SE447261B - Nya tripeptidamider, som inverkar pa det centrala nervsystemet - Google Patents

Description

15 20 _w 30 35 40 447 261 ning, när man insåg att den biologiska funktionen hos denna tripeptid icke inskränkte sig till reglering av frigörandet av det tyreotropa hormonet utan även utöva- de en verkan på det centrala nervsystemet, jämför N.P.

Plotnikoff och medarbetare, Science 178, 417 (1972); A.J.Prangeoch medarbetare, Lancet 2, 999 (1972). Man har nu fastställt att TRH förutom nämnda hormonfunk- tion väsentligt minskar den av barbiturat och alkohol orsakade sömnens längd och även minskar den av olika läkemedel orsakade hypotermin och stegrar den lokomo- toriska aktiviteten. En annan viktig faktor hos TRH's på det centrala nervsystemet utövade verkan är hämning- en av den genom haloperidol orsakade katalepsin. Det borde sålunda vara önskvärt att för terapeutisk praxis framställa sådana TRH-analoger, som endast har svag inverkan på hypofysen, men däremot samma verkan som el- ler till och med kraftigare verkan än TRH pâ det cent- rala nervsystemet. För detta ändamål har man framställt de föreningar, som beskríves i DE-OS 2 343 035, 2 343 037, 2 449 16l, 2 514 381, 2 609 154 och 2 639 393 liksom även i BE-PS 819 198. Den i detta avseende hittills genomför- da forskningen, vars resultat och erfarenheter samman- fattats av A.J. Pranne och medarbetare i “The Role of Hormones in Depression", Life Sciences 20, 1305 (1977) och av A.V. Schally och medarbetare i “Hypothalamic Re- gulatory Hormones", Ann. Rev. Biochem. 47, 89 (1978) har icke lämnat resultat, som i alla hänseenden uppfyl- ler den terapeutiska praktikens behov.

Det har nu visat sig, att man genom att utbyta en aminosyra i den av tre aminosyror uppbyggda TRH-molekylen kan uppnå att tripeptidens hormonverkan väsentligt minskas samtidigt som den på det centrala nervsystemet utövade effekten bibehålles eller till och med avsevärt förstärkes. De TRH-analoger, som i 2-ställ- ningen i stället för L-histidylgruppen innehåller en ali- fatisk aminosyragrupp med rak eller förgrenad kolkedja har visat sig vara speciellt fördelaktiga i detta avseen- de. Sådana TRH-analoger uppvisar vid praktiskt taget fullständig frånvaro av hormonverkan en verkan på det centrala nervsystemet, som flerfaldigt överträffar den 10 15 20 25 30 35 447 261 verkan som utövas av TRH.

För framställning av de nya tripeptidami- derna I utgår man enligt förevarande uppfinning från en aminosyraamid med den allmänna formeln L-Pro-NH-A, där A har den ovan vid definitionen av den allmänna formeln I angivna betydelsen. Till denna amid kopplas därefter stegvis, i enlighet med vanliga peptidkemiska metoder först den i stället för X önskade L-aminosyran och därefter den i slutprodukten i 1-ställningen stående L-pyroglutamylgruppen, och i anslutning därtill av- spjälkas i förekommande fall de vid nämnda kopplings- reaktioner eventuellt införda skyddsgrupperna.

De på ovan angivet sätt framställda tri- peptidamiderna I kan isoleras ur reaktionsblandningen genom kristallisation eller lyofilisering. Eventuellt kan de erhållna produkterna omvandlas till komplex på vanligt sätt.

Vid den stegvis genomförda uppbyggnaden av tripeptidmolekylen omsättes den lämpligen i överskott tillsatta utgångsföreningen L-Pro-NH-A med ett aktivt derivat, lämpligen med pentafluorfenylestern eller 'eventuellt med en blandad anhydrid av en skyddad L-amino- syra med den allmänna formeln Boc-X-OH. Vid användning av pentafluorfenylestrar erhålles de motsvarande, skyddade dipeptidderivaten Boc-X-L-Pro-NH~A på mycket - kort tid, närmare bestämt inom nâgra få minuter, varvid produkten lätt kan isoleras i en form som icke erfordrar ytterligare rening. Ur de på detta sätt erhållna, skyddade dipeptidderivaten kan man därefter erhålla de motsvarande, vid sina ändgrupper fria dipeptiderna med den allmänna formeln H-X-L-Pro-A. Dessa omsättes där- efter med pentafluorfenylestrar av skyddade L-pyro- glutaminsyror Z-Glp-OPFP, varigenom man erhåller den skyddade tripeptiden Z-Glp-X-L-Pro-NH-A, ur vilken skyddsgruppen Z lämpligen kan avlägsnas genom kata- lytisk hydrering. 447 261 Den erhållna slutprodukten kan renas ge- nom enkel kristallisation eller omfällning, men, om så erfordras, även genom kolonnkromatografering. I nâgra fall kan slütprodukten utvinnas genom enkel lyofilisering, sedan man avlägsnat biprodukterna.

De enligt förevarande uppfinning framställda tripeptiderna har undersökts enligt här nedan beskrivna biologiska förfaranden med avseende på farmakologisk verkan. 1. Hämning av haloperidol-katalepsi på råttor (jämför J. Delay och P. Deniker: Compt.

Rend. Cong. Med. Alenistes Neurologistes, 19, 497, Luxemburg 1952). 40 mg/kg haloperidol, 4-(p-klorfenyl)- 1- ¿3-(p-fluorbensoyl)-propyl/ -piperidin-4-ol, administrerades subkutant på försöksdjuren och efter 120 minuter kontrollerades katalepsins inträdande. Därefter uppdelades råttorna i grupper om vardera 10 försöksdjur och behandla- 10 15 20 25 30 35 40 447 261 des genom intravenös administration med doser av TRH respektive de nya THR-analoga tripeptiderna. Försöks- djuren i kontrollgrupperna behandlades med fysiolo- gisk koksaltlösning. De enskilda föreningarnas kata- lepsiupphävande verkan fastställdes 15, 30, 90 och 120 minuter efter behandlingen. De försöksdjur, som med sina framtassar ställdes på en 7 cm hög pelare och inom loppet av 30 sekunder icke korrigerade sin ställning betraktades som kataleptiska.

Av antalet försöksdjur, som icke uppvi- sade katalepsi fastställdes genom probitanalys de mot- svarande EDSD-värdena för de enskilda, verksamma be- ståndsdelarna.

Dessa försök genomfördes med hanrâttor (Wistar) vardera med 160 - 180 g kroppsvikt. 2. Potentiering av den av L-dopa orsaka- de lokomotoriska aktiviteten hos möss (jämför The Thy- roid Axis, Drugs and Behavaiour, S. 116, A.J. Prage Jr., Raven Press, New York 1974).

På djuren administrerades intraperito- nealt först 40 mg/kg N-metyl-N-propargyl-bensylamin (Pargyline), därefter 20 mg/kg TRH respektive samma doser av de för undersökning avsedda nya tripeptider- na, och slutligen 100 mg/kg L-dopa. Den lokomotoriska aktiviteten hos försöksdjuren mättes 30, 60 och 90 mi- nuter efter den ovan angivna behandlingen. De därvid erhållna värdena är sammanställda i nedanstående tabell.

Siffrorna i tabellen är procent av de värden som erhölls med de med TRH behandlade djuren. För dessa försök använ- des vardera 15 hanmöss med vardera 18 - 22 g kroppsvikt. 3. Reverserande verkan på reserpinhypoter- mi (möss). Jämför B.M. Askew: Life Sci. 2, 725-730 (1963).

De i grupper om vardera 10 försöksdjur upp- delade hanmössen med vardera 18-22 g kroppsvikt behandla- des genom intraperitoneal administration av vardera 5 mg/kg reserpin. Efter 16 timmar behandlades försöksdju- ren med vardera 20 mg/kg TRH respektive den för under- sökning avsedda tripeptiden.

Försöksdjurens rektaltemperatur mättes före reserpinbehandlingen (denna temperatur angives i 10 15 20 25 30 35 40 447 261 tabellen med “norm"), efter 16 timmar efter reserpinbe- handlingen (denna temperatur angives i tabellen med “res.") och en respektive tvâ timmar efter administra- tionen av den för undersökning avsedda tripeptiden (denna temperatur angives i tabellen med "efter behand- lingen"L I tabellen angives rektaltemperaturerna som genomsnittsvärden för 10 möss. 4. Inverkan på den av hexobarbital or- sakade sömnens längd. Pâ försöksdjur indelade i grupper om vardera 10 hanmöss administrerades intravenöst varde- ra 60 mg/kg hexobarbital-Na (Evipan® Bayer). Efter 10 minuter behandlades försöksdjuren därefter intraperito- nealt med vardera 20 mg/kg TRH respektive den för under- sökning avsedda tripeptiden. Sömntiderna beräknades i procent av kontrolldjurens sömn (i vart enskilt fall an- vändes genomsnittsvärden för 10 försöksdjur). 5. Etanol-narkos.

Jämför J.M. Cott och medarbetare: J. Phar- macol. Exp. Ther. 196, 594 (1976).

På försöksdjur uppdelade i grupper om var- dera 20 han- och honmöss med kroppsvikt 18-22 g vardera administrerades vardera 4,5 g etanol intraperitonealt, Efter 10 minuter behandlades försöksdjuren intraperitonealt med vardera 20 mg/kg av den för behandling avsedda tripep- tiden. Sömntiderna angives i nedanstående tabell omräk- nade i procent av kontrollgruppens sömntid (genomsnitt av 20 försöksdjur). 6. Hormonaktivitet (TSH-verkan) på råttor.

Hanråttor (Wistar), som vardera hade kropps- vikt ca 200 g, uppdelades i grupper om vardera 7-8 för- söksdjur och behandlades intravenöst vardera med 20 mg/kg TRH respektive den för undersökning avsedda tripeptiden.

TSH-reaktionen för försöksdjuren fastställdes 15 minuter efter behandlingen med TRH respektive med de nya TRH-ana- loga föreningarna med försöksdjurens plasma genom radio- immun undersökning. Den relativa verkningshöjden beräk- nades enligt 4-punktsmetoden med hjälp av en dator (TOA 101), varvid verkningshöjden för TRH betecknades med 100.

Data beträffande biologisk verkan för några av föreningarna I och fastställda med hjälp av de ovan 10 15 20 25 30 35 40 447 261 beskrivna farmakologiska metoderna är sammanställda i följande tabell. 447 261 Uflvcëmmiaofimum .EE Zdfloáw Ewflmo .äs moi H *tom Em H m, øflëwwlflmufinumnoxwm o.o3 mm om ïom mdm odo Qom ooo oofl ooo 2 oo nä. ~o.o om å ïmw Nâo ïofl ïom 2 3 R 2 om m oä så o mo oü "tom ïom ïow Ném SN om NS om odm å. 9.3 så må E. E Nån ošm 12.. Qom NI m3 må oü oöfi m oå :Ez o t. oi oâm ïom ofiw Nåm EN m3 ÉN oü ïï m nä msz mcmunfiø mnmusfiofiflon ...än w .Efiß fl .mun .suoc .om .om .om .owe moofißmwo 4 w x IHHONUGOM IßCOX >.m w .HÜGGSND .HUUMÜ HOUMU .M_E >m w .wfl-.Eaom 0 Ãflvmuwm æ .uwuflïfiuxm xmflu .fimmwamumx flßvnHwb .muflußflänww IHMUHQ lEwuädävfiwh ~..HE.HNHO%>SICHQNQM IOPOEOXOHIMAMOUIÅ IHOUHHQQOAMQ lflmn.. IHOGMHW IHMQOXwZ IwH mm Gmvflfiwæw w¶CflHwmHm>wm bß OGHHNHHGWNOQ >.m Oflflfinåfim ÉIEZININIQHU Ha 096m. 10 15 20 25 30 35 40 447 261 Av de i ovanstående tabell sammanställda resultaten framgår det, att utbyte av His i TRH-moleky- len mot en alifatisk aminosyra med rak eller förgrenad kolkedja orsakar eliminering eller åtminstone kraftig reduktion av TSH-utsöndring, varvid hämning av den av haloperidol orsakade katalepsin blir 2 - 7 gånger star- kare. Några nya TRH-analoger uppvisar också kraftig po- tentiering av den lokomotoriska aktiviteten respektive förkortning av hexobarbital- och etanolsömntidens längd.

Det är också anmärkningsvärt att de nya TRH-analogerna, som innehåller His, visserligen bibehåller ca 70% av hormonverkan men samtidigt uppvisar en kraftig inver- kan på det centrala nervsystemet.

De enligt förevarande uppfinning framställ- bara nya tripeptiderna liksom även farmaceutiskt godtag- bara salter och komplex därav kan användas i vanliga lä- kemedelspreparat. Dessa innehåller de verksamma bestånds- delarna enligt förevarande uppfinning tillsammans med förenteral eller parenteral administration lämpliga oor- ganiska eller organiska bärare. Läkemedelspreparaten kan exempelvis framställas i form av fasta lyofilisat, i vil- ka med peptiderna icke reagerande föreningar, exempelvis kolhydrat kan användas som bärare. De kan emellertid ock- så framställas i form av koncentrerade eller utspädda suspensioner eller emulsioner eller i form av tabletter eller injektionspreparat.

Sättet enligt uppfinningen och den kemiska framställningen av de nya TRH-analogerna belyses i nedan- stående exempel. I dessa exempel användes de inom peptid- kemin gängse förkortningarna, jämför härtill J. Biol.

Chem. 247, 977 /1972/. Dessutom användes följande förkort- ningar: Ada L-2-amino-dekansyra Abu L-2-amino-smörsyra Cha L-cyklohexyl-alanin Pip L-pipekolinsyra HPro L-homoprolin DAE 2-dimetylamino-etyl- DCC dicyklohexyl-karbodiimid PFPOH pentafluorfenol 10 15 20 25 30 35 40 _ 10 _ 447 261 DCU dicyklohexyl-karbamid DMFA dimetylformamid Smältpunkter för föreningarna som angives i exemplen har bestämts med hjälp av en smältpunktsappa- rat enligt Dr. Tottoli (Büchi). Värdena för optisk vrid- ningsförmâga har fastställts med hjälp av en polarimeter av typen Perkin-Elmer 141. Vid tunnskiktskromatografiska undersökningar respektive separationer användes kiseldi- oxidgelplattor ("Kieselgel G enligt Stahl", E. Merck, Darmstadt). För framkallning av kromatogrammen användes följande lösningsmedelsblandningar: 1. Kloroform:metanol 9:1 2. Etylacetat:(pyridin:ättiksyra: vatten 20:6:11) 9:1 3. Etylacetat:(pyridinzättiksyraz vatten 20:6:11) 8:2 4. Etylacetat:(pyridin:ättiksyra: vatten 20:6:11) 3:2 För framkallning av fläckarna användes nin- hydrinlösning. Efter besprutníng torkades plattorna i un- gefär 5 minuter vid 105°C. Därefter exponerades kromato- grammen för klorgas och efter luftning framkallades de med o-tolidin-kaliumjodidlösning.

För rening medelst kolonnkromatografering användes kiseldioxidgel ("Kieselgel G", E. Merck) med en partikelstorlek av 0,062 - 0,2 mm.

För indunstning av lösningarna i vakuum an- vändes en vakuumindunstare ("Rotavapor R", Büchi). Indunst- ningen genomfördes vid en temperatur icke över SOOC. Pen- tafluorfenylestrarna av BOC-skyddade aminosyror framställ- des enligt den av Kisfaludy och medarbetare utarbetade me- toden (Ann. 1973, 1421).

Närmare detaljer beträffande framställning av de nya TRH-analogerna enligt förevarande uppfinning framgår av följande utföringsexempel.

Exempel 1 L-pyroglutamyl-L-norleucyl-L-prolinamid Steg 1: L-norleucyl-L-prolinamid-hydroklorid 2,28 g (20 mmol) H-Pro-NH2 och 3,97 g (10 10 15 20 25 30 35 40 _ 11 _ 447 261 mmol) BOC-Nle-OPFP (jfr. Kisfaludy och medarbetare, Hoppe- Sayler's Z. Physiol. Chemie 359, 887 /1978/) löstes i 40 ml DMFA och sedan lösningen fått stå i 5 minuter indunsta- des den i vakuum. Den som återstod erhållna oljan löstes i 50 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (3 x 10 ml), därefter med N-NaHCO3 (3 x 10 ml) och till sist med 10 ml vatten, varpå lösningen torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Indunstningsåterstoden lös- tes i 5 ml etylacetat och lösningen försattes med 10 ml av en 5-normal lösning av HCl i etylacetat. Efter 30 minu- ter utspäddes reaktionsblandningen med eter, den bildade fällningen avfiltrerades och torkades i vakuum över vat- tenfri natriumhydroxid. Man erhöll på detta sätt 2,48 g H-Nle-Pro-NH2.HCl (94% av det på BOC-Nle-OPFP beräknade teoretiska utbytet); Rš“)= 0,20.

Steg 2: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-L-nor- leucyl-L-prolinamid 1,05 g (4 mmol) H-Nle-Pro-NH2.HCl löstes i 10 ml DMFA och lösningen försattes under iskylning och om- rörning med 0,56 ml (4 mmol) trietylamin och 1,89 g (4,4 mmol) Z-Glp-OPFP. Efter 5 minuters omrörning tillsattes ytterligare 0,56 ml (4 mmol) trietylamin. Blandningen om- rördes i ytterligare 20 minuter och indunstades därefter till torrhet i vakuum. Indunstningsåterstoden löstes i 40 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (2 x 10 ml) med N-NaHC03 (3 x 10 ml) och till sist med 10 ml vat- ten, varpå den torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades i vakuum. Den som återstod erhållna oljan bringades till kristallisation under eter och den på det- ta sätt erhållna râprodukten (1,52 g) omkristalliserades i 8 ml etylacetat. Man erhöll 1,36 g Z-Glp-Nle-Pro-NH; (72%). smäitpunkt 146 - 148%; REW= 0,32; [a]§5= -19,s° (c = 1 i ättiksyra).

Analys: % C % H % N beräknat för C2qH32O6Nq 61,00 6,83 11,86 (molekylvikt: 472,55) funnet: 60,90 7,04 11,87 Steg 3: L-pyroglutamyl-L-norleucyl-L-prolinamid 10 15 20 25 30 35 40 _12... 447 261 1,16 g (2,46 mmol) Z-Glp~Nle-Pro-NH2 lös- tes i 25 ml metanol. Lösningen försattes med 0,2 g av en 10%-ig palladium/aktivkolkatalysator och väte inled- des i lösningen under 30 minuter. Katalysatorn avfilt- rerades därefter och filtratet indunstades. Den fasta, amorfa återstoden revs med eter och avfiltrerades. Den på detta sätt erhållna råprodukten (0,72 g) löstes i vat- ten, lösningen klargjordes med aktivkol och den vatten- klara lösningen lyofiliserades. Man erhöll 0,66 g Glp-Nle- -Prø-NH, (79,s%); nfm= 0,43; [ajåßè -77,1° (c = 1, i ättiksyra).

Aminosyraanalys: Glu 0,96 (1,0), Nle 1,00 (1,0), Pro 1,00 (1,0).

Exemgel 2 L-pyroglutamy1-L-norvalyl-L-prolinamid Steg 1: L-norvalyl-L-prolinamid-hydroklorid 2,2 g (20 mmol) H-Pro-NH, och 3,83 g (10 mmol) BOC-Nva-OPFP (jfr. L. Kisfaludy och medarbetare, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chemie 395, 887 /1978/) lös- tes i 40 ml DMFA, lösningen fick stå i 5 minuter och in- dunstades därefter i vakuum. Den som en olja erhållna återstoden löstes i 50 ml kloroform, lösningen urskaka- des med N-HCl (3 x 10 ml), med N-NaHCO3 (3 x 10 ml) och med 10 ml vatten, varpå den torkades med vattenfritt nat- riumsulfat och indunstades. Indunstningsåterstoden lös- tes i 5 ml etylacetat och lösningen försattes med 10 ml av en 5-normal lösningen av HCl i etylacetat. Efter 30 minuter utspäddes reaktionsblandningen med eter, den er- hållna fällningen avfiltrerades och torkades i vakuum över vattenfri natriumhydroxid. Man erhöll 1,83 g H-Nva- -Pro-NH2.HCl (73% av det på BOC-Nva-OPFP beräknade teo- retiska utbytet); Rf(“)= 0,10.

Steg 2: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-L-norma- lyl-L-prolinamid 1,25 g (5 mmol) H-Nva-Pro-NH¿.HCl uppslam- mades i 15 ml DMFA och försattes under iskylning och om- rörning med 0,7 ml (5 mmol) trietylamin och 2,15 g (5 mmol) Z-Glp-OPFP. Efter 5 minuter tillsattes ytterligare 0,7 ml (5 mmol) trietylamin), blandningen omrördes i yt- 10 15 20 25 30 35 40 ._13- 447 261 terligare 20 minuter och indunstades därefter i vakuum.

Indunstningsåterstoden löstes i 50 ml kloroform och lös- ningen urskakades med N-HCl (3 x 10 ml), med N-NaHCO3 (3 x 10 ml) och till sist med 10 ml vatten, torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja erhållna indunstningsåterstoden bragtes till kris- tallisation under eter och man erhöll på detta sätt en râ- produkt (1,80 g). Denna omkristalliserades i en blandning av etanol och eter och man erhöll 1,66 g Z-Glp-Nva-Pro-NH2 (72%), smältpunkt 166 - 1e7°c; R (3)= 0,29; [a]§5= -s7,s° (c = 1, i ättiksyra). f Analys: - % C % H % N beräknat för C25H30O5N4 60,25 6,59 12,22 (molekylvikt: 458,52) funnet; 2 60,08 6,70 12,15 Steg 3: L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-prolinamid 1,42 g (3,1 mmol) Z-Glp-Nva-Pro-NH2 löstes i 30 ml metanol, lösningen försattes med 0,2 g av en 10%- ig palladium/aktivkolkatalysator och vätgas leddes genom lösningen i 30 minuter. Katalysatorn avfiltrerades och filtratet indunstades. Den fasta, amorfa återstoden revs med eter och avskildes. Den på detta sätt erhållna råpro- dukten löstes i vatten, lösningen klargjordes med aktiv- kol och den vattenklara lösningen lyofiliserades. Man er- höll 0,95 g slp-Nva-Pro-NH, (94%), R (“)= 0,36; [a]§S= -s7,o° (C = 1, 1 ättiksyra).

Aminosyraanalys: Glu 0,97 (1,0), Nva 1,09 (1,0): Pro 1,00 (1,0).

Exemgel 3 L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-prolinamid f Steg 1: L-prolyl-L-prolinamid-hydroklorid 2,28 g (20 mmol) H-Pro-NH2 och 3,81 g (10 mmol) BOC-Pro-OPFP löstes i 40 ml DMFA, lösningen urska- kades med N-HCl (3 x 10 ml) därefter med N-NaHCO3 (3 x 10 ml) och till sist med vatten (1 x 10 ml), varpå den torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades.

Indunstningsåterstoden löstes i 5 ml etylacetat och lös- ningen försattes med 10 ml av en 5-normal lösning av HCl 10 15 20 25 30 35 40 _14... 447 261 i etylacetat. Efter 30 minuter utspäddes reaktionsbland- ningen med eter, den bildade fällningen avfiltrerades och torkades i vakuum över vattenfri natriumhydroxid. Man er- höll_på detta sätt 2,06 g H-Pro-Pro-NH2.HCl (83% av det på BOC-Pro-OPFP beräknade teoretiska utbytet); Rf(") = 0,05.

Steg 2: Bensyloxikarbony1-L-pyroglutamyl-L-prolyl- -L-prolinamid 0,75 g (3 mmol) H-Pro-Pro-NH2.HCl uppslam- mades i 10 ml DMFA och försattes under iskylning och om- rörning med 0,42 ml (3 mmol) trietylamin och 1,35 g (3,15 mmol) Z-Glp-OPFP. Efter 5 minuter tillsattes ytterligare 0,42 ml (3 mmol) trietylamin och efter ytterligare 10 mi- nuters omrörning indunstades den bildade, tjocka suspen- sionen i vakuum. Den kristalliniska indunstningsâterso- den revs med 8 ml etanol och det hela fick stå i kylskåp i 3 timmar. Den erhållna fällningen avfiltrerades och tor- ' kades, och man erhöll 1,0 g Z-Glp-Pro-Pro-NH, (73%); smältpunkt 247 - 248oC (sönderdelning); Rf(3)= 0,19; [oqåë -sz,s° (c = 1, i ättiksyra).

Analys: % C % H % N beräknat för C23H28O6Nq 60,52 6,18 12,27 (molekylvikt: 456,50) funnet 60,03 6,20 12,20 Steg 3: L-pyroglutamyl-L-prolyl-L-prolinamid 1,0 g (2,2 mmol) Z-Glp-Pro-Pro-NH2 löstes i 50 ml ättiksyra, 0,2 g 10%-ig palladium/aktivkolkatalysa- tor tillsattes och vätgas leddes i en timme genom bland- ningen. Katalysatorn avfiltrerades, fíltratet indunsta- des och indunstningsåterstoden revs med eter. Man erhöll på detta sätt en amorf râprodukt (0,60 g). Denna löstes i vattes, lösningen klargjordes med aktívkol och den vat- tenklara lösningen lyofiliserades. Man erhöll 0,50 g Glp- -Pro-Pro-NH, (70%), Rfm= 0,10; [a]]§5= -223,1° (c = 1, i ättiksyra).

Exemgel 4 L-pyroglutamyl-L-valyl-L-prolinamid 10 15 20 25 30 35 40 '15" 447 261 Steg 1: L-valyl-L-prolinamid-hydroklorid 0,49 g (4,2 mmol) H-Pro-NH, och 0,82 g (2,T4 mmol) BOC-Val-OPFP löstes i 10 ml DMFA. Sedan lösningen fått stå i 30 minuter indunstades den i vakuum.

Indunstningsåterstoden erhölls i form av en olja. Denna löstes i 10 ml kloroform och lösningen urskakades med N-HCl (2 x 3 ml), med N-NaHCO3 (3 x 3 ml) och till sist med vatten (1 x 3 ml), torkades över vattenfritt natrium- sulfat och indunstades. Indunstningsåterstoden löstes i 3 ml etylacetat och lösningen försattes med 3 ml av en 5-normal lösning av HCl i etylacetat. Sedan reaktions- blandningen fått stå i en timme utspäddes den med eter, fällningen avfiltrerades och torkades i vakuum över vat- tenfri natriumhydroxid. Man erhöll 0,51 g H-Val-Pro-NH2.

HCl (95% av det på BOC-Val-OPFP beräknade teoretiska ut- bytet); Rf(“) = 0,10.

..Steg 2: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-L-valyl- -L-prolinamid 0,38 g(1,52 mmol) H-Val-Pro-NH¿.HCl upp- slammades i 10 ml DMFA och under iskylning och omrörning tillsattes 0,22 ml (1,52 mmol) trietylamin och 0,69 g (1,6 mmol) Z-Glp-OPFP. Efter 10 minuter tillsattes ytter- ligare 0,22 ml (1,52 mmol) trietylamin och efter ytter- ligare 30 minuters omrörning indunstades reaktionsbland- ningen i vakuum. Indunstningsåterstoden löstes 1 15 ml kloroform och lösningen urskakades med N-HCl (2 x 5 ml), med N-NaHCO3 (3 x 5 ml) och till sist med vatten (1 x 5 ml), varpå den torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades i vakuum. Den oljeartade återstoden bring- ades till kristallisation med eter och man erhöll 0,54 g z-cip-val-Pro-NH, (77%), smäitpunkt 116 - 11s°c; Rf(3) 0,30; [u]§5 = -1oo,s° (C = 1, i äftiksyra.

Steg 3: L-pyroglutamy1-L-valyl-L-prolinamid 9,65 g (21,2 mmol) Z-Glp-Val-Pro-NH2 löstes i 300 ml vatten och efter tillsats av 2 g 10%-ig palladium/ aktivkolkatalysator leddes vätgas genom lösningen i 5 tim- mar. Katalysatorn avfiltrerades och filtratet indunstades. 10 15 20 25 30 35 40 _ 15 _ 447 261 Den i form av en olja erhållna indunstningsåterstoden löstes i etanol, lösningen indunstades och detta upp- repades två gånger. Den slutligen erhållna amorfa, fas- ta återstoden revs med eter och man erhöll 4,47 g Glp- -val-Pro-Nnz (65%), nfm= 0,34; [(1135 = -1o4,9° (c = 1, i ättiksyra).

Aminosyraanalys: Glu 1,03 (1,01), Val 1,00 (1,0), Pro 0,94 (1,0).

Exemgel 5 L-pyroglutamyl-L-isoleucyl-L-prolinamid Steg 1: I Bensyloxikarbonyl-L-isoleucyl-L-prolinamid 51,4 g (0,1 mol) Z-Ile-OPFP och 12,5 g (0,11 mol) H-Pro-NHI löstes i 250 ml DMFA och lösningen försattes med 14,0 ml (0,1 mol) trietylamin. Reaktions- blandningen fick stå hela natten och påföljande dag in- dunstades den i vakuum. Den i form av en olja erhållna återstoden löstes i 500 ml kloroform, lösningen urksaka- des med N-HCl (2 x 100 ml), med N-NaHCO3 (2 x 100 ml) och med vatten (1 x 100 ml), varpå den torkades över vatten- fritt natriumsulfat och indunstades. Den oljeartades åter- stoden bringades till kristallisation med en blandning av 100 ml eter och 100 ml n-hexan. Den på detta sätt erhåll- na råprodukten (31, 7 g) omkristalliserades i en bland- ning av 60 ml etylacetat och 60 ml n-hexan. Man erhöll 30,32 g z-Ile-Pro-NH, (84%), smältpunkt 127 - 12s°c, Rfm = 0,54.

Steg 2: L-isoleucyl-L-prolinamid-hydroklorid 24,0g (66,5 mmol) Z-Ile-Pro-NH2 löstes i 470 ml metanol, varpå man till lösningen sattes 30 ml av en 2,4-normal lösning av HCl i metanol och 4 g 10%-ig palladium/aktivkolkatalysator. Vätgas leddes genom bland- ningen i en timme, varpå katalysatorn avfiltrerades och filtratet indunstades. Indunstningsåterstoden revs med eter och den på detta sätt erhållna râprodukten (20 g) omkristalliserades i en blandning av metanol och eter.

Man erhöll 16,5 g H-Ile-Pro-NH2.HCl (81%): smältpunkt 13s-14o°c; Rfm = 0,15. 10 15 20 25 30 35 40 _ 17 _ 447 261 Steg 3: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-L-iso- leucyl-L-prolinamid 0,90 g (3,5 mmol) H-Ile-Pro-NH2.HCl upp- slammades i 20 ml DMFA och under iskylning och omrörning tillsattes 0,49 ml (3,5 mmol) trietylamin och 1,57 g (3,7 mmol) Z-Glp-OPFP. Efter 5 minuters ytterligare om- rörning tillsattes 0,49 ml (3,5 mmol) trietylamin och efter omrörning i ytterligare 20 minuter indunstades reaktionsblandningen i vakuum. Indunstningsâterstoden löstes i 30 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (3 x 7 ml), med N-NaHCO3 (3 x 7 ml) och till sist med vatten (1 x 7 ml), varpå den torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja erhållna indunstningsâterstoden behandlades flera gång- er med eter, varpå etern avdekanterades. Till sist bringa- des râprodukten att kristallisera under eter, löstes i etylacetat och utfälldes på nytt genom tillsats av eter.

Man erhöll på detta sätt 1,18 g Z-Glp-Ile-Pro-NH2 (71,5%); smäitpunkt av - s9°c; Rfm = 0,36, [oqåë -91,4° (c = 1, i ättiksyra).

Analys: % C % H % N beräknat för C2qH3206Nq 61,00 6,83 11,6 (molekylvikt: 427,55) funnet: 59,19 6,88 11,16 Steg 4: L-pyroglutamyl-L-isoleucyl-L-prolinamid 4,72 g (10 mmol) Z-Glp-Ile-Pro-NH; löstes i 100 ml metanol, 1 g 10%-ig palladiumlaktivkolkatalysa- tor tillsattes och vätgas leddes genom blandningen i en timme. Katalysatorn avfiltrerades, filtratet indunstades och återstoden revs med eter. Den på detta sätt erhållna råprodukten (3,22 g) löstes i vatten och lösningen klar- gjordes med aktivkol. Den vattenklara lösningen lyofili- serades. Man erhöll 3,03 Glp-Ile-Pro-NH2 (98%); Rf(“)= 0,45; [cqåä = -1oo,7° (c = 1, i ättiksyra).

Aminosyraanalys: Glu 0,95 (1,0), Ile 1,00 (1,0), Pro 1,02 (1,0).

Exemgel 6 L-pyroglutamyl-L-u-aminobutyryl-L-prolinamid 10 15 20 25 30 35 40 _ 13 _ 447 261 Steg 1: t-butyloxikarbonyl-L-a-aminosmörsyra- -pentafluorfenylester 7,7 g (20 mmol) BOC-Abu-OH.DCHA uppslam- mades i 60 ml eter, uppslamningen försattes med 20 ml 2N-H2SOr och det hela skakades till dess att den upp- slammade substansen gick i lösning. Eterfasen avskildes, skakades med 20 ml 2N-H2SOr och därefter med 20 ml vat- ten, torkades med vattenfritt natriumsulfat och induns- tades. Den som indunstningsåterstod erhållna oljan (4,14 g) och 3,7 g (20 mmol) PFPOH löstes i 25 ml etylacetat, lösningen kyldes till en temperatur under 5°C och för- sattes under omrörning med 3,92 g (19 mmol) DCC. Reak- tionsblandningen omrördes i en timme i ett isbad, DCU avfiltrerades därefter och filtratet indunstades. Den i form av en olja erhållna återstoden löstes i n-hexan och lösningen fick stå i en timme i ett kylskåp. Den yt- terligare utfällda DCU avfiltrerades och filtratet in- dunstades till 20 ml. Sedan kristallutfällningen star- tat ställdes suspensionen i kylskåp och fick stå i det- ta hela natten. Påföljande dag avfiltrerades kristaller- na och man erhöll 5,57 g BOC-Abu-OPFP (76%), smältpunkt 83 - 84%; Ršl) = 0,86; 915% -32,s° (c = 1, i etylace- tat).

Analys: % C % H % N % F beräknat för C15H1GOrNF5 48,79 4,37 3,79 25,72 (molekylvikt: 369,29) funnet: 48,55 4,28 3,70 25,44 Steg 2: L-a-aminobutyryl-L-prolinamid-hydroklorid 3,2 g (28 mmol) H-Pro-NH2 och 5,16 g (14 mmol) BOC-Abu-OPFP löstes i 60 ml DMFA och lösningen in- dunstades i vakuum, sedan den fått stå i 5 minuter. Den i form av en olja erhållna indunstningsåterstoden lös- tes i 100 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (2 x 20 ml) och därefter med N-NaHCO3 (2 x 20 ml), tor- kades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades.

Den i form av en olja erhållna återstoden löstes i 20 ml etylacetat och lösningen försattes med 20 ml av en 6-normal lösning av HCl i etylacetat. Efter en timme 10 15 20 25 30 35 40 ._19- 447 261 utspäddes reaktionsblandningen med eter, den erhållna fällningen avfiltrerades och torkades i vakuum över vattenfri natriumhydroxid. Den på detta sätt erhållna râprodukten (3,86 g) revs med 20 ml kall DMFA. Man er- höll 2,40 g H-Abu-Pro-NH2.HCl (73% av det på BOC-Abu- -QPFP beräknade teoretiska utbytet), RÉ“) = o,1o.

Steg 3: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-L-a- -amino-butyryl-L-prolinamid 2,13 g (9 mmol) H-Abu-Pro-NH2.HCl upp- slammades i 30 ml DMFA och under omrörning och iskyl- ning försattes uppslamningen med 1,26 ml (9 mmol) tri- etylamin och 3,95 9 (9,2 mmol) Z-Glp-OPFP. Efter 5 mi- nuter tillsattes ytterligare 1,26 ml (9 mmol) trietyl- amin och efter omrörning i ytterligare 20 minuter in- dunstades reaktionsblandningen i vakuum. Den kristal- liniska återstoden revs med 20 ml etanol, fick stå i kylskåp över natten och filtrerades därefter. Man er- höll 3,30 g Z-Glp-Abu-Pro-NH2 (82%): smältpunkt 175 - 176%; RQ) = 0,28, [eqšs = -99,6° (e = 1,~i ättikeyre).

Steg 4: L-pyroglutamyl-L-a-aminobutyryl-L-pro- linamid 2,67 g (6 mmol) Z-Glp-Abu-Pro-NH2 löstes i 100 ml ättiksyra och lösningen försattes med 0,5 g 10%-ig palladium/aktivkolkatalysator, varpå vätgas led- des genom blandningen i en timme. Sedan katalysatorn avfiltrerats indunstades filtratet och återstoden revs med eter. Man erhöll på detta sätt en amorf råprodukt (1,82 g). Denna löstes i vatten, lösningen klargjordes med aktivkol och den vattenklara lösningen lyofilisera- des. Man erhöll 1,70 g Glp-Abu-Pro-NH; (91%); RÉ“) 0,24; [e]§5 = -1o2,s° (e = 1, i ättikeyre).

Exemgel 7 L-pyroglutamyl-L-c-aminodekanoyl-L-pro- linamid Steg 1: L-a-aminodekanoyl-L-prolinamid-hydroklorid 1,37 g (12 mmol) H-Pro-NH2 och 2,72 g (6 mmol) BOC-Ada-OPFP löstes i 20 ml DMFA, varpå lösningen 10 15 20 25 30 35 40 447 261 '2°" fick stå i 5 minuter och därefter indunstades i vakuum.

Den i form av en olja erhållna återstoden löstes i 50 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (3 x 10 ml), därefter med N-NaHCO3 (3 x 20 ml) och till sist med vat- ten (1 x 10 ml), varpå den torkades över vattenfritt nat- riumsulfat och indunstades. Den som återstod erhållna oljan löstes i 3 ml etylacetat och lösningen försattes med 5 ml av en 6-normal etylacetatlösningen av HCl. Se- dan reaktionsblandningen fått stå i en timme utspäddes den med eter, den bildade fällningen avfiltrerades och torkades i vakuum över vattenfri natriumhydroxid. Man er- höll på detta sätt 1,75 g H-Ada-Pro-NH2.HCl (91% av det teoretiska utbytet räknat på BOC-Ada-OPFP); Ršs) = 0,11.

Steg 2: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-L-a-ami- nodekanoyl-L-prolinamid 1,75 g (5,5 mmol) H-Ada-Pro-NH2.HCl och 2,58 g (6 mmol) Z-Glp-OPFP löstes i 30 ml DMFA och lös- ningen försattes med 0,77 ml (5,5 mmol) trietylamin. Ef- ter 5 minuter tillsattes ytterligare 0,77 g (5,5 mmol) trietylamin och efter 20 minuters ytterligare omrörning indunstades reaktionsblandningen i vakuum. Indunstnings- återstoden löstes i 50 ml kloroform, lösningen urskaka- des med N-HCl (3 x 20 ml), med N-NaHCO3 (3 x 20 ml) och till sist med vatten (2 x 20 ml), varpå den torkades. över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Atersto- den erhölls i form av en uppskummande olja. Denna revs med eter och den så erhållna gelartade suspensionen fick stå i 2 timmar i kylskåp, varpå fällningen avfiltrerades och torkades. Man erhöll på detta sätt en råprodukt (2,61 g) som omkristalliserades i 20 ml etylacetat. Slutligen erhölls 2,45 g Z-Glp-Ada-Pro-NH; (84%); smältpunkt 103 - 1os°c; ny) = 0,19; [oqåä = -63,7° (c = 1, i ättiksyra).

Analys: % C % H % N beräknat för C¿@Hr°O5Nr 63,62 7,63 10,60 (molekylvikt: 528,65) funnet: 63,24 7,81 10,57 Steg 3: L-pyroglutamyl-L-u-aminodekanoyl-L-prolin- amid 10 15 20 25 30 35 40 _21.. 447 261 1,9 g (3,6 mmol) Z-Glp-Ada-Pro-NHZ löstes i 40 ml ättiksyra, lösningen försattes med 0,2 g 10%-ig palladium/aktivkolkatalysator och vätgas leddes genom blandningen i 1,5 timmar. Katalysatorn avfiltrerades där- efter och filtratet indunstades. Indunstningsåterstoden löstes i vatten, vattenlösningen klargjordes med aktiv- kol och indunstades. Den som indunstningsåterstod er- hållna oljan löstes i 30 ml kloroform, lösningen torka- des med vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Den skumbildande, amorfa, fasta återstoden revs med eter, avfiltrerades och torkades. Man erhöll på detta sätt 1,20 g sip-Ada-Pro-NH, = 0,55; [a]§5 = -es,2° (C = f 1, i ättiksyra).

Exemgel 8 L-pyroglutamyl-L-cyklohexylalanyl-L-pro- linamid Steg 1: t-butyloxikarbonyl-L-cyklohexylalanin- -pentafluorfenylester 9,04 g (20 mmol) BOC-Cha-OH.DCHA uppslamma- des i 80 ml eter och suspensionen försattes med 20 ml 2N- -H2SO~. Blandningen skakades till dess att den fasta sub- stansen gick i lösning, varpå eterfasen avskildes, tvät- tades med 20 ml 2N-HZSOQ och i anslutning därtill med 20 ml vatten, torkades med natriumsulfat och indunstades.

Den i form av en olja erhållna återstoden (5,7 g) löstes i 30 ml etylacetat, lösningen försattes med 3,7 g (20 mmol) PFPOH, blandningen avkyldes till högst 5°C och försattes med 4,12 g (20 mmol) DCC. Reaktionsblandningen omrördes vid denna temperatur i en timme, varpå den utfällda DCU avfiltrerades, filtratet indunstades och den som återstod erhållna oljan löstes i 30 ml n-hexan. Lösningen fick stå i kylskåp i en timme, varpå den ännu kvarvarande DCU av- filtrerades och filtratet utspäddes med 70 ml n-hexan. Den utspädda lösningen urskakades med N-NaHCO3 (5 x 40 ml) och i anslutning därtill med vatten (2 x 40 ml), torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja erhållna indunstningsåterstoden kristalliserade när den fick stå. På detta sätt erhölls 8,48 g BOC-Cha-OPFP (97%), smältpunkt 75 - 77°c; RQ) = 0,88. 10 15 20 25 30 35 40 _ 22 _ 447 261 Analys: % C % H % N % F beräknat för C20H24O6NF5 54,92 5,53 3,20 21,72 (molekylvikt: 437,41) funnet: 54,67 5,66 3,11 21,43 Steg 2: L-cyklohexylalanyl-L-prolinamid-hydro- klorid 2,28 g (20 mmol) H-Pro-NH2 och 4,37 g (10 mmol) BOC-Cha-OPFP löstes i 40 ml DMFA och sedan lösning- en fått stå i 5 minuter indunstades den i vakuum. Den i form av en olja erhållna indunstningsâterstoden löstes i 80 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (3 x 20 ml), med N-NaHC03 (3 x 20 ml) och till sist med vatten (1 x 20 ml), torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja erhâllna.indunstnings- återstoden löstes i 8 ml etylacetat, lösningen försattes med 10 ml av en 5-normal lösning av HCl i etylacetat och efter en timme utspäddes reaktionsblandningen med eter.

Den bildade fällningen avfiltrerades och torkades i vakuum över vattenfri natriumhydroxid._Man erhöll på detta sätt 2,98 g H-Cha-Pro-NH¿.HCl (97% av det på BOC-Cha-OPFP be- räknade teoretiska utbytet); RÉ“) = 0,33.

Steg 3: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-L-cyklo- hexylalanyl-prolinamid 2,43 g (8 mmol) H-Cha-Pro-NH2.HCl och 3,60 g (8,4 mmol) Z-Glp-OPFP löstes i 25 ml DMFA och lösningen försattes med 1,12 ml (8 mmol) trietylamin. Efter 5 mi- nuter tillsattes ytterligare 1,12 ml (8 mmol) trietylamin och efter ytterligare 20 minuters omrörning indunstades reaktionsblandningen i vakuum. Indunstningsâterstoden lös- tes i 80 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (3 x 20 ml), med N-NaHCO3 (3 x 20 ml) och till sist med vat- ten (1 x 20 ml), torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja erhållna återsto- den bringades med eter till kristallisation och den på detta sätt erhållna råprodukten (3,88 g) omkristallise- rades i 30 ml etylacetat. Man erhöll 3,32 g Z-Glp-Cha-Pro- -Naz (81%), smäu-.punkt 165 - 166°c; Ršz) = 0,17; [6135 = -67,3° (c = 1, i ättiksyra). 10 15 20 25 30 35 40 -2ß- 447 261 Analys: % C % H % N beräknat för C27H;@05N4 63,26 7,08 10,93 (molekylvikt: 512,61) funnet: 63,15 7,04 10,91 Steg 4: L-pyroglutamyl-L-cyklohexylalanyl-L-pro- linamid 3,07 g (6 mmol) Z-Glp-Cha-Pro-NH; löstes 60 ml etanol, lösningen försattes med 0,6 g 10%-ig pal- ladium/aktivkolkatalysator och vätgas leddes genom lös- ningen i 2 timmar. Sedan katalysatorn avfiltrerats in- dunstades filtratet och återstoden revs med eter. Man er- höll på detta sätt 2,15 g amorf, fast Glp-Cha-Pro-NH2 (95%), nå” = 0,50; [oqås = -7o,9° (c = 1, i ättiksyra).

Exemgel 9 L-pyroglutamyl-L-treonyl-L-prolinamid Steg 1: O-bensyl-L-treonyl-L-prolinamid-hydroklo- rid 1,43 g (12,5 mmol) H-Pro-NH; och 2,98g(6,27 mmol) BOC-Thr(Bzl)-OPFP löstes i 20 ml DMFA och efter 5 minuter indunstades lösningen i vakuum. Den i form av en olja erhållna indunstningsåterstoden löstes i 30 ml klo- roform, lösningen urskakades med N-HCl (2 x 10 ml), i an- slutning därtill med N-NaHCO3 (3 x 10 ml), torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja erhållna indunstningsâterstoden löstes i 4 ml etylacetat och lösningen försattes med 5 ml av en 5-nor- mal lösning av HCl i etylacetat. Efter en timme utspäd- des reaktionsblandningen med eter, den bildade fällningen avfiltrerades och torkades i vakuum över vattenfri natrium- hydroxid. Man erhöll på detta sätt 2,05 g H-Thr(Bzl)-Pro- -Nnbncl (95%), nå” = 0,40.

Steg 2: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamvl-L-O-ben- syl-treonyl-L-prolinamid 2,05 g (6 mmol) H-Thr(Bzl)-Pro-NH2.HCl och 2,69 g (6,27 mmol) Z-Glp-OPFP löstes i 20 ml DMFA, lös- ningen försattes droppvis med 0,84 ml (6 mmol) trietyl- amin och efter 5 minuter med ytterligare 0,84 ml (6 mmol) t* 10 15 20 25 30 35 40 _ 24 _ 447 261 trietylamin. Efter omrörning i 20 minuter indunstades reaktionsblandningen i vakuum, återstoden löstes i 50 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (2 x 10 ml) och med N-NaHC03 (3 x 10 ml), torkades med vatten- fritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja erhållna återstoden behandlades med eter och kyl- des, varigenom produkten stelnade i amorft tillstånd.

Den på detta sätt erhållna råprodukten (2,76 g) löstes i etylacetat, klargjordes med aktivkol, filtrerades och filtratet indunstades. Den fasta, amorfa, skumbildande återstoden revs med eter och man erhöll 2,47 g Z-Glp- -Thr(Bzl)-Pro-NH2 (75%).

Steg 3: L-pyroglutamyl-L-treonyl-L-prolinamid 2,04 g (3,7 mmol) Z-Glp-Thr(Bzl)-Pro-NH; löstes i 40 ml ättiksyra, lösningen försattes med 0,4 g 10%-ig palladium/aktivkolkatalysator och väte leddes ge- nom blandningen i 4 timmar. Sedan katalysatorn avfiltre- rats indunstades filtratet och indunstningsåterstoden regfi med eter. Den på detta sätt erhållna amorfa råpro- dukten (1,31 g) kromatograferades på en kiseldioxidgel- kolonn (30 g, partikelstorlek 0,063 - 0,2 mm) och elue- ríng genomfördes med lösningsmedelsblandningen (3). De eluatfraktioner som innehöll den rena produkten förena- des och indunstades och den som återstod erhållna rå- produkten behandlades med eter. Man erhöll 0,72 g Glp- -frhr-Pro-NH, (59,5%); Rim = 0,16; [u]§5= -9o,o° (c i ättiksyra). 1, Aminosyraanalys: Glu 1,00 (1,0), Thr 0,99 (1,0), Pro 1,03 (1,0).

Exemgel 10 L-pyroglutamyl-O-t-butyl-L-seryl-L-prolin- amid Steg 1: O-t-butyl-L-seryl-L-prolinamid-hemioxalat 8,0 g (70 mmol) H-Pro-NH2 och 16,0 g (34,7 mmol) Z-Ser(tBu)-OPFP löstes i 120 ml DMFA och lösningen indunstades i vakuum efter 5 minuter. Den i form av en olja erhållna indunstningsåterstoden löstes i 300 ml klo- roform, lösningen urskakades med N-HCl (3 x 80 ml), med 10 15 20 25 30 35 40 _25.. 447 261 N-NaHCO3 (3 x 80 ml) och till sist med vatten (1 x 80 ml), torkades över vattenfritt natriumsulfat och induns- tades. Den i form av en olja erhållna indunstningsâter- stoden (18 g) och 4,37 g (34,7 mmol) oxalsyradihydrat löstes i 300 ml metanol, lösningen försattes med 3 g 10%-ig palladium/aktivkolkatalysator och vätgas leddes genom blandningen i en timme. Sedan katalysatorn av- filtrerats indunstades filtratet, återstoden revs med etylacetat och torkades i vakuum. Man erhöll på detta sätt 10,8 g H-Ser(tBu)-Pro-NH2.(COOH)2 (90% av det på Z-Ser(tBu)-OPFP beräknade teoretiska utbytet) i form av en amorf, hygroskopisk substans; RÉ") = 0,22.

Steg 2: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-O-t- -butyl-L-seryl-L-prolinamid 6,43 g (18,5 moi) n-sentßuwpro-Nnb- (COOH)2 och 7,95 g (18,5 mmol) Z-Glp-OPFP löstes i 80 ml DMFA och lösningen försattes med 5,18 ml (37 mmol) trietylamin. Efter 5 minuter indunstades reaktionsbland- ningen i vakuum och den kristalliniska återstoden revs med eter. Den på detta sätt erhållna produkten (9,53 g) omkristalliserades i 120 ml metanol. Man erhöll 7,70 g z-clp-seutlan-Pro-NH, (s3%); smäitpunkt 226 - 229%; nå” = 0,40; [oqšë 71,s° (c = 1, i ättiksyra).

Analys: % C % H % N beräknat för C¿5H34O7Nq 59,75 6,82 11,15 (molekylvikt: 502,57) funnet: 59,55 6,95 11,09 Steg 3: L-pyroglutamyl-O-t-butyl-L-seryl-L-prolin- amid 4,02 g (8 mmol) Z-Glp-Ser(tBu)-Pro-NH2 lös- tes i 160 ml metanol, lösningen försattes med 0,8 g 10%-ig palladium/kativkolkatalysator och vätgas leddes genom blandningen i 30 minuter. Sedan katalysatorn avfiltrerats indunstades filtratet. Den i form av en olja erhållna in- dunstningsâterstoden kristalliserades under eter, kristal- lerna avfiltrerades och torkades och man erhöll 2,50 g e1p-ser('°1au)-Pr0-NH, (ssæn smältpunkt 186 - 187%; RQ) = 0,45; [aßfi = -so,s° (c = 1, 1 ättiksyra). 10 15 20 25 30 35 40 _26_ 447 261 Aminosyraanalys: Glu 1,03 (1,0), Ser 1,00 (1,0), Pro 1,00 (1,0). ' Analys: % C % H % N beräknat för C11H28O5Nr 55,42 7,66 15,21 (molekylvikt: 368,44) funnet: 55,07 7,61 14,94 Exemgel 11 L-pyroglutamyl-D-leucyl-L-prolinamid Steg 1: _ t-butyloxikarbonyl-D-leucin-pentafluor- fenylester 4,62 g (20 mmol) BOC-D-Leu-OH och 4,23g(22 mmol) PFPOH löstes i 50 ml etylacetat och lösningen för- sattes under iskylning och omrörning med 4,12g(20 mmol) DCC. Reaktionsblandningen omrördes en timme i isbad, var- på den utfällda dicyklohexylkarbamiden avfiltrerades och filtratet indunstades. Den i form av en olja erhållna indunstningsåterstoden löstes i 100 ml n-hexan, lösning- en fick stå i kylskåp i en timme, varpå den ännu åter- stående dicyklohexylkarbamiden avfiltrerades. Filtratet urskakades med N-NaHC03 (5 x 50 ml) och med vatten (2 x 50 ml), torkades över vattenfritt natriumsulfat och in- dunstades. Den i form av en olja erhållna indunstnings- återstoden kristalliserade, när den fick stå över natten.

Man erhöll på detta sätt 7,0 g BOC-D-Leu-OPFP (88%); smält- punt 53 - SSOC; Ršl) = +31,7o (c = 1, i etylacetat).

Analys: % C % H % N % F beräknat för C17H20O,NF5 51,39 5,07 3,53 23,91 (molekylvikt: 397,35) funnet: 51,51 4,68 3,66 23,65 Steg 2: D-leucyl-L-prolinamid-hydroklorid 3,42 g (30 mmol) H-Pro-NH2 och 60,0g(15 mmol) BOC-D-Leu-OPFP löstes i 60 ml DMFA och efter 5 mi- nuter indunstades lösningen i vakuum. Indunstningsåter- stoden löstes i 100 ml kloroform, lösningen urskakades med N-HCl (2 x 20 ml), med N-NaHC03 (3 x 20 ml) och till sist med vatten (1 x 20 ml), torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja er- hållna indunstningsâterstoden löstes i etylacetat och 10 15 20 25 30 35 40 _27.. 447 261 lösningen försattes med 15 ml av en 4-normal lösning av HCl i etylacetat. Efter en timme utspäddes reaktions- blandningen med eter, fällningen avfiltrerades och tor- kades i vakuum över vattenfri natriumhydroxid. Man er- höll på detta sätt 3,66 g H-D-Leu-Pro-NH2.HCl (92,5% av det på BOC-D-Leu-OPFP beräknade teoretiska utbytet), nå” = 0,26.

Steg 3: Bensyloxikarbonyl-L-pyroglutamyl-D-Leucyl- -L-prolinamid 3,66 g (13,9 mmol) H-D-Leu-Pro-NH2.HCl och 6,43 g (15 mmol) Z-Glp-OPFP löstes i 50 ml DMFA och lösningen försattes under iskylning och omrörning med 1,95 ml (13,9 mmol) trietylamin. Blandningen omrördes i 5 minuter, varpå ytterligare 1,95 ml (13,9 mmol) trietyl- amin tillsattes. Efter ytterligare 20 minuters omrörning indunstades reaktionsblandningen i vakuum. Indunstnings- återstoden löstes i 120 ml kloroform och lösningen ur- skakades med N-HCl (3 x 30 ml), med N-NaHCO; (3 x 30 ml) och till sist med vatten (1 x 30 ml), torkades över vat- tenfritt natriumsulfat och indunstades. Den i form av en olja erhållna indunstningsâterstoden bringades till kris- tallisation genom behandling med eter. Den på detta sätt erhållna râprodukten (6 g) omkristalliserades i 30 ml etanol. Man erhöll 5,48 g Z-Glp-D-Leu-Pro-NH2 (77%): smäitpunkt 189 - 194°c; RÉ3) = 0,48; [u]§5 = ~33,2° (C 1, i ättiksyra).

Steg 4: L-pyroglutamyl-D-leucyl-L-prolinamid 3,78 g (8 mmol) Z-Glp-D-Leu-Pro-NH; löstes i 150 ml metanol, lösningen försattes med 0,8 g 10%-ig palladium/aktivkolkatalysator och vätgas leddes genom blandningen i en timme. Sedan katalysatorn avfiltrerats indunstades filtratet och återstoden revs med eter. Den på detta sätt erhållna råprodukten (2,5 g) löstes i vat- ten, lösningen klargjordes med aktivkol och den vatten- klara lösningen lyofiliserades. Man erhöll 2,35 g Glp-D- -Leu-Pro-NH, (87%), R(“) = 0,48, [u]§5 = -a3,3° (C = 1, f i ättiksyra). 10 15 20 _28.. 447 261 DATA AVSEENDE JÄMFÖRANDE FÖRSÖK I syfte att visa de fördelaktiga och oväntade egen- skaperna hos de nya tripeptidamiderna med den allmänna formeln(I) vill vi hänvisa till följande fakta: Med TRH-analogen enligt föreliggande uppfinning har det praktiskt taget fullständigt lyckats att separera den hormonella (TSG-mobiliserande) verkan och verkan på det centrala nervsystemet (CNS) från varandra. Den i svenska patentskriften 425 659 beskrivna kraftigaste CNS- stimulerande analogen uppvisar en hormonverkan, vars storlek är identisk med verkan av TRH, medan de föreningar som utövar en svag hormonverkan icke heller uppvisar någon CNS-stimulerande verkan.

Vi har utfört jämförande försök med föreningar enligt den svenska patentskriften 425 659 och föreningar enligt uppfinningen och hänvisar i detta sammanhang till bifogade tabell. Av tabellen framgår med all tydlighet över- lägsenheten hos de patentsökta föreningarna vad gäller separationen av CNS-verkan från hormonverkan. _29.. 447 261 RESULTAT AV JÄMFÖRANDE FÖRSÖK FÖRENING HORMONVERKAN CNS-VERKAN Naturligt TRH 1 1 Enligt svenska patentet 425 659: Kpc-His-Tca-NH2 1 8 Kpc-His-Pro-NH2 1 4 DL-Kpc-His-Pro-NH2 0,2 3 Kic-His-Pro-NH2 0,1 1 Kic-His-Pro-OCH3 0,001 0 Enligt föreliggande uppfinning: Glp-Nva-Pro-NH2 0 7 Glp-Nie-Pro-NH2 0,038 Glp-Abu-Pro-NH2 O 1 Med "Hormonverkan“ och "CNS-verkan" avses den relativa verkan i förhållande till TRH.

Claims (1)

1. 0 -30._ 447 261 PATENTKRAV Tripeptidamid med den allmänna formeln Glp - X - L - Pro - NH - A (I) där X representerar en L-norleucyl-, L-norvalyl-, D-leucyl-, L-prolyl-, L-2-aminobutyryl-, L-valyl-, L-treonyl-, L-iso- leucyl-, L-2-aminodekanoyl-, L-cyk1ohexyl-alanyl- eller L-t-butyl-serylgrupp; vidare A representerar väte eller en alkylgrupp med 1-10 kolatomer eller en med en dimetyl- aminogrupp substituerad alkylgrupp med 1-3 kolatomer i alkyldelen; liksom även terapeutiskt användbara komplex av dessa tripeptidamider.