Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych trójpeptydoamidów dzialajacych na centralny uklad nerwowy o wzorze ogólnym Glp- -X-Y-NH-A,w którym X oznacza grupe L-norleu- cylowa, L-leucylowa, L-norwalilowa, D-leucylowa, 5 L-prolilowa, L-2-aminobutyrylowa, L-walilowa, L- -treonylowa, L-izoleucylowa, L-2-aminodekanoilowa, L-cykloheksyloalanilowa lub L-IIIrz.-butylo-nerylo- wa, a Y oznacza grupe L-prolilowa, albo w którym X oznacza grupe L-histydylowa, a Y oznacza gru- io pe L-homoprolilowa lub D-pipekolilowa, zas A o- znacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—10 ato¬ mach wegla lub grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla podstawiona rodnikiem dwumetyloami.no- wym, przy czym gdy X oznacza grupe L-leucylo- 15 wa, równiez A ma znaczenie inne niz atom wo¬ doru, jak równiez terapeutycznie stosowanych kom¬ pleksów tych zwiazków.Nowe trójp^ptydoamidy odpowiadajace podane¬ mu wyzej wzorowi ogólnemu stanowia zwiazki ana- 20 logiczne do L-piroglutamylo-L-hiistydylo-L-proliina- midów (Glp-His-Piro-NH2) znanych pod nazwa an¬ gielska ,ythyrotropin-reieasing hormone" (TRH), lecz w których grupy aminokwasowe, w szczególnosci znajdujace sie w polozeniu 2 grupa hiistydyiowa » albo znajdujaca sie w polozeniu 5 grupa L-proli- lowa zostaja wymienione na inna grupe amiokwa- sowa wyszczególniona w powyzszej definicji.Istnienie trójpeptydu TRH bylo znane juz w la¬ tach szescdzisjiatych ale jego budowa zostala opi- *o w 127 100 sana dopiero w latach 1069—1970 niezaleznie przez dwie grupy badawcze [Bowers, C.Y., Radocrino- logy 86, 1143 (1970); R. Bungus etc., CR. Acad. Scd (Paris) 269, 1970 (1969)].Trójpeptyd TRH dotychczas opisano jako czyn¬ nik regulujacy uwalnianie TSH (hormon pobudza¬ jacy tarczyce) w leczeniu niskiego cisnienia ssa¬ ków. Badania nad tyimi hormonami zostaly utoro¬ wane w nowym kierunku wówczas, gdy pozoano fakt, ze biologiczne dzialanie tego trójpeptydu nie jest ograniczone do stymulowania uwalniania hor¬ monu tyrotropinowego lecz dziala on takze na cen¬ tralny uklad nerwowy. [N.P. Plotnikoff i inni, Science 178, 417 (1972); A. J. Prange i inni, Lancet 2, 999 (1972)]. Nastepnie stwierdzono, ze TRH nieza¬ leznie od podanej funkcji hormonalnej obnitza tak¬ ze znacznie okres czasu dzialania barbituranów i alkoholu na sen a ponadto redukuje dzialanie róz¬ nych leków wywolujacych obnizenie temperatury ciala i podwyzsza zdolnosci ruchowe. Jeszcze inna wazna funkcja wplywu TRH na centralny uklad nerwowy jest zahamowanie katailepsji wywolywa¬ nej przez chloroperidol. Z punktu widzenia tera¬ peutycznej praktyki pozadane jest takze wytwa¬ rzanie takiego zwiazku analogicznego do TRH, któ¬ ry tylko slabo dziala na niskie cisnienie krwi ale przy tym wykazuje dzialanie równe lub przewyz¬ szajace dzialanie znanych zwiazków TRH na cen¬ tralny uklad nerwowy. W tym celu otrzymywanie tego typu zwiazków zostalo opisane w opisach pa-127 100 4 tentowycih RFN DOS nr nir 2 343 035, 2 343 037, 2 449 167, 2 514 361, 2 609 154, 2 639 393 jak równiez w opisie patentowym Belgii noc 810198. Jednakze dotychczasowe badania w tym kierunku prowadzo¬ ne przez A.J. Ptranne i innych („The Rois of Hor- mones in Depressdon", Life Sciances 20, 1305; 1977) oraz A.V. Schally i innych („Hypoithalamic Regula¬ tory Hormones", Ann. Rev. Biochem. 47, 69; 1978) nie doprowadzily do zadowalajacych wyników z punktu widzenia potrzeb praktyki terapeutycznej.Obecnie stwierdzono, ze przez wymiane jednego z tych aminokwasów, z których zbudowana jest czasteczka TRH mozna osiagnac znaczne zreduko¬ wanie dzialania hormonalnego trójpeptydów, pod¬ czas gdy ich dzialanie na centralny uklad nerwo¬ wy zostaje zachowane lub nawet znacznie zwiek¬ szone. Szczególnie korzystne sa te pochodne trój¬ peptydów, w których na miejscu grupy histydyno¬ wej w polozeniu 2 znajduje sie alifatyczna grupa aminokwasowa o prostym lub rozgalezionym lan¬ cuchu weglowym.Takie analogi TRH przy praktycznie calkowitym braku dzialania hormonalnego wykazuja dzialanie wielokrotnie przewyzszajace dzialanie TRH na o- srodkowy Uklad nerwowy. Poza tym korzystne sa równiez takie analogi TRH, w których grupa L- -histydylowa w polozeniu 2 pozostaje niezmieniona, aHe umiejscowiona w polozeniu 3, grupa L-proli- lowa TRH zostaje wymieniona na grupe L4iomo- pirolilowa lub DTprpekoliloiwa.W celu wytworzenia nowego trójpeptydoamidu o ogólnym wzorze Glp-X-Y-NH-A, w którym X, Y i A maja wyzej podane znaczenie, zgodnie z wynalazkiem, jako produkt wyjsciowy stosuje sie podstawiony amid aminokwasu o ogólnym wzorze Y-NH-A, w którym Y i A maja wyzej podane znaczenie z tym, ze Y oznacza grupe aminokwasu wystepujacego w zadanym produkcie koncowym.Nastepnie do tego amidu aminokwasu, gólnych etapach, wedlug metod znanych w chemii peptydów na drodze N-acylowamia reaktywna po¬ chodna aminokwasu o wzorze X-OH z ewentual¬ nie chroniona grupa aminowa wprowadza sie od¬ powiednia zadana ewentualnie chroniona reszte L- -^aminokwasu, po czym otrzymany dwupeptydoarnid sprzega sie z wystepujaca w produkcie konco¬ wym w polozeniu 1 grupa L-piroglutamylowa i ewentualnie odszczepia grupy ochronne wprowa¬ dzone dla przeprowadzenia wymienionyoh reakcji sprzegania-.Otrzymane tym sposobem amidy trójpeptydu o ogólnym wzorze Glp-X-Y-NH-Amozna wyodrebnic z mieszaniny poreakcyjnej przez krystalizacje lub liofilizacje; jesli jest to pozadane to otrzymany produkt mozna w znany sposób przeprowadzic w zwiazek kompleksowy.Przy zastosowaniu metody etapowego budowania czasteczki trójpeptydu korzystnie poddaje sie wyjsciowy zwiazek o wzorze ogólnym Y-NH-A, uzyty w nadmiarze, reakcji z aktywowana po¬ chodna, zwlaszcza z astrem pieciofluorofenylowym lub ewentualnie z mieszanym bezwodnikiem chro¬ nionego L^aminokwasu o wzorze ogólnym BOC-X- -OH. Rrzy uzyciu estru pieciofluorofenylowego, od¬ powiednie chronione pochodne diwupeptydu o wzo¬ rze ogólnym BOC-X-Y-NH-A mozna otrzymac w ciagu bardzo krótkiego czasu reakcji (w ciagu kil¬ ku minut) w latwo wytwarzanej i nie wymagajacej oczyszczania postaci. Z tych pochodnych dwupep- 5 tydu na drodze hydrolizy kwasowej mozna wytwa¬ rzac odpowiednie wolne dwupeptydy o wzorze o- gólnym H-X-Y-A. Zwiazki te nastepnie poddaje sie reakcji z estrami pieciofluorofenylowymi chro¬ nionego kwasu L-piroglutaminowego o wzorze o- 10 gólnym Z-dp-OPEP, w którym Z oznacza ochron¬ na grupe benzyloksykarbonylowa przy czym wy¬ twarza sie chroniony trójpeptyd o wzorze ogólnym Z-Glp-X-Y-NH-A, z którego grupe ochronna Z ko¬ rzystnie usuwa sie za pomoca katalitycznego uwo- 16 dornienia.W innej postaci sposobu wedlug wynalazku dwu¬ peptydoarnid N^acyluje sie kwasem L-glutamino- wym zamiast kwasem L-piroglutaminowym i w otrzymanym trójpeptydoamidzie grupe giutaminyio- 20 wa cyklizuje sie do grupy piroglutamylowej.Oczyszczanie otrzymanego produktu koncowego mozna prowadzic za pomoca wykrystalizowania lufo wytracania a w razie potrzeby mozna produkt o- czyszczac chromatograficznie na drodze chromato- 23 grafii kolumnowej. Ewentualnie produkt koncowy po usunieciu . ubocznych produktów moze byc wy¬ dzielony na drodze zwyklej liofilizacji.Wytworzone sposobem wedlug wynalazku trój- peptydy o wzorze ogólnym Glp-X-Y-NH-Azostaly 30 przebadane pod wzgledem ich dzialania farmako¬ logicznego nizej opisanymi metodami biologiczny- .. mi. -• 1. Ograniczenia katalepsji wywolywanej u szczu¬ rów na skutek stosowania haloperidol. 35 Zwierzetom podano 40 mg/kg haloperidolu, to zna¬ czy 4-/p-chlorofenylo/-l-[3-/p-fluorobenzoilo^-propy- lo] ipiperyidynolu-4 i po 120 minutach zauwazono wystapienie katalepsji. Nastepnie szczury rozdzie¬ lono w grupy po 10 sztuk i podawano im dozyl- 40 nie dawki TRH lub trójpeptydów bedacych analo¬ gami TRH otrzymanych sposobem wedlug wyna¬ lazku. Zwierzeta z grupy kontrolnej potraktowano fizjologicznym roztworem soli kuchennej. Po uply¬ wie 15, 30, 90 i 120 minut przebadano kataleptycz- 45 ne dzialanie poszczególnych zwiazków. Za kataiep- tyczne uznano te zwierzeta, które po oparciu przed¬ nimi lapami na slupku na wysokosci 7 cm, w ciagu 30 sekund nie zmienily swojej pozycji.Ze zwierzat, kt6re nie wykazywaly objawów 50 katalepsji, wyznaczono odpowiednie wartosci EDM dla poszczególnych zwiazków za pomoca analizy przez sondowanie. Próby te przeprowadzono na meskich osobnikach szczurów Wistar o ciezarze 160^180 g. w 2. Potegowanie lokomotorycznej aktywnosci my¬ szy wywolywanej przez L-dopa (Patrz: TThe Tttiy- roid Axis, Drugs and Behavior, str. 116. A.J. Prage Ir, Reven Press, New York 1974). Zwierzetom po¬ dawano dootnzewnowo najpierw po 48 mgrikg N- 60 -metylo-N-propargilo-benzyloaminy (pargilina), nas¬ tepnie 20 mg/kg TRH, wzglednie taka sama dawke nowych badanych trójpeptydów otrzymywanych sposobem wedlug wynalazku i w koncu 100 mg/kg L-dopa. Po 30, 60 i 90 minutach zmierzono loko- « motoryczna aktywnosc zwierzat. IJ§g£kane war-127 100 tosci podano w ponizszej tablicy w procentach w porównaniu z wartosciami uzyskanymi dla zwie¬ rzat potraktowanych trójpeptydem TRH. Do tych prób uzyto po 15 meskich osobników myszy o cie¬ zarze ciala 18—22 g. 3. Przeciwdzialanie hipotarmii u myisizy spowo¬ dowanej rezerpina (Patrz: B. M. Askew: Life Sci. 2, 725—730 (1963).Osobnikom meskim myszy podzielonym na grupy po 10 sztuk o ciezarze ciala od 18 do 22 g podano dootrzewnowo 5 mg rezeirpiny na kg ciezaru ciala.Po 16 godzinach zwienzetom podano dawki po 20 mg/kg TRH albo badanych nowych trójpeptyidów, wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku.Przed podaniem rezerpiny amierzono temperature w odbytnicy (zwierzat (w tablicy oznaczenie „norm"), po czym mierzono te temperature po 16 godzinach po podaniu rezerpiny (w tablicy „red") i po jednej, ewentualnie dwóoh godzinach po poda¬ niu badanego trójpeptydu (w tablicy „po potr.").W tablicy podano sredmie wartosci tempetratiuiry w odbytnicy dla badanych 10 myszy. 4. Wplyw na czasooJkres snu spowodowanego po¬ braniem heksobarbitaiiu. Osobnikom meskim myszy pogrupowanym w grupy po 10 sztuk podawano do¬ zylnie po 60 mg^kg heksobaribitalu-Na (evipanR Sayer). Po 10 minutach zwierzetom podano do¬ otrzewnowo dawki po 20 mgi^kg TRH ewentualnie badanego trójpeptydu otrzymanego sposobem we¬ dlug wynalazku. Okres czasu spania podano w tablicy w procentach w stosunku do grupy kon¬ trolnej (wartosci przecietne dla 10 zwierzat). 5. Narkoza etanolowa (Patrz: J.M. Cott etc. J.Pharmacol. Exp. Ther. 196, 594 (1976).Myszom pogrupowanym w grupy po 20 sztuk o róznej plci i o ciezarze ciala od 18 do 22 g podano dootrzewnowo po 4,5 g etanolu. Po 10 minutach podano dootrzewnowo zwierzetom po 20 mg/kg TRH lub badaneg trójpeptydu, wytworzonego spo¬ sobem wedlug wynalazku. Czasy snu podano w tab¬ licy w procentach w stosunku do wartosci uzys¬ kanych dla zwierzat z grupy kontrolnej (przeciet¬ ne wartosci dla 20 zwierzat). 6. Hormonalna aktywnosc (dzialanie TSH) u szczurów. Szczurom, samcom rasy Wisitar o cieza¬ rze ciala okolo 200 g pogrupowanym w grupy po 7 do 8 zwierzat podano dozylnie dawki po 28 mg/kg TRH wzglednie badanego trójpeptydu otrzymanego sposobem wedlug wynalazku. Po 15 minutach po podaniu TRH lub nowych analogicznych trójpepty- dów wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku oznaczano w osoczu krwi zwierzat aktywnosc hor¬ monalna przez badanie odpornosci na napromienio¬ wanie. Wartosci wzgledne okreslajace to dzialanie wyliczono metoda ozteropunktowa za pomoca kom¬ putera TOA 101, przy czym wartosci dla TRH przyjmowano za 100.Dane okreslajace biologiczne dzialanie najwaz¬ niejszych zwiazków o ogólnym wzorze 1, które zostaly przebadane w opisanych próbach farmako¬ logicznych podano w ponizszej tablicy.Z danych przedstawionych w powyzszej tablicy Widac, ze przez wymiane w czasteczce TRH grupy His na alifatyczny aminokwas o prostym lub roz¬ galezionym lancuchu weglowodorowym powoduje 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3 i p K? GJ /—V -O 3 I § i, a "a 5 ,2 *• tl es 73 cd* b O •; M O ¦5 a: al" i! « &"9 g N * I S. s Si 1 a & Cl ¦a o O M E P 6 b0 ii i X I l CO o cf < 8 ^ h CD P5 f CO h t« e^ «fi co co o d ^ ^ tj< cm "* Sf S3 !S 12 S co co co 03 cg «f ^ co t» co c^ io £ £f 8 !S £ 58 Cg, CO CO Cg vi CO 0\ r-J^ t^ lO L» A icT t-* co co oT irt W M N S H « CN| CO C^ lO CO CM & sf & sf sf sf co co co Cg Cg CO rH i-H O f-H »H O « H M rl lH cd in o in Tf o m o a co h o ej o) t: o io ^ S o c5 o C^ CN i-H CN iH O O O O lO U5 Cs| (N CO Oq rH i-H ^ 00^ CO^ t^ i-T co' co" co" o o i-H rH lO rH 00 00 w w ^ w « s s s £ s & fi CU K 0, [* 8 3 tg 3 a S 5 3 < i co c- cg^ i-j^ Si- H W M W -H -H 1 I CU ¦8 a O U127100 7 8 sie zahamowanie albo co najmniej znaczne zmniej¬ szenie wydzielania TSH, przy czym na przyklad ograniczenie katalepsji wywolywanej przez halope- ridoi jest 2 do 7 razy silniejsze.Nowe analogi TRH wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wykazuja takze znaczne dzialanie pote¬ gujace lokomotoryczna aktywnosc albo zmniejszaja czas snu wywolanego pobraniem heksobarfoitallu albo etanolu.Warto zauwazyc takze, ze nowe analogi TRH zawierajace grupe His powoduja wprawdzie za¬ chowanie w okolo 70% dzialanie hormonalne, ale równoczesnie wywieraja znacznie silniejsze dziala¬ nie na centralny uklad nerwowy.Nowe trójpeptydoamidy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku jak równiez ich farmaceutycz¬ nie stosowane sole albo kompleksy moga byc u- zywane w postaci zwykle stosowanych w terapii preparatów leczniczych. Preparaty te zawieraja czynnik wytwarzany wedlug wynalazku w pola¬ czeniu z nieorganicznym albo organicznym nosni¬ kiem, który nadaje sie do podawania dojelitowego lufo pozajelitowego.Preparaty lecznicze moga byc wytwarzane na przyklad w postaci stalych lioffliza/tów, w których jako nosnik mozna stosowac zwiazki nie reagujace z peptydarni, np. weglowodany. Moga byc one spo¬ rzadzane takze w postaci stezonej lub rozcienczo¬ nej zawiesiny albo emulsji lub tabletek badz pre¬ paratów do wstrzykiwania.Praktycznie sposób wedlug wynalazku, to znaczy sposób wytwarzania nowych trójpeptydów analo¬ gicznych do TRH, zilustrowano w ponizszych przykladach. Zastosowane w tych przykladach skró¬ ty stanowia skróty znane w chemii peptydów we¬ dlug J, Biot. Ghem. 247, 977 (1072). Ponadto w przykladach zastosowano nastepujace dodatkowe skróty: Ada Abu Cha Pip HPro DAE DCC PPPOH PCU DMFA kwas L-2-aminondekanowy kwas L-2-aminonmaslowy . L-cykloheksylo-alanina kwas L-pipekolinowy L-homoprolina 2-dwumetyioaimino-etyi dwucykloheksylo^kambodwuimid pieciofluorofenol dwucykloheksylomocznik dwumetyloformamid Ponadto w przykladach temperatury topnienia zwiazków oznaczano w specjalnym aparacie dr Tottoli (Biichi). Skrecalnosc optyczna mierzono za pomoca polarymetru Perkina-Elrnera 141. Do chro¬ matografii cienkowarstwowej albo rozdzielczej sto¬ sowano plytki z zelu krzemionkowego (Kieselgel G nach Stahl — E, Merck, Darmstadt). Do wywo- lania chromatogramu stosowano nastepujace mie¬ szaniny rozpuszczalników: (1) chloroform: metanol 9:1 (2) octan etylu : (pirydyna : kwas octowy : woda 20:6:11/) 9:1 K3) octan etylu : (jpirydyna : kwas octowy : woda 20:6:11) 8:2 (4) octan etylu : (pirydyna : kwas octowy : : woda 20:6*111) 3:2 Do wywolywania plamki stosowano roztwór nin- hydryny. Po spryskaniu plytki suszono w ciagu 5 5 minut w temperaturze 105°C. Potem chromatogra- my umieszczano w atmosferze gazowego chloru i po przewietrzeniu wywolywano za pomoca roztwo¬ ru o-tolidyny z jodkiem potasowym.Do oczyszczania produktu w kolumnie chroma¬ tograficznej stosowano zel krzemionkowy „Kiesel¬ gel G" E. Mercka o rozmiarach czastek 0,062 do 0,2 mm.Do odparowywania roztworu pod zmniejszonym cisnieniem stosowano prózniowa wyparke Rotava- por (Biichi), przy czym odparowywanie przeprowa¬ dzano w temperaturze nie przekraczajacej 50°C.Ester pieciofluorofenylowy aminokwasów z gru¬ pa ochronna BOC wytwarzano metoda opisana przez L-Kisfaludy Ann. 1973, 1421'.Blizsze szczególy dotyczace sposobu wytwarzania nowych trójpeptydoamidów analogicznych do TRH sposobem wedlug wynalazku przedstawiono w nas¬ tepujacych przykladach wykonania.Przyklad I. Wytwarzanie LHpiroglutamylo-L- -norleucylo-L-prolinamidu Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku L-norieucy- lo-L-prolinamidu. 2,28 g (20 moli) H-Pro-NHa i 3,97 g (10 moli) BOC-Nle-DPFP rozpuszczono w 40 ml DMFA, a po 5 minutach roztwór odparowano pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymany jako pozostalosc olej roz¬ puszczono w 50 ml chloroformu. Roztwór wytrza¬ sano kolejno trzykrotnie z 10 ml porcjami nor- imalnego roztworu kwasu solnego, trzykrotnie z 10 ml porcjami normalnego roztworu wodoroweglanu sodu i raz z 10 ml wody, po czym osuszono w obecnosci siarczanu sodu i odparowano. Pozostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 5 ml octanu etylu i do roztworu dodano 10 'ml SN roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po 30 minutach rozcien¬ czono" mieszanine reakcyjna eterem a otrzymany osad odsaczono i wysuszono w prózni nad bezwod¬ nym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzyma¬ no 2,48 g H-Nle-Pro-NH2-HCl, czyli 94*/« teoretycz¬ nej wydajnosci przeliczonej na BOC-Nle-OPFP, przy czym Rf<4=0,20.Etap 2. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-pi- roglutamylo-Lnnorleucylo-L^prolinamidu. 1,05 g (4 mmole) H-Nle-Pro-NH2*HCl rozpuszczono w 10 ml DMFA i podczas mieszania i chlodzenia do roztworu dodano 0,56 ml (4 mmole) trójetyio- aminy i 1,89 g (4,4 mmole) Z-Glp-OPFP. Po 5 mi¬ nutach mieszania dodano dalsze 0,5 ml (11,4 mmole) trójetyloammy a po 20 minutach dalszego mieszania mieszanine odparowano w prózni. Pozostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 40 ml chloroformu i powstaly roztwór wytrzasano kolejno dwukrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w iHosci po 10 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem^kwaisu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z normal¬ nym roztworem wodorotlenku sodu w ilosci po 10 ml i raz w 10 ml wody, wysuszono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowano w prózni.Pozostaly olej doprowadzono do wykrystalizowa¬ nia w obecnosci ^teru. W ten sposób otrzymany 15 20 25 30 40 45 50 55127 100 10 bezpostaciowy surowy produkt w ilosci 1,52 g wy¬ krystalizowano z 8 ml octanu etylu. Otrzymano 1,36 g Z-Glp-Nle-Pro-NH2, co stanowilo 72% wy¬ dajnosci teoretycznej. Mial on nastepujace wlas¬ nosci: temperatura topnienia 146^148°C, Rf<3=0,32, r-^25 =79?8° (e=l, w kwasie octowym). Sklad 0241^320^4 o molekularnej masie 472,55 byl naste¬ pujacy: — wyliczony C 61,00%; H 6,83%; N 11,86% — otrzymany C 61,90%; H 7,04%; N 11,87% Etap 3. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L-norleu- cylo-L-prolimamidu. 1,16 g (2,46 mola) Z-Glp-Nle-Pro-NH2 rozpusz¬ czono w 25 ml metanolu, dodano 0,2 g 10% kata¬ lizatoira pallad-wegiel aktyiwmy i nastepnie do mie¬ szaniny doprowadzono w ciagu 30 minut gazowy wodór. Wówczas odsaczono katalizator, przesacz od¬ parowano a stala bezpostaciowa pozostalosc roztar¬ to z eterem i odfiltrowano. Otrzymamy w ten spo¬ sób surowy produkt w ilosci 0,72 g rozpuszczono w wodzie, wyklarowano weglem aktywnym i prze¬ zroczysty roztwór liofilizowano. W ten sposób o- trzymano 0,66 g Glp-Nle-Pro-NH*, co stanowi 79,5% wydajnosci teoretycznej. Wlasnosci otrzymanego produktu: Rf<4=0,43, Mg = —77,1° (c=l, w kwa¬ sie octowym).Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 0,96 (1,0), Nie 1,00 (1,0), Pro 1,00 (1,0).Przyklad II. Wytwarzanie L-pirogkutamyio-L- Hnorwaiilo-L-proiinamidiu.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku L-nonwadilo- -L-proIinarniriu. 2,2 g <20 mimoli) HnPro-NH2 i 3,83 g (10 mmoli) BOC-Nva-OPFP rozpuszczono w 40 ml DMFA.Otrzymany roztwór pozostawiono na 5 minut i od¬ parowano w prózni a pozostalosc w postaci oleju rozpuszczono w 50 ml chloroformu. Roztwór ten wstrzasano trzykrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilos¬ ci po 10 ml oraz raz z 10 ml wody, wysuszono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowa¬ no w prózni. Pozostalosc po odparowaniu rozpusz¬ czono w 5 ml octanu etylu, dodano nastepnie 10 ml 5iN roztworu kwasu solnego w octanie etylu i po¬ zostawiono na 30 minut. Nastepnie mieszanine re- alkcynja rozcienczono eterem a otrzymany osad od¬ saczono i wysuszono w prózni nad bezwodnym wo¬ dorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymano 1,83 g H-NvanPro-NH2-HCl, co stanowi 73% wydajnosci teoretycznej w przeliczeniu na BOC-(Niva-OPFP, przy czym Rf<4=0,10.Etap 2. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-Li-piro- glutamylo-LHnorwalilo-L-prolinamMu. 1,25 g (5 mmoli) H-Nva-Pro-NHa«HCl rozprowa¬ dzono w 15 ml DMFA i podczas mieszania i chlo¬ dzenia dodano 2,15 g (5 moli) Z-Glp-OPFP oraz 0,7 ml (5 moli) trójetyloaminy. Po 5 minutach .dodano 0,7 ml (5 mmoli) trójetyloaniiny i miesza¬ nine mieszano w ciagu 20 minut a potem odparo¬ wano w prózni.Pozostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 50 ml chloroformu i roztwór ten wstrzasano trzykrot¬ nie % narrnalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z normalnym roztwo¬ rem wodoroweglanu sodu w ilosci po 10 ml i w koncu raz z 10 ml wody, wysuszono z bezwod¬ nym siarczanem sodu i odparowano. Pozostalosc 5 w postaci oleju roztarto z eterem doprowadzajac do wykrystalizowania i otrzymany surowy produkt w ilosci 1,80 g wykrystalizowano z mieszaniny eta¬ nolu i eteru. Otrzymano 1,66 g Z-GlpHNva-Pro-NH2 o nastepujacych wlasnosciach: temperatura topnie- !• nia 166^167°C, Rf<3=0,29, [a]™ =—67,5° (c=il, w kwasie octowym), co stanowilo 72% wydajnosci teo¬ retycznej.Sklad C23H3o05iN4 o masie molowej 458,52 byl nastepujacy: 15 wedlug wyliczenia: C 60,25% H 6,59% N 12,22% faktyczny: C 60,08% H 6,7/)% N 12^15% Etap 3. Wytwarzanie L-piroglutamyio-L-norwali- lo-L-prolinaimidu. 1,42 g (3,1 mmola) Z-GWp-Nya^Pro-iNH^ rozpusz- *° czono w 30 ml metanolu, dodano 0,2 g 10% kata¬ lizatora pallad—wegiel aktywny i nastepnie do mieszaniny doprowadzono w ciagu 30 minut wo¬ dór. Wówczas odsaczono katalizator, przesacz od¬ parowano a stala bezpostaciowa pozostalosc roz- 25 tafto z eterem i odfiltrowano. Otazyimany w ten sposób surowy produkt w ilosci 0,72 g rozpusz¬ czono w wodzie, wyklarowano weglem aktywnym i przezroczysty roztwór liofilizowano. W ten spo¬ sób otrzymano 0,95 Gip-Nya-Pro-NH* o wlasnos- 80 ciach: Rf<4=0,36, [*]** =—87,0° (c=l, w kwasie" octowym) co stanowilo 94% wydajnosci teoretycz¬ nej.Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 0,97 (1,0), Nva 1,09 (1,0), Pro 1,00 (1,0). 35 Przyklad III. Wytwarzanie Lipirogkutamylo- -L^prolilo-L-prolinamidu.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku L-prolilo-L- -prolinamidu. 2,2(8 g (20 mmoli) H-Pro-NH2 i 3,&1 g (ilO mimoli) 40 BOC^Pro-OPFP rozpuszczono w 20 ml DMFA. Roz¬ twór wytrzasano kolejno trzykrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzy¬ krotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 10 ml i raz z 10 ml wody, póz- 45 niej osuszono w obecnosci siarczanu sodu i odparo¬ wano. Pozostalosc po odparowaniu rzpuszczmo w 5 ml ootanu etylu i do roztworu dodano 10 ml 5N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po 30 ¦minutach rozcienczono mieszanine reakcyjna ete- w rem a otrzymany osad odsaczono i wysuszono w prózni nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymano 2,06 g H-Pro^ro-NHa^HCl, czyli 83% teoretycznej wydajnosci przeliczonej na BOC-Pro-OPFP, przy czym Rf<4=0,06. 55 Etap 2. Wytwarzanie benzylOksykaribonylo-L-piro- glutamylo-L-prolilo-Lnprolinamidu. 0,75 g (3 mole) H-Pro-Pro-NH2*HCl rozpuszczono w 10 ml DMFA i do roztworu tego podczas mie¬ szania i oziebiania dodano 0,42 ml (3 mole) trój- •° etyloaminy i 1,35 g (3,15 mimola) Z-Glp-OPFP. Po 5 minutach dodano jeszcze 0,42 ml (3 mmole) trój¬ etyloaniiny i po 10 minutach dalszego mieszania gesta zawiesine odparowano w prózni. Krystaliczna pozostalosc po odparowaniu roztarto z 8 ml eteru f5 i pozostawiono na 3 godziny w lodówce. Otrzyma*11 127 100 12 ny osad odfiltrowano i wysuszono. W ten sposób otrzymano 1,0 g Z-Glp-Pro-Pro-NH2 o wlasnos¬ ciach: temperatura topnienia 247—248°C, Rf<3=0y10, jwj25 = —82,8° (c=l, w kwasie octowym), co sta¬ nowilo 73tyo wydajnosci teoretycznej.Sklad C23H2806N4 o masie molowej 456,50 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 60,52% H 6,18% fN 12,27% faktyczny: C 60,03% H 6,20% N 12,20% Etap 3. Wytwairzanie L-piroglutaniylo-L-prolilo- -L-prolimamidu. 1,0 g (2,2 mmola) Z-Glp-Pro-Pro-NH2 rozpuszczono w 50 ml kwasu octowego a do otrzymanego roz¬ tworu dodano 0,2 g 10% katalizatora pallad^ak- tywny wegiel a nastejpnie przez roztwór przepusz¬ czano w ciagu godziny wodór gazowy. Po odsacze¬ niu katalizator przesacz odparowano i pozostalosc roztarto z eterem. Otrzymany bezpostaciowy suro¬ wy produkt w ilosci 0,60 g rozpuszczono w wodzie, roztwór wyklarowano weglem aktywnym i parze- zroczysty roztwór liofilizowano. Otrzymano 0,50 g Glp-Pro-Pro-NH2 o wlasnosciach: Rf<4—0,10, [«]£• = =» —223,1° (c=l, w kwasie octowym), co stano¬ wilo 70% wydajnosci teoretycznej.Przyklad IV. Wytwarzanie L-piroglutamylo- -L-walilo -L-prolinamidu.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku L-walilo-L- -prolinamidu. ii 0,40 g (4,2 mmola) BOC-ValOPFP rozpuszczono w 10 ml DMFA, i po 30 minutach roztwór odparowa¬ no w prózni. Pozostalosc po odparowaniu w pos¬ taci oleju rozpuszczono w 10 ml chloroformu, roz¬ twór wstrzasano dwukrotnie z normalnym roz¬ tworem kwasu solnego w ilosci po 3 ml, nastep¬ nie trzykrotnie z normalnym roztworem wodoro¬ weglanu sodu w ilosci po 3 ml a w koncu raz z 3 ml wody, wysuszono z bezwodnym siarczanem sodu oraz odparowano. Oleista pozostalosc po od¬ parowaniu rozpuszczono w 3 ml octanu etylu i do¬ dano dó niej 3 m 15N roztworu kwasu solnego w octanie etylu.Reakcyjna mieszanine przetrzymywano w ciagu godziny a nastepnie rozcienczono ja eterem. O- trzymany osad przesaczono i wysuszono w prózni nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten spo¬ sób otrzymano 0,51 g H-Val-Pro-NH2'HCl, co sta¬ nowi 05% wydajnosci teoretycznej przeliczonej na BOC-Val-OPFP, przy czym Rf<4=0y10.Etap 2. Wytwarzanie benzyloksykarbonylojL-pi- ro@lutamylo-L-walilo-L-prolinarnidu. 0,38 g (1,52 mmola) H-ValnPro-NH2-HCl rozprowa¬ dzono w 10 ml DMFA i podczas mieszania i chlo¬ dzenia dodano 0,22 ml (1,52 mmola) trójetyloaminy oraz 0,69 g (1,6 mmoli) Z-Glp-OPFP. Do miesza¬ niny reakcyjnej po 10 minutach dodano dalsze 0,22 ml (1,52 mmola) trójetyloaminy, mieszano w ciagu dalszych 30 minut i potem odparowano w prózni.Pozostalosc rozpuszczono w 15 ml chlorofotnmu, roztwór wstrzasano dwukrotnie z normalnym roz¬ tworem kwasu solnego w ilosci po 5 ml, trzykrot¬ nie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 5 ml i w koncu raz z woda w ilosci 5 ml, wysuszono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowano. Oleista pozostalosc doprowadzo¬ no do krys/talizacjd z eterem. W ten sposób otrzyma¬ no 0,54 g Z-Glp-Val-Pro-NH2 o wlasnosciach: tem¬ peratura topnienia 116—118°C, Rf<3=0,30, [a] 25 = = —100,5° (c=l, w kwasie octowym), co stanowilo 771% wydajnosci teoretycznej.Etap 3. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L-walilo- -L-prolinamidu. 9,65 g (21,2 mola) Z-Grp-Val-Pro-NH2 rozpusz¬ czono w 200 ml wody. Potem dodano 2 g 10% katalizatora pallad—wegiel aktywny i w ciagu 5 godzin przepuszczano przez roztwór gazowy wodór.Katalizator odsaczono a przesacz odparowano. Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w etanolu, roztwór odparowano i operacje te powtórzono jesz¬ cze dwukrotnie. Otrzymana w koncu bezpostacio¬ wa stala pozostalosc roztarto z eterem. W ten spo¬ sób otrzymano 4,47 g Glp-Val-Pro-NH2 o wlasnos¬ ciach: Rf<4=0,34, [ octowym), co stanowilo 65% wydajnosci teoretycz¬ no mej.Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 1,03 (1,01), Val 1,00 (1,0), Pro 0,94 (1,0).Przyklad V. Wytwarzanie L-piroglutaimylo-L- -izoleuicylo-L-prolinamMu. 25 Etap 1. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-izo- leucylo-L-prolinamidu. 51,4 g (0,1 mola) Z-Ile-OPFP i 12,5 (0,11 mola) H- -Pro-NH2 rozpuszczono w 250 ml DMFA i do roz¬ tworu dodano 14 ml (0,1 mola), trójetyloaminy. Mie- 30 szanine pozostawiono na noc i nastepnego dnia od¬ parowano. Jako pozostalosc otrzymany olej rozpiusz- czono w 500 ml chloroformu a potem wstrzasano roztwór dwukrotnie z normalnym roztworem kwa¬ su solnego w ilosci po 100 ml, dwukrotnie z roz- 35 tworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 100 ml i raz z woda w ilosci 100 ml, wysuszono nad bez¬ wodnym siarczanem sodu i odparowano. Olejowa pozostalosc doprowadzono do wykrystalizowania za pomoca mieszaniny 100 ml eteru i 100 ml n-hek- 40 sanu. Otrzymany w ten sposób surowy produkt w ilosci 31,7 g wykrystalizowano z mieszaniny 60 ml octanu etylu i 60 ml n-heksanu. Otrzymano 30,32 g Z-Ile-Pro-NH2 o wlasnosciach: temperatura top¬ nienia 127—12«^C, Rf<2=0,54, co stanowilo 84% wy- 45 dajnoscd teoretycznej.Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku L-izoleucylo- -L-prolinaimidu. 24,0 g (66,5 mmola) Z-IleHPro-NH2 rozpuszczono w 470 ml metanolu, dodano 30 ml 2,4N roztworu kwa- 50 su solnego w metanolu, 4 g 10% katalizatora pal¬ lad—wegiel aktywny oraz przepuszczano przez mie¬ szanine w ciagu godziny gazowy wodór. Kataliza¬ tor odfiltrowano a przesacz odparowano. Pozosta¬ losc po odparowaniu roztarto z eterem i w ten 55 sposób otrzymany surowy produkt w ilosci 20 g wykrystalizowano z mieszaniny metanolu i eteru.Otrzymano 16,05 g H-Ile-Pro-NH2-HCl o wlasnos¬ ciach:' temperatura topnienia 135^140°C, Rf(4=0,15, co stanowilo 81% wydajnosci teoretycznej. 60 Etap 3. Wytwarzanie benzyloksykairbonylo-L-pi- roglutamylo-L-izoleucylo-L-prolinamidu. 0,90 g (3,5 mmola) H-Ile-Bro-'NH2-HCl rozprowa¬ dzono w 20 ml DMFA i podczas mieszania i chlo¬ dzenia dodano 0,49 ml (3,5 mmola) trójetyloaminy •5 oraz 1,57 g (3,5 mmola) Z-Gip-OPFP. Po 5 minu-127 100 13 14 tach dodano jeszcze 0,49 ml (3,5 mmola)' trójety - loaminy a po dalszych 20 minutach mieszania mie¬ szanine reakcyjna odparowano w prózni. Pozosta¬ losc po odparowaniu rozpuszczono w 30 mi chlo- rofonmu, roztwór wstrzasano trzykrotnie z nor¬ malnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 7 ml, równiez trzykrotnie z roztworem wodoroweg¬ lanu sodu w ilosci po 7 ml i w koncu z woda w ilosci 7 ml, wysuszono nad bezwodnym siarcza¬ nem sodu i odparowano.Jako pozostalosc otrzymany olej potraktowano wielokrotnie eterem a potem zdekantowano eter.W koncu surowy produkt doprowadzono do wykry¬ stalizowania w obecnosci eteru, oddzielono, roz¬ puszczono w octanie etylu i przez dodanie eteru ponownie wytracono. W ten sposób otrzymano 1,18 g Z-Gl£-IIe-Pro-NH2 o wlasnosciach: temperatura topnienia 87^89°C, Rf<3 = 0,36, [ w kwasie octowym), co stanowi 71,5% wydajnosci teoretycznej.Sklad C24H320eN4 o masie molowej 427,55 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 61,00% H 6,83% N 11,6% . faktyczny: C 59,19% H 6,88% N 11,16% Etap 4. Wytwarzanie L-piroglu/tamyio-L-izoleu- cylo-L-prolmamidu. 4,72 g (10 mmoli) Z-Glp-Ile-Pro-NH2 rozpuszczono w 100 ml metanolu, dodano 1 g 10% katalizatora pallad—wegiel aktywny i w ciagu godziny przez mieszanine przepuszczano gazowy wod6r. Kataliza¬ tor odsaczono, przesacz odparowano, pozostalosc roztarto z eterem. Otrzymany w ten sposób suro¬ wy produkt w ilosci 3,22 g rozpuszczono w wo¬ dzie i roztwór wyklarowano weglem aktywnym.Przezroczysty roztwór liofilizowano. Otrzymano 3,03 g Glp-Ile-Pro-NHa o wlasnosciach: Rf<4=0,45, [a] 25 = —,100,7° (c=l, w kwasie octowym), co sta¬ nowilo 98% wydajnosci teoretycznej.Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 0,05 (1,0), Ile 1,00 <1,0), Pro 1,02 (1,0).Przyklad VI. Wytwarzanie L-piroglutamylo- -L-.a-aminobutyrylo-L-proiinamidu.Etap 1. Wytwarzanie IIIrz.-pieciofluorofenyloestTu kwasu butyloksykarbonylo-L-a-aniinoniaslowego. 7,7 g (20 mmoli) BOC-Abu-OH-DCHA rozprowa¬ dzono w 60 ml eteru, dodano 20 ml 2N kwasu siar¬ kowego i az do rozpuszczenia zawiesiny roztwór wytrzasano. Nastepnie faze eterowa oddzielono i wytrzasano z 20 ml 2N kwasu siarkowego i w koncu z 20 ml wody, wysuszono w obecnosci bez¬ wodnego siarczanu sodu i odparowano. Jako pozo¬ stalosc otrzymany olej w ilosci 4,14 g oraz 3,7 (20 mmoli) PFPOH rozpuszczono w 25 ml octanu ety¬ lu, roztwór oziebiono do temperatury ponizej 5°C i podczas mieszania dodano 3,92 g (19 mmoli) DCC.Mieszanine reakcyjna mieszano w lodowatej ka¬ pieli w ciagu godziny, potem odfiltrowano DCU a przesacz odparowano. Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w n-heksanie a roztwór pozosta¬ wiono na godzine w lodówce. Wydzielony DCU odsaczono a przesacz natezono do objetosci 20 ml.Po rozpoczeciu krystalizacji zawiesine umieszczo¬ no w lodówce i pozostawiono ja tam na noc. Nas¬ tepnego dnia krysztalki oddzielono za pomoca prze¬ saczania. W ten- sposób Otrzymano 5,57 g BOC- 10 30 35 40 45 50 55 60 -Abu-OPFP o wlasnosciach: temperatura topnie¬ nia &3^84°C, Rf<1= 0,86, [a]25 = 6—32,8° (c=l, w octanie etylu), co stanowilo 76% wydajnosci teore¬ tycznej.Sklad C15Hi604dNrF5 o masie molowej 369,20 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 48,79% H 4,37% N 3,7ft% F 25,72i°/o faktyczny: C 48,55% H 4,28% N 3,70% F 25,44% Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku a-aminobu- tyrylo-L-proliinaniiidu. 3,2 g (28 mmoli) H-Pro-NH2 i 5,16 g (14 mmoli) BOC-Abu-OPFP rozpuszczono w 60 ml DMFA a po 5 minutach roztwór odparowano w prózni. O- trzymany jako pozostalosc olej rozpuszczono w 100 ml chloroformu. Roztwór wytrzasano kolejno dwukrotnie z normalnym roztworem kwasu sol¬ nego w ilosci po 20 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 20 ml, pózniej osuszono w obecnosci siarczanu sodu i od¬ parowano.Pozostalosc po odparowaniu w postaci oleju roz¬ puszczono w 20 ml octanu etylu i do roztworu do¬ dano 20 ml 6N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po godzinie rozcienczono mieszanine reakcyj¬ na eterem a otrzymany osad odsaczono i wysu¬ szono w prózni nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymany surowy produkt w ilosci 3,86 g roztarto z 20 ml zimnego DMFA.Otrzymano wiec 2,40 g H-Abu^Pro-N^HCl, czyli 73% teoretycznej wydajnosci przeliczonej na BOC- -Abu-OPFP, przy czym Rf<4=0,10.Etap 3. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-pi- ix3glutamylo-L-a-aminobutyrylo-L-prolinamidu. 2,13 g (9 mmoli) H-AibunPro-NH^HCI rozpuszczono w 30 ml DMFA i podczas mieszania i chlodzenia do roztworu dodano 1,26 ml (9 mmoli) tr6jetylo- amimy i 3,95 g (9,2 mmola) Z-Glp-OPFP. Po 5 mi¬ nutach dodano dalsze 1,26 ml (9 mmoli) trójetylo- aminy a po 20 minutach dalszego mieszania mie¬ szanine odparowano w prózni. Krystaliczna pozo¬ stalosc po odparowaniu roztarto w 20 ml etanolu, pozostawiono na noc w lodówce i potem odsaczo¬ no. W ten sposób otrzymano 1,36 g Z-Glp-AJbu- -Pro-NH2, co stanowilo 82% wydajnosci teoretycz¬ nej. Mial on nastepujace wlasnosci: temperatura topnienia 175—176°C, Rf<3=0,28, [ w kwasie octowym).Etap 4. Wytwarzanie L-piin^ilu^amylO-iL-la-ami- nobutyrylo-L-prolinaimidu. 2,67 g (6 mmoli) Z-Glp-Abu-Pro-NH2 rozpuszczono w 100 ml kwasu octowego dodano 0,5 g 10% ka¬ talizatora pallad—wegiel aktywny i nastepnie do mieszaniny doprowadzano w* oiagu godziny gazo¬ wy wodór. Wówczas odsaczono katalizator, przesacz odparowano a pozostalosc roztarto z eterem i od¬ filtrowano. Otrzymany w ten sposób bezpostacio¬ wy surowy produkt w ilosci 1,82 g rozpuszczono iv wodzie, wyklarowano weglem aktywnym i pirzeziro- czyisty roztwór liofilizowano. W ten sposób otrzy¬ mano 1,70 g Gip-Abu-PrOnNH2, co stanowi 91% wydajnosci teoretycznej. Wlasnosci otrcymaiiego15 127 100 16 • produktu: Rf<4=0,24, [a]g = ^102,5° (c=l, w kwa¬ sie octowym).Przyklad VII. Wytwarzanie L-piroglutaimylo- -L-a-aiminodekanoilo-L-prolinamidu.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku Lna-amino- dekanoilo-Lnrjrolinaimidu. 1,37 g (12 moli) H-Pro-NH2 i 2,72 g (6 moli) BOC-Ada-OPFP rozpuszczono w 20 ml DMFA. O- trzyniany roztwór pozostawiono na 5 minut i od¬ parowano w prózni a pozostalosc w postaci ole¬ ju rozpuszczono w 50 ml chloroformu. Rozitwór ten wytrzasano trzykrotnie z normalnym roztwo¬ rem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z nominalnym roztworem worodoweglanu sodu w ilosci po 10 ml oraz dwukrotnie z woda w ilosci po 10 ml wody, wysuszono w obecnosci bezwod¬ nego siarczanu sodu i odparowano. Pozostalosc w postaci oleju po odparowaniu rozpuszczono w 3 ml octanu etylu, dodano nastepnie 5 ml 6N roztworu kwasu solnego w octanie etylu i pozostawiono na 1 godzine. Nastepnie mieszanine reakcyjna roz¬ cienczono eterem a otrzymany osad odsaczono i wysuszono w prózni nad bezwodnym wodorotlen¬ kiem sodu. W ten sposób otrzymano 1,75 g H-Ada- -Pro-NH2'HCl, co stanowi 91% wydajnosci teore¬ tycznej w przeliczeniu na BOC-Ada-OPFP, przy czym Rf<3=0,ll.Etap 2. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-pi- roglutamylo-L-a-amdnodekanoiio-Liprolinamidu. 1,79 g (5,5 mmola) H-Ada-Pro-NH2-HCl i 2,58 g (6 mmoli) Z-Glp-OPFP rozpuszczono w 30 ml DiMFA oraz dodano 0,77 ml (5,5 mmola) trójetyta- aminy. Po 5 minutach dodano jeszcze 0,77 ml (5,5 mmola) trójetyloaiminy i mieszanine mieszano w ciagu 20 minut a potem odparowano w prózni.Pozostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 50 ml chloroformu i .roztwór ten wytrzasano trzykrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 20 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wo¬ doroweglanu sodu w ilosci po 20 ml i w koncu raz z 20 ml wody, wysuszono z bezwodnym siar¬ czanem sodu i odparowano. Pozostalosc w postaci spienionego oleju roztarto i z eterem a otrzymana zelowa zawiesine pozostawiono na 2 godziny w lodówce, osad odfiltrowano i wysuszono. Otrzy¬ many surowy produkt w ilosci 2,61 g wykrystali¬ zowano z octanu etylu. Otrzymano 2,45 g Z-Glp- -Ada-Pro-NH2 o nastepujacych wlasnosciach: tem¬ peratura topnienia 103^105°C, Rf<2=0,19, [a] 25 = = —63,7° (c=l, w kwasie octowym), co stanowilo 84% wydajnosci teoretycznej.Sklad C2SH40O0N4 o masie molowej 528,65 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 63,62% H 7,63% N 10,60% faktyczny: C 63,24% H 7,81% N 10,57% Etap 3. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L-ia-amino- dekanoiio-L^prolinamidu. 1,9 g (3,6 mola) Z-Glp^Ada-Pro-NH3 rozpuszczo¬ no w 40 ml kwasu octowego, dodano 0,2 g 10% katalizatora pallad—wegiel aktywny i nastepnie do mieszaniny doprowadzano w ciagu 1,5 godziny gazowy wodór. Wówczas odsaczono katalizator, przesacz odparowano a pozostalosc rozpuszczono w wódzie* Otrzymany w ten sposób wodny roztwór wyklarowano weglem aktywnym i odparowano.Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 30 ml chloroformu i powstaly roztwór wysuszono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowa¬ no. Spieniona, bezpostaciowa pozostalosc roztarto z 5 eterem, odsaczono i wysuszono. W ten spsób o- trzymano 1,20 g Glp-Ada-Pro-NH2 o wlasnosciach: Rf<4=0,55, [ wym), co stanowilo 82% wydajnosci teoretycznej.Przyklad VIII. Wytwarzanie L-piroglutamylo- 10 -L-cykloheksyloadanylo-L-pirolinamidu.Etap 1. Wytwarzanie Illrz.-pieciofluorofenyloestru butyloksykarbonylo-L-cykloheksyloalaniny. 9,04 g (20 mmoli) BOC-Cha-OH-DCHA rozprowa¬ dzono w 80 ml eteru i do zawiesiny dodano 20 ml w 2N kwasu siarkowego i az do rozpuszczenia stalej substancji roztwór wstrzasano. Nastepnie faze ete¬ rowa oddzielono i wstrzasano z 20 ml 2N kwasu siarkowego i w koncu z 20 ml wody, wysuszono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparo- 20 wano. Jako pozostalosc otrzymany olej w ilosci 5,7 g rozpuszczono w 30 ml octanu etylu oraz dodano 3,7 g (20 mmoli) PFPOH, roztwór oziebiono do temperatury ponizej 5°C i dodano 4,12 g (20 mmoli) DOC. 15 Mieszanine reakcyjna mieszano w tej temperatu¬ rze w ciagu godziny, potem odfiltrowano DCU a przesacz odparowano. Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 30 ml n-heksanu a roztwór pozostawiono na godzine w lodówce. Wydzielony 30 DCU znowu odsaczono i przesacz rozcienczono w 70 ml n-heksanu. Rozcienczony roztwór wytrzasa¬ no pieciokrotnie z normalnym roztworem wodoro¬ weglanu sodu w ilosci po 40 ml i w koncu dwu¬ krotnie z woda w ilosci po 40 ml, wysuszono w 38 obecnosci siarczanu sodu i odparowano. Jako po¬ zostalosc otrzymany olej krystalizuje po odstaniu.W ten sposób otrzymano 8,48 g BOC-Cha-OPFP o nastepujacych wlasnosciach: temperatura topnienia 75—77°C, Rf<1=0,88, co stanowilo 97% wydajnosci *o teoretycznej.Sklad C20H24O4NF5 o masie molowej 437,41 byl nastepujacy: - wo|lnejsieoIczL?4- wedlug wyliczenia: C 54,92% H 5,53% N 3,20% « F 21,72% faktyczny: C 54,67% H 5,66% N 3yll% F 21,43% Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku L-cyklohek- sylo-L-prolinamidu. 50 2,28 g {20 mmoli) H-Pro-NH2 i 4,37 g (10 mmoli) BOC-Cha-OPFP rozpuszczono w 40 ml DMFA i po 5 minutach roztwór odparowano w prózni. Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 80 ml chloroformu, roztwór wytrzasano kolejno trzykrot- 65 nie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilos¬ ci po 20 ml, trzykrotnie z nonmalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 20 ml i raz z 20 md wody, pózniej osuszono w obecnosci siarcza¬ nu sodu i odparowano. Pozostalosc po odparowa- 60 niu w postaci oleju rozpuszczono w 8 ml octanu etylu i do roztworu dodano JO ml 5N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po godzinie roz¬ cienczono mieszanine reakcyjna eterem a otrzy¬ many osad odsaczono i wysuszono w prózni nad 65 bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób17 otrzymano 2,98 g H-Cha-Paro-NH^-HCl, czyli 97% teoretycznej wydajnosci przeliczonej na BOC-Cha- -OPFP, przy czym Rf<4=0,33.Etap 3. Wytwarzanie benzyloks^karbonylo-tL-pi- roglutamylo-L-cyldoliekisyloalanylo-L-prolinamidu. 2,43 g (8 moli) H-ChaHPro-NH2 -HC1 i 3,60 g (8,4 mola) Z-Glp-OPFP rozpuszczono w 25 ml DMFA i do roztworu dodano 1,12 ml (8 moli) trójetyioaminy. Po 5 minutach dodano jeszcze 1,12 (8 moli) trójetyioaminy i po dalszych 20 mi¬ nutach mieszania reakcyjna mieszanine odparo¬ wano w prózni. Pozostalosc rozpuszczono w 80 ml chloroformu a potem wytrzasano roztwór trzykrotnie z normalnym roztworem kwasu solne¬ go w ilosci po 20 ml, równiez trzykrotnie z roz¬ tworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 20 ml i raz z woda w ilosci 20 ml, wysuszono nad bez¬ wodnym siarczanem sodu i odparowano.Olejowa pozostalosc doprowadzono do wykrysta¬ lizowania za pomoca eteru. Otrzymany w ten spo¬ sób surowy produkt w ilosci 3,88 g wykrystalizo¬ wano w 30 ml octanu etylu. Otrzymano 3,32 g Z-Glp-Cha-Pro-NH2 o wlasnosciach: temperatura topnienia 165-466°C, K,<2=0,17, £«]g = —67,3° (c= — 1, w kwasie octowym), co stanowilo 81% wydaj¬ nosci teoretycznej.Sklad C^H360tfN4 o masie molowej 512,61 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 63,26% H 7,08% N 10,93% faktyczny: C 63,15% H 7,04% N 10,91% Etap 4. Wytwarzanie L-pirogluitamylo-L-cyklohek- syloalanylo-L-prolinamidu. 3,07 g (4,6 mmoli) Z-Glp-Cha-Pro-NHa rozpuszczo¬ no w 60 ml etanolu a do otrzymanego roztworu dodano 0,6 g 10% katalizatora pallad—aktywny wegiel a nastepnie przez roztwór przepuszczano w ciagu 2 godzin gazowy wodór. Po odsaczeniu katalizatora przesacz odparowano a pozostalosc roz¬ tarto z eterem. Otrzymano 2,15 g bezpostaciowego stalego Glp-Cha-Pro-LNH2 o wlasnosciach: Rf<4 = =0,50, [ co stanowilo 95% wydajnosci teoretycznej.Przyklad IX. Wytwarzanie L-piroglutamylo- -L-treonylo-L-proliinamidu.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku o-benzylo- - treonylo-L-prolinamidu. 1,43 g (12,5 mola) H-Pro-NlH2 i 2,98 g (6,27 mmola) BOC-Thir(Bzl)-OPFP rozpuszczono w 20 ml DMFA i po 5 minutach odparowano w prózni. Jako po¬ zostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 30 ml chloroformu a potem wstrzasano roztwór dwu¬ krotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z roztworem wo¬ doroweglanu sodu w ilosci po 10 ml, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano.Olejowa pozostalosc po odparowaniu rozpuszczo¬ no w 4 ml octanu etylu i do roztworu tego doda¬ no 5 ml 5N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po godzinie mieszanine reakcyjna rozcien¬ czono eterem a otrzymany osad odsaczono w próz¬ ni i wysuszono nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymano 2,05 g H-Thr(Bzl)- -Pro^NH^HCl, co stanowilo 95% wydajnosci teore¬ tycznej, przy czym Rf(4=0,40. noo 18 Etap 2. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-pi- roglutamylo-L-O-benzylo-trenylo-L-prolinamidu. 2,05 g (6 moli) H-Thr(Bzl)-Pro-NH2-HCl i 2,60 g (6,27 mmola) Z-Glp-OPFP rozpuszczono w 20 mi 5 DMFA, do roztworu wkroplono 0,84 ml (6 mmoli) trójetyloaiminy a po 5 minutach jeszcze 0,84 ml (6 mmoli) trójetyioaminy. Mieszanine mieszano w cia¬ gu 20 minut a potem odparowano w prózni. Po¬ zostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 50 ml 10 chloroformu i roztwór ten wytrzasano dwukrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 10 ml, wysuszono z bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Po- 15 zostaiosc w postaci oleju potraktowano eterem i o- ziebiono powodujac zestalenie produktu. Otrzyma¬ ny w ten sposób produkt w ilosci 2,76 g rozpusz¬ czono w octanie etylu, wyklarowano weglem ak¬ tywnym. Przesacz odparowano a stala bezposta- 20 ciowa spieniona pozostalosc roztarto z eterem. W ten sposób otrzymano 2,47 g Z-G*Lp-Thr{Bzl)-Pro- -NH^, co stanowi 75% wydajnosci teoretycznej.Etap 3. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L-tireony- lO-L-prolinamidu. 25 2,04 g (3,7 mmola) Z-Glp-Thr czono w 40 ml kwasu octowego i do roztworu dodano 0,4 g 10% katalizatora pallad—wegiel ak¬ tywny oraz przez mieszanine przepuszczano gazo¬ wy wodór w ciagu 4 godzin. Po odfiltrowaniu ka- 30 talizatora przesacz odparowano a pozostalosc roz¬ tarto z eterem. W ten sposób otrzymany bezpos¬ taciowy surowy produkt w ilosci 1,31 g umiesz¬ czono w kolumnie chromatograficznej na zelu krze¬ mionkowym w ilosci 30 g (rozmiar czasteczek 35 0,063—0,2 mm) a nastepnie eluowano mieszanina rozpuszczalników (3). Frakcje eluatu zawierajace czysty produkt polaczono i odparowano. Otrzymany jako pozostalosc surowy produkt potraktowano ete¬ rem. Otrzymano 0,72 g Glp-ThrnPro-NH2 o naste- 40 pujacych wlasnosciach: Rf<4 = 0,16, [a] £5 = ^90,0° (c=l, w kwasie octowym), co stanowilo 59,5% wy¬ dajnosci teoretycznej.Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 1,00 (1,0), Thr 0,99 (1,0), Pro 1,03 (1,0). 45 Przyklad X. Wytwarzanie L-fpiroglutamylo-O- IHirz.-butylo-Lnserylo-L-prolioamidu.Etap 1. Wytwarzanie O-IIIrz.-ibutylo-L-serylo-L- -prolinamido-pólszczawianu. 8,0 g (70 mmoli) H-Pro-NH2 i 16,0 g (34,7 mmola) 50 Z-Ser-OBuJ-OPFP rozpuszczono w 120 ml DMFA i roztwór ten po 5 minutach odparowano w próz¬ ni. Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 300 ml chloroformu, roztwór wytrzasano trzy¬ krotnie z normalnym kwasem solnym w ilosci po 55 80 ml, równiez trzykrotnie z normalnym roztwo¬ rem wodoroweglanu sodu w ilosci po 80 ml i w koncu raz z woda w ilosci 80 ml, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Jako pozostalosc otrzymany olej w ilosci 18 g oraz 4,37 g oo (34,7 mmola) dwuwodzianu kwasu szczawiowego rozpuszczono w 300 ml metanolu.Do roztworu dodano 3 g 10% katalizatora pal¬ lad—wegiel aktywny a nastepnie przepuszczano przez roztwór w ciagu godziny gazowy wodór. Po 65 odsaczeniu katalizatora przesacz odparowano a po-127100 19 20 zostalosc roztarto z octanem etylu i wysuszono w prózni. W ten sposób otrzymano 10,6 g H-Ser^Bu)- HPro-NH2-(COOH)2 w postaci bezpostaciowej sub¬ stancji hygroskopijnej, co stanowilo 90% wydaj¬ nosci teoretycznej przeliczonej na Z-Ser^BuJ-OPFP, przy czym Rf<4=0,2& Etap 2. Wytwarzanie benzylokisykarbonylosL-pi- roglutamylo^-IHrz.--butylo-L-serylo-L-(pa:olinaimidu. 6,43 g (18,5 mmola) H-Ser^Bu^Pro-NHs^COOH), i 7,95 g (18,5 mmola) Z-Glp-OPFP rozpuszczono w 80 ml DMFA oraz do roztworu dodano 5,18 ml (37 mmola) trójetyloaminy. Po 5 minutach mieszanine reakcyjna odparowano w prózni a krystaliczna po¬ zostalosc roztiairto z eterem. Otrzymany w ten spo¬ sób surowy produkt w ilosci 9,53 g wykrystalizo¬ wano ze 120 ml metanolu. Otrzymano 7,70 g Z- -Glp-SerCBuJ^Pro-NHj o nastepujacych wlasnos¬ ciach: temperatura topnienia 226—229°C, Rf<3 = =0,40, [aE5 = 7iy6° (c=l, w kwasie octowym), co stanowilo 83% wydajnosci teoretycznej.Sklad C25H34O7N4 o masie molowej 502,57 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 59,75% H 5,82% N 1)1,15% faktyczny: C 59,55% H 6,96% N 11,09% Etap 3. Wytwarzanie L-piroglutamylo-O-IIIrz.- -butylo-L-serylo-L-prolinamidu. 4,02 g (8 mmoM) Z-GIp-SerCBuJ-Piro-NA rozpusz¬ czono w 160 ml metanolu, dodano 0,8 g 10% kata¬ lizatora pallad—wegiel aktywny i w ciagu 30 mi¬ nut przez mieszanine przepuszczano gazowy wodór.Katalizator odsaczono, przesacz odparowano, a po¬ zostalosc w postaci oleju poddano krystalizacji z eterem. Krysztaly odfiltrowano i wysuszono. W ten sposób otrzymano 2,50 g Glp-Ser(tBu)^Pro-NH2 o wlasnosciach: temperatura topnienia 186—187°C, Rf(4)=o,45, [a]» = —60,8° (c=l, w kwasie octo¬ wym), co stanowilo 85% wydajnosci teoretycznej.Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 1,03 (1,0), Ser 1,00 (1,0), Pro 1,00 (1,0).Sklad C^H^O^ o masie molowej 368,44 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 55,42% H 7,66% N 15,21% faktyczny: C 55,07% H 7,61% N 14,94% Przyklad XI. Wytwarzanie L^piroglutamyio- -D-leucylo-L-prolinamiriu.Etap 1. Wytwarzanie Illrz.-ibutyloksyfcarbonylo- -D-leucylo-LHpieciofluorofenyloestTU. 4,62 g (20 mmoli) BOC-D-Leu-OH i 4,23 g (22 mmole) PFPOH rozpuszczono w 50 nil octanu etylu a do mieszanego i oziebionego roztworu dodano 4,12 g (20 mmoli) DCC. Mieszanine reakcyjna mie¬ szano w ciagu godziny w kapieli lodowatej, po¬ tem wydzielony dwucykloheksylamocznik odsaczo¬ no a przesacz odparowano. Jaiko pozostalosc otrzy¬ many olej rozpuszczono w 100 ml n-heksanu, roz¬ twór wstawiono do lodówki na godzine i ponow¬ nie odsaczono wytracony dwucykloheksylomocznik.Przesacz wstrzasano pieciokrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 50 ml i dwukrotnie z woda w ilosci po 50 ml, wysuszo¬ no w obecnosci siarczanu sodu i odparowano.Jako pozostalosc otrzymany olej poddano krys¬ talizacji w nocy. W ten sposób otrzymano 7,0 g BOC-D-Leu-OPFP o wlasnosciach: temperatura topnienia 53—$5°C, Rfa= +31?7° (c=l, w octa¬ nie etylu), co stanowilo 88% wydajnosci teoretycz¬ nej.Sklad Cl7H2o04NFB o masie molowej 307,3i5'byl nastepujacy: 5 wedlug wyliczenia: C 51,39% H 5,07% N 3,53% F 23,91% faktyczny: C 51,51% H 4,68% N 3,66% F 23,05% Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku D-leucylo-L- 10 -prolinamidu. 3,42 g (30 mmoli) H-Pro-NH2 i 60,0 g (15 mmoli) BOC-D-Leu-OPFP rozpuszczono w 60 ml DMFA i po 5 minutach odparowano w prózni. Pozosta¬ losc rozpuszczono w 100 ml chloroformu a potem 15 wstrzasano roztwór dwukrotnie z normalnym roz¬ tworem kwasu solnego w ilosci po 20 ml, trzy¬ krotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 20 ml i raz z woda w ilosci 20 ml, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu 20 i odparowano. Olejowa pozostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 10 ml octanu etylu i do roztworu tego dodano 15 ml 4N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po godzinie mieszanine reakcyjna rozcienczono eterem a otrzymany osad odsaczono 25. w prózni i wysuszono nad bezwodnym wodorotlen¬ kiem sodu. W ten sposób otrzymano 3,66 g HhD- -Deu-Pro-NH2'HCl, co stanowilo 92,5% wydajnosci przeliczonej na BOC-D-Leu-OPFP, przy czym Rf<4=0,26. 80 Etap 3. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-pi- roglutamyloHD-ieucylo-L-prolinamidu. 3,66 g (13,9 mmola) H-D-Deu-Pro-NH2-HiCl i 6,43 g (15 mmoli) Z-Glp-OPFP rozpuszczono w 50 ml DMFA, do roztworu podczas mieszania : chlodzenia 85 dodano 1,95 ml (13,9 mmola) trójetyloaminy a po 5 minutach mieszania jeszcze 1,95 ml (13,9 mmola) trójetyloaminy. Mieszanine mieszano jeszcze w cia¬ gu 20 minut a potem odparowano w prózni.Pozostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 120 40 ml chloroformu i roztwór ten wytrzasano trzy¬ krotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 30 ml, równiez trzykrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 30 ml i w koncu z woda w ilosci 30 ml, wysuszono z 45 bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Pozo¬ stalosc w postaci oleju potraktowano eterem po¬ wodujac jej wykrystalizowanie. Otrzymany w ten sposób surowy produkt w ilosci 6 g wykrystalizo¬ wano z 30 ml octanu etylu. Otrzymano 5,48 g 50 Z-Glp-D-Leu-NHj, co stanowi 77% wydajnosci teo¬ retycznej. Wlasnosci produktu byly nastepujace: temperatura topnienia 189—194°C, R£C3)=0,48 [a] g = —33,2° (c=l, w kwasie octowym).Etap 4. Wytwarzanie Lipiroglutamylo-D4eucylo- 55 -Lnprolinamidu. 3,78 g (8 mmoli) Z-Glp-DnLeu-Pro-NiHj rozpusz¬ czono w 150 ml metanolu. Potem dodano do roz¬ tworu 0,8 g 10% katalizatora pallad-^wegiel ak¬ tywny i w ciagu godziny przepuszczano przez roz- 60 twór gazowy wodór. Katalizator odsaczono a prze¬ sacz odparowano. Pozostalosc roztarto z eterem. W ten sposób otrzymany surowy pordukt w ilosci 2,5 g rozpuszczono w wodzie, wyklarowano weglem aktywnym i przezroczysty roztwór liofilizowano.W Otrzymano 2,35 g Glp-D-I^eu-Pro-NH, 0 wlasmos-21 127 100 22 ciach: Rf<4=0,48, [a]25 = -^83,3° (c=l, w kwasie octowym), co stanowilo 87% wydajnosci teoretycz¬ nej.Przyklad XII. Wytwarzanie L-piroglutamylo- -L-leucylo-L-prolino-etyloamidu.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku L-leucylo- -L-prolio-etyloamidu. 1,67 g (7,2 mimola) H-Pro-NH-Et.(COOH)2 rozpro¬ wadzono w 20 ml octanu etylu i do zawiesiny do¬ dano 20 ml (14,4 mniola) trójetyloaminy i 2,38 g (6 mmoli) BOC-Leu-OPFP. Po 5 minutach roztwór wytrzasano dwukrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 5 ml, nastepnie trzy¬ krotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 5 ml a w koncu raz z 5 ml wody, wysuszono w obecnosci bezwodnego siarcza¬ nu sodu oraz odparowano.Oleista potostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 10 -ml 5N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Reakcyjna mieszanine po 20 minutach roz¬ cienczono eterem, otrzymany osad przesaczono i wysuszono w prózni nad bezwodnym wodorotlen¬ kiem sodu. W ten sposób otrzymano 1,46 g hy- groskopijnego H-Leu-Pro-NH-Et-HCl, co stanowi 831% wydajnosci teoretycznej przeliczonej na BOC- -Leu-OPFP, przy czym Rf<4= 0,43.Etap 2. Wytwarzanie banzyloksykarbonylo-L-pi- roglutamylo-L-leucylo-L-proliinamidu. 1,17 g (4 mmole) H-Leu-Pro-NH-Et-HCl i 1,72 g (4 mmole) Z-Glp-OPFP rozpuszczono w 15 ml DMFA i do mieszaniny 'dodano 0,56 ml (4 mmole) trójetyloaminy. Do mieszaniny reakcyjnej po 5 minutach dodano jeszcze 0,56 ml (4 mmole) trój¬ etyloaiminy i mieszanine odparowano w prózni.Pozostalosc w postaci oleju rozpuszczono w 40 ml chloroformu roztwór wytrzasano dwukrotnie z normalnym roztworom kwasu solnego w ilosci po 10 mlv trzykrotnie, z normalnym roztworem wodo¬ roweglanu sodu w ilosci po 10 ml i w koncu raz z woda w ilosci 10 ml, wysuszono w obecnosci bez¬ wodnego siarczanu sodu i odparowano. Pozostalosc roztarto z n-heksanem i odsaczono. W ten sposób otrzymano 1,61 g bezpostaciowego Z-Glp-Leu-Pro- -NH-Et o wlasnosciach: Rf<3=0,50, [ (c=l, w kwasie octowym), co stanowilo 80,5% wydajnosci teoretycznej.Etap 3. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L-leucylo- -L-prolino-etyloamidu. 1,07 g (2,14 mimola) Z-Glp-Leu-Bro-NH-Et rozpusz¬ czono w 30 ml wody, dodano 0,25 g 10°/o katali¬ zatora pallad—wegiel aktywny i nastepnie do mie¬ szaniny doprowadzano w ciagu 1,5 godziny gazowy wodór. Wówczas odsaczono katalizator, przesacz od¬ parowano a pozostalosc rozpuszczono w 20 ml chlo¬ roformu i powstaly roztwór wysuszono w obec¬ nosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowano.Spieniona, zestalona pozostalosc roztarto z mie¬ szanina eteru i n-heksanu. W ten sposób otrzy¬ mano 0,52 g Glp-Leu-Pro-NH-Et o wlasnosciach: Rf<4=0,57, [ towym), co stanowilo 66% wydajnosci teoretycznej.Przyklad XIII. Wytwarzanie L-piroglutamylo- -L-Leucylo-L-prolino-n-decyloamidu.Etap 1. Wytwarzanie benzyloksykarfoonylo-L-pro- lino-n^decyloamidu. 5,0 g (20 mmoli) Z-Pro-OH rozpuszczono w 50 ml DMFA, do roztworu tego dodano 2,8 ml (20 mimoli) 5 trójetyloaminy i ochlodzono do temperatury —\10°C.Nastepnie podczas mieszania w tej temperaturze skroplono najpierw 2,8 ml (21,5 mmola) izofoutylo- estru kwasu chloroweglowego i po 10 minutach wkroplono do niego w tej samej temperaturze 4,4 10 ml (22 mmole) n-decyl-aminy.Mieszanine mieszano jeszcze pól godziny w tem¬ peraturze 0°C i w koncu pozostawiono ja na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Otrzymana za¬ wiesine odsaczono, przesacz odparowano a pozo- w stalosc rozpuszczono w 100 ml octanu etylu. O- trzymany roztwór wytrzasano czterokrotnie z nor¬ malnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 50 ml, dwukrotnie z normalnym roztworem wodoro¬ weglanu sodu po 50 ml i w koncu raz z woda w 20 ilosci 50 ml, wysuszono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowano w prózni.Jako pozostalosc otrzymany olej doprowadzono do krystalizacji za pomoca n-heksanu. W ten sposób otrzymano 5,43 g Z-Pro-NH-Ci0H2i o wlasnosciach: 25 temperatura topnienia 78—80°C, Rf<2=0,75, co sta¬ nowilo 70% wydajnosci teoretycznej.Etap 2. Wytwarzanie L-prolino-n-decyloamino- -pólszczawdanu. 5,0g (12,9 mmola) dwuwodzdanu kwasu szczawio- 30 wego i 2,02 g (16 mmola) rozpuszczono w 100 ml metanolu, do roztworu dodano 0,9 g 10% katali¬ zatora pallad—wegiel aktywny oraz przez miesza¬ nine przepuszczano gazowy wodór w ciagu 2 go¬ dzin. 35 Po zakonczeniu uwodornienia mieszanine reak¬ cyjna podgrzano, katalizator oddzielono za pomoca filtrowania, zas przesacz odparowano. Krystaliczna pozostalosc roztarto z eterem i odsaczono. W ten sposób otrzymano 3,9 g HHPro-NH-CioH21-(COOH)2 40 o wlasnosciach: temperatura topnienia 152^-il540C, Rf(3) = 0,16, co stanowilo 88% wydajnosci teoretycz¬ nej.Etap 3. Wytwarzanie chlorowodorku L-leucylo- -L-prolino-n-decyloamidu. 45 3,44 g (10 mmoli) HHPro-NH-Ci0H21-'(COOH)2 i 2,0 g (5 mmoli) BOC-Leu-OPFP rozpuszczono w 30 ml DMFA i do roztworu dodano 2,8 ml (20 mmoli) trójetyloaminy. Po 5 minutach mieszanine odparo¬ wano w prózni a pozostalosc rozpuszczono w 50 50 ml n-heksanu a potem wstrzasano roztwór piecio¬ krotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 30 ml, trzykrotnie z normalnym roztwo¬ rem wodoroweglanu sodu w ilosci po 30 ml i raz z woda w ilosci 30 ml, wysuszono nad bezwodnym 55 siarczanem sodu i odparowano.Olejowa pozostalosc po odparowaniu rozpusz¬ czono w 10 5N roztworu kwasu solnego w oc¬ tanie etylu. Po 30 minutach mieszanine odparowa¬ no. Spieniony bezpostaciowy osad w prózni roz- 6° tarto z n-heksanem, odsaczono w prózni i wysu¬ szono nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymano 1,05 g H-Leu-ProHNH2-CidH2r •HC1, co stanowilo 60% wydajnosci przeliczonej na BOC-Leu-OPFP, przy czym Rf<3=0,17. 65 Etap 4. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-pi-23 127 100 24 roghitamylo-L-leucylo-L-prolino-n^decyloamidu. 1,03 g <2,55 mmola) H-Leu-Pro-NH-CioH21-HCl roz¬ puszczono w 10 mi DMFA, do roztworu dodano 0,36 ml (2,55 mmola) krójetyloaminy i 1,1 g (2,55 mmola) Z-Glp-OPPP a po 5 minutach mieszania jeszcze 0,36 ml (2,55 mmola) trójetyloaminy. Mie¬ szanine mieszano jeszcze w ciagu 20 mdnuit a po¬ tem odparowano w prózni. Pozostalosc po odpa¬ rowaniu rozpuszczono w 20 ml chloroformu i roztwór ten wytrzasano pieciokrotnie z normalnym roztwo¬ rem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 10 ml iw koncu z woda w ilosci 10 ml, wysuszono z bezwodnym siarczanem sodu i odpa¬ rowano.Pzostalosc w postaci oleju potraktowano ete¬ rem powodujac jej wykrystalizowanie. Otrzymany w ten sposóib produkt odsaczono. Otrzymano 1,22 g Z-Glp-Leu-Pro-NH-CioHa, co stanowilo 78Vt wy¬ dajnosci teoretycznej. Wlasnosci produktu byly nas¬ tepujace: temperatura topnienia 108—dO0°C, Rf(2= =0,50, [a]25 = —74,5° (c=l, w kwasie octowym).Etap 5. Wytwarzanie L-ptiroglutamylo-L-leucylo- -L-prolino-n-decyloaimidu. 1,22 g (2 mimole) Z-Glp-Leu-Pro-NH-CiJH21 roz¬ puszczono w 30 ml metanolu, dodano 4 g 10f/o katalizatora pallad—wegiel aktywny oraz przepusz¬ czano przez mieszanine w ciagu 30 minut gazowy wodór. Katalizator odfiltrowano a przesacz odpa¬ rowano. Pozostalosc po odparowaniu w postaci ole¬ ju doprowadzono do krystalizacji z n-heksanem. W ten sposób otrzymany surowy produkt w ilosci 0,85 g wykrystalizowano z 4 ml octanu etylu. Otrzy¬ mano 0,74 g Glp-Leu-Pro-NH-CioH2i o wlasnos¬ ciach: temperatura topnienia 140—il4)l°C, Rf<4=0,76, [a]25 = —71,3° (c—1, w kwasie octowym), co sta^ nowiio 77% wydajnosci teoretycznej.Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 0,97 (1,0), Leu 1,00 (1,0), Pro 1,01 (1,0).Przyklad XIV. Wytwarzanie L-pdroglutamylo- -L-Ieucylo-L-prolino-/2-dwiumetyloaimino-etylo/- -amidu.Etap 1. ^Wytwarzanie IIIrz.-butyloksykarbonylo- -L-pirolino-y!2-dwumetyloaniino-etylo/-aimidu. 11,43 g (30 mmoli) BOC-Pro-OPFP rozpuszczono w 100 ml eteru i do roztworu dodano N,N^dwume- tyloamino-etyloamine w ilosci 6,54 ml (60 mmoli).Roztwór pozostawiono na 10 minut a potem wy¬ trzasano go trzykrotnie z woda w ilosci po 30 ml, wodne fazy polaczone, doprowadzono do wartosci pH1—10 przez dodatek stalego weglanu sodu a na¬ stepnie czterokrotnie ekstrahowano go octanem etylu.Oddzielone organiczne fazy polaczono z pierwot¬ nym organicznym roztworem przemyto 20 ml wody, wysuszono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowano. Jako pozostalosc otrzymany olej wy¬ krystalizowal podczas odstania. W ten sposób o- tnzymano 6,71 g BOC-Pro-NH-CHgOHj^NCCHj^, co stanowilo 7,85% wydajnosci teoretycznej, przy czym Rf«=0,23.Etap 2. Wytwarzanie dwuchlorowodorku L-leucy- lo-L-proliino^2-dwumetyloamino^etylO(/-amidu. 6,71 g (23,5 mmola) BOC-Pro-NH-CHj-CHi-INKCHsfe potraktowano w ciagu 30 minut 5 kwasu solnego w octanie etylu w ilosci 30 ml a petem mieszanine odparowano. Jako pozostalosc o- trzymany olej rozpuszczono w 50 ml chloroformu i dodano do niego 2,8 ml (20 mmoli) trójetyloami- 5 ny. Do otrzymanego klarownego roztworu dodano 6,74 g (17 mmoli) BOC-Leu-OPFP i po godzinie mieszania wkroplono jeszcze 2,8 ml (20 mmoli) trójetyloaminy.Mieszanine pozostawiono na noc i nastepnego 10 dnia odparowano. Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 50 -ml wody, przez dodatek stalego weglanu sodu doprowadzono wartosc pH=10 i o- chroniony dwupeptyd ekstrahowano z wodnej fazy za pomoca octanu etylu. Oddzielona faze wysu- *• szono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowano.Jako pozostalosc otrzymany olej potraktowano w ciagu godziny 5N roztworem kwasu solnego w oc¬ tanie etylu, potem mieszanine reakcyjna odpairo- 10 wano i pozostalosc roztarto z eterem. Po odfiltro¬ waniu wysuszono bezpostaciowy, staly higroskopij- ny produkt w prózni i wysuszono nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymano 4.5 g (12,1 mmola) H-Leu^Pro-NH-CHt-CHi-NfCHj),- 25 -2HC1, przy czym Rf<*=0,05.Etap 3. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L-leucylo- -Li-proliino-/2-dwumetyloamino-etylo/-amidu. 2.6 g (7 mmoli) H-Leu-Ptro-NH-CI^-CHj-N^Ha)!- 30 -2HC1 rozpuszczono w 30 ml DMFA i do roztworu dodano 1,96 ml (14 mmoli) trójetyloaminy. Otrzy¬ many osad odsaczono i przesacz wkroplono pod¬ czas mieszania i oziejbiania do roztworu 3,20 g (7,7 mmola) Z-Glp-OPFP w 10 ml DMFA. Po zakon- 35 czeniiu dodawania pozostawiono mieszanine reak¬ cyjna na 4 godziny i potem odparowano w prózni.Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 50 ml wody, zakwaszono roztwór stezonym kwa¬ sem solnym do wartosci pH=3 i trzykrotnie wy- ^ trzasano z octanem etylu w ilosci po 20 ml.Potem przez dodanie stalego weglanu sodu alka- lizowano ten roztwór wodny do wartosci pH=ll0 i ekstrahowano go pieciokrotnie octanem etylu w ilosci po 30 ml. Organiczne fazy polaczono, wysu- 45 szono w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i od¬ parowano. W ten sposób otrzymany oleisty chro¬ niony dwupeptyd w ilosci 3,05 g (5,6 mmola) roz¬ puszczono w 60 ml wody, do roztworu dodano 5,6 ml normalnego roztworu kwasu solnego i 0,6 g 50 10% katalizatora pallad—wegiel aktywny, po czym przepuszczano przez roztwór w ciagu 30 minut ga¬ zowy wodór. Po odfiltrowaniu katalizatora odparo¬ wano przesacz a jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w mieszaninie 50 ml chloroformu i w 20 ml roztworu wodoroweglanu sodu. Fazy zostaly oddzielone, a faza z chloroformem zostala wysu¬ szona w obecnosci bezwodnego siarczanu sodu i odparowana.Pozostalosc po odparowaniu roztarto z n-heksa- 60 nem i odsaczono. W ten sposób otrzymany bezpos¬ taciowy surowy produkt w ilosci 2,0 g rozpusz¬ czono w wodzie, wyklarowano weglem aktywnym i przezroczysty roztwór liofilizowano. Otrzymano 1,72 g Glp-LeuHPro-NH-CH2-CH2-N(CH3)s o wlas- •s nosoiach; R*<4=0?06, [a]jj - —71,7* (c=l, w kwa-127100 25 26 sie octowymi, co stanowilo 60% wydajnosci teore¬ tycznej.Analiza zawartosci aminokwasów: GUu 1,02 (1,0), Leu 1,00 (1,0), Pro 1,03 (1,0).Przyklad XV. Wytwarzanie amidu kwasu L- -pirogiutamylo-L-hiiBtydylo-D-pipekolinowego.Etap 1. Wytwarzanie amidu kwasu benzyloksy- karbonylo-D-pipekolinowego. 13,15 g (50 mimoli) Z-DnPip-OH rozpuszczono w 100 ml octanu etylu i dodano 7,0 ml (50 mmoli) trójetyloaiminy. Mieszanine ochlodzono do tempe¬ ratury —20°C i w tej temperaturze podczas mie¬ szania wkroplono do niej 6,5 ml (50 mmoli) izo- butyloesfcru kwasu chlorowejglDwego* Po dalszych 15 minutach mieszania w temperaturze —10°C przez mieszanine przepuszczano w ciagu póltorej godziny gazowy amoniak. Po odfiltrowaniu osadu, przesacz wytrzasano z normalnym roztworem kwa¬ su solnego, potem z normalnymi roztworem wo¬ doroweglanu sodu i w koncu z woda, wysuszo¬ no w obecnosci siarczanu sodu i odparowano. Po¬ zostalosc po odparowaniu wykrystalizowano z mie¬ szaniny octanu etylu i eteru. W ten sposób otrzy¬ mano 11,5 g Z-D-Pip-NHa o wlasciwosciach: tem¬ peratura topnienia 114—115°C, Rf<*=0,50, [a]g = = —71,7° (c—1, w kwasie octowym), co stanowilo 88f/t wydajnosci teoretycznej.Sklad Ci^HiiOjNi o masie molowej 262,30 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: N lO^/o faktyczny: N 10,63°/t Etap 2. Wytwarzanie kwasu D-pipekolinowego. 3,93 g (15 mmoli) Z-D-Pip-NHj rozpuszczono w 75 ml metanolu, do roztworu dodano 0,5 g 10% kata¬ lizatora pallad—wegiel aktywny oraz przepuszcza¬ no przez mieszanine gazowy wodór w ciagu go¬ dziny. Po odsaczeniu katalizatora przesacz odpa¬ rowano a pozostalosc roztarto z eterem. W ten spo¬ sób otrzymano 1,70 g H-D-Pip-NH2 o wlasnosciach: temperatura topnienia 161—d63°C, Rf<4^0,10, [ot]g = = +31,0° (c=l, w metanolu), co stanowilo 90% wydajnosci teoretycznej.Etap 3. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-glu- tamylo-L-histydynoHhydirazydku. 71,0 g (0465 mola) Z-Gln-His-OMe rozpuszczono w 700 ml DMFA i do roztworu dodano 33,6 ml (0,495 mola) wodzianu hydrazyny. Mieszandne re¬ akcyjna pozostawiono na 3 dni a potem rozcien¬ czono ja 600 ml octanu etylu oraz pozostawiono na noc w lodówce. Otrzymany w ten sposób pól¬ produkt w ilosci 71,65 g wykrystalizowano z 1800 mi metanolu. Otrzymano 55,1 g Z-Gln-His-N^Hs o wlasnosciach: temperatura topnienia 196^2O0°C, Rf(4)=o^fi, co stanowilo 76f/e wydajnosci teoretycz¬ nej.Sklad CiftH^sN? o masie molowej 431,40 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 52,90^/o H 5,84°/o N 22,72p/o faktyczny: C 52,21«/o H 5,73*/o N 2a,78f/o Etap 4. Wytwarzanie amidu kwasu benzyloksy- kaaribonylo^^utaminylo-L-histydylo-iD-pipekolino- wego. 5,39 g (12,5 mmola) Z-Gln-HLs-iNdHa rozprowadzo¬ no w 100 ml DMFA i do zawiesiny dodano 4,6 ml (37,6 mmola) 8,1N roztworu kwasu solnego w dwuoiksanie. Otrzymany roztwór ochlodzono do temperatury —20°C i podczas mieszania w tempe¬ raturze —X5°C wkroplono do niego 1,63 ml (13,7 mmola) Illrz.-azotynu butylu. Mieszano mieszanine & reakcyjna w ciagu 20 minut w temperaturze—il0°C, do której nastepnie wkroplono 3,5 ml (25 mmoli) trójetyloaiminy. Do mieszaniny dodano roztwór 1,57 g (12,5 mmola) H-D-Pip-NHa i w koncu dodano jeszcze 1,75 ml (12,5 mmola) trójetyloaminy. Po za- io konczeniu tego dodawania mieszanine reakcyjna mieszano jeszcze godzine w temperaturze —10°C a nastepnie pozostawiono ja na noc w lodówce w temperaturze 2°C. Nastepnego dnia wydzielony osad odfiltrowano, przesacz odparowano w prózni a 15 bezpostaciowa pozostalosc roztarto z octanem ety¬ lu. Otrzymany w ten sposób surowy produkt u- mieszczono w kolumnie chromatograficznej na zelu krzemionkowym a nastepnie eluowano mieszanina rozpuszczalników (2). Frakcje zawierajace czysty 20 produkt zebrano i odparowano a pozostalosc roz^*" tarto z eterem i odfiltrowano. Otrzymano 2,76 g bezpostaciowego Z-Gln-His-Pip-NHj, co stanowilo 426/o wydajnosci teoretycznej, przy czym Ri(4)=0,10.Etap 5. Wytwarzanie amidu kwasu L-pirogluta- 25 mylo-L-histydylo -D-pipekolinowego. 2,63 g (5 mmoli) Z-Gln-His-D-Pip-NH2 rozpuszczo¬ no w 50 ml kwasu octowego, do roztworu dodano 0,5 g iOtyo katalizatora pallad—wegiel aktywny i przez roztwór przepuszczano gazowy wodór w cia- 30 gu 1 godziny. Po odsaczeniu katalizatora przesacz podgrzano do temperatury 60—70°C, utrzymywano go w tej temperaturze i nastepnie odparowano w prózni.Pozostalosc rozpuszczono w wodzie, roztwór po¬ traktowano zywica dowex-2 z grupa OH w piers¬ cieniowym zwiazku. W ten sposób otrzymany su¬ rowy produkt umieszczono w kolumnie chromato¬ graficznej na zelu krzemionkowym oraz eluowano mieszanina rozpuszczalników (1). Frakcje zawiera¬ jace czysty produkt polaczono i odparowano, po¬ zostalosc rozpuszczono w wodzie, roztwór wykla- rwano weglem aktywnym i przezroczysty roztwór odparowano. Bezpostaciowa pozostalosc wysuszono w prózni nad pieciotlenkiem fosforu.'Otrzymano 45 704 mg Glp-Has-D-Pip-NH2 o wlasnosciach: Rf(*= =0,10, Mg = +il6,0° (c=l, w wodzie), co sta¬ nowilo 51l*/o wydajnosci teoretycznej.Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 1,03 (1,0), M His, 1,00 (1,0), Pip 0,96 <1).Przyklad XVI. Wytwarzanie L-piroglutamylo- -L-histydylo-L-homoprolinasmidu. , Etap 1. Wytwarzanie IIIrz.Hbutyloksykanbonylo- -L^histydylo-L-homoprolinamidu. » 2,29 g (10 mmoli) BOC-HPro-OH rozpuszczono w 30 ml octanu etylu, do roztworu dodano 1,4 ml (10 mmoli) trójetyloaminy, potem mieszanine o- chlodzono do temperatury —10°C i wkroplono do niej w tej temperaturze 1,3 ml (10 mmoli) estru 60 izobutylowego kwasu chloroweglowego. Po 15 mi¬ nutach mieszania do mieszaniny reakcyjnej dopro¬ wadzono w ciagu pól godziny amoniak gazowy w temperaturze —<10°C. Nastepnie mieszanine pozo¬ stawiono na 2 godziny w temperaturze od 0 do •5 5°C. Osad odfiltrowano, przesacz odparowano i jako27 127 100 28 pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 30 ml chloroformu.Roztwór wytrzasano dwukrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, rów¬ niez dwukrotnie z normalnym roztworem wodo¬ roweglanu sodu w ilosci po 10 ml i w koncu z woda w ilosci 10 ml, wysuszono w obecnosci bez¬ wodnego siarczanu sodu i odparowano. Jako po¬ zostalosc otrzymany olej doprowadzono do krystali¬ zacji za pomoca n-heksanu. Otrzymany w ten spo¬ sób pólprodukt w ilosci 1,96 g wykrystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru. W koncu otrzy¬ mano 1,78 g BOC-HPro-NH2 o wlasnosciach: tem¬ peratura topnienia 138—140°C, Rf<2=0,43, [a] 25 = = —24,8-5° (c=l, w kwasie octowym), co stano¬ wilo 78% wydajnosci teoretycznej.Sklad CuH^O^Nj o masie molekularnej 228,29 byl nastepujacy: wedlug wyliczenia: C 57,87% H 8,83°/o N 12,27% faktyczny: C 57,60% H 8,80% N 12,11% Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku L-homopro- linamidu- 1,6 g (7 mmoli) BOC-HPro-NH2 rozpuszczono w 10 ml podgrzewanego octanu etylu, roztwór ochlodzo¬ no do temperatury pokojowej i dodano do niego 10 ml 6N-roztworu kwasu solnego w octanie etylu.Mieszanine reakcyjna pozostawiono na godzine, pózniej rozcienczono eterem, osad roztarto i odsa¬ czono. W ten sposób otrzymano 1,05 H-HPro-NHa* *HC1 o wlasnosciach: temperatura topnienia 178— 180°C, Rf<6=0,32, [a]25 = +26,2° (c=l. w meta¬ nolu), co stanowilo 91% wydajnosci teoretycznej.Etap 3. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-glu- tamdnylo-L-histydyio-L-homoprolinamidu. 5,39 g (12,5 mmola) Z-Gln-His-N2H3 (patrz przyk¬ lad XV etap 3) rozprowadzono w 100 ml DMFA i do zawiesiny dodano 4,6 ml (37,5 mmola) 8,IN roztworu kwasu solnego w dwuoksanie. Otrzymany roztwór oziebiono do temperatury —20°C i potem w temperaturze —15°C do mieszanego roztworu wkroplono 1,63 ml (13,7 mmola) Illrz.-azotynu bu¬ tylu. Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu 20 minut w temperaturze —10°C a potem dodano do niej 3,5*ml (25 mmoli) trójetyloaminy. Tymcza¬ sem 2,07 g (12,5 mmola) H-BPro-NHa-HO rozpusz¬ czono w 10 ml DMFA i do roztworu tego dodano 1,75 ml (12,5 mmola) trójetyloaminy. Po odsacze¬ niu osadu otrzymany roztwór wkroplono do po¬ wyzej wspomnianego kwasowego roztworu utrzy¬ mywanego w temperaturze —10°C i w koncu, do mieszaniny dodano jeszcze 1,75 ml (12,5 mmola) trójetyloaminy.Mieszanine reakcyjna w koncu mieszano jeszcze godzine w temperaturze —'10°C a nastepnie pozo¬ stawiono ja na noc w lodówce w temperaturze 2°C.Nastepnego dnia wydzielony osad odfiltrowano, przesacz odparowano w prózni a bezpostaciowa po¬ zostalosc roztarto z octanem etylu. Otrzymany w ten sposób surowy produkt umieszczono w kolum¬ nie chromatograficznej na zelu krzemionkowym a nastepnie eluowano mieszanina rozpuszczalników (2). Erakcje zawierajace czysty produkt zebrano i odparowano a pozostalosc roztarto z eterem. Otrzy¬ mano 2,35 g Z-Gln-His-HPro-NH2, co stanowilo 36% wydajnosci teoretycznej, przy czym Rf(4=0,30.Etap 4. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L-histydy- lo-L-homoprolinamidu. 2,1 g (4 mmola) Z-Gln-His-HPro-NH2 rozpuszczono w 40 ml kwasu octowego, "do roztworu tego doda¬ no 0,4 g 10% katalizatora pallad—wegiel aktywny i przez mieszanine przepuszczano gazowy wodór w ciagu godziny. Katalizator nastepnie odsaczono, przesacz podgrzano do temperatury 60—70°C i po¬ tem odparowano w prózni.Jako pozostalosc otrzymany pólprodukt zostal potraktowany zywica jonowo-wymienna w sposób opisany w przykladzie XV etapie 5 oraz oczyszczo¬ no w kolumnie chromatograficznej na zelu krze¬ mionkowym. Otrzymano 618 mg Glp-His-HPro-NH2 o nastepujacych wlasnosciach: Rf<4)= 0,08 [a] 25 = —24,0° (c=l, w metanolu), co stanowilo 56% wydajnosci teoretycznej.Analiza zawartosci aminokwasów: Glu 0,97 (1,0), His 1,00 (1,0), HPro 0,91 (1,0).Zastrzezenia patentowe 25 1. Sposób wytwarzania nowych trójpeptydoami- dów o ogólnym wzorze Glp-X-Y-NH-A, w którym X oznacza grupe L-norleucylowa, L-leucylowa, L- -norwalilowa, D-leucylowa, L-prolilowa, L-2-ami- nobutyrylowa, L-walilowa, L-treonylowa, L-izoleu- 30 cylowa, L-2-aminodekanoilowa, L-cykloheksyioala- nilowa lub L-IIIrz. butyloserylowa, a Y oznacza grupe L-prolilowa, albo w którym X oznacza gru¬ pe L-histydylowa, a Y oznacza grupe L-homopro- lilowa lub D-pipekolilowa, zas A oznacza atom 35 wodoru, grupe alkilowa o l^lfl atomach wegla lub grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla podsta¬ wiona rodnikiem dwumetyloaminowyim, przy czyim gdy X oznacza grupe L-leucylowa, wówczas A ma znaczenie inne niz atom wodoru, jak równiez 40 terapeutycznie stosowanych kompleksów tych. zwiazków, znamienny tym, ze amid aminokwasu o wzorze ogólnym Y-NiH-A, w którym Y i A maja powyzej podane znaczenie, N-acyluje sie reaktyw¬ na pochodna aminokwasu o wzorze X-OH, w któ- 45 rym X ma wyzej podane znaczenie, korzystnie estrem pieciofluorofenylowym, przy czym grupa aminowa tej reaktywnej pochodnej aminokwasu jest ewentualnie ochroniona i otrzymany dwupep- tydoamid N-acyluje sie kwasem L-piroglutamino- 50 wym wzglednie chroniona i/lub aktywowana jego pochodna, ewentualnie oddziela sie grupy ochron¬ ne, i otrzymany zwiazek ewentualnie przeprowa¬ dza sie w terapeutycznie stosowany kompleks. 2. Sposób wytwarzania nowych trójpeptydoami- 55 dów o ogólnym wzorze Glp-X-Y-NH-A,w którym X oznacza grupe L-norleucylowa, L-leucylowa, L- -norwalilowa, D-leucylowa, L-prolilowa, L-2-aimi- nobutyrylowa, L-walilowa, L-treonylowa, L-izoleu- cylowa, L-2-aminodekanoilowa, L-cykloheksyloala- ^ nilowa lub L-IIIrzed. butyloserylowa, a Y oznacza grupe L-prolilowa ,albo w którym X oznacza gru¬ pe L-histydylowa a Y oznacza grupe L4iomoproli- lowa lub D-pipekolilowa, zas A oznacza atom wo¬ doru, grupe alkilowa o 1—10 atomach wegla lub grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla podstawiona 65 'odnifciem dwumetyloaiminowym, przy czym gdy X;127 100 29 30 oznacza grupe L-leucylowa wówczas A ma zna¬ czenie inne niz atom wodoru, jak równiez tera¬ peutycznie stosowanych kompleksów tych zwiaz¬ ków, znamienny tym, ze amid aminokwasu o ogól¬ nym wzorze Y-NH-A, w którym Y i A maja wy¬ zej podane znaczenie, N-acyluje sie reaktywna pochodna aminokwasu o wzorze X-OH, w którym X ma wyzej podane znaczenie, korzystnie estrem pieciotfluorofenylowyim, przy czym grupa aminowa tej reaktywnej pochodnej aminokwasu jest ewen¬ tualnie ochroniona, i otrzymany dwupeptydoamid N^acyluje sie kwasem Liglutaimiinowym i w otrzy¬ manym trójpeptydoamidzie cyklizuje sie grupe glutaminyIowa do grupy piroiglutamylowej, po czym ewentualnie oddziela sie grupy ochronne i otrzy¬ many zwiazek ewentualnie przeprowadza sie w terapeutycznie stosowany kompleks. 5 PL PL PL PL PL PL PL PL