AT392644B - Verfahren zur herstellung von neuen, auf das zentralnervensystem wirkenden tripeptidamiden - Google Patents

Description

AT 392 644 B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen, auf das Zentralnervensystem wirkenden Tripeptidamiden der allgemeinen Formel ,0) L-Glp-L-His-Y-NH2 worin Y eine L-Homopropylgruppe (= L-Pyrrolidin-2-yl-essigsäuregruppe) oder die D-Pipecolylgruppe bedeutet

Die neuen, der oben definierten allgemeinen Formel I entsprechenden Tripeptidamide sind Analoga des auch als "thyrotropin-releasing hormone" (TRH) bekannten L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolin-amides (Glp-His-Pro-NH2), in welchen eine Aminosäuregruppe, u. zw. die an dritter Stelle stehende L-Prolylgruppe gegen einen anderen, der obigen Definition entsprechenden Aminosäurerest ausgetauscht ist

Die Existenz von TRH war schon in den 60-er Jahren bekannt seine Struktur wurde aber erst in den Jahren 1969 bzw. 1970 von den Forschergruppen um R. Guillemin bzw. A. Schally fast gleichzeitig, aber von einander unabhängig, aufgeklärt, vgl. C. Y. Bowers etc., Endocrinology ££. 1143 (1970); R. Burgus etc., C. R. Acad. Sei. (Paris) 262,1870(1969).

Das Tripeptid TRH wurde ursprünglich als die Freisetzung von TSH (thyreotropes Hormon) in der Hypophyse von Säugetieren regulierender Faktor beschrieben; die sich mit diesem Hormon befassende Forschung wurde aber in eine neue Richtung gelenkt als erkannt wurde, daß die biologische Funktion dieses Tripeptids nicht auf die Regulierung der Freisetzung des thyreotropen Hormons beschränkt ist sondern auch eine Wirkung auf das Zentralnervensystem auftritt [vgl.: N. P. Plotnikoff u. Mitarb., Science 178.417 (1972); A. J. Prange u. Mitarb., Lancet 2,999 (1972)]. Es wurde dann festgestellt, daß das TRH neben dar erwähnten Hormonfunktion auch die Zeitdauer des durch Barbiturate oder Alkohol verursachten Schlafens erheblich herabsetzt ferner auch die durch verschiedene Arzneimittel verursachte Hypothermie reduziert und die lokomotorische Aktivität steigert Ein weiterer wichtiger Faktor der auf das Zentralnervensystem ausgeübten Wirkung von TRH ist die Hemmung der durch Haloperidol verursachten Katalepsie. Es schien also wünschenswert für die therapeutische Praxis solche TRH-Analoga herzustellen, welche auf die Hypophyse nur schwach wirken, dagegen aber die Wirkung von TRH erreichende oder sogar übertreffende Wirkungen auf das Zentralnervensystem ausüben. Zu diesem Zweck wurden die in den DE-OS 2 343 035, 2 343 037, 2 449 167, 2 514 381, 2 609 154 und 2 639 393, sowie in der BE-PS 819 198 beschriebenen derartigen Verbindungen hergestellt. Die bisherige diesbezügliche Forschung, deren Ergebnisse und Erfahrungen von A. J. Pranne u. Mitarb. ["The Role of Hormones in Depression", Life Sciences 2Ω, 1305 (1977)] und von A. V. Schally u. Mitarb. ["Hypothalamic Regulatory Hormones", Ann. Rev. Biochem. 42, 89 (1978)] zusammengefaßt wurden, konnte aber nicht zu die Bedürfnisse der therapeutischen Praxis in jeder Hinsicht befriedigenden Ergebnissen führen.

Es wurde nun gefunden, daß man durch den Austausch einer Aminosäure des aus drei Aminosäuren aufgebauten TRH-Moleküls erreichen kann, daß die Hormonwirkung des Tripeptids erheblich reduziert die auf das Zentralnervensystem ausgeübte Wirkung aber beibehalten oder sogar bedeutend erhöht wird. Als besonders vorteilhaft haben sich in dieser Hinsicht diejenigen TRH-Analoga erwiesen, in welchen dieL-Propylgruppe in der 3-Stellung von TRH gegen eine L-Homoprolyl-Gruppe (= L-Pyrrolidin-2-yl-essigsäuregruppe) oder die D-Pipecolylgruppe ausgetauscht ist

Ein Verfahren zur Herstellung von Tripeptiden ist aus der DE-A-25 14 381 bekannt Verbindungen der allgemeinen Formel Mj-M^Mg-E, worin Mj (unter anderem) eine Pyroglutamylgruppe, M2 (unter anderem) eine Histidylgruppe, M3 eine L-pip-, L-pro- oder L-tca-Gruppe und E (unter anderem) eine -NH2-Gruppe bedeuten, müssen nach diesem Verfahren durch schrittweise Kondensation aus den einzelnen Aminosäuren hergestellt werden.

Zur Herstellung der neuen Tripeptidamide der allgemeinen Formel I wird erfindungsgemäß das geschützte Dipeptidhydrazid der Formel ,(ΠΙ) Z-L-Gln-L-His-N2H3 worin Z Benzyloxycarbonyl darstellt mit Nitriten zum entsprechenden geschützten Azid umgesetzt letzteres mit einem Aminosäureamid der allgemeinen Formel Y-NH2, worin Y obige Bedeutung hat umgesetzt, und in dem erhaltenen Tripeptidamid nach dem Abspalten der Schutzgruppe Z die Glutaminylgruppe durch Wärmebehandlung zu ein« Pyroglutamylgruppe cyclisiert

Die Abspaltung der Schutzgruppe Z erfolgt vorteilhaft so, daß man das erhaltene geschützte Tripeptidamid der allgemeinen Formel Z-Gln-His-Y-NH2 einer katalytischen Hydrierung unterwirft. Die nach dem Abfiltrieren des Katalysators erhaltene essigsaure Lösung wird auf 60 bis 70 °C erwärmt wobei die Glutaminylgruppe in einer -2-

AT 392 644 B

Reaktionszeit von etwa 30 min zur Pyroglutaminsäuregruppe cyclisiert wild.

Die auf obige Weise hergestellten Tripeptidamide der allgemeinen Formel I können durch Kristallisieren oder Lyophilisieren aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden; gewünschtenfalls können die erhaltenen Produkte auf übliche Weise in Komplexe übergeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat den besonderen Vorteil, daß die Hydrazide der Formel (QI) gut kristallisierbare und so in sehr reiner Form isolierbare Produkte sind.

Die Reinigung des erhaltenen Endproduktes kann durch einfaches Kristallisieren oder Umfällen, nötigenfalls aber auch durch Säulenchromatographie erfolgen. In einigen Fällen kann das Endprodukt nach dem Entfernen der Nebenprodukte auch durch einfaches Lyophilisieren auspräpariert werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten Tripeptide wurden nach den nachstehend beschriebenen biologischen Methoden auf ihre pharmakologischen Wirkungen geprüft 1. Hemmung der Haloperidol-Katalepsie an Ratten (Vgl. J. Delay und P. Deniker: Compt Rend. Cong. Med. Alenistes Neurologistes, 12,497, Luxemburg 1952). 40 mg Haloperidol, d. i. 4-(p-Chlorphenyl)-l-[3-(p-fluorbenzoyl)-propyl]-piperidin-4-ol, pro kg wurden den Tieren s. c. verabreicht und nach 120 min wurde das Eintreten der Katalepsie kontrolliert; dann wurden die Ratten in Gruppen von je 10 Tieren eingeteilt und mit intravenös verabreichten Dosen von TRH bzw. von den neuen TRH-analogen Tripeptiden behandelt Die Tiere der Kontrollgruppen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt 15, 30, 90 und 120 min nach der Behandlung wurde die katalepsie-aufhebende Wirkung der einzelnen Verbindungen geprüft. Diejenigen Tiere wurden als kataleptisch betrachtet welche, wenn sie mit ihren vorderen Füßen auf eine 7 cm hohe Säule gestellt wurden, ihre Position innerhalb von 30 Sekunden nicht korrigiert haben.

Aus der Zahl der keine Katalepsie zeigenden Tiere wurden durch Probit-Analyse die entsprechenden EDgg-Werte für die einzelnen Wirkstoffe ermittelt.

Diese Versuche wurden mit männlichen Wistar-Ratten mit 160 bis 180 g Einzelgewicht durchgefuhrt 2. Potenzierung der durch L-Dopa verursachten lokomotorischen Aktivität an Mäusen (Vgl.: The Thyroid Axis, Drugs and Behavior, S. 116, A. J. Präge Jr„ Raven Press, New York 1974)

Den Tieren wurden zuerst je 40 mg/kg N-Methyl-N-propargyl-benzylamin (Pargyline), dann 20 mgAg TRH, bzw. die gleichen Dosen der zu untersuchenden neuen Tripeptide und schließlich 100 mg/kg L-Dopa, jeweils intraperitoneal verabreicht. 30,60 und 90 min nach der obigen Behandlung wurde die lokomotorische Aktivität der Tiere gemessen; die ermittelten Werte wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die mit TRH behandelten Tieren erhaltenen Werte bezogenen Prozenten angegeben. Zu diesen Versuchen wurden je 15 männliche Mäuse mit 18 bis 22 g Einzelgewicht eingesetzt. 3. Reserpin-Hypothermie-umkehrende Wirkung an Mäusen

Vgl.: B. M. Askew: Life Sei. 2,725-730 (1963).

Den in Gruppen von je 10 Tieren eingeteilten männlichen Mäusen mit 18 bis 22 g Einzelgewicht wurden 5 mg/kg Reseipin i. p. verabreicht; nach 16 Stunden wurden die Tiere mit Dosen von je 20 mg/kg TRH bzw. des zu untersuchenden Tripeptids behandelt

Die rektale Temperatur der Tiere wurde vor der Behandlung mit Reserpin (in der nachstehenden Tabelle: "norm."), nach 16 Stunden nach der Behandlung mit Reserpin (in der Tabelle: "res.") und eine bzw. zwei Stunden nach der Verabreichung der zu untersuchenden Tripeptide (in der Tabelle: "nach Behandl.") gemessen. In der Tabelle sind die Durchschnittswerte der bei je 10 Mäusen gemessenen rektalen Temperaturen angegeben. 4. Beeinflussung der Dauer des durch Hexobarbital verursachten Schlafes

Den in Gruppen von je 10 Tieren eingeteilten männlichen Mäusen wurden je 60 mg/kg Hexobarbital-Na (Evipan® Bayer) intravenös verabreicht; nach 10 min wurden die Tiere mit Dosen von je 20 mg/kg TRH bzw. der zu untersuchenden Tripeptide intraperitoneal behandelt. Die Schlafzeiten wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die bei den Tieren der Kontrollgruppe gemessenen Werte bezogenen Prozentsätzen (Durchschnittswerte von je 10 Tieren) angegeben. 5. Äthanol-Narkose

Vgl.: J. M. Cott etc.: J. Pharmacol. Exp. Ther. 196.594 (1976).

Den in Gruppen von je 20 Tieren eingeteilten Mäusen gemischten Geschlechts mit 18 bis 22 g Einzelgewicht wurden je 4,5 g Äthanol i. p. verabreicht; nach 10 Minuten wurden dann die Tiere mit Dosen von je 20 mg/kg der zu untersuchenden Tripeptide intraperitoneal behandelt. Die Schlafzeiten wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die bei den Tieren der Kontrollgruppe gemessenen Werte bezogenen Prozentwerten (Durchschnittswerte von je 20 Tieren) angegeben. -3-

AT 392 644 B 6. Hormon-Aktivität (TSH-Wirkung) an Ratten Männliche Wistar-Ratten mit etwa 200 g Einzelgewicht wurden in Gruppen von je 7 bis 8 Tieren eingeteilt und mit Dosen von je 20 mg/kg TRH bzw. der zu untersuchenden Tripeptide intravenös behandelt. Die TSH-Reaktion der Tiere wurde 15 min nach der Behandlung mit TRH bzw. mit den neuen IRH-analogen Verbindungen aus dem Plasma der Tiere durch radioimmune Untersuchung ermittelt. Die relativen Wirkungshöhen wurden nach der Vierpunktmethode, mit Hilfe eines TOA101 Computers berechnet, wobei die Wirkungshöhe von TRH als 100 betrachtet wurde.

Die nach den oben geschilderten pharmakologischen Methoden ermittelten Daten der biologischen Wirkungen von einigen Verbindung«! der allgemein«! Formel I wurden in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. (Es folgt eine Tabelle) 4-

AT 392 644 B gl!

00 VO

, - §§ i-ss•5 ä£i ^ CO W

m CO

1^8I «g .Ssi §£§ n 5/5 S co vo vo 1/Ί U o Ί e & 8. a ^ g cs <u PQ j=

s-, Wi CO

cs ®“ CO w co in co

Tabelle v-) 'S p° i 9¾11 Ö ·§ « S1 8* e* § 4 e .£ l% c . § N I £ 2 0ε1 ·§ -ά U Ä“f'l i l-i

His in m 00 cs

Ov >n cs o c cε

.sε o CO cä O fco ***« .1

ΙΛ VO" CO

cs vo" CO >n oo S ^ CN i-»4

>n cs

c c •P4 *p«ε ε VO t" CO «•H cs +1 +1 s-o\ 00 vo CO 'T

-H -H

O co >n co -5-

AT 392 644 B

Aus den Daten der Tabelle ist ersichtlich, daß die neuen TRH-Analoga zwar etwa 70 % der Hormonwiikung beibehalten, gleichzeitig aber erhebliche Wirkungen auf das Zentralnervensystem zeigen.

Die erfindungsgemäß herstellbaren neuen Tripeptide, sowie auch ihre pharmazeutisch anwendbaren Salze bzw. Komplexe können in Form von üblichen Arzneimittelpräparaten in der Therapie angewendet werden. Diese Arzneimittelpräparate enthalten die erfindungsgemäß erhältlichen Wirkstoffe in Begleitung von zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten anorganischen oder organischen Trägerstoffen. Die Arzneimittelpräparate können z. B. in Form von festen Lyophilisaten hergestellt werden, bei welchen mit den Peptiden nicht reagierende Verbindungen, z. B. Kohlehydrate, als Trägerstoffe verwendet werden können; sie können aber auch in Form von konzentrierten oder verdünnten Suspensionen oder Emulsionen oder Tabletten oder Injektionspräparaten hergestellt werden.

Die praktische Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. die chemische Herstellung der neuen TRH- Analoga wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht Die in diesen Beispielen verwendeten Abkürzungen entsprechen den in der Peptidchemie üblichen konventionellen Abkürzungen, vgl. J. Biol. Chem. 242.977 (1972). Es werden ferner die folgenden weiteren Abkürzungen verwendet:

Pip L-Pipecolinylgruppe h2c-ch2

I I HPro L-Homoprolylgruppe (= H2C CH-CH2-CO-Gruppe)

N

H DAE 2-Dirnethylamino-äthyl DCC Dicyclohexyl-carbodiimid PFPOH Pentafluorphenol DCU Dicyclohexyl-hamstoff DMF Dimethylformamid

Die in den Beispielen angegebenen Schmelzpunkte der Verbindungen wurden mittels eines Schmelzpunkt-Meßapparats nach Dr. TottoU (Büchi) ermittelt Die optischen Drehwerte wurden mit Hilfe eines Polarimeters vom Typ Perkin-Elmer 141 gemessen. In den dünnschichtchromatographischen Untersuchungen bzw. Trennungen wurden "Kieselgel G nach Stahl" 05. Merck, Darmstadt) Silicagelplatten verwendet Zur Herstellung der Chromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelgemische eingesetzt: (1) Chloroform : Methanol = 9 : 1 (2) Äthylacetat : (Pyridin:Essigsäure:Wasser 20:6:11) = 9 : 1 (3) Äthylacetat : (Pyridin:Essigsäure:Wasser 20:6:11) = 8 : 2 (4) Äthylacetat : (Pyridin:Essigsäure: Wasser 20:6:11) = 3 : 2

Zur Entwicklung der Flecke wurde Ninhydrinlösung verwendet; nach dem Besprühen wurden die Platten etwa 5 min lang bei 105 °C getrocknet. Dann wurden die Chromatogramme in Chlorgas gelegt und nach Belüftung mit o-Tolidin-Kaliumjodidlösung entwickelt.

Zur säulenchromatographischen Reinigung der Produkte wurde "Kieselgel G" (E. Merck) Silicagel mit 0,062 bis 0,2 mm Teilchengröße verwendet.

Zum Eindampfen der Lösungen im Vakuum wurde ein "Rotavapor R" (Büchi) Vakuum-Eindampfer verwendet, das Eindampfen wurde bei 50 °C nicht überschreitenden Temperaturen durchgeführt.

Die Pentafluorphenylester von BOC-geschützten Aminosäuren wurden nach der Methode von Kisfaludy u. Mitarb. (Ann. 1973.1421) hergestellt.

Die näheren Einzelheiten der Herstellung dar neuen TRH-Analoga nach der vorliegenden Erfindung sind durch die nachstehenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht.

BefcjMl: L-Pyroglutamyl-L-histidyl-D-pipecolinsäureamid

Schritt 1:

Benzyloxycarbonyl-D-pipecolinsäureamid 13,15 g (50 mMol) Z-D-Pip-OH [vgl. L. Baläspiri u. Mitarb.: Monatsh. Chem. lflL 1177 (1970)] werden in 100 ml Äthylacetat gelöst und mit 7,0 ml (50 mMol) Triäthylamin versetzt Das Gemisch wird auf -20 °C abgekühlt und es werden bei dieser Temperatur, unter Rühren 6,5 ml (50 mMol) Chlorkohlensäure-iso-butylester -6-

AT 392 644 B tropfenweise zugesetzt. Nach weiteren 15 Minuten Rühren wird bei -10 °C eineinhalb Stunden lang Ammoniakgas in das Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Niederschlags wird das Filtrat mit N Salzsäurelösung, dann mit N Natriumhydrogencarbonatlösung und zuletzt mit Wasser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Äther kristallisiert; es werden auf diese Weise 11,5 g Z-D-Pip-NH2 (88 % d. Th.) erhalten;

Fp.: 114 bis 115 °C; r/2) = 0,50; [a]D25 = +32,0° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für (Mol.Gew. 262,30): berechnet: N 10,68 %; gefunden: N 10,63 %.

Schritt 2: D-Pipecolinsäureamid 3,93 g (15 mMol) Z-D-Pip-NF^ werden in 75 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,5 g 10 %igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat eingedampft und der Verdampfungsrückstand mit Äther verrieben. Es werden auf diese Weise 1,70 g H-D-Pip-NEFj (90 % d. Th.) erhalten; F. 161-163 °C; R^ = 0,10; [a]jj2^ = +31,0° (c = 1, in Methanol).

Schritt 3:

Benzyloxycaibonyl-L-ghitaminyl-L-histidin-hydrazid 71,0 g (0,165 Mol) Z-Gln-His-OMe [vgl. H. Kappelen Helv. Chim. Acta 44» 476 (1961)] werden in 700 ml DMF gelöst und die Lösung mit 33,6 ml (0,495 Mol) Hydrazinhydrat versetzt Das Reaküonsgemisch wird 3 Tage stehen gelassen, dann mit 600 ml Äthylacetat verdünnt und über Nacht im Kühlschrank gehalten. Am nächsten Tag wird der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (71,65 g) wird aus 1800 ml Methanol umkristallisiert Es werden 55,1 g Z-Gln-His-^Hg (8 % d. 1h.) erhalten;

Fp.: 198-200 °C; r/4> = 0,28.

Analyse für C19H25O5N7 (MoLGew. 431,40): berechnet C 52,90 %, H5,84%, N 22,72%; gefunden: C 52,21%, H5,73%, N 22,78%.

Schritt 4:

Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-histidyl-D-pipecolinsäureamid 5,39 g (12,5 mMol) Z-Gln-His-^Hg werden in 100 ml DMF aufgeschlämmt und die Suspension mit 4,6 ml (37,5 mMol) 8,1 N Salzsäurelösung in Dioxan versetzt Die erhaltene Lösung wird auf -20 °C abgekühlt und dann bei -15 °C, unter Rühren, tropfenweise mit 1,63 ml (13,7 mMol) tert-Butylnitrit versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei -10 °C 20 Minuten gerührt, dann werden tropfenweise 3,5 ml (25 mMol) Triäthylamin, anschließend die Lösung von 1,57 g (12,5 mMol) H-D-Pip-NH2 und zuletzt noch weitere 1,75 ml (12,5 mMol) Triäthylamin zugegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch bei -10 °C noch eine Stunde gerührt, dann über Nacht im Kühlschrank bei 2 °C stehen gelassen. Am nächsten Tag wird der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der amorphe Rückstand wird mit Äthylacetat verrieben. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt wird auf eine Silicagel-Säule gebracht und mit dem Lösungsmittelgemisch (2) eluiert Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, der Rückstand mit Äther verrieben und abfiltriert. Es werden 2,76 g amorphes Z-Gln-His-D-Pip-NE^ (42 % d. Th.) erhalten: r/4) = 0,10.

Schritt-5; L-Pyroglutamyl-L-histidyl-D-pipecolinsäureamid 2,63 g (5 mMol) Z-Gln-His-D-Pip-N^ werden in 50 ml Essigsäure gelöst, die Lösung mit 0,5 g 10 %igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird eine Stunde lang durch die Lösung geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat auf 60-70 °C erwärmt, 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten und dann im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Dowex-2-Ionenaustauscherharz im OH-Zyklus behandelt und eingedampft Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt wird auf eine Silicagel-Säule gebracht und mit dem Lösungsmittelgemisch (1) eluiert Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst, die Lösung mit -7-

ΑΤ 392 644 B

Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung eingedampft. Der amorphe Rückstand wird im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Es werden 704 mg Glp-His-D-Pip-NH2 (51 % d. Th.) erhalten; R^ = 0,10; [a]D25 = 16,0° (c = 1, in Wasser).

Aminosäure-Analyse: Glu 1,03 (1,0), His 1,00 (1,0), Pip 0,96 (1,0).

Beispiel 2: L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-homqprolinamid

Schritt 1: tert-Butyloxycarbonyl-L-homoproIinamid 2,29 g (10 mMol) BOC-HPro-OH werden in 30 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin versetzt und auf -10 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden 1,3 ml (10 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester tropfenweise zugesetzt Nach 15 Minuten Rühren wird bei -10 °C eine halbe Stunde lang Ammoniakgas in das Reaktionsgemisch geleitet worauf das Gemisch zwei Stunden bei 0° bis 5 °C stehen gelassen wird. Der Niederschlag wird dann abfiltriert, das Filtrat eingedampft und das als Rückstand erhaltene Öl in 30 ml Chloroform gelöst Die Lösung wird mit je 10 ml N Salzsäurelösung zweimal, dann mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls zweimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene öl wird durch Behandlung mit n-Hexan zum Kristallisieren gebracht Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (1,96 g) wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Äther umkristallisiert. Es werden 1,78 g BOC-HPro-NH2 (78 % d. Th.) erhalten; Fp.: 138-140 °C; r/2^ = 0,43; [a]D2^ = -24,85° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für Cj 1H20O3N2 (Mol.Gew. 228,29): berechnet: C 57,87%, H8,83%, N 12,27%; gefunden: C 57,60%, H8,89%, N 12,11 %.

Schritt 2; L-Homoprolinamid-hydrochlorid 1,6 g (7 mMol) BOC-HPro-NH2 werden in 10 ml Äthylacetat unter Erwärmung gelöst Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10 ml 6 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt der erhaltene Niederschlag wird verrieben und abfiltriert. Es werden auf diese Weise 1,05 g H-HPro-NH2.HCl (91 % d. Th.) erhalten; F. 178-180 °C; R/6) = 032; [a]D25 = +263° (c = 1, in Methanol).

Schritt 3:

Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-homoprolinamid 539 g (12,5 mMol) Z-Gln-His-^Hß (s. Beispiel 1, Schritt 3) werden in 100 ml DMF aufgeschlämmt und die Suspension mit 4,6 ml (37,5 mMol) 8,1 N Salzsäurelösung in Dioxan versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf -20 °C abgekühlt und dann bei -15 °C, unter Rühren, tropfenweise mit 1,63 ml (13,7 mMol) tert-Butylnitrit versetzt Das Reaktionsgemisch wird bei -10 °C 20 Minuten gerührt, dann mit 3,5 ml (25 mMol) Triäthylamin versetzt Inzwischen werden 2,07 g (12,5 mMol) H-HPro-NI^HCl in 10 ml DMF gelöst und die Lösung mit 1,75 ml (12,5 mMol) Triäthylamin versetzt Nach Abfiltrieren des Niederschlags wird die erhaltene Lösung bei -10 °C zu der obigen Azidlösung tropfenweise zugesetzt und zuletzt werden noch 1,75 ml (12,5 mMol) Triäthylamin zu dem Gemisch zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird anschließend eine Stunde bei -10 °C gerührt und dann über Nacht bei 2 °C stehen gelassen. Am nächsten Tag wird der Niederschlag abfiltriert das Filtrat im Vakuum eingedampft und der amorphe Rückstand mit Äthylacetat verrieben. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt wird auf eine Silicagel-Säule gebracht und mit dem Lösungsmittelgemisch (2) eluiert Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft und der Verdampfungsrückstand mit Äther verrieben. Es worden 235 g Z-Gln-His-HPro-NH^ (36 % d. Th.) erhalten; R^ = 030.

Schritt 4: L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-homoprolinamid 2,1 g (4 mMol) Z-Gln-His-HPro-NH2 werden in 40 ml Essigsäure gelöst, die Lösung mit 0,4 g 10 %igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wird dann abfiltriert, das Filtrat auf 60° bis 70 °C erwärmt, 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten und dann im Vakuum eingedampft Das als Rückstand erhaltene rohe Produkt wird auf die im Beispiel 1, -8-

Claims (1)

1. AT 392 644 B Schritt 5 beschriebene Weise mit Ionenaustauscherharz behandelt und auf einer Silicagel-Säule gereinigt. Es werden 618 mg Glp-His-HPro-NH2 (56 % d. Th.) erhalten; = 0,08; [a]jy^ = -24,0° (c = 1, in Methanol). Aminosäure-Analyse: Glu 0,97 (1,0), His 1,00 (1,0), HPro 0,91 (1,0). PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von neuen Tripeptidamiden der allgemeinen Formel ,(D L-Glp-L-His-Y-NH2 worin Y eine L-Homoprolyl- oder D-Pipecolylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß das geschützte Dipeptid-hydrazid der Formel Z-L-Gln-L-His-N2H3, worin Z Benzyloxycarbonyl darstellt, mit Nitriten zum entsprechenden geschützten Azid umgesetzt wird, letzteres mit einem Aminosäureamid der allgemeinen Formel Y-NH2, worin Y obige Bedeutung hat, umgesetzt wird, und in dem erhaltenen Tripeptidamid nach dem Abspalten der Schutzgruppe Z die Glutaminylgruppe durch Wärmebehandlung zu einer Pyroglutamylgruppe cycüsiert wird. -9-