgemisch eluiert. Jeweils 150 ml des Eluats wurden fraktioniert und die Fraktionen Nr. 5 bis 10 wurden kombiniert. Das erhaltene Gemisch wurde im Vakuum konzen triert. Das Konzentrat wurde auf eine Silicagelsäule (240 ml) aufgegeben, die zuvor mit einer Mischlösung aus Chloroform : Methanol : Essigsäure (10 : 2 : 0,2) bepackt worden war. Es wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, wobei jeweils 20 g der Fraktion fraktioniert wurden. Die Fraktio nen Nr. 67 bis 120 wurden kombiniert, konzentriert und ge trocknet, wodurch rohe Kristalle von Neplanocin F (108 mg, Ausbeute 51%) erhalten wurden.

Rohe Kristalle von Neplanocin F (108 mg) wurden auf eine Säule von Sephadex® G-15 (186 ml) aufgegeben, die mit Wasser bepackt war. Es wurde mit Wasser eluiert. Jeweils 10 g der Fraktion wurden fraktioniert und die Fraktionen Nr. 22 bis 27 wurden gesammelt, kombiniert und auf 5 ml konzentriert. Die erhaltene Lösung wurde in einem kalten Raum stehen gelassen, um das Neplanocin F in Form von weißen nadelförmigen Kristallen auszufällen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wodurch kri stallines Neplanocin F (87 mg) erhalten wurde (Ausbeute 41%).

Claims

1. Neplanocin C mit der Formel:

2. Neplanocin D mit der Formel:

3. Neplanocin-D-derivat mit der Formel:

4. Neplanocin-D-derivat mit der Formel:

5. Neplanocin-D-derivat mit der Formel: worin Ac für eine Acetylgruppe steht.

6. Neplanocin B mit der Formel:

7. Neplanocin F mit der Formel:

8. Verfahren zur Herstellung der Neplanocine -C, -D, -B und -F gemäß den Ansprüchen 1, 2, 6 bzw. 7, dadurch ge kennzeichnet, daß man Ampullarilla sp. A 11079 FERM-P. Nr. 4494 in einem Nährmedium kultiviert, wel ches Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und eine anorganische Substanz enthält, und daß man Nepla nocin-C, -D, -B und -F aus der Kulturmasse isoliert.

9. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es neben üblichen Hilfs- und Trägerstoffen wenigstens ein Neplanocin nach den Ansprüchen 1 bis 7 enthält.