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MEMOIRE DESCRIPTIF à l'appui d'une demande de
BREVET D ' I N V E N T I O N pour "Peptides biologiquement actifs, procédé pour leur préparation et leur emploi comme médicaments" par la Société : FARMITALIA CARLO ERBA S. p. A., Via Carlo Imbonati, 24, I - 20159 MILAN. (Italie). Priorité de deux demandes de brevet déposée en Grande-Bretagne, les 10 novembre 1982, sous le NO 82 32080 et 20 avril 1983, sous le NO 83 10719. Inventeurs : Roberto de CASTIGLIONE, Luigia GOZZINI, Pier Carlo MONTECUCCHI,
Giuseppe PERSEO.
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L'invention a pour objet des peptides biologiquement actifs, leurs sels pharmaceutiquement acceptables, un procédé pour les préparer et leur emploi comme agents
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Dans ce qui suit, les symboles et les abréviations utilisés sont ceux qui sont employés communément dans la chimie des peptides (voir J. Biol. Chem. 1972, 247,977-983), c'est-à-dire Boc, t-butyloxycarbonyle ; Bzl, benzyle ; c, concentration ; d, décomposition ; HOTcp, trichlorophénol ; MeOH, méthanol ; Met (O), méthionine- - sulfoxyde ; (4-Cl) Phe ; 4-chloro-L-phénylalanine ; (4-NH2) Phe, 4-amino-L-phénylalanine ; (4-NO2) Phe, 4-nitro-L-phénylalanine ; Pip, acide L-pipécolique ; Thz, acide 4-L-thiazolidine carboxylique ; TLC, chromatographie sur couche mince.
L'invention concerne les peptides de formule générale :
X-A-B-C-Trp-D-Y dans laquelle X représente un atome d'hydrogène, un groupe protégeant un atome d'azote terminal de type acyle, uréthane aromatique, alkyle, aralkyle ou uréthane aliphatique ; A représente une liaison de valence ou un reste de L-Oc-amino-acide ;
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B représente un reste de L-oimino-acide ou un reste de L-oc-amino-acide ; C représente un reste de L-c-imino-acide ou un reste neutre de L-oc-amino-acide ; D représente une liaison de valence ou un reste de L-oc-amino- - acide ;
Y représente un groupe hydroxy, un groupe amino ou un groupe de formule OR, NHR, NR2 ou NH-NH-R'dans lesquelles R représente un groupe alkyle à chaîne droite, à chaîne ramifiée ou cyclique (y compris les anneaux fusionnés ou pontés) ayant jusqu'à 11 atomes de carbone, et étant substitué ou insubstitué, un groupe phényle ou un groupe aralkyle ayant de 7 à 9 atomes de carbone ;
R'représente un atome d'hydrogène, l'un quelconque des groupes que R
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peut représenter, un groupe acyle aliphatique cyclique ou à chaîne droite ou à chaîne ramifiée ayant de 1 à
11 atomes de carbone, insubstitué ou substitué par un groupe hydroxy ou amino ou un atome d'halogène, un groupe acyle aromatique, insubstitué ou substitué par un groupe hydroxy ou amino ou un atome d'halogène, un groupe de type uréthane aliphatique cyclique, à chaîne droite ou à chaîne ramifiée ayant de 3 à 11 atomes de carbone, un groupe de type uréthane aromatique.
Les groupes préférés protégeant l'atome terminal d'azote que X peut représenter comprennent les groupes (de type acyle) formyle, acétyle, trifluoroacétyle, propionyle et benzoyle ; (de type uréthane aromatique) benzyloxycarbonyle) (Z), 4-nitrobenzyloxycarbonyle,
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4-méthoxybenzyloxycarbonyle, 2, 4-dichlorobenzyloxycarbonyle, 2-bromobenzyloxycarbonyle, 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc) et 3, 5-diméthoxy- < < '-diméthylbenzyloxy- carbonyle (Ddz) ; (de type uréthane aliphatique) t-butoxycarbonyle, 1-méthylcyclobutoxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle et isobornyloxycarbonyle ; (de type alkyle et aralkyle) trityle, benzyle, méthyle et isopropyle.
Les restes de L-oc-amino-acide préférés que A peut représenter peuvent comprendre Phe, (4-NO2) Phe, (4-NH2) Phe, (4-Cl) Phe, et Tyr. Les restes de L-oc-imino- - acide préférés que B peut représenter comprennent Pro, Thz et Pip ; quand A est absent, les restes de L-a-amino-acide préférés que B peut représenter comprennent Pyr, Phe et Tyr.
Les restes de L-c-imino-acide préférés que C peut représenter comprennent Pro, Thz et Pip ; les restes neutres de L- < x-amino-acide préférés que C peut représenter comprennent Ala, Val et Leu. Les restes de L-oc-amino-acide préférés que D peut représenter comprennent Val, Leu, Met, Met (O), Ile et Phe. Les groupes préférés que R peut représenter comprennent les groupes méthyle, éthyle, n-propyle,
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isopropyle, n-butyle, s-butyle, isobutyle, t-butyle, 2,2, 2-trifluoroéthyle, cyclohexyle, adamantyle, phényle, benzyle et phénéthyle.
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Des exemples de groupes acyle que R'peut représenter sont les suivants : formyle, acétyle, trifluoroacétyle, propionyle, butyryle, adamantyl-carbonyle, benzoyle, phénylacétyle et cinnamyle. Les groupes de type aliphatique et uréthane aromatique que R'peut représenter sont de préférence les groupes mentionnés comme groupe X préféré protégeant l'atome d'azote terminal de type aliphatique et uréthane aromatique.
Les sels des peptides de l'invention avec des acides ou des bases pharmaceutiquement acceptables font partie du cadre de l'invention. De tels sels acides d'addition peuvent dériver d'une variété d'acides organiques et inorganiques comme les acides sulfurique, phosphorique, chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, nitrique, sulfamique, citrique, lactique, pyruvique, oxalique, maléique, succinique, tartrique, cinnamique, acétique, trifluoroacétique, benzoique, salicylique, gluconique, ascorbique et les acides apparentés. De tels sels d'addition basiques peuvent dériver d'une variété de bases organique et inorganique comme l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, la diéthylamine, la triéthylamine et la dicyclohexylamine.
La synthèse des peptides de l'invention s'accomplit par des méthodes classiques en solution. La synthèse consiste essentiellement en des condensations successives appropriées d'amino-acides protégés ou de peptides. La condensation est effectuée de façon que les peptides résultant possèdent la séquence désirée des 4 ou 5 restes d'amino-acides. Les amino-acides et les peptides, qui sont condensés selon des méthodes connues en soi dans la chimie des polypeptides, ont ceux de leurs groupes amino et carboxylique qui ne sont pas impliqués dans la formation de la liaison peptidique bloqués par un groupe protecteur convenable. Les groupes protecteurs sont susceptibles d'être éliminés par acidolyse, saponification ou hydrogénolyse.
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Pour la protection des groupes amino on peut utiliser par exemple les groupes protecteurs suivants : benzyloxycarbonyle, t-butoxycarbonyle, trityle, formyle,
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trifluoroacétyle, o-nitrophénylsulfényle, 4-méthoxybenzyl- oxycarbonyle, 9-fluorénylméthoxycarbonyle ou 3, 5-diméthoxy- - od-diméthylbenzyloxycarbonyle. Pour la protection des groupes carboxy on peut utiliser par exemple les groupes protecteurs suivants : méthyle, éthyle, t-butyle, benzyle
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ou p-nitrobenzyle.
La condensation entre un groupe amino d'une molécule et un groupe carboxyled'une autre molécule pour former la liaison peptidique peut s'effectuer au moyen d'un dérivé acyle activé comme un anhydride mixte, un azide ou un ester activé, ou par condensation directe entre un groupe amino libre et un groupe carboxyle libre, en présence d'un agent de condensation comme le dicyclohexylcarbodiimide, seul ou avec un agent empêchant la racémisation, comme le N-hydroxysuccinimide ou le 1-hydroxybenzotriazole.
Les dérivés hydrazido ou hydrazido substitués conformes à l'invention sont préparés par condensation du peptide N-protégé ou de l'amino-acide avec une hydrazine convenablement substituée, comme le benzylcarbazate, le t-butylcarbazate, l'adamantylcarbazate, la phénylhydrazine ou l'adamantylhydrazine, ou par réaction du peptide N-protégé ou de l'hydrazide d'amino-acide avec un agent convenable d'alkylation comme un chlorure d'alkyle, ou avec un agent convenable d'acylation comme le benzylchloroformate, le t-butylfluoroformate, le di-t-butyl-dicarbonate ou l'adamantylfluoroformate. La condensation peut être effectuée dans un solvant comme le diméthylformamide, la pyridine, l'acétonitrile, le tétrahydrofuranne ou la N-méthyl-2- - pyrrolidone. La température de réaction peut être entre - 300C et la température ambiante.
La durée de la réaction est généralement de 1 à 120 heures. Le schéma de la synthèse, les groupes protecteurs et les agents de condensation sont choisis de manière à éviter le risque de racémisation.
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Les réactions d'élimination des protections sont effectuées selon des méthodes connues en soi dans la chimie des polypeptides. Les peptides dans lesquels Y représente OR sont préparés, par exemple, à partir de l'amino-acide à C-terminal estérifié par un alcool approprié. Les peptides dans lesquels Y représente OH peuvent être préparés, par exemple, par hydrolyse de peptides dans lesquels Y représente OR. Les peptides dans lesquels Y représente NH2'NHR ou NR peuvent être préparés par ammoniolyse des esters correspondants ou à partir d'un amino acide à C-terminal amidaté à l'aide d'une amine appropriée.
Activité biologique
Les composés de l'invention possèdent une activité intéressante favorisant la croissance chez les animaux comme indiqué par un ensemble d'essais in vivo- - in vitro sur la synthèse des protéines des tissus du foie comme décrit par K. Kammerer et A. Dey-Hazra dans Veterinär-Medizinische Nachrichten, 99-112 (1980). Ils présentent aussi une activité endocrinologique intéressante comme la libération de la prolactine et de l'hormone lutéinisante.
Evaluation de l'activité favorisant la croissance
Les peptides de l'invention, par exemple H-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-NH, ont été essayés sur des rats à des doses quotidiennes allant de 1 à 100 ng/kg administrées par voie sous-cutanée pendant une période de une à quatre semaines. Ils ont montré un accroissement de la synthèse des protéines du foie comme déterminé par la méthode de Kämmerer et Dey-Hazra et une augmentation du poids du corps à la fin des quatre semaines d'expérimentation. De plus, le rapport de conversion de l'alimentation était amélioré.
Pour l'usage vétérinaire, l'administration des composés de l'invention aux animaux produisant de la nourriture peut être effectuée dans une gamme de doses allant de 1 à 100 ng/kg, selon les techniques vétérinaires usuelles pour le traitement à l'aide d'agents anabolisants
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ou favorisant la croissance, nommément par implantation sous-cutanée ou sous forme stabilisée convenable en mélange avec l'alimentation. En conséquence, l'invention couvre aussi toute composition pharmaceutique ou vétérinaire comprenant un composé de l'invention ou un sel acceptable en pharmacie ou en pratique vétérinaire de ce composé en mélange avec un diluant ou un véhicule acceptable en pharmacie ou en pratique vétérinaire ; de plus, ces préparations peuvent être du type à libération contrôlée ou retardée de l'ingrédient actif.
Les peptides préférés de l'invention sont les suivants : Pyr-Pro-Trp-Met-OH Pyr-Pro-Trp-Met-OMe Pyr-Pro-Trp-Met-NH2 Pyr-Pro-Trp-Met (O)-OH Pyr-Pro-Trp-Met (0) -OMe Pyr-Pro-Trp-Met (0) -NH2 Pyr-Ala-Trp-Met-OH pyr-Ala-Trp-Met-0Me Pyr-Ala-Trp-Met-NH Pyr-Ala-Trp-Leu-OH pyr-Ala-Trp-Leu-OMe Pyr-Ala-Trp-Leu-NH2 Pyr-Pro-Trp-Val-OH Pyr-Pro-Trp-Val-OMe Pyr-Pro-Trp-Val-NH2 H-Phe-Pro-Pro-Trp-OH H-Phe-Pro-Pro-Trp-OMe H-PhePro-Pro-Trp-NH
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H-Phe-Pro-Trp-Met-OMe H-Phe-Pro-Trp-Met-NH2 H-Tyr-Pro-Trp-Met-OH H-Ty-Pro-Trp-Met-0Me H-Tyr-Pro-Trp-Met-NH2 H-Tyr-Pro-Trp-Leu-OH H-Tyr-Pro-Trp-Leu-OMe H-Tyr-Pro-Trp-Leu-NH2 H-Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-OH
H-Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-OMe H-Phe-Pro-Pro-Trp-Leu-NH2 H-PhePro-Pro-Trp-Met-0H H-Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe H-Phe-Pro-ProTrp-Met-NH2 H-Phe-Pro-Pro-Trp-Val-CH H-Phe-Pro-Pro-Trp-Val-OMe H-Phe-Pro-Pro-Trp-Val-NH2 H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Met-OH H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Met-OMe H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Met-NH2 H- (4-Cl) Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OH H- (4-Cl) Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe
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H- H- H- Phe-Pro-Pro-Trp-Met-OMe H-
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On donnera maintenant plusieurs exemples de préparations de composés de l'invention, sans intention limitative.
Les valeurs Rf ont été déterminées sur des plaques pré-enduites d'une couche d'une épaisseur de 0,25 mm de gel de silice 60 F254 (Merck) d'une longueur de 20 cm, à l'aide des systèmes suivants de développement : Système A : benzène/acétate d'éthyle/acide acétique/eau =
100/100/20/10 en volume (phase supérieure).
Système B : benzène/acétate d'éthyle/acide acétique/eau =
100/100/40/15 en volume (phase supérieure).
Système C : n-butanol/acide acétique/eau = 4/1/1 en volume.
Système D : chloroforme/méthanol/hydroxyde d'ammonium à 32% = 55/45/20 en volume.
"E. Merck"est une marque commerciale.
Les anaylses TLC n'ont pas été exécutées selon des conditions standardisées. Les valeurs Rf peuvent par conséquent changer, particulièrement à des températures différentes. Les points de fusion ont été déterminés dans des tubes capillaires ouverts à l'aide de l'appareil de Tottoli et n'ont pas été corrigés.
La plupart des dérivés se ramollissent et se décomposent avant la fusion. Les solvants pour la cristallisation, la précipitation ou le broyage sont indiqués entre crochets. L'électrophorèse sur papier à haute tension a été effectuée à l'aide d'un appareil Pherograph-Original- - Frankfurt Type 64 de Schleicher et SchUll sur papier No 2317 au pH 1,2 (acide formique : acide acétique : eau = 123 : 100 : 777) à 1600 V (40 V/cm) et au pH 5,8 (pyridine : : acide acétique : eau = 450 : 50 : 4500) à 1400 V (32,5 V/cm).
Les produits ont été caractérisés par leur mobilité au pH
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1, 2 relativement à Glu au pH 5, 8 par rapport à His (E5, 8) ou à Glu, selon la direction de migration.
(El, 2)' etExemple 1 Préparation de pyr-pro-Trp-Met-NH2 (IV) Opération 1. Boc-Trp-Met-NH (I)
A une solution de 3,043 g (10 mmoles) de Boc-Trp-OH dans 30 ml de tétrahydrofuranne anhydre, on a
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ajouté successivement à la température de 1, 12 ml (10 mmoles) de N-méthyl-morpholine et 0, 99 ml (10 mmoles) de chloroformiate d'éthyle. Après agitation pendant 2 minutes, on a ajouté une solution froide de 1,482 g (10 mmoles) de H-Met-NH2 (F. Chillemi, Gazz. Chim. Ital., 1963, 93, 1079) dans 30 ml de diméthylformamide. Le mélange en réaction a été agité pendant 1 heure à -120C, puis pendant 2 heures entre 0 et 150C, filtré pour séparation des sels et soumis à évaporation sous vide.
Le résidu a été mis en solution dans de l'acétate d'éthyle et lavé plusieurs fois successivement avec des solutions saturées de chlorure de sodium, d'acide citrique 1 M, de bicarbonate de soude 1 M et d'eau. La couche organique a été séchée sur du sulfate de sodium anhydre et le solvant a été éliminé sous vide.
On a obtenu 4,041 g (rendement 93%) du composé
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I à partir de l'acétate d'éthyle ; 7 D - (c = 1 Me0H) 61 ; 0, 84.
Opération 2. HCl. H-Trp-Met-NH2 (II)
On a fait dissoudre 3,911 g (9 mmoles) de Boc-Trp-Met-NH2 (I) dans 40 ml d'acide formique à la température de la pièce. Après élimination complète de Boc (contrôle par TLC) le solvant a été évaporé sous vide à 30 C. Le résidu a été mis en solution dans du méthanol refroidi à OOC et on a ajouté 3,6 ml (10,8 mmoles) d'une solution 3 M de chlorure d'hydrogène dans du tétrahydrofuranne anhydre. Les solvants ont été éliminés sous vide et on a obtenu 3 g (rendement 90%) du composé II à partir de
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MeOH/AcOEt : f. 1140C (d) ; 7 + 20, D (c = 1 MeOH) ; 0, 62 ;E 0, 82. p.Opération 3. Pyr-Pro-OH (III)
3,604 g (10 mmoles) de Z-Pyr-Pro-OH (R. de Castiglione et al., Gazz-. Chim.
Ital. 1964, 94, 875) en solution dans 30 ml du mélange méthanol : diméthylformamide = 1 : 1 ont été soumis à hydrogénation à la température
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de la pièce et à la pression atmosphérique en présence de 1,2 g de 10% en poids de palladium sur charbon. On a éliminé le catalyseur par filtration et on a concentré la solution sous vide. On a obtenu 2,149 g (rendement 95%) du composé III à partir d'éther diéthylique : p. f. 168 C ;
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--20 '7 =-105, (c = 1 MeOH) ; 0, 21 ; RfD 0, 62
1 E5, 8 0, 98.
Opération 4. pyr-Pro-Trp-Met-NH2 (IV)
A une solution de 1,584 g (7 mmoles) de Pyr-Pro-OH (III) en solution dans 20 ml de tétrahydrofuranne anhydre, on a ajouté successivement à -120C 0,79 ml (7 mmoles) de N-méthyl-morpholine et 0,69 ml (7 mmoles) de chloroformiate d'éthyle. Après agitation pendant 2 minutes, on a ajouté une solution froide de 2,596 g (7 mmoles) de HCl. H-Trp-Met-NH2 (II) et 0,79 ml (7 mmoles) de N-méthyl- - morpholine dans 20 ml de diméthylformamide. Le mélange
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en réaction a été agité pendant 1 heure à et pendant 2 heures à une température de 0 à 15 C, puis filtré pour séparation des sels et soumis à évaporation sous vide.
Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne, sur gel de silice (Merck) 0,040-0, 063 mm en éluant avec le mélange chloroforme : méthanol : eau 87 : 13 : 1 en volume. On a obtenu 2,545 g (rendement 67%) du produit IV à partir de l'éther diisopropylique : p. f. 207-2090C,
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--23 L/D (c = 1 MeOH) ; Rfc 0, Rapport des amino-acides : Glu 1, 00 ; Pro 0,98 ; Met 1,00.
Exemple 2
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Préparation de HCl. H-Phe-Pro-pro-Trp-Met-NH2 (IX) Opération 1. Boc-Phe-Pro-OH (V)
On a mis en suspension dans 10 ml d'eau 1,151 g (10 mmoles) de proline et on a ajouté 10 ml de 1 N NaOH. La solution obtenue a été diluée avec du diméthylformamide et les solvants ont été évaporés sous vide ; on a ajouté du diméthylformamide et on a soumis à évaporation à nouveau sous vide. On a ajouté une solution de Boc-Phe-OTcp
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(4, 447 g, 10 mmoles) (E. Sandrin et R. A. Boissonnas, Helv.
Chim. Acta, 1963, 46, 1637) dans 50 ml de diméthylformamide et on a agité le mélange en réaction à la température de la pièce pendant une nuit. Après élimination du solvant par évaporation sous vide, le produit brut a été transformé en acide libre correspondant de manière usuelle et purifié par chromatographie sur colonne, sur gel de silice (Merck) 0,040-0, 063 mm en éluant avec le mélange chloroforme : : méthanol = 9 : 1 en volume ; on a obtenu 3,252 g du composé V (rendement 90%) sous forme d'une mousse par évaporation à partir d'éther de pétrole : RfA 0, 67.
Opération 2. Boc-pro-Trp-Met-NH2 (VI)
En partant de 1,722 g (8 mmoles) de Boc-Pro-OH et de 2,967 g (8 mmoles) de HCl. H-Trp-Met-NH2 (II) et en opérant comme à l'opération 1 de l'exemple 1, on a obtenu 3,828 g (rendement 90%) du produit VI à partir d'alcool
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isopropylique c7" (c = 1 MeOH) D :/RfA 0,38 ; RfB 0, 73.
Opération 3. HCl. H-pro-Trp-Met-NH2 (VII)
En partant de 3,722 g (7 mmoles) de Boc-Pro- -Trp-Met-NH2 (VI) et en opérant comme à l'opération 2 de l'exemple 1, on a obtenu 2,621 g (rendement 80%) du produit
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VII à partir d'alcool éthylique absolu ; 2 D (c = 1 MeOH) ; 0, ; E 20, 7
ZOpération 4. Boc-Phe-pro-Pro-Trp-Met-NH2 (VIII)
Une solution de 2,340 g (5 mmoles de HC1. H- -Pro-Trp-Met-NH2 (VII) dans 20 ml de diméthylformamide a été refroidie à OOC et on a ajouté 0,56 ml de N-méthyl- - morpholine suivis de 1,812 g de Boc-Phe-Pro-OH (V), de 0,676 g (5 mmoles) de 1-hydroxy-benzotriazole et de 1,135 g (5,5 mmoles) de dicyclohexylcarbodiimide.
Le mélange en réaction a été agité à la température de la pièce pendant 3 heures puis soumis à filtration et à évaporation sous vide. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne, sur gel de silice (Merck) 0,040-0, 063 mm en
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éluant avec le mélange acétate d'éthyle : méthanol : eau = 70 : 30 : 2 en volume. On a obtenu 1,940 g (rendement 50%) du composé (VIII) à partir du mélange acétate d'éthyle/ /éther diéthylique : RfA 0, 15 ; RfB 0, 60. 1 Opération 5. HCl. H-Phe-pro-pro-Trp-Met-NH2 (IX)
En partant de 1,552 g (2 mmoles) de Boc-Phe- -Pro-Pro-Trp-Met-NH2 (VIII) et en opérant comme à l'opération 2 de l'exemple 1, on a obtenu 1,282 g du produit brut.
Ce dernier a été purifié par chromatographie sur colonne, sur gel de silice (Merck) 0,040-0, 063 mm en éluant avec le mélange chloroforme : méthanol = 82 : 18 en volume. 0n a obtenu 0,705 g du composé IX (rendement général 50%) à
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partir du mélange méthanol/éther diéthylique : f. 205-215 C (d), Z7=-79, (c = 1 MESH) Rf ; E 2 0, 61. Rapport des amino-acides : Pro 1, 99 Met 1,00 ; Phe 1,00.
Exemple 3 Préparation de Pyr-Pro-Trp-Val-OMe (XII) Opération 1. Boc-Trp-Val-OMe (X)
A une solution de 12,17 g (40 mmoles) de Boc-Trp-OH dans 100 ml de tétrahydrofuranne anhydre, on a ajouté successivement à une température de -120C 4,5 ml (40 mmoles) de N-méthyl-morpholine et 3,96 ml (40 mmoles) de chloroformiate d'éthyle. Après agitation pendant 2 minutes, on a ajouté une solution froide de 6,70 g (40
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mmoles) de HCl. H-Val-OMe (E. L. Smith et al., J. Biol.
Chem. 199, 801, 1952) et de 4, 5 ml de N-méthyl-morpholine (40 mmoles) dans 50 ml de diméthylformamide. Le mélange en réaction a été agité pendant 1 heure à-120C et. pendant 2 heures entre 0 et 150C, filtré pour séparation des sels et soumis à évaporation sous vide. Le résidu a été mis en solution dans de l'acétate d'éthyle et lavé plusieurs fois successivement avec des solutions saturées en chlorure de sodium de 1 M d'acide citrique, 1 M de bicarbonate de soude et d'eau. La couche organique a été séchée sur du sulfate de sodium anhydre et le solvant a été éliminé sous vide.
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On a obtenu 14,1 g (rendement 84,4%) du composé X à partir du mélange alcool isopropylique/éther
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diisopropylique. 0, 81 ; 0, 87. A B
RfAOpération 2. HCl. H-Trp-Val-OMe (XI) 1
12,52 g (30 mmoles) de Boc-Trp-Val-OMe (X) ont été mis en solution dans 15 ml d'acide formique à la température de la pièce. Après élimination complète de Boc (contrôle par TLC), le solvant a été évaporé sous vide à 30 C. Le résidu a été mis en solution dans du méthanol refroidi à OOC et on a ajouté 11 ml (33 mmoles) d'une solution 3 M d'acide chlorhydrique dans du tétrahydrofuranne anhydre. Les solvants ont été éliminés sous vide et on a obtenu 9,55 g (rendement 90%) du composé II à partir
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du mélange alcool isopropylique/éther diisopropylique.
Rfc0, 69, 0, 89 Glu.
Opération 3. Pyr-Pro-Trp-Val-OMe (XII)
A une solution de 5,66 g (25 mmoles) de Pyr-Pro-OH (III) dans 60 ml de tétrahydrofuranne anhydre on a ajouté successivement à-12 C 2,81 ml (25 mmoles) de N-méthyl-morpholine et 2,48 ml (25 mmoles) de chloroformiate d'éthyle. Après agitation pendant 2 minutes, on a ajouté une solution froide de 8,85 g (25 mmoles) de HCl. H-Trp-Val- - OMe (XI) et de 2,81 ml (25 mmoles) de N-méthyl-morpholine dans 60 ml de diméthylformamide. On a agité le mélange en réaction pendant 1 heure à -120C et pendant 2 heures entre 00 et 150C, puis on l'a soumis à filtration pour séparation des sels et à évaporation sous vide. Le produit brut a été purifié par chromatographie sur colonne, sur gel de silice (Merck) 0,040-0, 063 mm en éluant avec le mélange dichlorure de méthylène : méthanol : eau = 92 : 8 : 1 en volume.
On a obtenu
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8, 37 g (rendement 63, 7%) du produit XII à partir du mélange alcool isopropylique/éther diisopropylique. p. f. 1200C --24 //D (c = 1 MeOH) ; RfB 0, 21 ; 0, 56 rapport des amino-acides : Glu 1, 00 ; Pro 0, 98 ; Val 1, 00.
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Exemple 4 Préparation de Pyr-Pro-Trp-Val-OH (XIII)
2,63 g (5 mmoles) de Pyr-Pro-Trp-Val-OMe (XII), préparés selon l'exemple 3, opération 3, ont été mis en solution dans 15 ml de méthanol et saponifiés à l'aide de 7,5 ml d'hydroxyde de sodium IN à la température de la pièce. La réaction a été complète en 4 heures. La solution a été diluée à l'aide de 40 ml d'eau et concentrée sous vide jusqu'à la moitié du volume, diluée à nouveau avec 40 ml d'eau, refroidie à OOC, acidifiée avec de l'acide chlorhydrique 5 N au pH 2 et finalement soumise à extraction à l'aide d'acétate d'éthyle. La couche organique a été lavée jusqu'à neutralité à l'aide de solutions saturées de chlorure de sodium, séchée sur du sulfate de sodium anhydre et le solvant a été éliminé sous vide.
On a obtenu 2,1 g (rendement 82%) du composé (XIII) à partir du mélange alcool isopropylique/éther diisopropylique.
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--25 /' (c = 1 MeOH) ; RfB 0, 11 L-3, 0 Rapport des amino acides : Glu 1,00 ; Pro 0,99 ; Val 1,00.
Exemple 5 Préparation de Pyr-pro-Trp-Val-NH2 (XIV)
2,63 g (5 mmoles) de Pyr-Pro-Trp-Val-OMe (XII) préparés comme à l'exemple 3, opération 3, ont été mis en solution dans 20 ml de méthanol et 0,4 ml (2% v/v) d'éthylène glycol. La solution a été saturée à 5 C avec de l'ammoniac gazeux et conservée au réfrigérateur jusqu'à achèvement de la réaction (contrôle par TLC). L'ammoniac en excès a été éliminé sous vide et la solution concentrée sous
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vide.
Après purification par chromatographie sur colonne (gel de silice 0, 040-0, 063 mm ; éluant mélange CH2C12 : : = 87 : 13) on a obtenu le composé désiré XIV (1, 99 à partir du mélange alcool isopropylique/éther diisopropylique. p. f. 1280C ; ïD (c = 1 MeOH) ; RfB 0, 10 ; Rfc 0, Rapport des amino acides : Glu 0, 99 ; Pro 0, 97 ; Val 1, 00.
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En opérant comme aux exemples qui précèdent on a synthétisé les autres peptides qui suivent XV) H-Phe-pro-pro-Trp-Leu-NH2. HCl Rfc 0, 0, XVI) Pyr-Ala-Trp-Met-OH Rfc 0,57.
XVII) Pyr-Pro-Trp-Met-OH Rfc 0, 42 XVIII) H-Tyr-Pro-Trp-Leu-NH2. HCl - p. f. 160-170 C (d) (méthanol/éther diéthylique) ;
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E 2 0, 63.
XIX) H-Phe-Pro-Trp-Ile-NH2HCl p. f. 125 -130 C (d) (éther diéthylique) ;
E 2 0,60.