Verfahren zur Herstellung eines Tetracosapeptids
Im Patent Nr. 471 819 ist die Herstellung neuer Tetracosapeptide der Formel L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- (X)- -L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryp tophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L- -lysyl-L-a rginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-va- lyl-L-tyrosyl-L-prolin, sowie der entsprechenden Verbin dung, die statt des Glutamylrestes den Rest des Glutamins aufweist, und ihrer Derivate, Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe beschrieben.
Diese Verbindungen, insbesondere das L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl -L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryp tophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L- -lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-va- lyl-L-tyrosyl-L-prolin und sein Zinkkomplex sowie die entsprechende Glutaminylverbindung, haben eine hohe adrenocorticotrope (ACTH-) Wirksamkeit.
Es wurde nun gefunden, dass das Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen, insbesondere des L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L- -histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L- -lysyl-L-prolyl-L-valyi-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl- -L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L -prolins. bei dem man das Dekapeptid der Aminosäuren
1-10 mit dem Tetradecapeptid der Aminosäuren 11-24 kondensiert, verbessert werden kann.
Das bei diesem Verfahren verwendete Tetradecapeptidderivat tert.-Bu tyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-ar- ginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl- -L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester wird vorteilhaft erhalten, wenn man L-Prolin-tert.-butylester mit Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin-azid kondensiert, aus dem crhaltenen Tripeptidderivat die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tripeptidester mit Carbo benzoxy-NF-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin kondensiert, aus dem erhaltenen Tetrapeptidester die Carbobenzoxy- gruppe abspaltet,
den freien Tetrapeptidester mit Carbo benzoxy-L-valin kondensiert, aus dem erhaltenen Penta peptidester die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den so erhaltenen L-Valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl- -L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester mit Carbobenzoxy-L -arginyl-L-arginyl-L-prolin zum geschützten Octapeptidester kondensiert, aus diesem die Carbobenzoxygruppe abspaltet und den erhaltenen freien Octapeptidester mit Carbobenzoxy-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-pro- lyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tcrt.-bu- tyloxycarbonyl-L-lysin-azid,
das durch Kondensation von Carbobenzoxy-NF-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-pro- lyl-L-valyl-glycin mit NF-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl- -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester zum Carbo- benzoxy-NF-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-va- lyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysin-methylester und überführung des Esters in das Hydrazid und Azid erhalten wird, zum Tetradeca- peptidester kondensiert und schliesslich aus diesem die Carbobenzoxygruppe abspaltet, vgl. Fig. 1. BOC bedeutet die tert.-Butyloxycarbonylgruppe. Z die Carbobenzoxy- gruppe.
EMI2.1
Fig. 1
Das erhaltene Tetradecapeptidderivat kann. wie im Hauptpatent Nr. 471 819 beschrieben, mit dem Decapeptidderivat tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L- -seryl-L-methionyl---tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L- -phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin oder mit der entsprechenden am Histidinrest tritylierten Verbindung (vgl. franz. Patent Nr. 85 518) zum Tetracosapeptidderivat kondensiert werden, aus dem dann. wie im Hauptpatent beschrieben, die Schutzgruppen abgespalten werden.
Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Für die Papierchromatographie wurden die folgenden Systeme benützt : System 4 () : n-Butanol-Äthanol-Wasser = 2 : 2 : 1 43 : tert. Amylalkohol-lsopropanol-Wasser =
100 : 40 : 55 45 : sek.-Butanol-3'7 Ammoniak = 100 : 44 49 : sek.-Butanol-Triäthylamin-Diäthylbarbitur- säure-Wasser-Isopropanol = 100. 0, 8 :
1.8 g : 60 10 > > 53 : n-Butanol-ameisensäure-Wasser = 480 : 6 :
314 54 : sek.-Butanol-Isopropanol-Monochloressig- säure-Wasser = 70 : 10 : 3 g : 40 56 :
S-Butanol-isopropanol-5% Veronal-Na trium-in Wasser = 100 : 15 : 10 : 60 87 : Isopropanol-Ameisensäure-Wasser = 400 : 20 : 60 100: Essigester - Pyridin - Essigsäure - Wasser =
60 : 20 : 6 1 101: n - Butanol-Pyridin-Essigsäure - Wasser =
30 : 20 : 6 # 24 102 : Essigester-Methyläthylketon-Ameisensäure- -Wasser = 50 : 30 : 10 :)0.
Beispiel 1 L-Prolin-tert-butylester a) Hydrochlorid
In einer Druckflasche werden 5 g trockenes L-Prolin.
150 ml trockeness alkoholfreies Chloroform. 5 ml reinste, konzentrierte Schwefelsäure und 150 ml flüssiges Isobutylen bei Zimmertemperatur so lange geschüttelt, bis Lösung eintritt (ca. 3-4 Tage). Nach Abkühlen auf-15 wird das Druckgefäss geöffnet und das Isobutylen unter Feuchtigkeitsausschluss im Vakuum abdestilliert. Die verbleibende Chloroformlösung wird unter Eiskühlung mit 200 ml 20^, Kaliumcarbonatlösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach Abnutschen des Na triumsulfats wird der Gehalt der Chloroformlösung an L-Prolin-tert.-butylester durch Titration einer Probe mit verdünnter Salzsäure ermittelt.
Hierauf wird die restliche Chloroformlösung auf - 15 gekühlt und mit der genau berechneten Menge Salzsäure in Alkohol versetzt. Eindampfen und Zerreiben des Rückstands mit Äther gibt 6, 88 g kristallines L-Prolin-tert.-butylester-hydrochlorid (76% d. Th.) vom F. 107-108 . Das Produkt ist äusserst hygroskopisch. b) freier Ester
Zur Überführung in den freien Ester wird das Hydrochlorid in möglichst wenig Wasser gelöst, die Lösung mit viel Äther überschichtet und durch Zugabe von konzentrierter Kaliumcarbonatlösung stark alkalisch gestellt.
Der dabei ausgeschiedene Ester wird in dem Äther aufgenommen; die Ätherlösung gibt nach Trocknen und Eindampfen öligen L-Prolin-tert.-butylester, der direkt weiterverarbeitet werden kann 2. Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin-azid 12*9 g (0, 3 Mol) Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin-hydrazid [H. Schwarz. F. M. Bumpus und I. Page. J. Am.
Chem. Soc. 79, 5697 (1957)] werden in einem Gemisch von 600 ml 2-n. Satzsäure und 1200 ml Dimethylform- amid gelöst und nach Kiihlen auf - 15 unter Rühren mit 70 ml einer 5-n. wässrigen Lösung von Natriumnitrit versetzt. Die Lösung wird weitere 5 Min. bei - 10 gerührt und anschliessend in viel Eiswasser eingetragen.
Das ausgeschiedene Azid wird abfiltriert, in kaltem Essigester gelost, die Lösung bei OD mit gesättigter Natrium bicarbonat) ösung und Eiswasser gewaschen, kurz über Magnesiumsulfat getrocknet und direkt für den weiteren Umsatz verwendet.
3. Carbobenzoxy-L-Valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butyl ester
51. 5 L-Prolin-tert.-butylester werden in der nach 2. erhaltenen Lösung von Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin- -azid in ca. 2. 9 Litern Essigester von 0 gelöst u. während 5 Std. bei 0 und 15 Std. bei 22 im Dunkeln stehen gelasse.
Das Reaktionsgemisch wird nun im 5-Liter Kolben bei 4 () D auf das halbe Volumen eineeengt. Dabei fällt der kristalline Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosyl-L- -prolin-tert.-butylester aus, der durch eine Glasfritte abfiltriert. mit wenig E ; sigester. dann mit Benzol (50 ml) und mit Benzol-Petroläther 1 # 1 (75 ml) gewaschen und zuletzt bei 55'im Vakuum getrocknet wird. Ausbeute : 79, 5 g.
F. 173-175'9 Das Filtrat (Volumen ca. 1, 5 Liter) wird in einem Scheidetrichter abgekühlt und bei 0 wie folgt gewaschen mit 450 ml Zitronensäure 10%: 3mal mit 300 ml gesattigter Natriumchloridlösung: 2mal mit 250 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung; 3mal mit 150 ml Wasser. Die Essigesterphase wird nach Zu- satz von 200 ml Benzol zur Trockene eingedampft, nochmals mit 100 ml Benzol versetzt und wiederum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 25 ml Acetonitril durch Erwärmen gelöst, mit 45 ml Benzol versetzt und nach Animpfen über Nacht bei 0 kristallisieren gelassen.
Der Niederschlag wird abfiltriert, mit wenig Benzol und zuletzt mit Petroläther gewaschen und bei 55 im Vakuum getrocknet. Ausbeute : 29 g, F. 163 - 167 . Durch einmaliges Umkristallisieren dieser 29 g aus 430 ml heissem Acetonitril erhält man 19. 2 g reines Material vom F. 173-175 , durch Aufarbeiten der noch verbliebenen Mutterlauge noch weitere 3g vom F. 172 - 173 Papierchromatographie : nach 1 Std. bei 40 mit konz. Salzsaure ; 200-f auf Whatman 1, Anfärbung mit Ninhydrin und Pauly : Rf (40) = 0. 65 ; Rf (45) = 0.48, 4.
L-Valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester
28, 35 g Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin- -tert.-butylester vom F. 173 - 175 werden in 250 ml Methanol (dest.) suspendiert und nach Zugabe von 3 g Palladiumkohle 0'' unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds in der Schüttelentc hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist in weniger als 2 Std. beendet und nach insgesamt 4 Std. wird der Katalysator durch eine G4 Nutsche abfiltriert und mit 25 ml Methanol ausgewaschen.
Die klare, farblose Liisung wird im Vakuum eingeengt und bei 45 getrocknet. Die amorphe, schaumige Masse wird fein pulverisiert und im Hochvakuum bei 45 bis zur Gewichtskonstanz nachgetrocknet. Man erhält 21, 3 g (98, 5 T) chromatographisch reinen L-Valyl-L-tyrosyl-L- -prolin-tert.-butylester vom F. ca. 100 (unscharf) [α]D = -47, 4 (c = 2 in Methanol).
Papierchromatographie : direkt oder nach Hydrolyse mit konz. Salzsäure während 1 Std. bei 40 ; 200 y auf Whatman 1, Anfärbung mit Ninhydrin und Pauly : Rf (40) = 0, 87; Rf (45) = 0, 92 : nach Salzsäurebehandlung : Rf (40) = 0. 65 : Rf (45) = 0, 48.
5. Carbobenzc xy-NF-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L- -vcrlyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester 19, 15 g Carbobenzoxy-NF-tert.-butyloxycarbonyl-L-ly- sin und 21, 8 g L-Valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester werden in 200 ml destilliertem Acetonitril gelöst und dazu bei 20 auf einmal und unter Rühren 11, 4 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form zugegeben. Es löst sich sofort, unter gleichzeitigem Auskristallisieren von Dicy clohexylharnstoff. Anfänglich wird kurz mit Eis gekühlt, damit die Temperatur nicht über 25 steigt. Man rührt sodann während 3 Std. bei Zimmertemperatur und lässt noch über Nacht stehen.
Nach Zugabe von 1 ml Eisessig rührt man 30 Min. bei Zimmertemperatur, dann 30 Min. bei 0 und filtriert den ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab. Das Filtrat ergibt beim Eindampfen zur Trockene 44, 3 g eines amorphen Pulvers, das in 44, 3 ml Essigester warm gelöst und durch Zugabe von 221 ml Petroläther wieder ausgeschieden wird. Nach Dekantieren des Lösungsmittels und Trocknen der pulverisierten Fal- lung bei 45 im Hochvakuum erhält man 37, 94 g Carbo benzoxy-NF-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-ty- rosyl-L-prolin-tert.-butylester vom F. ca. 100 .
Das Produkt wird direkt hydriert. Hi,--62. 3 0. 5 (c = 1, 98 in Methanol).
Papierchromatographie : nach 1 Std. bei 40 mit konz.
Salzsäure. 200 y auf Whatman 1, Anfärbung mit Ninhydrin und Pauly : Rf (40) = 0. 40 ; Rf (45) = 0, 28.
6. NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-aalyl-L-tyrosyl- -L-prolin-tert-butylester
37. 37 g Carbobenzoxy-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-ly- syl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester werden in 200 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 3 g Palladiumkohle e) 0% in der Schüttelente unter Kohlendioxyd Absorption hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist in ca. 6 Std. beendet. Man filtriert den Katalysator durch eine G4 Fritte ab. spült mit Methanol und dampft das Filtrat zur Trockene ein.
Nach Pulverisieren trocknet man im Hochvakuum bei 45 und erhält so 29. 68 g chromatographisch einheitlichen N#-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl- -L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester vom F. 95-100 .
[α]D = - 61.8 # 0, 5 (c = 2. 0 in Methanol).
Papierchromatographie : 200 auf Whatman 1, Anfärbung mit Ninhydrin und Pauly : Rf (40) = 0, 86.
7. ('arhpbenzoxy-L-valyl-NE-tert.-hutyloxyearbonyl-L- @ysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester
In einem Dreihalskolben mit Rührwerk, Tropftrichter, Thermometer und Kalziumchlorid-Rohr werden 8, 73 g Carbobenzoxy-L-valin und 5. 09 ml Triäthylamin in 85 ml abs. Essigester gelöst und auf-10 abgekühlt.
Dazu lässt man unter Rühren und Kühlen bei-10 wäh- rend ca. 1 4 Min. 4s57 ml Isobutylchlorcarbonat zutropfen. Man spült mit 12 ml Essigester nach und rührt noch während 15 Min. bei - 10 Sodann werden 21, 92g NF-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- -prolin-tert.-butylester, gelost in 50 ml abs. Essigester. während 5 Min. bei-5 zugetropft und mit 15 ml Essigester nachgespült. Man rührt das Gemisch 30 Min. bei 0 , lässt dann die Temperatur auf 20 steigen und rührt noch 1 Std. bei Zimmertemperatur weiter. Zur Aufarbeitung versetzt man mit 170 ml Wasser und extrahiert mit 270 ml Essigester.
Die Essigesterlösung wird nacheinander gewaschen mit 85 ml Weinsäure 107toc (0 ). 85 ml Wasser. zweimal mit je 100 ml Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit je 100 ml verdünnter Natriumsulfatlösung. Nach Stehenlassen über Magnesiumsulfat dampft man zur Trockene ein und erhält nach Pulverisieren und Nachtrocknen bei 45 29, 98 g eines amorphen Rohproduktes.
Dieses wird heiss in 300 ml Acetonitril gelöst, angeimpft und unter Rühren erkalten gelassen. Nach Stehenlassen bei Zimmertemperatur filtriert man den kristallinen Niederschlag ab und trocknet ihn bei 45 im Vakuum. Man erhält 23, 55 g Carbobenzoxy-L-valyl-NF-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butyl- ester vom F. 159-164 . das zur weiteren Reinigung nochmals während 3 Min. in 235 ml siedendem Acetonitril gerührt wird. Nach Stehenlassen über Nacht bei Zimmertemperatur wird filtriert, mit 70 ml Acetonitril gewaschen und im Hochvakuum bei 45 getrocknet.
Man erhält 22. 55 g Reinprodukt vom F. 162 - 165 [α]n = - 71, 4 + 1 (c = 0, 9 in Methanol).
Papierchromatographie : nach 1 Std. bei 40 in konz.
Salzsäure. 200 y auf Whatman 1, Anfärbung mit Ninhydrin und Pauly : Rf (40) = 0, 40 ; Rf (45) = 0. 36.
8. L-Valyl-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L- -tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester
47, 98 g Carbobenzoxy-L-valyl-NF-tert.-butyloxycarbo- nyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester vom F. 161-163 werden in 320 ml Methanol suspendiert und nach Zugabe von 3. 2g Palladiumkohle 109 in der Schüttelente unter Kohlendioxyd-Absorption hydriert.
Die Wasserstoffaufnahme erfolgt unter gleichzeitiger Auflösung des suspendierten Pentapeptides und ist in ca. 3 Std. beendet. Nach weiteren 1-2 Std. wird der Kataly- sator durch eine G4-Fritte abfiltriert. mit Methanol nachgewaschen und das Filtrat zur Trockne eingeengt. Das pulverisierte Material wird im Hochvakuum bei 45 bis zur Gewichtskonstanz nachgetrocknet. Man erhält dabei 40, 27 g (98. 7% d. Th.) amorphen L-Valyl-NF-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-bu- tylester mit unscharfem Schmelzpunkt bei ca. 130 [oc], =-69, 2' + 0. 6 (c = 2 in Methanol).
Papierchromatographie: 200 γ auf Whatman 1. Anfär- bung mit Ninhydrin und Pauly: Rf (40) = 0,92: Rf (45) = 0, 94.
9. Carbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin-methylester -hydrochlorid
154 g (0. 5 Mol) Carbobenzoxy-L-arginin und 83 g (0. 5 Mol) L-Prolin-methylester-hydrochlorid werden in 2. 5 Litern Chloroform suspendiert und unter kräftigem Rüh- ren mit 112 g (0, 55 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird während 5 Std. bei 50 gerührt, darauf auf 20 gekühit und unter Rühren mit 5 ml Eisessig versetzt.
Nach weiterem Rühren während 2 Std. bei 0-5 wird das kristalline Gemisch von Dicvclo- hexylharnstoff und Reaktionsprodukt abizentitsclit, mit Chloroform gewaschen und im Vakuum bei 40 getrock- net. Man verrührt das Gemisch mit 2 Litern Wasser während 30 Min. bei 40 und filtriert vom ungelösten Di cyclohexylharnstoff ab. Das wässrige Filtrat wird im Vakuum bei 40 - 50 Badtemperatur zum Sirup konzentriert und mit 150ml Äthanol versetzt. Nach 2 Std. wird das ausgeschiedene kristalline Produkt abfiltriert und mit Äthanol gewaschen.
Man erhält 192 g (= 84%) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin-methylester-hydrochlorid vom F. 164-165 . Aus der Mutterlauge gewinnt man nach Einengen weitere 5g vom F. 163-165 , total 197 g (= 86% d. Th.). Nach Umkristallisieren aus 1, 5 Litern abs. Äthanol schmilzt das Produkt bei 165-167 ; [a] D = 7R9 (c - 1, 8 in Wasser),-64. 4 (c = 1, 9 in Methanol) und-67, 1 (c = 2 in Methanol/Wasser 1 : 1).
Das Produkt ist papierchromatographisch einheitlich.
Rf-Werte in den Systemen 43 : 0, 79; 49 : 0, 90 ; 54 : 0, 86;
87 : 0. 82. Anfärbung mit Sakaguchi.
10. L-arginyl-L-prolin-methylester-dihydrochlorid
45, 6 g (0, 1 Mol) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin -methylester-hydrochlorid werden in 400 ml Methanol unter Erwärmen gelöst und nach Kühlen auf Zimmertemperatur mit einer Lösung, enthaltend 0, 15 Mol Chlorwasserstoff in Methanol versetzt. Nach Zugabe von 2, 0 g Palladiumkohle (10e/f) wird bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert ; innert 30 Min. werden 2180 ml Wasserstoff aufgenommen. Die Lösung wird vom Kata lysator abfiltriert, im Vakuum bei höchstens 35 eingedampft und der Rückstand bei 0, 1 mm Hg über Kaliumhydroxyd getrocknet.
Das erhaltene Öl ergibt beim Ver reiben mit 150 mol Essigester 35g (98C% C) eines farblosen amorphen Pulvers des L-Arginyl-l..-prolin-methylester- -dihydrochlorids. Die Substanz ist papierchromatogra phisch einheitlich : Rf-Werte in den Systemen 49 : 0, 57 ;
54 : 0, 37 : 56 : 0. 42 : 87 : 0, 36 (Anfärbung mit Sakaguchi Reagens).
11. Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-L-prolin-methyl ester-dihydrochlorid 30, 8g (0. 1 Mol) Carbobenzoxy-L-arginin und 35, 8g (0, 1 Mol) L-Arginyl-L-prolin-methylester-dihydrochlorid werden in 100 ml Dimethylforriamid suspendiert und bei Zimmertemperatur 30 Min. lang verrührt bis zur fast vollständigen Lösung. Nach Zugabe von 100 ml Chloroform wird die Lösung auf-5'gekühlt und mit 22, 7g (0, 11 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt.
Anschliessend werden unter Rühren bei-5 innert ca. 30 Min. weitere 300 ml Chloroform zugetropft und das Reaktionsgemisch, aus dem sich allmählich Dicyclohexylharnstoff abscheidet. wird über Nacht bei 0 gerührt. Nach Zugabe von 2 ml Eisessig und weiterem Rühren während 1 Std. bei 0 wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und mit Dimethylformamid/Chloroform 1 : 4 nachgewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum bei 40 zum Sirup eingedampft und der Rückstand in 300 ml Wasser aufgenommen. Der unlösliche Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat zweimal mit je 100 ml Chloroform extrahiert.
Die wässrige Lösung wird im Vakuum vollständig eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei 40 getrocknet : Zäher hydroskopischer
Schaum; 78 g (ber. 64. 8 g) ; enthält Wasser, das sich durch weitere Trocknung nicht entfernen lässt.
Zur weiteren Reinigung werden 90 g Rohprodukt in 200 ml Methanol gelöst und unter Rühren mit 1 Liter Essigester ausgefällt. Das abgeschiedene ölige Produkt verfestigt sich bei mehrmaligem Verreiben mit Essigester zu einem amorphen Pulver. Nach Trocknen bei 40 und 0,1 mm Hg : 86 g, F. 90-120 . Das umgefällte Produkt enthält ca. 3c L-Arginyl-L-prolin und ca. 3Ec Carbobenzoxy-L-arginin : es ist jedoch genügend rein für den weiteren Umsatz.
12. Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-L-prolin-hydro chlorid 32, 4 g (ca. 50 mMol) rohes Carbobenzoxy-L-arginyl -L-arginyl-L-prolin-methylester-dihydrochlorid werden unter Rühren in 100 ml l-n. Natronlauge gelöst und 20 Min. bei 20 weitergerührt. Dann gibt man unter gutem Rühren 52 ml 2-n. Salzsäure zu und dampft die Reaktionslösung im Vakuum bei 30 ein. Der zähflüssige Rückstand wird bis zur Gewichtskonstanz bei 0.1 mm Hg und 30 zum spröden, farblosen Schaum getrocknet : 34 g Gemisch, enthaltend ca. 70% Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-L-prolin-dihydrochlorid neben Natriumchlorid und anderen Verunreinigungen.
Zur Überführung in das Carbobenzoxy-tripeptidmo- nohydrochlorid werden 34 g des Dihydrochlorids in 150 ml Dimethylformamid aufgenommen, vom unlösli- chen Natriumchlorid abfiltriert und unter Rühren bei Raumtemperatur mit 10, 1 g Triäthylamin versetzt. Das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid wird abfiltriert und das klare Filtrat mit dem Monohydrochlorid des Carbobenzoxytripeptids angeimpft. Das Monohydrochlo- rid kristallisiert langsam in feinkörniger Form aus. Man lässt 20-24 Std. bei Raumtemperatur stehen. saugt dann das Kristallisat ab und wäscht mit Dimethylformamid und Essigester nach.
Nach Trocknen im Vakuum bei 50 erhält man 19 g (= 66'xi d. Th.) Carbobenzoxy-L-arginyl -L-arginyl-L-prolin-monohydrochlorid vom F. 248 bis 249 . Umkristallisiert durch Lösen in 100 ml Methanol, enthaltend 1 Äquivalent Chlorwasserstoff und Zugabe von 2 Äquivalent Triäthylamin : 16. 7 g F¯ 259-262 ; [a] 25D = -64.8 # 1 (c = 1. 4 in Wasser) ; schwer löslich in allen organischen Lösungsmitteln ; leicht lös- lich in Wasser.
Die Substanz ist einheitlich im Papierchromatogramm (200 y einer 5%igen Lösung in Wasser) : Rf-Werte in den Systemen 49 : 0, 68 ; 54 : 0. 64: 56 : 0, 63 ; 87 : 0. 62 : Anfärbung mit Sakaouchi-Relgens 13. Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L -prolin-tert.-butylester-sulfat
9 g (15 mMol) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-L- -prolin-hydrochlorid werden in 75 ml Dimethylformamid suspendiert und durch Zugabe von 7.5 ml einer 2-n.
Lösung von Chlorwasserstoff in Essigester unter Rühren gelöst (Überführung ins Dihydrochlorid). Nach Kühlen auf-10 werden unter Rühren 1. 8g (15mMol) frisch destilliertes Pivaloylchlorid und anschliessend 1, 5 g (15 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach 10 Min. wird die Lösung des gemischten Anhydrids mit 9. 5 g (12. 5 mMol) L - Valyl-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-va- lyl-L-tyrosy !-L-prolin-tert.-butylester. geleist in 20 ml Di methylformamid, versetzt.
Nach weiterem Riihren während 10 Min. bei-10 werden 100 mi Wasser zugegeben und anschliessend 75 ml 2-n. Natriumsulfatliisung zuge- tropft. Das auseeschiedene kristalline Sulfat des Octapeptidderivats wird noch 15 Min. abfiltriert. mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 40 getrocknet : 13. 7 g (78%) farbloses Pulver mit unscharfem Schmelzpunkt bei ca. 220 . Das Rohprodukt wird in 75 ml 80% Me thanol gelöst und durch Zugabe von 250 ml Wasser aus gefällt : 11, 8 g.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel sind die Rf-Werte in den Systemen 100 : 0, 30: 102: 0,42. Die Sub stanz enthält Spuren einer langsamer laufenden Verbindung, ist aber genügend rein für den weiteren Umsatz.
14. L-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.- -butylester-triacetat
14 g (10 mMol) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-arginyl-L- -prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L -tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester-sulfat werden in 200 ml 80go Methanol suspendiert und in Gegenwart von 2 g Palladiumkohle (10J) bei Zimmertemperatur und Nor maldruck hydriert. Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Die vom Katalysator abfiltrierte Lösung wird zur Entfernung von Sulfationen über eine Säule von 200 ml Amberlite IRA-400 (Acetatform) filtriert und mit 80'7o Methanol nachgewaschen.
Das Eluat wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand zum Pulver verrieben.
Die Ausbeute an L-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-pro- lin-tert.-butylester-triacetat ist nahezu quantitativ.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel sind die Rf-Werte in den Systemen 54 : 0, 40; 101 : 0, 60 ; auf Aluminiumoxyd : 0, 22 in System 102. Anfärbung mit Sakaguchi-und Reindel-Hoppe-Reagens.
15. Carbobenzoxy-NF-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L- -prolyl-L-valyl-glycin 40, 85 g (61. 7 mMol) Carbobenzoxy-Ne-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin-äthylester (R.
Schwyzer & W. Rittel. Helv. 44, 159 [1961]) werden in 800 ml Äthanol gelost, die Lösung auf 5 gekühlt und 80 ml 1-n. Natronlauge zugegeben. Nach 3 Stunden bei 5 wird I Liter Wasser zugegeben, die überschüssige Natronlauge durch Zugabe von festem Kohlendioxyd neutralisiert und das Äthanol im Vakuum abdestilliert.
Dabei scheidet sich in der verbleibenden wässrigen Phase das Natriumsalz des Tetrapeptidderivates als gallertiger Niederschlag aus. Er wird durch Erwärmen auf 45 gelöst, von etwas ungelöstem Material abfiltriert. die Lösung auf 5 gekiihlt und mit 80 ml kalter 1-n. Salzsäure versetzt. Dabei fällt das Carbobenzoxy-NF-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin als feinpulveriger Niederschlag aus. Er wird abfiltriert und mit Eiswasser chloridfrei gewaschen dann im Vakuum über Schwefelsäure getrocknet. Die Ausbeute beträgt 34, 19g (886Yo d. th.); F. ca. 71-95 . Das Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein.
16. Carbobenzoxy-NF-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L -prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester 23, 3 g (36. 8 mMol) Carbobenzoxy-NE-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-elycin werden in 200 ml abs. Tetrahydrofuran und 5. 65 ml (1, 1 Aeq.) abs. Tri äthylamin gelost. Zu der auf 15 gekühiten Lösung tropft man unter Rühren 3. 63 ml Chlorameisensäure- äthylester (1, 03 Aeq.).
Man riihrt 20 Minuten bei - 15 und tropft dann eine Lösung von 17, 5 g (35, 9 mMol) N# - tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-N#-tert.-butyloxycar- bonyl-L-lysin-methylester (dargestellt nach Anmeldung G. Nr. 8219/60-Case 4351/1-3) in 80 ml abs. Tetra hydrofuran zu. Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Dann wird das ausgeschie- dene Material (Gemisch von Triiithylaminhydrochlorid und Hexapeptidderivat) abgenutscht und mit Tetrahydro- furan und viel Essigester gewaschen, wobei das Hexapeptidderivat wieder in Lösung geht.
Man vereinigt die Tetrahydrofuran-und Essigester-Filtrate, dampft zur Trockne ein und verteilt den Rückstand zwischen Wasser und viel Essigester. Die Essigesterlösung wird unter Eiskühlung mit verdünnter Zitronensäurelösung. Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Ein dampfrückstand wird 2mal mit je 500 ml Äther und 3mal mit je 1 Liter Tetrahydrofuran-Äther-Gemisch (1 : 4) zerrieben. Dabei erhält man das Hexapeptidderivat als unlösliches gallertiges Pulver : die Ausbeute beträgt 31, 3 g.
Zur weiteren Reinigung wird das Rohprodukt in 300 ml Acetonitril unter Erwärmen gelöst und die Lösung in einem Wasserbad von 60 (im Dewargefäss) langsam erkalten gelassen. Dabei kristallisiert das Hexapeptidderivat im Verlaufe mehrerer Tage in feinen Nadeln aus, daneben scheidet sich noch etwas gallertiges Material aus. Der Niederschlag wird deshalb mehrere Male wieder auf ca. 50 - 60 erwärmt. wobei die Kristalle ungelöst bleiben und das gallertige Material in Lösung geht.
Schliesslich wird auf diese Weise das Hexapeptidderivat vollständig kristallin erhalten ; F. 121-126 . Ausbeute 30, 12 g (76% d. Th.). Zur Analyse wird aus Methanol und Acetonitril umkristallisiert. F. 121 - 126 ; [α]D = - 50.8 (c = 1, 89 in Methanol).
Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten zeigt das geschützte Hexapeptidderivat nur 1 Fleck, Rf Wert = 0, 03 in Essigester. Rf = 0, 23 in Chloroform Methanol = 19 : 1 : Rf = 0, 65 in Chloroform-Methanol = 9 : 1 ; (die Platten werden mit Reindel-Hoppe-Reagens entwickelt).
17. Carbobenzoxy-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L- prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-hydrazid
20. 00g (18, 0 mMol) Carbobenzoxy-NF-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-me- thylester werden in 200 ml Methanol gelöst und die auf 0 gekühlte Lösung mit 10 ml Hydrazinhydrat versetzt.
Die klare Lösung wird 3 Tage bei 2c belassen. hierauf auf ein kleines Volumes eingeengt und mit viel Wasser versetzt. Das dabei ausfallende Produkt wird griindlich zerrieben, genutscht und mit viel Eiswasser gewaschen.
Das noch feuchte Material wird wiederum in wenig Methanol gelöst und erneut mit Wasser gefällt. Abnutschen und Trocknen im Vakuum bei 40 gibt 18. 82 g (94% d. Th.) rohes Hexapeptidhydrazid. F. 141-145 .
37, 0g Rohprodukt liefert nach Umkristallisieren aus 500 ml t-Butanol-Was, er 2 : 3 34, 30 g kristallines Hydrazid vom F. 156 - 158 . [α]25D = - 51,9 # 0.5 (c = 1, 91 in Methanol).
Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel- platten (60y des Hydrazids aufgetragen und mit Reindel Hoppe-Reagens entwickelt) erhalt man folgende Rf-Werte : 0, 0 (Benzol-Essigester 1 # 1): 0, 26 (Chloroform-Me- thanol 9 : 1) ; 0, 73 (Dioxan-Wasser 9 : I).
18. Carbobenzoxy-N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L- -prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl -tert.-hutyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L -prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl -L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester
6, 26 g (5, 66 mMol) C'arhobenzoxy-NF-tert.-butyloxy- carbonyl-L-Iysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-hydrazid werden in 50 ml Dimethylformamid geliist, die Lösung auf - 20 gekühlt und unter Rühren werdenh 15 ml 1-n.
Salzsäure so zugetropft, dass die Temperatur nicht über -15 steigt. Hierauf werden in gleicher Weise 5, 7 ml 1-n. Natriumnitritlösung eingetropft und die Lösung bei -7 20 Min. gerührt. Dann wird eine Lösung von 6, 12 g (4. 53 mMol) L-Arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-pro- lin-tert.-butylester-triacetat und 3, 1 ml Triäthylamin in 60 ml Dimethylformamid bei-7 eingetropft und das Reaktionsgemisch 65 Std. bei-2 belassen. Hierauf wird das Lösungsmittel bei 0, 1 mm Hg und 40 Bad- temperatur abdestilliert und der Rückstand mit Äther mehrmals unter Zerreiben gewaschen :
10, 7 g Rohprodukt. Das Produkt zeigt in der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel das Tetradecapeptidderivat als Hauptfleck mit Rf 0. 35 in System 100, 0, 25 in System 53 (Anfärbung mit Sakaguchi-und Reindel-Hoppe-Reagens) und zusätzlich unverändertes Octapeptidderivat, sowie mehrere aus dem Hexapeptidanteil stammende Nebenprodukte.
Zur Abtrennung der Cl-Ionen wird das Rohprodukt in 200 mi 0, 5-n. Essigsäure in 50'rXC Methanol gelöst, über eines Säule von 50 ml Merck-Ionenaustauscher II (schwach basisch, Acetatform) filtriert und mit 200 ml des gleichen Lösungsmittels nachgewaschen. Das im Eluat enthaltene Produkt wird direkt weiter umgesetzt.
19. N#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl- -glycyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-tert.-butyloxy carbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-va lyl-tert.-butylo. l-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl -L-prolin-tert.-but ylester-tri tosylat
Die Lösung des geschützten Tetradecapeptidesters wird mit 10 ml Eisessig versetzt und in Gegenwart von 1 g Palladiumkohle (10' Pd) hydriert. Nach 17 Std. und Aufnahme von 157 ml Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Hierauf wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird mit Petroläther gewaschen und 18 Std. bei 40 und 0. 01 mm Hg getrocknet. Man erhält 7, 5 g Rohprodukt.
Dieses wird in 50ml t-Butanol-Wasser I. I gelöst, auf eine Säure von 60 g Carboxymethylcellulose (im gleichen Lösungsmittelgemisch suspendiert) gegossen und unter Verwendung eines Uvicords und eines linearen Gradienten zwischen 1 Liter 50% t-Butanol und 1 Liter 500 t-Butanol, enthaltend) 0% Essigsäure, chromatographiert.
Nach Durchlauf von 560 ml Lösunesmittel beginnt die Elution des Tetradecapeptidderivats. Dieses wird in mehreren Fraktionen aufgefangen. die separat eingedampft werden. Dabei werden 4. 1 g reines NE-tert-Butyloxycar- bonyl-L-Iysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-tert.-butyloxycar- bonyl-L-Iysyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L- -arginyl-L-prolyl-L-valyl-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl- -L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.-butylester-triacetat gewonnen. Weitere 2. 8 g unreinere Substanz werden in 10 ml Wasser gelöst und nochmals an 16 g Carboxymethylcellulose chromatographiert, unter Verwendung eines linearen Gradienten zwischen 500 ml Wasser und 500 ml 0%iger Essigsäure.
Dabei werden weitere 2, 15 g reine Substanz erhalten ; total 6,25 g (= 60% ber. auf das eingesetzte Octapeptid).
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel sind die Rf-Werte : 0. 23 im System 100, 0. 25 im System 52.
Das erhaltene Triacetat des Tetradecapeptidderivats wird wie folgt in das Tritosylat übergeführt :
6, 25 g (2, 73 mMol) werden in 100 ml trockenem Pyridin gelöst, mit 1. 70 g p-Toluolsulfosäure versetzt, die Lösung zur Trockne verdampft, der Rückstand zur Entfernung von Pyridinacetat 18 Std. bei 35 und 0. 01 mm Hg getrocknet und zur Entfernung von Pyridintosylat mit Aceton verrieben und abgenutscht : 7. 26 g farbloses Pulver vom F. 155 - 162 .
Der geschützte Tetradecapeptid-tert.-butylester wird in der im Hauptpatent beschriebenen Weise mit tert. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl --tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyla) anyl-L-ar- ginyl-L-tryptophyl-glycin oder mit der entsprechenden am Histidinrest tritylierten Verbindung zum geschützten Te tracosapeptid-tert.-butylester kondensiert und aus diesem mittels Trifluoressigsäure. wie im Hauptpatent beschrieben, sämtliche Schutzgruppen abgespalten.