DD151746A5 - Verfahren zur herstellung von tripeptidamiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft neue, auf das zentrale Nervensystem wirkende Tripeptidamide der allgemeinen Formel Glp-X-Y-NH-A, worin X eine L-Norleucyl-, L-Leucyl-, L-Norvalyl-, D-Leucyl-, L-Prolyl-, L-2-Aminobutyryl-, L-Valyl-, L-Threonyl-, L-Isoleucyl-, L-2-Aminodecanoyl-, L-Cyclohexylalanyl- oder L-tert.-Butyl-serylgruppe und Y eine L-Homoprolyl- oder L-Pipecolylgruppe, A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine durch einen Dimethylaminorest substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkyl Teil bedeuten, mit der Einschraenkung, dasz, wenn X eine L-Leucylgruppe ist, A nicht Wasserstoff ist. Die neuen TRH-Analoga werden aus den entsprechenden Aminosaeuren nach den ueblichen peptidchemischen Methoden hergestellt.

Description

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.Λ- 2 2 2 1 7 5

Verfahren zur Herstellung von Tripeptidamiden

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen, auf das zentrale Nervensystem wirkenden Tripeptidamiden der allgemeinen Formel I

""* GIp-X-Y-M-A (T)

worin

X eine L-Horleucyl-, L-Leucyl-, L-Norvalyl-, D-Leucyl-, L-Prolyl-, L-2-Aminobutyryl-, L-VaIy1-, L-Threonyl-, L-Isöleucyl-, L-2-ilminodecanoyl-, L-Cyclohexyl-ala-" nyl- oder L-tert.-Butyl-serylgruppe und

-2-/22217

Y eine L-Proly!gruppe, oder X eine L-Histidy!gruppe und

Y eine L-Homoprolyl- oder D-Pipecolylgruppe, ferner/ A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 10

Kohlenstoffatomen, oder eine durch eine Dimethyl- aminogruppe substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkyl-Teil

bedeuten, mit der Einschränkung, daß, wenn X eine L-Ieucylgruppe ist, dann A nicht V/asserstoff ist, sowie.von Komplexen dieser Verbindungen.

Die neuen, der oben definierten allgemeinen Formel I entsprechenden Tripeptid-amide sind Analoga von dem auch als "thyrotropin-releaoind hormone" /THH/ bekannten L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolin~amid (GIp-HiS-PrO-InI₂), in welchen aber eine Aminosäure und zwar die an der zweiten Stelle stehende L-Histidylgruppe oder die an der dritten Stelle stehende L-Prolylgruppe auf eine andere_$ in der obigen Definition angegebene Aminosäure ausgetauscht ist.

Charakteristik der bekannten _tgcjTniscjhcj^..Löaungeni_

Die Existenz von TPUl war bereits in den 60-er Jahren bekannt, seine Struktur wurde aber erst in den Jahren 1969 bzw. 1970 von den Forschergruppen von R. Guillemin bzw. A Schally fast gleichzeitig, aber von einander unabhängig erkannt, vgl. C.Y. Bowers etc., Endocrinology 8j5, 1143 (1970); R. Burgus etc., CR. Acad. Sei. (Paris) 26j3, 1870

Das Tripeptid TRH wurde ursprünglich als die Freisetzung ·' von TSH (thyreotropes H_ormon) in der Hypophyse von Säugetieren regulierender Faktor beschrieben; die sich mit diesem Hormon befassende Forschung wurde aber in eine neue

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Richtung gelenkt, als erkannt wurde, daß die biologische Punktion dieses Tripeptids nicht auf die Regulierung der Freisetzung des thyreotropen Hormons beschränkt ist-f sondern auch eine Wirkung auf das zentrale Nervensystem ausübt, (vgl.: N.P, Plotnikoff u, Mitarb., Science Γ78, 417 /1972/; A.J. Prange u. Mitarb., Lancet 2, 999 /1972/). Es wurde dann festgestellt, daß das TRH neben der erwähnten Hormonfunktion auch die Zeitdauer des durch Barbiturate oder Alkohol verursachten Schlafens erheblich herabsetzt, ferner auch die durch verschiedene Arzneimittel verursachte Hypothermie reduziert und die lokomotorische Aktivität steigert. Ein weiterer wichtiger Paktor der auf das zentrale Nervensystem ausgeübten Wirkung von TRH ist die Hemmung der durch Haioperidol verursachten Katalepsie. Es schien also als erwünscht, für die therapeutische Praxis solche TRH-Analoga herzustellen, welche auf die Hypohyse nur schwach wirken, dagegen aber die Wirkung von TRH erreichende oder sogar übertreffende Wirkungen auf das zentrale Nervensystem zeigen. Zu diesem Zweck wurden die in den DE-OS 2 343 035, 2- 343 037, 2 449 167, 2 514 381, 2 609 154 und 2 639 393, sowie in der BE-PS 819 198 beschriebenen derartigen Verbindungen hergestellt. Die bisherige diesbezügliche Forschung, deren Ergebnisse und Erfahrungen von A.J. Pranne u· Mitarb. ("The Role of Hormones in Depression", Life Sciences _20, 1305 /1977/) und von A.V, Schally u. Mitarb. ("Hypothalamic Regulatory Hormones", Ann. Rev. Biochem. jjj[, 89 /1978/) zusammengefaßt wurden, konnte aber nicht zu den Bedürfnissen der therapeutischen Praxis in jeder Hinsicht befriedigenden Ergebnissen führen.

Ziel der Erfindung;

Mit der Erfindung soll diesem Mangel abgeholfen.werden.

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des Wesens der 3*1 rfindun.g;;

Es wurde gefunden, daß man durch den Austausch von einer Aminosäure des aus drei Aminosäuren aufgebauten TRH-MoIeküls erreichen kann, daß die Hormonwirkung des Tripeptide erheblich reduziert, die auf das zentrale Nervensystem ausgeübte Wirkung aber beibehalten oder sogar bedeutend erhöht wird. Als besonders vorteilhaft haben sich aus dieser Hinsicht diejenigen TRH-Analoge erwiesen, welche in der 2-Stellung anstatt der L-Histidylgruppe eine aliphatische Aminosäuregruppe mit gerader oder verzweigter Kohlenstoffkette enthalten· Solche TRH-Analoga zeigen bei einer praktisch vollständigen Abwesenheit der Hormonwirkung eine die derartige Wirkung von TIiH mehrfach übertreffende Wirkung auf das zentrale Nervensystem. Vorteilhaft sind ferner auch diejenigen TRH-Analoga, in welchen die L-Histidylgruppe in der 2-Stellung unverändert beibehalten ist, aber in der 3-Stellung der L-Prolylgruppe von TRH auf eine L-Homopropyl- oder D-Pipecoly!gruppe ausgetauscht ist.

Zur Herstellung der neuen Tripeptidamide der allgemeinen Formel I wird erfindungsgemäß aus einem anstelle von Y die Aminosäuregruppe des gewünschten Endproduktes enthaltenden substituierten Aminosäureamid der allgemeinen Formel Y-NH-A, worin Y und A die bei der allgemeinen Formel I angegebenen Bedeutungen haben, ausgegangen; an dieses Amid werden dann schrittweise, nach den üblichen peptidchemischen Methoden zuerst die an der Stelle von X gewünschte !-Aminosäure und dann die; im Endprodukt in der 1-Stellung stehende L~Pyroglutamylgruppe angekoppelt und .gegebenenfalls anschließend die bei den erwähnten Koppe-' lungsreaktionen eingesetzten Schutzgruppen .abgespalten.· ' Bei der Herstellung von an der Stelle von X eine L-Histidylgruppe enthaltenden Tripeptidamiden der allgemeinen Formel I kann auch so vorgegangen werden, daß man die Aus-

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gangsverbindung der allgemeinen Formel Y-NH-A unmittelbar mit dein aus dem Hydrazid Z-Gln-His-ITH-TfflL - worin Z---eine Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe bedeutet - herge- * stellten geschützten Azid acyliert und dann das erhaltene geschützte Tripeptidamid der allgemeinen Formel Z-Gln-His-Y-ΗϊΙ-Α einer katalytischen Hydrierung unterwirft, die nach dem Abfiltrieren des Katalysators erhaltene essigsäure Lösung auf 60-7O⁰C erwärmt, wobei die Glutaminylgruppe in einer Rekationszeit von etwa 30 Minuten zur Pyroglutaminsäuregruppe cyclisiert wird.

Die auf obige Weise hergestellten Tripeptidanide der allgemeinen Formel I können durch Kristallisieren oder Lyophilisieren aus dem Rekationsgemisch isoliert werden; gevvünschtenfalls können die erhaltenen Produkte auf die übliche Y/eise in Komplexe übergeführt werden.

Bei dem schrittweise erfolgenden Aufbau des Tripeptidmoleküls wird die vorteilhaft im Überschuß eingesetzte Ausgangsverbindung der allgemeinen Formel Y-WH-A mit einem aktivierten Derivat, vorteilhaft mit dem Pentafluorphenylester oder gegebenenfalls mit einem gemischten Anhydrid einer geschützten L-Aminosäure der allgemeinen Formel BoC-X-OH umgesetzt. Bei der Anwendung von Pentafluorphenylestern werden die entsprechenden geschützten Dipeptidderivate der allgemeinen Formel Boc-X-Y-WH-A in äußerst kurzer Rekationszeit, innerhalb von einigen Hinuten erhalten, wobei das Produkt leicht und in einer weiteren Reinigung meistens nicht beanspruchenden Form isoliert werden kann. Aus den auf diese Weise erhaltenen geschützten Dipeptidderivaten können dann durch Acidolyse die entsprechenden, an ihrer Endgruppe freien Dipeptide der allgemeinen Formel*H-X-Y-A erhalten werden; diese werden dann mit Pentafluorphenylestern von geschützter L-Pyroglutaminsäure der allgemeinen Formel Z-GIp-OPi¹P umge-

setzt, wobei das geschützte Tripeptid der allgemeinen Formel Z-LGIp-X-Y-IiH-Y erhalten wird, aus welchem die Schutzgruppe Z vorteilhaft durch katalytisches Hydrieren entfernt werden kann*

Die anstelle von Y eine. L-Homoprolyl- oder D-Pipecolylgruppe enthaltenden freien Amide der allgemeinen Formel H-Y-IiH-A können auch mit dem aus den Hydraziden der allgemeinen Formel Z-Gln-His-l^Ho hergestellten Aziden vorteilhaft acyliert werden; diese Verfahrensweise zeigt den besonderen Vorteil, daß die Hydrazide gut kristallisierbare und so in sehr reiner Form isolierbare Zwischenprodukte sind, In dein letzten V_erfahrensschritt kann die Schutzgruppe Z auch in diesem Fall zweckmäßig durch kata-Iytische Hydrierung abgespaltet werden, wobei dann die Lösung auf 60-7O⁰C erwärmt und dadurch die Glutaminylgruppe in Pyroglutaminylgruppe übergeführt wird.

Die Reinigung des erhaltenen Endproduktes kann durch einfaches Kristallisieren oder Umfallen, nötigenfalls aber auch durch Säulenchromatographie erfolgen. In einigen Fällen kann das Endprodukt nach dem Entfernen der Nebenprodukte auch durch einfaches lyophilisieren auspräpariert werden.

Die. erfindungsgemäß hergestellten Tripeptide wurden nach den nachstehend beschriebenen biologischen Methoden auf ihre pharmakologischen V/irkungen geprüft.

1. Hemmung der Haloperidol-Katalep3ie an Ratten (vgl.; JeDelay und P. Deniker: Compt,-Hend, Cong. lied. 'Aleniotes leurologistes, !£, 497, Luxemburg 1952)

40 mg/kg Haioperidol - 4-/p~Chlorphenyl/-l-_i/3-/p-fluorbenzcyl/-propyl7-piperidin-4-olwurden den Tieren s.c.

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verabreicht und nach 120 Minuten wurde das Eintreten der Katalepsie kontrolliert; dann wurden die Ratten in Gruppen von je 10 Tieren eingeteilt und mit intravenös verabreichten Dosen von TRH bzw. von den neuen TKR-analogen Tripeptiden behandelt. Die Tiere der Kontrollgruppen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt. 15, 30, 90 und 120 Minuten nach der Behandlung wurde die katalepsie-aufhebende Wirkung der einezlnen Verbindungen geprüft. Diejenigen Tieren wurden als kataleptisch betrachtet, welche, wenn sie mit ihren worderen Püßen auf ein 7 cm hohe Säule gestellt wurden, ihre Position innerhalb von 30 Sekunden nicht korrigiert haben.

Aus der Zahl der keine Katalepsie zeigenden Tiere wurden durch Probit-Analyse die entsprechenden ED^Q-Werte für die einzelnen Wirkstoffe ermittelt.

Diese Versuche wurden mit männlichen Wistar Ratten mit 160 bis 180 g Einzelgewicht durchgeführt.

2. Potenzierung der durch L-Dopa verursachten lokomotorischen Aktivität an Mäusen

(Vgl.: The Thyroid Axis, Grugs and Behavior, S. Il6, A.J. Präge Jr., Raven Press, Hew York 1974)

Den Tieren wurden zuerst je 40 mg/kg H-Methyl-lJ-propargyl-• benzylamin (Pargyline), dann 20 mg/kg TRII, bzw. die gleichen Dosen der zu untersuchenden neuen Tripeptide und schließlich 100 mg/kg L-Dopy, jeweils intraperitorieal verabreicht. Nach 30, 60 und 90 Minuten nach der obigen Behandlung wurde die lokomotorische Aktivität der Tiere gemessen; die ermittelten Werten wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die^mit TRII behandelten Tiere erhaltenen'Werte bezogenen Prozente angegeben. Zu diesen Versuchen wurden je 15 männliche Mäuse mit 18 bis 22 g Einzelgewicht eingesetzt.

-8 - 22 2 175

3. Reserpin-Hypothennie-umkehrende Wirkung an Mäusen Vgl.: B.M. Askew: Life Sei. 2, 725-730 (19^3).

Den in Gruppen von je 10 Tieren eingeteilten männlichen Mäusen mit 18 bis 22 g Einzelgewischt wurden 5 mg/kg Reserpin i.p. verabreicht; nach 16 Stunden wurden die Tiere mit Dosen von je 20 mg/kg TRH bzw. des zu untersuchenden Tripeptids behandelt.

Die rektale Temperatur der Tiere wurde vor der Behandlung mit Reserpin (in der nachstehenden Tabelle: "norm"), nach 16 Stunden nach der Behandlung mit Reserpin (in der Tabelle: "res"/ und nach einer bzw. zwei Stunden nach der Verabreichung der zu untersuchenden Tripeptide (in der Tabelle: "nach Behandl.") gemessen. In der Tabelle sind die Durchschnittswerte der bei je 10 Mäusen gemessenen rektalen Temperaturen angegeben.

4« Beeinflussung der Dauer des durch Hexobarbital ver~ ursachten Schlafes

Den in Gruppen von je 10 Tieren eingestellten männlichen Mäusen wurden je 60 mg/kg Hexobarbital-Ua/Evipan¹ Bayer/ intravenös verabreicht; nach 10 Minuten wurden dann die Tiere mit Dosen vpn je 20 mg/kg TRH bzw. der zu untersuchenden Tripeptide intraperitoneal behandelt. Die Schlafzeiten wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die bei den Tieren der Kontrollgruppe gemessenen Werte bezogenen Prozenten (Durchschnittswerte von je 10 Tieren) angegeben.

5. Äthanol-lTarkoae

Vgl.: J.IJ. Cott etc.: J.Pharamcol. Exp. Ther. 2Ü> 595 (1976).

Den in Gruppen von je 20 Tieren eingeteilten Mäusen ge-

„ ₉ . 2 2 2 1 7 S

mischten Geschlechts mit 18 bis 22 g Einzelgewicht wurden je 4,5 g Äthanol i.p. verabreicht; nach IO Minuten wurden dann die Tiere mit Dosen von je 20 mg/kg der zu untersuchenden Tripeptide intraperitoneal behandelt. Die Schlafzeiten wurden in der nachstehenden Tabelle in auf die bei den Tieren der Kontrollgruppe gemessenen V/erte bezogenen Prozente (Durchschnittswerte von je¹ 20 Tieren) angegeben.

6. Hormon-Aktivität (TSH-Wirkung) an Ratten

Männliche V/istar-Ratten mit etwa 200 g Einzelgewicht wurden in Gruppen von je 7 bis 8 Tieren eingeteilt und mit Dosen von je 20 ing/kg TRH bzw. der zu untersuchenden Tripeptide intravenös behandelt. Die TSH-Reaktion der Tiere wurde 15 Minuten nach der Behandlung mit TRH bzw. mit den neuen TRH-analogen Verbindungen au3 dem Plasma der Tiere durch radioimmune Untersuchung ermittelt. Die relativen V/irkungshöhen wurden nach der Vierpunktmethode, mit Hilfe eines TOA 101 Computers berechnet, wobei die V/irkungshöhe "von TRH als 100 betrachtet wurde.

Die nach den oben geschilderten pharmakologischen Methoden ermittelten Daten der biologischen Y/irkungen von einigen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßtο

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Tabelle

	H	Hemmung von Haloperidol- Katalepsie	3 Zeit :g Min.	Potenzierung von L-Dopa lokomotor. Aktivität %	nach 60'	90·	Umkehrung von Reserpin- Hypothermie; rektale Temperatur, C	nach üehandi. res. ,h pk	36,4 32,0	Hexobarbi tal-Schlaf zeit	Äthanol- Schlaf zeit	TSH- Wirkung
	H	mg/1'	,4 120	30·	156	214	norm.	25,9	37,6 32,2	% der Kontroll- Tiere	% der Kontroll- Tiere '
GIp-X-Y-HH-A XYA	Et	11,	,8 120	254	105	112	36,2	27,1	30,7 33,4	114	77	0
	H	16,	,6 30	249	90	201	36,3	28,7	35,3 35,4	77	74	3,8
liva Pro	H	56,	,7 120	102	85	110	36,2	28,5	22,2 25,4	126	65	0
Nleu Pro		13,	15	209	14	18	36,5	19,7	35,5 30,2	63	114	68,6
Leu Pro		80	15	27	100	100	36,3	25,9		84	39	0,02
His HPrο		80		100		36,2	56	35 ,	I 100,0 μ
Abu 'Pro
TRH

Hexobarbital-Schlafzeit /S + SE/ : 38,4 + 1,36 Min.

ro

Äthanol-Schlafzeit

/1 ± SE/ : 46,9 + 2,17 Hin.

- η - 2 2 2 17 5

Aus den Daten dieser Tabelle ist es ersichtlich, daß durch den Austausch von His für eine aliphatische Aminosäure mit 'gerader oder verzweigter Kohlenstoffkette im TRH-Molekül das Aufhören oder mindestens eine erhebliche Reduktion der Ausscheidung von TSH verursacht wird, wobei z.B. die Hemmung der durch Haloperidol verursachten Katalepsie 2- bis 7~mal stärker wird. Einige neue TRH-Analoga zeigen auch eine erhebliche Potenzierung der lokomotorischen Aktivität, bzw. Reduzierung der Hexobarbital- bzw. Äthanol-Schlafzeit. Es ist auch beachtenswert, daß die His-antheltenden neuen TRH-Analoga zwar etwa 70 % der Hormonwirkung beibehalten, gleichzeitig aber erhebliche Wirkungen auf da3 zentrale Nervensystem zeigen.

Die erfindungsgemäß herstellbaren neuen Tripeptide, ao~ wie auch ihre pharmazeutisch anwendbaren Salze bzw. Komplexe können in der Form von üblichen Arzneimittelpräparaten in der Therapie angewendet werden. Diese Arzneimittelpräparate enthalten die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Begleitung von zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten anorganischen oder organischen Trägerstoffen. Die Arzneimittelpräparate können z.B. in der Form von festen Lyophilisaten hergestellt werden, bei welchen mit den Peptiden nicht reagierende Verbindungen, z.B. Kohlehydrate als Trägerstoffe verwendet werden können; sie können aber auch in der Form von konzentrierten oder verdünnten Suspensionen oder Emulsionen oder Tabletten oder Injektionspräparaten hergestellt werden.

Ausführungsbeispiele^

Das erfindungsgemäße Verfahren b'zw. die chemische Hera'tel« lung der erfindungsgemäßen neuen TRH-Analoga wird durch ' die nachstehendn Beispiele näher veranschaulicht. Die in diesen Beispielen verwendeten Abkürzungen entsprechen den

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in der Peptidchemie üblichen konventionellen Abkürzungen, vgl.: J. Biol.. Chem. 2£7, 977 (1972). Ss werden ferner die' folgenden weiteren Abkürzungen verwendet:' ,

Ada 1-2-Ainino-decansäure

Abu l-2~Amino-buttersäure

. Cha L-Cyclohexyl~alanin

Pip 1-Pipecolinsäure

HPro L-Horaoprolin

DiIE 2-Dimethylainino~äthyl-

DCG Dicyclohexyl-carbodiimid

' PPPOH Pentafluorphenol . ·

DCU Dicylohexyl-harnstoff

DHPA Dimethylformamid

Die in den Beispielen angegebenen Schmelzpunkte der Verbindungen wurden mittels eines Schmelzpunkt-Meßapparates nach Dr. Tottoli /Büchi) ermittelt. Die optischen Drehwerte wurden mit Hilfe eines Polarimeters vom Typ Perkin-Elmer 141 gemessen. In den dünnschichtchromatographischen Untersuchungen bzw. Trennungen wurden "Kieselgel G nach Stahl" (JE. Merck, Darmstadt) Silicagelplatten verwendet« Zur Entwicklung der Chromatogramme wurden die folgenden Lösungsmittelgemische eingesetzt:

(1) Chloroform : Methanol 9:1

(2) Äthylacetat: (PyridinEssigsäure:V/asser 20:6:11). 9:1

(3) Äthylacetat: (Pyridin:Sssigsäure:Wasser 20:G:11) 8:2

(4) Äthylacetat: (ParidinEssigsäure:Wasser .20:6:11) 3:2

Zur Entwicklung der Flecke wurde Ninhydrinlösung verwendet; nach der Besprühung wurden.die Platten etwa 5 Minuten lang bei 105 C getrocknet. Dann wurden die Chromatogramme in Chlorgaa gelegt und nach der Belüftung mit o-Tolidin-Kaliumjodidlösung entwickelt.

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Zu der säulenchromatographischen Reinigung der Produkte wurde "Kieselgel G" (E. Merck) Silicagel mit 0,062 bis 0,2 mm«Teilchengröße verwendet.

Zum Eindampfen der Lösungen im Vakuum wurde ein "Rotavapor R" (Büchi) Vakuuin-Eindampfer verwnedet, das Eindampfen wurde bei 50⁰C nicht überschrietenden Temperaturen durchgeführt.

Die Pnetafluorphenylester von BOC-geschützten Aminosäuren wurden nach der Methode von Kisfalady u. Mitarb. (Ann. -1421) hergestellt.

Die näheren Einzelheiten der Herstellung der neuen TRH-Analoga nach der vorliegenden Erfindung sind durch die nachstehenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

L-Pyroglutamyl-L-norleucyl-L-Prolinamid Schritt 1: . L-Norleucyl-L-prolinamid-hydrochlorid

2,28 g (20 mLIol) H-PrO-IiH₂ und 3,97 g (10 mMol) BOC-ltte- -OPPP /""vgl. Kisfalady u. Mitarb., Hoppe-Sayler's Z. Physiol. Chemie £&. 887 (1978]7 werden in 40 ml DMPA gelöst und nach 5 Minuten Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung dreimal mit je 10 ml Salzsäurelösung, dann dreimal mit je 10 ml Ii liatriumhydrogencarbonatlösung und zuletzt einmal mit 10 ml V/asser -ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 5 ml iithylacetat gelöst und die Lösung mit 10 ml 5 U Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Nach 30 Minuten

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-u - ^: 2 2 2 17 5

wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiein IJatriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese Weise 2,48 g H-NIe-PrO-HH₂.HCl (94 % der auf BOC-Ule-OPPP berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten;

R\H-) _ π OCi Ϋ = U, dV_t

Schritt 2: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-norleucyl- -L-prolinamid

1,05 g (4 mlvlol) H-IIIe-PrO-M₂-HCl werden in 10 ml DLIPA gelöst und die Lösung unter Eiskühlung und Rühren mit 0,56 ml (4 nl.iol). Triethylamin und'1,89 g (4,4 ml/Iol) Z-GIp-OPPP versetzt. Hach 5 Minuten Rühren werden weitere 0,56 ml (4 roMol) Triä'thylamin zugegeben; das Gemisch \vird 20 Minuten weiter gerührt und dann im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 40 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 10 ml N Salzsäure zweimal, mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml V/asser einmal ausgeschüttelt, dann mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird unter Äther zum Kristallisieren gebracht und da3 auf diese V/eise erhaltene rohr_Produkt (1,52 g) aus 8 ml Äthylacetat umkristallisiert. Es werden 1,36 g Z-GIp-IiIe-PrO-ITH₂. (72 % d. Th.) erhalten; P. 146-148⁰C; R_f ⁽³⁾ = 0,32 fd,J²^ = - 79,8 (c =1, in Essigsäure).

Analyse für C₂₄H₃₂O₆IT₄ (Mol.Gew. 472,55): berechnet: C 6l,00 %, H 6,83 %, N 11,86 %\ gefunden; C 60,90 %_t Il 7,04 %_t N 11,87 %.

Schritt 3: L-Pyroglutamyl-L-norleucyl-L-prolinamid ^; " ..·.

1,16 g (2,46 mlol) Z-GIp-HIe-PrO-M-I₂ werden in 25 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,2 g 10 tigern Palladium-

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22 2 1 75

Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird 30 Minuten lang durch die Lösung geleitet. Der Katalysator "wird dann abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der feste, amorphe Rückstand wird mit Äther verrieben und abfiltriert. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (0,72 g) wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung lyophilisiert. Bs werden 0,66 g GIp-ITIe-PrO-HH₂ (79,5 % d. Th.) erhalten; R_f ⁽⁴⁾= 0,43; CoOj²J) = -77,1° (c = 1, in Essigsäure).

Aminosäure-Analyse: GIu 0,96 (1,0), Nie 1,00 (1,0), Pro 1,00 (1,0). ,

Beisüiel 2:

L-Pyroglutamyl-L-nervalyl-L-prolinamid Schritt 1: L-Horvalyl-L-prolinamid-hydrochlorid

2,2 g (20 jftlol) H-PrO-IIK₂ und 3,33 g (10 mUol) BOC-ilva- -OPPP /vglT L. Kisfaludy u. Mitarb., Hoppe-Seyler·α Ζ. Physiol. Chemie 222> ⁸⁸7 (1978) werden in 40 ml DUi¹A gelöst, die Lösung 5 Minuten stehen gelassen und dann im Vakuum eingedampft. Da3 als Rückstand erhaltene Öl wird in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 10 ml H-Salzsäure dreimal, mit je 10 ml H Hatriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 5 ml Äthylacetat gelöst und mit 10 ml 5 H Salzsäurelöoung in Äthylacetat versetzt, lach 30 Hinuten wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der erhaltene niederschlag ab-."' filtriert und im Vakuum, über wasserfreiem-Hatriumhydroxyd getrocknet. Ss werden auf diese Weise 1,83 g H-Hva-Pro- -.HH₂-HCl (73 % der auf BOC-ITva-OPPP berechnete theore-

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tischen Ausbeute) erhalten; R-* = 0,10.

Schritt 2: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-prolinamid-

1,25 g'.(5 mMol) H-Nva-Prο-NH₂-HCl werden in 15 ml DMPA aufgeschlämmt und unter Eiskühlung und Rühren mit 0,7 ml (5 rnLlol) Triäthylamin und 2,15 g (5mMol) Z-GIp-OPPP versetzt. IJach 5 Minuten werden weitere 0,7 ml (5 mlvlol) Triethylamin zugegeben, das Gemisch wird v/eitere 20 Minuten gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 10 nil N Salzsäure dreimal, mit je 10 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft« Das als Rückstand erhaltene Öl wird unter Äther zum Kristallisieren gebracht und das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (1,80 g) aus einem Gemisch von Äthanol und Äther umkristallisiert. Es werden 1,66 g Z-GIp-IlVa-PrO-IiH₂ (72 %

d. Th.) erhalten; P. l66~l67°C; R.,⁽³⁾ = 0,29; /^ 7²Z = Q x — — 1/

-87,5 (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für 023Ho₀OgIi₄ (Mol.Gew. 458,52): berechnet? C 60,25 %, H 6,59 %, N 12,22 %\ gefunden: C 60,08 %_t H 6,70 %, IT 12,15 %.

Schritt 3: L-Pyroglutamyl-L~-norvalyl-L-prolinamid

1,42 g (3,1 Mlol) Z-GIp¹NVa-PrO-MI₂ werden in 30 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,2 10 tigern Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und V/asoer3toffgas wird 30 Minuten lang durch die Lösung geleitet. Der Katalysator wird dann abfiltriert und das'Piltrat eingedampft. Der feste, amorphe Rückstand wird mit Äther verrieben und abgetrennt. Das auf diese V/eise erhaltene rohe Pro-

-π- 222175

dukt wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung lyophilisiert. Es werden 0,95 g GIp-MVa-PrO-HH₂ (94 % d. Th.)'erhalten; R_f^ = 0,36; UkJ^ = -87,0° (c = 1, in Essigsäure).

Aminosäure-Analyse: GIu 0,97 (1,0), ITva U,09, 1,0, Pro 1,00 (1,0).

Beispiel J>\

L-J- Py r oglu tainyl-L-prolyl-L-prolinamid Schritt 1: L-Prolyl-L-prolinamid.hydrochlorid

2,28 g (20 mMol) H-PrO-OTI₂ und 3,81 g (10 mllol) BOC~Pro- -OPi¹P werden in 40 ml DLIPA gelöst, die Lösung mit Je 10 ml IT Salzsäure dreimal, dann mit Je 10ml IT Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 10 ml V/asser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 5 ml Äthylacetat gelöst und mit 10 ml 5 IT Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der entstandene Niederschlag abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese V/eise 2,06 g H-PrO-ITH₂-HCl (83 % der auf BOG-Pro- -OPPP berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; R_f ⁽⁴⁾ = 0,05.

Schritt 2: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-polyl- -L-prolinamid

0,75 g (3 mlvlol) H-PrO-MH₂-HOl werden in 10 ml DIiPA aufgeschlämmt und unter Eiskühlung und Rühren mit 0,42 ml (3 mlvlol) Triethylamin und 1,35 g (3,15 mllol) Z-GIp-OPPP

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BOO-VaI-OPi¹P werden in 10 ml DMPA gelöst und nach 30 Minuten Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Das als Verdampfungsrückstand erhaltene Öl wird in 10 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 3 ml Έ Salzsäure zweimal, mit je 3 ml Ή Hatriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 3 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, *mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 3 BiI Äthylacetat gelöst und mit 3 ml 5 Ii Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt« lach einer Stunde Stehen wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der Niederschlag abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem ITatriurahydroxyd getrocknet* Ss werden auf diese Weise 0,51 g HJVaI-PrO-IiH₂.HCl (95 % der auf BOC-VaI-OPZP berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; Rn, = 0,10.

Schritt 2: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-valyl- -L-prolinainid

0,38 g (1,52 ml.iol) H-VaI-PrO-NH₂. PICl werden in 10 ml DMPA aufgeochlämmt und unter Eiskühlung und Rühren mit 0,22 ml (L,52 inMol) Triethylamin und 0,69 g (1,6 ml.iol) Z-GIp-OPFP versetzt. Nach 10 Minuten werden weitere 0,22 ml (1,52 mlvlol) Triäthylamin zugegeben und nach weiteren 30 Minuten Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 15 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 5 ml W Salzsäure zweimal, mit je 5 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 5 ml Wasser einmal ausgeschüt- . telt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther zum Kristallisieren gebracht; es werden auf diese Weise 0,54 g Z-GIp-VaI-PrO-Mi₂ (77 % d. Th.) erhalten; P. 116-118⁰C; R_f ⁽³⁾= 0,30; IFO?²^ =-100,5° Co = 1, in 33ssigsäure).

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- is - 2 2 2 17 5

versetzt. Nach 5 Minuten werden weitere 0,42 ml (3 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach weiteren 10 Minuten -Rühren wi'rd die entstandene dicke Suspension im Vakuum eingedampft. Der kristalline Verdampfungsrückstand wird mit 8 ml Äthanol verrieben und 3 Stunden im Kühlschrank stehen gelassen« Der erhaltene Niederschlag wird dann abfiitriert und getrocknet. Es wird auf diese V/eise 1,0 g Z-GIp-PrO-M₂ (73 % d. Th.) erhalten; P. 247-248⁰C (Zers.) R_f^= 0>19;..Ζ^7²£ = -82,8° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für G₂₃H₂₈O₆II₄ (LIoI.Gew. 456,50): berechnet:

_{c 6Q}^₂ ^ _{ß β?18} ^ _n 12,27-%; gefunden: C 60,03 %, H 6,20 JS, N 12,20 %.

Schritt 3J L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-prolinamid

1,0 g· (2,2 rnldol) Z-Glp-Pro-Pro-HH₂ wird in 50 ml Essigsäure gelöst, 0,2 g 10 %iger Palladium-Aktivkohle-Katalysator werden zugegeben und V/asserstoffgas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wird dann abfiltriert, das Piltrat eingedampft und der Verdampfungsrückstand mit Äther verrieben. Das auf diese V/eise erhaltene amorphe rohe Produkt (0,60 g ) wird in V/asser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung lyophilisiert. Es werden 0,50 g GIp- -Pro-Pro-2'JH₂ (70 % d. Th.) erhalten; R_f ⁽⁴⁾ = -0,10; /J<cJ²\ = -223,1° (c = 1, in Essigsäure).

BeianieI 4 L-Pyroglutamyl-L-valyl-L-prolinamid

Schritt 1: L-VaIyl-L-prolinamid-hydrochlorid 0,49 g (4,2 mMol) H-PrO-NH₂ und 0,82 g (2,14 mMol)

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Schritt 3: L-Pyroglutamyl-L-valyl~L-prolinamid

9,65 g (21,2 mMol) Z-GIp-VaI-PrO-UH₂ werden in 300 ml Wasser gelöst und nach der Zugabe von 2 g 10 tigern PaI-ladiurn-Aktivkohle-Katalysator wird Wasserstoffgas 5 Stunden lang durch die Lösung geleitet. Der Katalysator wird dann abfiltriert und das Piltrat eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in Äthanol gelöst, die lösung eingedampft und diese Operation wird noch zweimal wiederholt. Der schließlich erhaltene amorphe feste Rückstand wird mit Äther verrieben; es werden auf diese Weise 4,47 g GIp-VaI-PrO-Mi₂ (65 % d. Th.) erhalten; R_f ⁽⁴⁾ =

ö,34; /c£7p⁵= -104,9° (c = 1, in Essigsäure).

Aminosäure-Analyse: GIu 1,03 (1,01) VaI 1,00 (1,0), Pro 0,94 (1,0).

Beispiel 5,»

L-Pyroßlutamyl-L-iooleucyl-L-prolinamid Schritt 1: Benzyloxycarbonyl-L-isoleucyl-L-prolinarnid

51,4 g (0,1 Mol) Z-IIe-OPPP und 12,5 g (0,11 Mol) H-Pro- -NH₂ werden in 250 ml DLIPA gelöst und die Lösung mit 14,0 ml (0,1 Mol) Triethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehen gelassen und am nächsten Tag im Vakuum eingedampft.. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 5OO ml Chloroform gelöst, die Lösung nacheinander mit je 100 ml H Salzsäure zweimal, mit- je 100 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls zweimal und mit 100 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampfte. Der ölige Rückstand wird¹¹ aera Gemisch von 100 ml Äther und 100 ml η-Hexan zum

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Kristallisieren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (31,7'g) wird aus dem Gemisch von 60 ml Äthylacetat und 60 ml η-Hexan umkristallisiert. Es werden 30,32 g Z-IIe-PrO-M-I₂ (84 % d. Th.) erhalten; 3?. 127-128⁰C; R_f ⁽²⁾ = 0,54.

Schritt 2:, L-Isoleucyl-L-prolinamid-hydrochlorid

24,0 g (66,5 mlvlol) Z-IIe-PrO-ITH₂ v/erden in 470 ml Methanol gelöst, 30 ml 2,4 N methanolische Salzsäurelösung und 4 g 10 #iger Palladium-Aktivkohle-Katalysator werden zugegeben untJ Wasserstoffgas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wird dann abfiltriert und das Piltrat eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit iither verrieben und das auf diese V/eise erhaltene rohe Produkt (20 g) aus einem Gemisch von !!ethanol und Äther umkristallisiert. Es werden 16,05 g H-IIe-Prο-In-I₂.HCl (81 £ d. Th.) erhalten; P. 135-14O⁰C; R_f^ = 0,15.

Schritt 3: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl~L-i3O-

leucyl-L-prolinamid

0,90 g (3,5 raMol) H-IIe-PrO-ITH₂.HCl werden in 20 ml DLIPA aufgeschlämmt-und unter Eiskühlung und Rühren mit 0,49 ml (3,5 mllol) Triäthylamin und 1,57 g (3,7 ml-Iol) Z-GIp-OPPP versetzt. Nach 5 Minuten werden weitere 0,49 ml (3,5 mMol) Triäthylamin zugesetzt und nach weiteren 20 Minuten Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 30 ml Chloroform gelöst, die Lösung- nacheinander mit je 7 ml U Salzsäure dreimal, mit je 7 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal . und zuletzt mit 7 ml V/asser einmal ausgeschüttet, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. . ·' Das als Rückstand erhaltene Öl wird mehrmal mit Äther behandelt und der Äther dekantiert; zuletzt wird das rohe Produkt unter Äther zum Kristallisieren gebracht, abge-

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trennt, in Äthylacetat gelöst und durch die Zugabe von Äther wieder gefällt. Ea werden auf diese \7eise 1,18 g Z-GIp-IIe-PrO-MH₂ (71,5 % d. Th. ) erhalten; |. 87-89° C; R_f = 0,36; /S'Jjf= -91,4° (c = 1, in Essigsäure). Analyse für C₂₄H ₂O₆N₄ (Mol.Gew. 427,55):

berechnet: C 6l,00 %,-E 6,83 %, N 11,6 %\ '

gefunden: C 59,19 %, H 6,88 %, Ή 11,l6 %.

Schritt 4: L-Pyroglutamyl-L-isoleucyl-L-prolinaraid

4,72 g (10 mMol) Z-GIp-He-PrO-Mi₂ werden in 100 ml Methanol gelöst, 1 g 10 ?Siger Palladium-Aktivkohle-Katalysator wird zugegeben und Y/asserstoffgas eine Stunde durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wird dann abfil'triert, das Piltrat wird eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Da3 auf diese V/eise erhaltene rohe Produkt (3,22 g) wird in V/asser gelöst und die Lösung mit Aktivkohle geklärt. Die wasserklare Lösung wird lyophilisiert; es werden 3,03 g GIp-He-PrO-IiH₂ (98 # d. Th.) erhalten; R^ = 0,45; i?^J T) ~ " 100,7° (c = 1, in Essigsäure). Aminosäure-Analyse: GIu 0,95 (l»0), He 1,00

(1,0), Pro 1,02 (1,0).

Beispiel 6 L-Pyroglutamyl~L-,,£ -aminobutyryl-L-prolinamid

Schritt 1:· tert.-Butyloxycarbonyl-L-^-aminobuttersäure- -pentafluorphenylester

7,7 g (20 mMol) BOC-Abu-OH.DCHA werden in 60 ml Äther aufgeschlämmt,, mit 20 ml 2ITi Schwefelsäure, versetzt und bis zum Auflösen der suspendierten Substanz geschüttelt. Die Ätherphase wird dann' abgetrennt, mit 20 ml 2 H Schwefel-

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säure und anschließend mit 20 ml V/asser ausgeschüttelt, mit. wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl (4,14 g) und 3,7 g (20 mlvlol) PPPOH werden in 25 ml iithylacetat gelöst, die Lösung unter 5 C abgekühlt und unter Rühren mit 3,92 g (19,HiIiIoI) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde im Eisbad gerührt, dann wird der DCU abfiltriert und das Piltrat eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in η-Hexan gelöst und die Lösung eine Stunde im Kühlschrank stehen gelassen. Der noch ausgeschiedene DCU wird abfiltriert und das Filtrat auf 20 ml Volumen eingeengt. Nach Beginn der Kristallausscheidung wird die Suspension in den Kühlschrank gelegt und dort über Nacht stehen gelassen; am nächsten Tag werden die Kristalle durch Filtrieren abgetrennt. Es werden auf diese Weise 5,57 g BOG-Abu-OPPP (76 % d. Th.) erhalten; P. 83-84⁰C; R_f ⁽¹⁾ = 0,86; /47p⁵ = -32,8° (c = 1, in iithylacetat).

Analyse für C₁₅H .O₄NP₅ (Mol.Gew. 369,29):

berechnet: C 48,79 &, H 4,37 %, N 3,79 %, P 25,72 %\ gefunden: C 43,55 %, H 4,28 %_t N 3,70 %, P 25,44 %.

Schritt 2: L-c^-Aminobutyryl-L-prolinamid-hydrochlorid

3,2 g (28 mMol) H-PrO-NiI₂ und 5,16 g (14 mMol) BOC-Abu- -OPPP werden in 60 ml,DMPA gelöst und nach 5 Minuten Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 100 ml Chloroform gelöst, •die Lösung mit je 20 ml N Salzsäure zweimal und anschliessend mit je 20 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls zweimal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 20 ml Athylacetat gelöst und mit 20 ml 6 N Salzsäurelösung in iithylacetat versetzt. Nach einer

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Stunde wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der erhaltene Niederschlag., wird^ abfiltriert und im Vakuum , über wasserfreiem Natriumhydrbxyd getrocknet. Das auf diese Y/eise erhaltene rohe Produkt )3,86 g) wird mit 20 ml kaltem DIiU¹A verrieben. Ss werden 2,40 g H-Abu-Pro-.HCl (73 % der.auf £00-Abu-OPFB berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; R^ = 0.10.

Schritt 3: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutariiyl-L-c/O-aminobutyryl-L-prolinamid

2,13 g (9 mMol) H-Abu-Pro-HH₂.HC1 werden- in 30 ml DMPA aufgeschlämmt und unter Eiskühlung und Rühren mit 1,26 ml (9 inLIol) Triethylamin und 3,95 g (9,2 rnMol) Z-GIp-OPPP versetzt. Nach 5 Minuten werden weitere 1,26 ml (9 lnl.iol) Triäthylamin zugegeben und nach 20 Minuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemiach im Vakuum eingedampft* Der kristalline Rückstand wird mit 20 ml Äthanol verrieben, über !lacht im Kühlschrank stehen gelassen und dann abfiltriert. Es werden auf diese Y/eise 3,30 g Z-GI -Abu-Pro-lTHp (82 % d. Th.) erhalten; P. 175-1To⁰C; _f^ 0,28; [kJ²\ = - 99,6° (c = 1, in Essigsäure).

Schritt 4: L~Pyroglutamyl-L-o£ -aminobutyryl-L-prolinamid

2,67 g (6 ralvlol) Z-Glp-Abu-Pro-1TH₂ werden in 100 ml Essigsäure gelöst, die Lösung mit 0,5 10 ^igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Y/asserstoffgas wird eine Stunde lang durch das G misch geleitet. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das auf diese V/eise erhaltene amorphe rohe Produkt (o,82 g) wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung pyophilisiert. Es werden 1,70 Glp-Abu-Pro-

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(91 % d. Th.) erhalten: R_f ' = 0,24; loCiJ j/= - 102,5° (c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 7 : L-Pyroglutamyl-L-oo-aminodecanoyl-L-prolinamid

Schritt 1:

L-o6 -Aminodecanoyl-L-prolinamid-hydrochlorid

1,37 g (12 mMol) Ii-PrO-NH₂ und 2,72 g (6 mMol) BOC-Ada- -OPPP werden in 20 ml DUPA gelöst und nach 5 Minuten Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Das ctls Rückstand erhaltene öl wird in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 10 ml N Salzsäure dreimal, dann mit je 20 ml N llatriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit je .10 ml Wasser zweimal ausgeschüttelt,, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 3 ml A* thy lace tat gelöst und die Lösung mit 5 nil β IT Salzsäurelösung in Athylacetat versetzt. Nach 1 Stunde «Stehen wird das Reaktionsgemisch mit iithter verdünnt, der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum, über wasser-' .freiem Natriumhydroxyd getrocknet« Es werden auf diese Weise 1,75 g H-Ada-Pro-NII₂.HC1 (91 Sä der auf BOC-Ada- -OPPP berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; B_f»> =.0,11.

Schritt 2: Benzylcarbonyl-L-pyroglutamyl-L-eC-amino- -decanoyl-L-prolinamid

1,75 g (5,5 mMol) H-Ada-Pro-HHgrHGL und 2,58 g (6 mMol) Z-GIp-OPPP werden in 30 ml DMJ¹A gelöst und die Lösung mit 0,77 ml (5,5 mMol) Triethylamin versetzt. Nach 5 Mi-

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nuten werden weitere 0,77 g (5,5 mMol) Triäthylamin zugegeben und nach 2 0 Minuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft*. Der Verdampfungsrückstand wird in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 20 ml Ii Salzsäurelösung dreimal, mit je 20 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit je 20 ml Wasser zweimal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene aufschäumende Öl wird mit Äther verrieben, die erhaltene gelartige Suspension wird etwa' 2 Stunden im Kühlschrank stehen gelassen, dann wird der niederschlag abfiltriert und getrocknet. Das auf diese V/eise erhaltene rohe Produkt (2,6l g) wird aus ml Äthylacetat umkristallisiert. Es werden 2,45 g Z-GIp- -Ada-Pro-HH₂ (84 % d. Th.) erhalten; P. 1O3-1O5°C; ^⁾ = 0,19; Zc</7Jp = - 63,7° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für ^c ₂8^H40°6^N4 (^Mo1· ^Gev/* 528,65): berechnet: C 63,62 %, H 7,6-3 g, N 10,60 %\ gefunden: C 63,24 #, H 7,81 %_t N 10,57 %.

Schritt 3: L-Pyroglutamyl-L-iO-aminodecanoyl-L-prolinamid

1»9 g (3,6 .mlvlol) Z-Glp-Ada-Pro-IiHp werden in 40 ml Essigsäure gelöst, die lösung mit 0,2 g 10 tigern Palladium Aktivkohle-Katalysator versetzt und V/asserstoffgas wird anderthalb Stunden lang 'durch das,Gemisch geleitet. Der Katalysator wird dann abfiltriert, das Piltrat eingedampft und der Verdampfungsrückstand in V/asser gelöst. Die wäßrige Lösung wird mit Aktivkohle geklärt und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 30 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit wasserfreiem Natriumsulfat gelöst, die Lösung mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der aufschäumende, amorphe,

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feste Rückstand wird mit Äther verrieben, abfiltriert und getrocknet. Es werden auf diese Weise 1,20 g • Glp-Ada-Pr©^Mi₂ (82 % d. Th.) erhalten; R_£ = 0,55, /ZbI £ - - 66>2° (c = 1, in Essigsäure),

Beispiel 8

L-Pyroglutamyl-L-cyclohexylalanyl-L-proiinamid

Schritt 1: tert.-Butyloxycarbonyl-L-cyclohexylalanin- -pentafluorphenylester

9,04 g (20 ml.iol) BOC-Cha-OH.DCHA werden in 80 ml Äther aufgeschlämmt und die Suspension mit 20 ml 2 N Schwefelsäure versetzt. Das Gemisch wird bis zur Auflösung der festen Substanz geschüttelt, dann wird die Ätherphase abgetrennt, mit 20 ml 2 N Schwefelsäure und anschließend mit 20ml V/asser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl (5j7 g) wird in 30 ml Äthylacetat gelöst, mit 3»7 g (20 ml.lol) PPPOH veroetzt, das Gemisch wird auf höchstens 5°C abgekühlt und mit 4,12 g (20 laMol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch-wird bei dieser Temperatur eine Stunde gerührt, dann wird der ausgeschiedene DCU abfiltriert, das Piltrat eingedampft und das als Rückstand erhaltene Öl in 30 ml η-Hexan gelöst. Die Lösung wird eine Stunde im Kühlschrank stehen gelassen, der dabei noch ausgeschiedene DCU wieder abfiltriert und das Piltrat mit 70 ml η-Hexan verdünnt. Die verdünnte Lösung wird mit je 40 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung fünfmal und an-. schließend mit je 40 ml V/asser zweimal ausgeschüttelt, '· mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und einge- · ·' dampft. Das als Rückstand erhaltene Öl kristallisiert beim Stehen. Ss werden auf diese Weise 8,48 g BOC-Cha-

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-OPPP (97 % d. Th.) erhalten; P. 75-77⁰C; R_f ^(l) = 0,88.

Analyse für C₂₀H₂₄O₄BP₅ (MoIg.Gew. 437,41):

berechnet: C 54,92 %, H 5,53^, N 3,20 %, P 21,72 #; -gefunden: C 54,67 %_t H 5,66 %,N 3,11 %, P 21,43 %.

Schritt 2: L-Cyclohexylalanyl-L-prolinamid-hydrochlorid

2,28 g (20 mLiol) H-PrO-IH₂ und 4,37 g (10 rnMol) BOC-Cha- -OPPP.werden in 40 ml DMPA gelöst und nach 5 Minuten Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 80 ml Chloroform gelöst, die lösung mit je 20 ml IJ Salzsäure dreimal, mit je 20 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 20 ml V/asser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Da3 als Rückstand erhaltene Öl wird in 8 ml Äthylacetat gelöst, mit 10 ml 5 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt und nach einer Stunde wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt« Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxid getrocknet. Es werden auf diese V/eise 2,98 g H-Cha-Pr0-IiH₂.HCl (97 % der auf BOC-Cha-OPPP berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; rJ^ = 0,33.

Schritt 3: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L- - -cyclohexyl-alanyl-prolinamid

2,43 g (8 mliol) H-Cha-Pro-HHg.HCl und 3,60 g (8,4 mlvlol) Z-GIp-OPPP werden in 25 ml DlIPA- gelöst und die Lösung mit 1,12 ml (8 niMol) Triethylamin versetzt. Nach 5 Minuten werden weitere 1,12 ml (8 mMol) 'Tr iä thy larain zugesetzt und nach weiteren 20 Minuten Rühren wird das Reaktionsge*· misch im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in ,80 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 20 ml Έ Salzsäure dreimal, mit je 20 ml IT Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 20 ml V/asser

22 2 1 75

einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhalterie Öl wird mit Äther zum Kristallisieren gebracht; das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (3,88 g) wird aus 30 ml Äthylacetat umkristallisiert. Es werden 3,32 g Z-Glp-Cha-M₂ (81 % d. Th.) erhalten; P. l65-l66°C; B_f^²''= 0,17; L~^J²^ - *67,3'° (o = 1, in Essigsäure). «

Analyse für C₂₇H₃^OgN₄ (IvIoI.Gew. 512,61):

berechnet: C 63,26 %, H 7,08 %, N 10,93. #; gefunden: C 63,15 /*, H 7,04 %, N 10,91 %.

Schritt 4: L-Pyroglutamyl-L-cyclohexylalanyl-L- -prolinaraid

3,07 g (6 mLIol) Z-Glp-Cha-PrO-IIH₂ werden in 60 ml Äthanol gelöst, die Lösung wird mit 0,6 g 10 tigern Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und V/asserstoffga3 wird 2 Stunden lang durch die Lösung geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Es werden auf diese Weise 2,15 g amorphes, festes Glp-Cha~Pro-NH₂ (95 % d. Th.) erhalten; R_f^ = 0,50; fcCj²^ = -70,9° (c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 9,

L-Pyroglutamyl-L-threonyl-L-prolinamid Schritt 1: O-Benzyl-L-threonyl-L-prolinamid-hydrochlorid

1,43 g (12,5 iriMol) H-PrO-MI₂ und 2,98 g (6m27 nil.iol) BOC-Thr(BzI)-OPPP werden in 20 ml DMPA gelöst und*nach 5 Minuten Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 30 ml Chloroform

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gelöst, die Lösung mit je 10 ml N Salzsäure zweimal, anschließend mit je 10 ml IT Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Verdampfungsrückstand erhaltene Öl wird in 4 ml Äthylacetat gelöst und mit 5 ml 5 N Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt., Nach einer Stunden Stehen wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der entstandene niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese V/eise 2,05 g H-Thr(BzI)- -PrO-IJH₂.HCl (95 % d. Th.) erhalten; R_f ⁽⁴⁾ = 0,40.

Schritt 2: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-O- -benzyl-threonyl~L-prolinamid

2,05 g (SmLIoI) H-Thr(BzI)-PrO-HII₂.HCl und 2,69 g (62,7 ml.Iol) Z-GIp-OPPP werden in 2L ml DLIPA gelöst, die Lösung mit 0,84 ml (6 mlvlol) Triäthylamin tropfenweise versetzt und nach 5 Minuten Stehen werden weitere 0,84 ml (6 mlvlol) Triäthylamin zugesetzt. Nach 20 I.Iinuten Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft, der Rückstand in 50 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 10 ml IT Salzsäure zweimal und mit je 10 ml-uJ ITatriuinhydrogencarbonatlösung dreimal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene 01 wird mit Äther behandelt und abgekühlt, wobei das Produkt in amorphem Zustand erstarrt. Da3 auf diese V/eise erhaltene rohe Produkt (2,76 g) wird in Äthylacetat gelöst und mit Aktivkohle geklärt. Nach dem Abfiltrieren wird das Piltrat eingedampft und der feste, amorphe, aufschäumende Rückstand mit Äther verrieben. Es werden 2,47 g Z-Glp-Thr(BzI)-Pr₀-NH₂ (75 % d. Th.) erhalten.

-31- 22 2 175

Schritt 3: L-Pyroglutamyl-L-threonyl-L-prolinamid

2,04 g (3,7 mMol) Z-Glp-Thr(BzI)-PrO-HH₂ werden in 40 ml Essigsäure gelöst, die Lösung mit 0,4 g 10 tigern Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und V/asserstoffgas wird 4 Stunden lang durch das Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das auf diese Weise erhaltene amorphe rohe Produkt (1,31 g) wird auf eine 30 g Silicagel (Teilchengröße: 0,063 - 0,2 mm) enthaltende Säule getragen »und mit dem Lösungsmifctelgemisch (3) aluiert. Die reines Produkt enthaltenden Eluatfraktionen werden vereinigt und eingedampft und das als Rückstand erhaltene rohe Produkt mit Äther behandelt. Es v/erden 0,72 qip-Thr-Pro-lJH₂ (59,5 % d. Th.)' erhalten; ... E_f ⁽⁴⁾ = 0,16; ßj^z\ = - 90,0° _{c . _{lt in E3si3Eäure)}.

Aminosäure-Analyse: GIu 1,00 (o,0), Thr 0,99

(1,0), Pro 1,03 (1,0).

Beispiel 10

L-Pyroglutamyl-O-tert.-butyl-Ii-seryl-L-prolin-

amid

Schritt 1: O-tert.-Butyl-L-seryl-L-prolinamid-hemioxalat

8,0 g (70 EiIiIoI) H-Pro-lfflp und 16,0 g (34,7 mMol) Z-Ser

IM 1 TT ImI)KH¹K TTl fJ Τ» Γ\ £·Λ ΓΙ "1 Π I χ" I I ΤΊΊ I I I Y,.\ it" il ΓΤΏΙί^ηΐ" nn/1 Π Π Ω Ι,ΛΠΙΙΙ¹.,,

(^xBut)~OPEP werden in 120 ml DIvIPA gelöst und die Lösung nach 5 Minuten Stehen im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 300 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 80 ml IT Salzsäure dreimal, mit je 80 ml H Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 80 ml V/asser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Da3

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2 2 2 17 5

als Rückstand erhaltene Öl (18 g) und 4,37 g (34,7 mMol) Oxalsäuredihydrat werden in 300 ml Methanol gelöst, die ^:Lö3ung. mit ,3 g 10 tigern Pallaidum-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat eingedampft, der Rückstand wird mit Äthylacetat verrieben und im Vakuum getrocknet. Es werden auf diese Weise 10,8 g H-Ser (¹³Bu)-PrO-IiHp. (COOH)_P (90 % der auf Z-Ser( Bu)-OPJ¹P berechneten theoretischen Ausbeute) in der Form einer amorphen, hygroskopischen Substanz erhalten; R_f^ = ß,22.

Schritt 2: ' Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutanyl-O- - tert.~butyl-l-3eryl-L-prolinamid

6,43 g (18,5 ml.lol) H-Ser("⁵Bu)-PrO-IIK₂. (COOH)₂ und 7,95 g (18,5 -mlJol) Z-GIp-OPPP werden in 80 ml DIJPA gelöst und die Lösung mit 5,18 ml (37 mMol) Triethylamin versetzt. Nach 5 Minuten Stehen wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der kristalline Rückstand mit Äther verrieben. Das auf diese V/eise erhaltene rohr Produkt (9,53 g) wird aus 120 ml Methanol umkristalli3iert. Es werden 7,70 g Z-Glp-Ser^Bu)-PrO-IJH₂ (83 % d. Th.) er^{(3) 2}^

halten; P. 226„229°C; R_f ⁽³⁾ = 0,40; [cOj²^= 71,6° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für C₂₅II₃₄O₇IT₄ )Mol.Gew. 502,57):

berechnet: C 59,75 %, H 6,82 %, IT 11,15 %\ gefunden: C 59,55 %, H 6,95 &, IT 11,09 %.

Schritt 3: L-Pyroglutamyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-

-prolinamid ' "

4,02 g (8 mMol) Z-GIp-SGr(^u)-PrO-IiH₂ werden in 16 ml Methanol gelöst, die· Lösung mit 0,8 g 10 tigern Palladiurn-Aktivkohle-Katalysator versetzt und V/asserstoffgas

- 33

- 33 - 2 2 2 17 5

wird 30 Minuten lang durch daa Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das FiItrat eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl kristallisiert unter Äther; die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Es werden auf diese Weise 2,50 g Glp-Ser( Bu) -Pro-HHp (85 % d. Th.) erhalten;.P. 186-187⁰C; R ^⁴' = 0,45; ßii/t ⁷D = - 60,8 (c = 1,'in Essigsäure).

Aminosäure-Analyse: GIu 1,03 (1,0), Ser 1,00

(1,0), Pro 1,00 (1,0).

Analyse für C₁^H₂₈O₅N₄ (LIoI.Gew. 368,44):

berechnet: C 55,42 ^c/₀, H 7,66 #, N 15,21 ^; gefunden: C 55,07 %, H 7,6l #, N 14,94 Ύο.

Beispiel 11 L-Pyroglutamyl-D-leucyl-L-prolinamid

Schritt 1: tert.-Butyloxycarbonyl-D-leucin-pentafluorphcnylester

4,62 g (20 mlJol) BOC-D-Leu-OH und 4,23 g (22 mlJol) PPPOH werden in 50 ml ÄthLylacetat gelöst und die Lösung unter Eiskühlung und Rühren mit 4,12 g (20 mllol) DCC versetzt. Da3 Reaktionsgemisch wird eine Stunde im Eisbad gerührt, dann wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abil-^ triert und das Filtrat eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 100 ml η-Hexan gelöst, die Lösung eine Stunde im Kühlschrank stehen gelassen und der noch ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird wieder abfiltriert. Das Filtrat wird mit je 50 ml N Natriumhydrogencarbonat-Ib'sung fünfmal und mit je 50 ml V/asser zweimal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl kristallisiert über Nacht« Es werden auf diese Weise 7,0 g BOC-D- -leu.OPPP (88 ^c/o d. Th.) erhalten; F. 53-55⁰C; R_f^ =

- 34 -

, - 34 - 2 2 2 1 7 5

+ 31,7° (c = 1, in Äthylacetat).

Analyse für C₁₇H₂₀O₄ITP₅ (Hol. Gew. 397.35):,

berechnet: C 51,39 %, .H 5,07 %, Ii 3,53 %, S¹ 23,91 %\ gefunden: C 51,51 %, H 4,68 %₉ Ii 3,66 %, P 23,65 %.

Schritt 2: D-Leucyl-L-prolinamid-hydrochlorid

3,42 g (3° ΐώΐοΐ) H-Pro-I\fH₂ und 60,0 g (15 mLIol) BOC-D-Leu- -OPPP werden in 60 ml DMPA gelöst und nach 5 Minuten Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 20 ml Ii Salzsäurelösung zweimal, mit Qe 20 ml Ii Iiatriumhydrogencaronatlösung dreimal und zuletzt mit 20 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 100 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit 15 ml 4 Ii Salzsäurelösung in Äthylacetat versetzt; nach einer Stunde wird das Reaktionsgemisch mit Äther verdünnt, der Niederschlag abfiltriert und im Vakuum über wasserfreiem ITatriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese Weise 3,66 g H-D-Leu-Pro-IJIL).HCl (92,5 % dor auf BOCJ·D-Leu»OPPP be-

rechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; R_f = 0,26.

Schritt 3: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-D-Leucyl-L- -prolinamid

3,66 g (13,9 mHol) H-D-Leu-Pro-ffllg.HCl und 6,43 g (15 mlvIOL) Z-GIp-OPPP werden in 50 ml DHPA gelöst und die Lösung unter Eiskühlung und Rühren mit 1,95 ml (13,9 mMol) Triethylamin versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten gerührt und dann werden weitere 1,95 ml (13,·9 mllol) Triethylamin zugegeben; nach weiteren 20 Hinuten Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in 120 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 30 ml H Salzsäurelösung dreimal, mit je 30.ml Ii liatriumhydrogen-

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carbonatlösung ebenfalls dreimal und zuletzt mit 30 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird durch Behandlung mit Äther zum Kristallisieren gebracht* Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt' (6 g) wird aus 30 ml Äthanol umkristallisiert. Bs werden 5,48 g Z-Glp-D-leu-Pro-HHg»(77 % d. Th.) erhalten; F. 189-194°C; R_f ⁽³⁾ = 0,48; HhJ^= - 33,2° (c = 1, in Essigsäure).

Schritt 4: L-Pyroglutamyl-D-leucyl-L-prolinamid

3,78 g (o mMöl) Z-GIp-D-LeU-PrO-IiH₂ werden in 150 nl Methanol gelöst, die Lösung mit 0,8 g 10 tigern Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und V/asserstoffgas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. !lach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das auf diese V/eise erhaltene rohe Produkt (2,5 g) wird in Wasser gelöst, mit Aktivkohle geklärt und die wasaerklare Lösung lyophilisiert. 3s werden 2,35 g Glp-D-Leu-Pro-ITHg (87 % d. Th.) erhalten; R_f ⁽⁴⁾ = 0,48; £ZC_7 ²^ = - 83,3°·(c = 1, in ' Essigsäure).

Beispiel 12

' L-Pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolin-äthylamid Schritt 1: L-Leucyl-L-prolin-äthylamid-hydrochlorid

1,67 g (7,2 mlvlol) H-Pro-IJH-St. (COOH)₂. werden in 20 ml •Äthylacetat aufgeschlämmt und die Suspension mit 2,0 ml (14,4 mi-Ιοί) Triäthylamin und 2,36 g (6 mlVIol) BOC-Leu- ' " -OPPP versetzt. Hach 5 Minuten wird das Reaktionsgemisch mit je 5 nil N Salzsäurelösung zweimal, dann mit je 5 ml

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- ³⁶ - 22217

N Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 5 ml-Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene öl wird mit 10 ml 5 N Salzsäurelösung in Äthylacetat behandelt, nach 20 Minuten wird das Gemisch mit Äther verdünnt, der Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese V/eise 1,46 g hygroskopisches H-Leu-Pro- -Mi-EtJIGl (83 % der auf BOC-Leu-OPIT berechneten theoretischen Ausbeute) erhalten; Rf =.0,43.

Schritt 2: Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl- -I-prolinamid

1,17 g (4 mlvlol) H-Leu-Pro-NH-Et.Hcl und 1,72 g (4 ml.Iol) Z-GIp-OPPP werden in 15 ml DLiPA gelöst und die Lösung mit 0,56 ml (4mMol) Triethylamin versetzt. Wach 5 Hinuten werden weitere 0,56 ml .(4 ml'.Iol) Triethylamin zugegeben und das Gemisch im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 40 ml Chloroform gelöst, die Lösung mit je 10 ml N-Salssäure zweimal, mit je 10 ml Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mit η-Hexan verrieben und abfiltriert. Es werden auf diese Weise 1,61 g amorphes Z-GIp-Leu-Pro-IJH-Et {80,5 % d. Th.) erhalten; Rf^ = 0,50; C<J²\ = -.89,0° (c = 1, in Essigsäure).

Schritt 3: L-Pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolin-äthylamid

1,07 g (2,14 mLlol) Z-Glp-Leu-Pro-ira-Bt werden in 30 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 0,25 g 10 tigern Pallaidum-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird anderthalb Stunden lang durch das Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat eingedampft, der ölige Rückstand in 20 ml Chloroform gelöst,

2 9 O 1 7

die Lösung mit wasserfreiem Natriumsulaft getrocknet und eingedampft. Der nach Aufschäumen erstarrende Rückstand wird mit einem Gemisch von Äther*und η-Hexan verrieben. Es werden auf diese Weise 0.52 g Glp-Leu-Pro- -NH-Et (66 % d. Th.) erhalten; R_f^ = 0,57; ßoj²^ = - 94j5° (c = 1, in Essigsäure).

Beispiel 1.3

L-Pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolin-n-decylamid Schritt 1: Benzyloxycarbonyl-L-prolin-n-decylamid

5,0 g (20 mlvlol) Z-Pro-OH werden in 50 nil DLlPA gelöst, die Lösung mit 2,8 ml (20 mMol) Triäthylamin versetzt und auf -10 C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden unter Rühren zuerst 2,8 ml (21,5 ml.iol) Chlorkohlensäureisobutylester und nach 10 Hinuten 4,4 ml (22 ml/Iol) n-Decylamin tropfenweise zugesetzt. Uach der Beendigung der Zugabe wird das Gemisch 30 Minuten bei O⁰C und anschliessend 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die ^erhaltene» Suspension wird abfiltriert, das Piltrat eingedampft.und der Rückstand in 100 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit je 50 ml N Salzsäurelösung viermal, mit je 50 ml N Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal und zuletzt mit 50 ml V/asser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Verdampfungsrückstand erhaltene Öl wird durch Behadnlung mit η-Hexan zum Kristallisieren gebracht. Es werden auf diese Weise 5,43 g Z-PrO-NH-G₁₀H₂₁ (70 % d. Th.) erhalten; F- 78 - 80⁰C; Rf⁽²⁾ = 0,75.

Schritt 2: L-Prolin-n-dacylamin-hemioxalat.: · ' 5,0 g (12,9 mlvlol) Z-PrO-IOl-C₁₀H₂₁ und 2,02 g (l6 mlvlol)

- 38 -

- 38 - 2 2 2 17 5

Oxalsäure-dihydrat werden in 100 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,8 g 10 tigern Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird 2 Stunden lang durch das Gemisch geleitet. Nach der Beendigung der Hydrierung wird das Reaktionsgemisch erwärmt, der Katalysator wird durch Filtrieren entfernt und das Piltrat eingedampft. Der kristalline Rückstand wird mit Äther verrieben und abfiltriert. Es werden auf diese Weise 3,9 g H-Pro-₀H₂₁.(COOH)₂ (88 % d. Th.) erhalten; P. 152 - 154⁰C;

"= 0,16.

Schritt 3ί L-Leucyl-L-prolin-n-decylamid-hydrochlorid

3,44 g (10 mliol) H-PrO-NH-C_1nH₂₁.(COOH)₂ und 2,0 g (5 mMol) BOC-Leu-OPPP werden in 30 ml DLIPA gelöst und die Lösung mit 2,8 ml (20 mliol) Triäthylarain versetzt. Nach 5 Minuten Stehen wird das Reaktionsgemisch eingedampft und das · als Rückstand erhaltene Öl in 50 ml η-Hexan gelöst. Die Lösung wird mit je 30 ml H Salzsäurelösung fünfmal, mit je 30 ml N Natriurnhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 30 ml V/asser einmal ausgeschüttelt und eingedampft. Da3 al3 Rückstand erhaltene Öl wird in 10 ml N Salzsäurelösung in Äthylacetat gelöst, die Lösung wird 30 Hinuten stehen gelassen und anschließend eingedampft. Der im Vakuum aufschäumende amorphe Rückstand wird mit η-Hexan verrieben, abfiltriert und im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese Weise 1,05 g H-Leu-Pro-HH-C₁₀H₂₁.HC1 erhalten (' 60 % der auf BOC-Leu-OPPP berechneten theoretischen Ausbeute); R_f ⁽³⁾ = 0,17.

Schritt 4: Benzylcarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl- ~L~prolin~n~decylamid

1,03 g (2,55 ml'Jol) H-LeU-PrO-NH-C₁₀H₂₁.HCl werden in 10 ml

- 39 -

222 1 75

DMFA gelöst und die Lösung mit 0,36 ml (2,55 mMol) Triäthylamin und 1,1 g (2,55 mMol) Z-GIp-OPFP versetzt.

'Das Gemisch wird 5 Minuten gerührt, dann werden weitere 0,36 ml (2,55 mMol) Triethylamin zugesetzt und nach 20 Minuten weiterem Rühren wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml Chloroform' gelöst, die Lösung mit je 10 ml IT Salzsäurelösung fünfmal, mit je 10 IT Natriumhydrogencarbonatlösung dreimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird unter Äther zum Kristallisieren gebracht und abfiltriert. Es werden auf diese Weise 1,22 g Z-GIp-LeU-PrO-M-O_1nII₀₀ (78 5» d. Th.) erhalten; F. 108-109^yC; R-,^u; = 0,50; /oi/r\ = -74,5

'· (c = 1, in Essigsäure). *

Analyse für O₃₄Hr₃O₆IT₄ (Mol. Gew. 612,82); berechnet: C 66,64 %, H 8,55 #, N 9,14 %\ gefunden: C 66,43 %, H 8,84 %, IT 9,13 %.

Schritt 5: L-Pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolin-n-decylamid

1,22 g (2 mLIol) Z-GIp-Leu-Pro.NH-O₁₀H₂₁ werden in 30 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,2 g 10 %igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und V/asserstoffgas wird 30 Minuten lang durch da3 Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat eingedampft und das als Rückstand erhaltene Öl-'durch Behandlung mit η-Hexan zum Kristallisieren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (0,85 g) wird aus 4 ml Äthylacetat umkristallisiert. Es werden 0,74 g Glp-Leu- -Pr0-Im-C₁₀H₂₁ (77 % d. Th.) erhalten; P. 140-141⁰C; R_f ^ζ4) = 0,76; (PoJ ^⁵= -71,3° (c = 1, in Essigsäure).

Aminosäure-Analyse: GIu 0,97 (1,0), Leu 1,00

(1,0), Pro 1,01 (1,0).

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Beispiel 14

*L-Pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolin-(2-dimethylamino-äthyl)-amid

Schritt 1: tert.-Butyloxycarbonyl-L-prolin-(2-diraethylamino-a"thyl)-amid

11,43 g (30 mMol) BOC-Pro-OPFP werden in 100 ml Äther ge- loot und die Lösung mit 6,54 ml (60 ml.Iol) lJ,iJ-D:ünethylainino-äthylamin versetzt. Die Lösung wird 10 Minuten stehen gelassen, dann wird eie mit je 30 ml· Wasser dreimal ausgeschüttelt j die wäßrigen Phasen v/erden vereinigt, durch die Zugabe von festem Natriumcarbonat auf pH = 10 eingestellt und mit je 20 ml Äthylacetat viermal extrahiert. Die abgetrennten organischen Phasen werden mit der ursprünglichen organischen Lösung vereinigt, mit 20 ml . Wasser genaschen, mit wasserfreiem natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl kristallin siert beim Stehen. Ss werden auf diese V/eise 6,71 g BOC- -PrO-IJH-CH₂-CH₂-IT(CH^)₂ (78,5 % d. Th.) erhalten; R_f^ = 0,29. '

Schritt 2: L-Leucyl-L-prolin-(2~dimethylamino-äthyl)-

amid-dihydrochlorid

6,71 g (23,5 mMol) BOC-PrO-Mi-CHp-N(CHo)₉ werden mit 30 ml IJ Salzsäurelösung in Äthylacetat 30 Minuten lang behandelt, dann wird das Gemisch eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird mit 50 ml Chloroform aufgenommen und mit 2,8 ml (20 mMol)' Triethylamin versetzt. Der erhaltenen klaren Lösung werden 6,74 g (17 mllol) BOC-Leu- -OPPP zugesetz-t und nach einer Stunde Rühren werden weitere 2,8 ml (20 mMol) Triethylamin tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wird über !Jacht stehen gelassen und am nächsten Tag eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird

41

- 41 - 2 2 2 17 5

in 50 ml Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung wird durch die Zugabe von festem natriumcarbonat auf 10 eingestellt und das geschützte Dipeptig wird aus:der wäßrigen Phase mit Äthylacetat extrahierte Die abgetrennte Äthylacetat-Phase wird mit wasserfreiem Natriumsulaft getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird mit 5 N Salzsäurelösung in Äthylacetat eine Stunde lang behandelt, dann wird das Reaktionsgemisch eingedampft und der Verdampfungsrückstand mit iither verrieben» Nach dem Abfiltrieren wird das amorphe, stark hygroskopische Produkt im Vakuum, über wasserfreiem Natriumhydroxyd getrocknet. Es werden auf diese Weise 4,5 S H-LeU-PrO-IiH-CH₂-IT(CHo)₂. .2HCl (12,1 mMol) erhalten; R_f^ = 0,05.

Schritt 3: L-Pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolin-(2-dimethy1-amino-äthyI)-amid

2,6 g (7 inLIol) H-Leu-Pro-Iffi-CH₂~CH₂-H(CH₃)₂.2HC1 werden in 30 ml DLIPA gelöst und die Lösung mit 1,96 ml (14 mLIol) Triethylamin versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und das Piltrat zu der Lösung von 3,29 (7,7 mMol) Z-GIp-OPPP in 10 ml DHPA unter Eiskühlung und Rühren tropfenweise zugesetzt. Nach der Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch 4 Stunden stehen gelassen und dann im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird in 50 ml Wasser gelöst, die Lösung mit konz. Salzsäure auf pH« 3 angesäuert und mit je 20 ml Äthylacetat dreimal ausgeschüttelt. Dann wird der pH-Bert der wäßrigen Lösung durch die Zugabe von festem Natriumcarbonat auf 10 eingestellt und die alkalisch gemachte Lösung wird mit je 30 ml Äthylacetat·fünfmal extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und einge'dampft. Daa auf diese V/eise erhaltene ölige geschützte Dipeptid (3,05 g; 5,6 mMol) wird in 60 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 5,6 ml

- 42

- 42 - 2 2 2 17

N Salzsäure und 0,6 g 10 %igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Wasserstoffgas wird 30 Minuten lang durch das Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat eingedampft, das als Rückstand erhaltene Öl wird im Gemisch von 50 ml Chloroform und 20 ml Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst. Die Phasen werden getrennt, die Chloroformphase mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird mit η'Hexan verrieben und abfiltriert. Das auf diese V/eise erhaltene amorphe rohe Produkt (2,0 g) wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung"lyophilisiert. Es. werden 1,72 g GIp-LeU-PrO-IIH-CH₂-N(CH₃)₂ (60 % d. Th.) erhalten; R_f^ = 0,06; ß&J²\ = -71,7° (c = 1, in Essigsäure) .

Aminosäure-Analyse; GIu 1,02 (1,0), Leu 1,00

(1,0), Pro 1,03 (1,0).

L-Pyroglutamyl-L-histidy1-D-pipecolinoäureamid Schritt 1: Benzyloxycarbonyl-D-pipecolinsäureamid

13,15 g (50 mlvlol) Z-D-Pip-OH /vgl. L. Baläspiri u. Mitarb.: Monatsh. Chem. 101, 1177 (197O}7 werden in 100 ml Äthylacetat gelöst und mit 7,0 ml (50 mLIol) Triethylamin versetzt. Das Gemisch wird auf -20⁰C abgekühlt und es werden bei dieser Temperatur, unter Rühren 6,5 ml (50 mlvlol) Chlor, kohlensäure-isobutylester tropfenweise zugesetzt. ITach weiteren 15 Minuten Rühren wird bei -10⁰C anderthalb Stunden lang Ammoniakgas in das Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Niederschlgas wird das Piltrat mit N Salzsäurelösung, dann mit N Natriurahydrogencarbonat 8fiÖ^nß zuletzt mit V/asser ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat

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getrocknet und eingedampft« Der Verdampfungsrückstand wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Äther kristallisiert; es werden auf diese V/eise 11,5 g Z-D-Pip- -NH₂ (88 % d. Th.) erhalten; P. 114 - 115⁰O; Rf^ 0,50; JJk)J²Q^ + 32,0° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für C₁₄H₁₈O^lT₂ (Mol.Gew. 262,30): berechnet: Ii 10,68 ⁽/o\ .

gefunden: N 10,63 %.

Schritt 2: D-Pipecolinsä'urearaid

3,93 g (15 mLlbl) Z-D~Pip-NH₂ werden in 75 ml Methanol gelöst, die Lösung mit 0,5 g 10 ^igem Palladium-Aktivkohle- -Katalysator versetzt und V/asserstoffgas wird eine. Stunde lang durch da3 Gemisch geleitet. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das FiItrat eingedampft und der Verdampfungsrückstand mit Äther verrieben. Ss werden auf diese V/eise 1,70 g H-D-Pip~NH₂ (90 % d. Th.) erhalten; F. l6l-l63°C'i R_d ⁽⁴⁾ = 0,10; 12J ß⁵= + 31,0° ( c = 1, in Methanol).

Schritt 3: Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-histidinlaydrazid

71,0 g (0,175 Mol) Z-Gln-His-OLIe /"vgl. H.Kappeler: HeIv. Chira. Acta £4, 476 (196127 werden in 700 ml DMFA gelöst und die Lösung mit 33,6 ml (0,495 Mol) Hydrazinhydrat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage stehen gelassen, dann mit 600 ml Äthylacetat verdünnt und über Nacht im Kühlschrank gehalten. Am nächsten Tag wird der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt. Das auf diese V/eise erhaltene rohe Produkt (71,65 g) wird aus 1800 ml Methanol umkristallisiert. Es werden 55,1 g Z-GIn-HiS-N₂H₃ (78 % d, Th.) erhalten; F. 198-200⁰C; Rf^ = 0,28.

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Analyse für C₁₉H₂₅O₅N₇ (Mol.Gew· 431,40): berechnet: C 52,90 %, H 5,85 %, N 22,72 %\ gefunden: G 52,21 %\ H 5,73 #, N 22,78 %,

Schritt 4: Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-histidy 1-D-pipecolinsäureamid

5,39 g (12,5 mMol) Z-GIn-HiS-N₂Ii₃ werden in 100 ml DMPA aufgeschlämmt und die Suspension mit 4,6 ml (37,5 mMol), 8,1 II Salzsäurelösung in Dioxan versetzt« Die erhaltene Lösung wird auf -2O⁰G abgekühlt und dann bei ~15°C, unter Rühren, tropfenweise mit 1,63 ml (13,7 mMol) tert.-Butylnitrit versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei -1O⁰C 20 Minuten gerührt, dann werden tropfenweise 3,6 ml (25 mMol) Triethylamin, anschließend die Lösung von 1,57 g (12,5 mMol) H-D-Pip-1IH₂ und zuletzt noch weitere 1,75 ml (12,5 mMol) Triäthylamin zugegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch bei -1O⁰C noch eine Stunde gerührt, dann über Nacht im Kühlschrank, bei 2 C stehen gelassen. Am nächsten Tag wird der Niederschlag abfiltriert und das Piltrat im Vakuum eingedampft. Der amorphe Rückstand wird mit Äthylacetat verrieben. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt wird auf eine SiIicagel-Säule gebracht und mit dem Lösungsmittelgemisch (2) eluiert. Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, der Rückstand mit Äther verrieben und abfiltriert. Es werden 2,76 g amorphes Z-GIn-HiS-D-PIp-NH₂ (42 % d. Th.) erhalten: R_f ⁱ⁴' = 0,10.

Schritt 5: L-Pyroglutarayl-L-histidyl~D-pipecolinsäureajoiid

2,63 g (5 mMol) Z-GIn-HiS-D-PiP-M-I₂ werden in 50 ml Essigsäure gelöst, die Lösung mit 0,5 g 10 ^igem Palladium-Aktivkohle-Katlysator versetzt und Wasserstoffgas wird eine

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Stunde lang durch die Lösung geleitet. Bach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat auf 60-7O⁰C erwärmt, 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten und dann im Vakuum eingedampft. Der Verdampfungsrückstand wird in V/asser gelöst, die Lösung mit Dowex-2 Harz im OH-Zyklus behandelt und eingedampft» Das auf diese V/eise erhaltene rohe Produkt wird auf eine Silisagel-Säule gebracht und mit'dem Lb" sung smit te lg'emi 3 ch (1) eluiert. Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, der Rückstand in V/asser gelöst, die Lösung mit Aktivkohle geklärt und die wasserklare Lösung eingedampft. Der armorphe Rückstand wird im Vakuum, über" Phosphorpentoxyd getrocknet. Es werden 704 mg Glp-His-D- -PIp-NH₂ (51 % d. Th.) erhalten; R_f^⁴⁾ = 0,10 (ZJ^ = + 16,0 (c = 1, in 'Hasser),

Aminosäure-Analyse: GIu 1,03 (1,0), His 1,00

(1,0); Pip 0,96 (1,0).

Beispiel l6

L-Py r oglu tamyl-rL-his tidy 1-L-homoprolinanid Schritt 1: tert.-Butyloxycarbonyl-L~homoprolinamid

2,29 g (10 raMol) BOC-HPro-OH werden in 30 ml Äthylacetat gelöst, die Lösung mit 1,4 ml (10 mi.iol) Triethylamin versetzt und auf -10⁰C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden 1,3 ml (10 mllol) Chlorkohlensäure-isobutylester tropfenweise zugesetzt. Nach 15 Minuten Rühren wird bei -10⁰C eine halbe Stunde lang Ammoniakgas in das Reaktionsgemisch geleitet, worauf das Gemisch zwei Stunden bei 0° bis 5 C stehen gelassen wird. Der niederschlag wird dann ab-.filtriert, das Piltrat eingedampft und das als Rückstand " erhaltene Öl in 30 ml Chloroform gelöst.- Die Lösung wird mit je 10 ml IT Natriumhydrogencarbonatlösung ebenfalls

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zweimal und zuletzt mit 10 ml Wasser einmal ausgeschüttelt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als Rückstand erhaltene Öl wird durch Behandlung mit η-Hexan zum Kristallisieren gebracht. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt (1,96 g) wird aus einem Gemisch von Äthylacetat und Äther uinkristallisiert. Es werden 1,78 g BOG-HPrO-NH₂ (78'^d. Th.) erhalten; P. 138-140⁰C; R_f ⁽²⁾ = 0,43; ϋ&ΐψ = - 24,85° (c = 1, in Essigsäure).

Analyse für ^Gii^2d°°^ll2 (^1;io1· ^GeVl/e 228,29): berechnet: C 57,87 %, H 8,83 #, N 12,27 %\ gefunden: C 57,60 %, H 8,89 %, N 12,11 ß.

Schritt 2: L-Homoprolinamid-hydrochlorid

1,6 g (7 ml.Iol) BOG-HPi-O-ITH₂ werden in 10 ml Äthylacetat unter Erwärmung gelöst. Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10 ml 6 N Salzsäurelösung in Athylacetat versetzt. Das Reaktioncgemisch wird eine Stunde stehen gelassen, dann mit Äther verdünnt, der erhaltene Niederschlag wird verrieben und abfiltriert. Ba werden auf diese Weise 1,05 g H-HPrO-NII₂.HCl (91 % d. Th.) erhalten; P. 178-180⁰C; R^⁶' = 0,32 ; l~4j²^ = + 26,2° (c = 1, in Methanol). '

Schritt 3: Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-histidyl- -I-homoprolinamid

5,39 g (12,5 raMol) Z-GIn-IUs-N₂II₃ (s. Beispiel 15, Schritt 3) werden in 100 ml DLIE¹A aufgeschlämmt und die Suspension mit 4,6 ml (37,5 mMol) 8,1 N Salzsäurelösung in Dioxan versetzt. Die erhaltene „Lösung wird auf -2O⁰C abgekühlt und dann bei -15⁰C, unter Rühren, tropfenweise mit 1,63 ml (13,7 mlvlol) tert.-Butylnitrit versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei -10 C 20 Minuten gerührt, dann

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rait 3,5 ml (25 mMol) Triethylamin versetzt. Inzwischen werden 2,07 g (12,5 mMol) H-Hpro-NHg.HCl in 10 ml DIvIPA gelöat und die Lösung mit 1,75 ml' (12,5 mMol) Triäthylamin versetzt. Nach Abfiltrieren des Niederschlags wird die erhaltene Lösung bei -10⁰C zu der obigen Azidlösung tropfenweise zugesetzt und zuletzt werden noch 1,75 ml Triethylamin zu dem Gemisch zugegeben. Das'

Reaktionsgemisch wird anschließend eine Stunde bei -10⁰C gerührt und dann über Nacht bei 2⁰C stehen gelassen. Am nächsten Tag wird der Niederschlag abfiltriert, das FiI-trat im Vakuum eingedampft und der amorphe Rückstand mit Äthylacetat verrieben. Das auf diese V/eise erhaltene rohe Produkt wird auf eine Silicagel-Säule gebracht und mit dem Lösungsmittelgemisch (2) eluiert. Die reines Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft.. und der Verdampfungsrückstand mit Äther verrieben. Es werden 2,35 g Z-GIn-HiS-HPrO-HH₂ (36 % d. Th.) erhalten; R_f^⁴⁾ = 0,30.

Schritt 4: L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-homoprolinamid

2,1 g (4 mMol) Z-GIn-HiS-HPrO-NiI₂ werden in 40 ml Essigsäure gelöst, die Lösung mit 0,4 g 10 tigern Palladium-Aktivkohle-Katalysator versetzt und Y/asserstoffgas wird eine Stunde lang durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wird dann abfiltriert, das Piltrat auf 60° bis 70⁰C erwärmt, 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten und dann im Vakuum eingedampft. Das als Rückstand erhaltene rohe Produkt wird auf die im Beispiel 15, Schritt 5 beschriebene V/eise mit Ionenaustauscherharz behandelt und auf einer Silicagel-Säule gereinigt. Es werden 618 mg GIp-HiS-HPrO-M₂ ( 5ξ % d. Th.) erhalten; R_f^ = 0,08; ²^ = - 24,o° (c = 1, in Methanol).

Aminosäure-Analyse: GIu 0,97 (1,0), His 1,00

(1,0), HPro 0,91 (1,0).

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Claims (3)

1. Erfindungsanspruch

   1.' Verfahren zur Herstellung von Tripeptidamiden der allgemeinen Formel I

   . Glp.~ X - Y - NH - A , (I) worin

   X eine L-ITorleucyl-, L-leucyl-, L-lTorvalyl-, D-Leucyl-, L-Prolyl-, L-2-Aminobutyryl-, 1-Valyl-, L-Threonyl-, l-Iaoleucyl-, L~2~ilminodecanoyl-, L-Cyclohexylalanyl- oder L~tert.»Butyl~serylgruppe und

   Y eine L-Prolylgruppe oder X eine L-IIi π tidy !gruppe und

   Y eine L~Homoprolyl- oder D-Pipecolylgruppe, ferner

   A Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bie 10 Kohlenstoffatomen oder eine durch einen Dimethylaminorest substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkyl-Teil bedeuten,

   mit der Einschränkung, daß, viomi X eine L-Leucylgruppe ist, A nicht V/asserstoff ist, sowie von therapeutisch anwendbaren Komplexen dieser Verbindungen, gekennzeichnet dadurch, daß man Tripeptidamide der allgemeinen Pormel I, worin X, Y und A die oben angegebenen Bedeutungen haben, aus den entsprechenden Aminosäuren oder Aminosäurederivaten nach an sich bekannten peptidchemischen Methoden aufbaut und gewünschtenfalls das erhaltene Produkt in einen therapeutisch anwendbaren Komplex überführt.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man ein Aminosäureamid der allgemeinen Pormel Y-Mi-A, worin

   Y und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einer

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   gegebenenfalls gescbützten L-Aminosäurerest X unter Anwendung der üblichen peptidchemischen Methoden N-acyliert und das erhaltene Dipeptid mit !-Pyroglutaminsäure bzw. mit einem geschützten und/oder aktivierten Derivat davon N-acyliert und gegebenenfalls die anwesenden Schutzgruppen abspaltet.

   3e Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Herstellung von anstelle von X eine L-Histidylgruppe enthaltenden Tripeptidamiden der allgemeinen Formel I, worin Y und A die oben angegebenen Bedeutungen haben, ein Amino säur eamid der allgemeinen Pormel Y-HH-A,"* worin Y und A die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit dem aus dem Hydrazid Z-Gln-His-HH-NILj, worin Z eine Benzyloxycarbonylgruppe bedeutet, hergestellten geschützten Azid acyliert und in dem erhaltenen Tripeptidamid nach dem Abspalten der Schutzgruppe Z die Glutaminylgruppe durch Wärmebehandlung zu einer Pyroglutamy!gruppe cyclisiert.
3. 4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man das IDi ersten Reaktionsschritt erfhaltene Dipeptidamid anstatt von L-Pyroglutaminsäure mit L-Glutaminsäure IT-acyliert und in dem erhaltenen Tripeptidamid die Glutaminylgrujjpe zur Pyroglutamy !gruppe cyclisiert.