SU1048702A1 - Циклический аналог энкефалина, обладающий пролонгированной анальгетической активностью - Google Patents

Abstract

Циклический аналог энкефалина формулы NHj- СН-СО-Туг -DMet- (ly -Phe -Рго И CHrCHrCHf-CHrNH- обладающий пролонгированной анальгетической активностью. г 1 00 О ю

Description

Изобретение относитс  к новому биологически активному соединению циклическому аналогу энкефалина, обладающему пролонгированной анальгетической активностью, которое может найти применение в медицине.

Известны природные метионин- и лейцин - энкефалины (HTyf-Gly-ClyPhe-Met-OH- и HTyr-Gly-Gly-Phe-LeuОН соответственно), про вл ющие морфиноподобную активность в опытах на специфических модел х опиатного рецептора , а также подавл ющие стереоспецифическое св зывание с рецептором опиатного антагониста налоксона в гомогенйтах мозга., Однако метионин- и лейцин- энкефа лины обладают слабой и кратковременной (5-15 мин) анальгезией при внутрижелудковом введении в мозг мыши. Известны близкие структурные аналоги описываемых соединений - циклические аналоги энкефалина, включающи в цикл 18 атомных группировок формул pCHrCO-Tyr-Wa-Gly-Phe-Mel I--I NHCHf- CHf Tyr-Ola- My-Phe - Mel Однако эти соединени  показьшаю полное отсутствие специфической активностиiэнкефалина . Цель изобретени  - расширение арсенала средств воздействи  на живой организм. Поставленна  цель достигаетс  описываемым циклическим аналогом энкефалина формулы NHj- СН- СО Т9Г (1у -Phe - РгоCHrCHz-CHg-CHrNH обладающим пролонгированной анальгетической активностью. Цикло- , D-Met, Pro/ энкефалин (I) синтезирован известны ми методами пептидной химии в растворе согласно приведенной схеме с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламинокислот , S-аминофункцию лизина защищают бензнлоксикарбонильной группой гидроксил тирозина - бензильньм радикалом . На чертеже приведена схема синте за. Пример. Дл  синтеза аналог энкефалина (I) и :пользуют аминокислоты и их производные фирмы Reanal ( Венгри ). Все аминокислоты, кроме D-Метионина, имеют L-конфигурацию. Температуру плавлени  веществ определ ли , в капилл ре (без коррекции) .Индивидуальность промежуточных соединений контролировали с помощью тех на пластинках Silufol (ЧССР) в следующих системах растворителей: хлороформ - этанол-- уксусна  кислот ( АсОН), 85:10:5 (А), н-бутанол-пиридин-АсОН-Н О , 15:10:3:6 (В), н-бу .танол-АсОН-Н40, 4:1:1 (С). Аналоги энкефалина хроматографируют на пластинках фирмы Merck в системах: хлороформ -метанол - АсОН-Н О , 30:20:4:6 (D), 60:18:2:3 (Е), н-бутанол-пиридин-АсОН-Н-0 , 15:12:3:10 (F). Удельное оптическое вращение пептидов измер ют на пол риметре Perkin Elmer 141 М (ФРГ). Кислотный гидролиз провод т при 120с в течение 24 ч. Аминокислотный- состав определ ют на анализаторе Jeol-3.) Дл  всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, Н, N. По данным аминокислотного анализа дл  гексапептидов полученудовлетворительный аминокислотньй состав . -бутилоксикарбонйл-глицил-L-фенилаланин (7). 6,60 г (40 ммоль) L-фенилаланина раствор ют в 40 мл 1 н. раствора гидроокиси натри , добавл ют 3-,44 г бикарбоната натри , 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 г (40 ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутилоксикарбонил-глицина , растворенного в 20 мл .ДМФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершени  реакции (хроматографический контроль) реакционнуюмассу разбавл ют этилацетатом и водой (до разделени  слоев), охлащхают до и подкисл ют 0,5 н. сол ной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отдел ют , водную фазу экcтpaгиpyюt повторно . Объединенный этилацетатный слой промьшают водой, насьщенным раствором хлористого натри  и сушат над безводным сульфатом натри . Кристаллический остаток, полученный после отгонки растворител , перекристаллйзовывают из эtилaцeтaтa с небольшой добавкой петролейного эфира. Выход дипептида (7) 11.,4 г. (88%), Т.пл. 133-1354, 15,7° (с 1, ДМФА); Rf 0,73 (А),- Rf 0,80 (D). . Н-третбутнлоксикарбонил-глицил-L-фенилаланил-пролин (9). 3,22 г (10 ммоль) дипептида (7) раствор ют в 10 мл этилацетата, охлаждают до и при перемешивании добавл ют 2,02 г (11 ммоль) пентафторфенола и 2,26 г (11 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДСС), растворенных в этилацетате. Через 2 ч смесь охлаждают до -10°С, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, растворитель отгон ют, маслообразный остаток растирают с гексаном до затвердени . Получают 4,4 г пектафторфенилового эфира дипептида (8)i Rf,« 0,85 (А) . 1,03 г (9 ммоль) L-пролина раств р ют в 16 мл ДМФА и при перемешиваНИИ добавл ют 1,26 мл (9 ммоль) три этиламин в 2 мл ДМФА и 4,4 г (9 1Ф1оль пентафторфенилового эфира дипептида (8), растворенного в 4 мл ДМФА. Реак ционную массу перемешивают несколько часов, ДМФА отгон ют при , остаток раствор ют в этилацетате и обрабатьшают аналогично соединению (7). Продукт, полученный после отгонки растворител , хроматографируют на колонке с силикагелем в системе: хло роформ - гексан - EtOH 10:4:1. Соответствующие фракции объедин ют, растворитель отгон ют, сушат в вакууме. Выход 3,3 г (87%) трипептида(5); - 31,1°(с 1,ДМФА); Rf 0,77 С) К-трет-бутилоксийарбонил-О-бензил -Ъ-тирозил-В-метионин (10). К 2,09 г (14 ммоль) D-метионина. прибавл ют 28 мл 0,5 н. раствора гид роокиси натри , перемешивают, затем .прибавл ют 1,18 .(14 ммоль) бикарбоната натри , 20 мл ДМФА и 6,89 г. (14 ммоль) нитрофенилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозина , растворенног,о в 30 мл ДМФА. После завершени  реакции .(около 48 ч) реакционную массу обрабатывают и вьщел ют продукт (10) аналогично соединению (7). Прсле перекристаллизации из смеси этилацетата и гексана получают 4,8 г (68%) дипептида (10)i т.пл. 129-132 С, io. о 2,0 (с 1, даФА) Rf 0,72 (А) N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил Ъ-тирозил-В-метионил-глицил-Ь-фенилаланил-Ъг-пролин (13) 3,52 г (7 ммоль) дипептида (10) раствор ют в 20 мл этилацетата с небольшой добавкой ДМФА, охлаждают до и при перемешивании добавл ют ,1,41 г (7,7 ммоль) пентафторфенола и 1,58 г (7,7 ммоль) ДСС, растворен ных в этилацетате. После окончани  реакции дициклогексилмочевину отфиль ровьшают, растворитель отгон ют, кристаллический остаток растирают с гексаном. Ползгчают 4,1 г пентафтор026 фенилового эфира дипептида (11); Rf 0,94 (А). 2,34 г (5,6 ммоль) трипептида (9) раствор ют в 15 мл. 70%-кого раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане и выдерживают 30 мин. Растворитель отгон ют, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают. промывают эфиром на фильтре и сушат в вакууме над гидроокисью кали . По-. лучают 2,3 г (94%) трифторадетата (12);Rf 0,67 (D) 2,3 г (5,3 ммоль) трифторацетата (12) раствор ют в 15 мл ДМФА и при перемешивании и охлаждении до 0°С добавл ют 1,1 :мл (10,6 ммоль) N-метилморфолина в 2 мл ДМФА- и 3,5 г (5,3 ммоль) пентафторфенилового эфира дипейтида (11), растворенного в 10 мл ДМФА. Реакционную массу пере- . мешивают несколько часов и после завершени  реакции обрабатьшают аналогично соединению (7) . Продукт, полученный посЛе отгонки растворител , очищают на колонке с силикагелем. Элюирование провод т в системе: хлороформ - этанол - этилацетат - АсОНН О 285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме. Выход 2,1 г (49%) пентапептида (13); М - 10,4(с 1, ДМФА);К 0,51 (А); Rf, 0,72 (F, Merck). N-трет-бутйлоксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозил-В-метилнил- лицил-Ь- -фенилаланил-Ь-пролил-Ы -.(N- бензилоксикарбонил )-Ь-лизин (15). 2,09 г (2,6 ммоль) защищенного пентапептида (13) раствор ют в 20 мл ДМФА, охлаждают до 0°С и при переме-, шивании добавл ют 0,53 г (2,9 ммоль) пент торфенола, 0,59 г (2,9 ммоль) ДСС, растворенных в ДМФА. По-завершении реакции дициклогексилмочевину, отфильтровывают, растворитель отго-. н ют, остаток растирают с гексаном. Получают активированный эфир пентапептида (14); Rf 0,67 (А). -х 0,78 г (2,6 ммоль) К -бензилоксикарбонил-L-лизина раствор ют в 5,2 мл 0,5 н. гидроокиси натри , добавл ют О,22 г (2,6 ммоль) бикарбоната нат10 мл ДМФА и активированный ри , :птида (14) в ДМФА. Mej эфир пентапептида (14) в ДМФА. Через 48 ч реакционную массу расслаивают между этилацетатом и 5%-ным раствором бисульфата кали . Этилацета ный слой

отдел ют, водную фазу экстрагируют повторно. Объединенный этилацетат промывают водой, насыщенным раствором NaCl, сушат над безводным сульфатом натри . Продукт, полученный после отгонки этилацетата, хроматографируют аналогично соединению (13) Выходе 1,54 г (57%) гексапептида

(15), ш - 14,1 (с 1, даФА);

Rf 0,69 (В)

Цикло /N(N -бензилоксикарбонил)-Ь-лизил-О-бензил-Ь-тирозил-В-метионил-глицил-Ъ-фенилалнил-Ь-пролил/ (17).

0,5 г (0,5 ммоль) гексапептида (15) раствор ют в 2 мл 70%-ного раствора ТМ в дихлорметане и вьщерживают в течение 30 мин. Растворитель отгон ют, остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме. Получают г (94%) трифторацетата гексапептида (16); Rf 0,5 (Е, Merck)} Rf 0,1 (А).

0,4 (0,37 ммоль) трифторацетата гексапептида (16) раствор ют в 400 мл очищенного ДМФА, охлаждают до -20с, прибавл ют триэтйламин до рН 7,2 и медленно прибавл ют 0,11 мл (0,5 ммоль) дифенилфосфорилазида в 50 мл ДМФА. Раствор перемешивают в течение 7 дней, периодически добавл ют триэтйламин, поддержива  рН около 7. По окончании циклизации растворитель отгон ют при , к остатку прибавл ют 1-2 мл этилацетата Нерастворившийс-  осадок отфильтровывают и хроматографируют на колонке с сйликагелем в системе хлороформ метанол - АсОН 85:10:5.

Выход: 145 мг (40%) циклогексапептида (17); ,2 (с 0,5, ..АсОН), Rf 0,60 А, Merck).

Цйкло- (N -1,-лизил-о6-тирозил-В-метионил-глицил-Ъ енилаланил-Ь-пролил ) (I).

К раствору 60 мл (0,063 ммоль) соединени  (16) в 5 мл метанола и 2 мл АсОН добавл ют палладиевую чернь, 0,5 мл воды и гидрируют в течение 4 дней. Катализатор отфильтровьша1от , фшштрат упаривают досуха остаток растирают с эфиром, отфильтровьшают , сушат в вакууме над гидроокисью кали . Полученньй продукт очищают на КМ-целлюлозе (СМ-32 фирмы Whatman) в аммоний-ацетатном буфере (градиентное элюирование). Соответствующие фракции собирают и лиофилизуют .

Выход; 35 мг (76%) циклогексапептида энкефалина (I); /oi/ +25,7° (с 0,33, 0,2 н. АсОН); Rf 0,52 (Д, Merck), Rf 0,48 (В, Merck).

Проведены биологические испытани  аналога описываемого энкефалина ЦИКЛО (N -Lys-DMet -Pro )-энкефалина

Биологическую активность описьтаемого аналога энкефалина (1) исследуют в опытах in vivo. Анальгетическую активность определ ют по методу Heda Н. В работе бьши использованы беспородные мьши-самцы массой 20 г, Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, ввод т при помощи 1-образной иглы в cisterna magna мозга неанестезированным мышам в количестве 10 мкг. Исследовалс  диапазон доз от 0,1 до 100 мкг/животное. Контрольным животным ввод т 10 мкг стерильного физиологического раствора. Кажда  экспериментальна  группа состоит из 10 мышей. Анальгетический эффект соединени  оценивают по тесту tail pinch при помощи артериального зажима, накладьшаемого на основание хвоста.Определение болевой реакции провод т через 5,15,30,60 и 9.0 мин после введени  и затем каждые 30 мин до исчезновени  анальгетической реакции.

Результаты выражают альтернативным методом (процент мьшгей, показавших анальгетическую реакцию). При вычислении EDjQ используют метод Литчфилда и Уилкоксона. Анальгетическа  ак- тивность и продолжительность действи  соединений приведены в таблице.

Цикло-(, , Pro)- энкефалйн обладает выраженной анальгетической активностью. Максимальный эффект наблюдаетс  на 5-15 мин после введени . Анальгетическа  активность нового аналога (I) значительно превышает активность природных энкефалинов (II и III) и сопоставима по величине и продолжительности действи  с анальгетическим эффектом морфина. Характерной особенностью  вл етс  зчительна  пролонгаци  анапьгетического эффекта. Продолжительность аналгезии при EDgQ.gp составл ет 90 мин. Доза 100 мкг/животное вызьшает аналь гетический эффект продолжительностью 2,5 ч (у энкефалинов 15 мин)«

Анальгетическа  активность описываемого соединени  исследована в диапазоне доз от OJ до 100 мкг/жи-йотное . Эффективна  доза (EDjo) при этом 5,9 ммоль/животное (или 5,1 мкг /животное).

В интервале изученных доз не было -отмечено случаев гибели животных. Сделан вывод, что Щдд 109 нкг/жйвотное , и вычислен терапевтический

Анальгетическа  активность энкефалина и его аналога при интрацистеральном введении мышам

индекс описываемого циклического аналога энкефалина:

100 мкг/животное

.20

5,1 мкг/животное

Полученные результаты подтверлздают, что описываемый циклический аналог энкефалина обладает выраженной анальгетической активностью и может найти применение в медицине.

1)EDjg - эффективна  доза исследуемого соединени , котора  вызывает анальгетический эффект у 50% подопытных животных}

2)при EDgo.eo-,

3)в. работе использовалс  морфин гидрохлорид в ампулах производства Ташкентского ХФЗ.

5г

tft

Дг

Claims (1)

1. Циклический аналог энкефалина формулы

   НН₂~ СН-СО-Туг -ПМе1- <^1у -РЬе -Рго—

   СНг-СНг сн_г-сн₂-1Ш —-“

   обладающий пролонгированной анальгетической активностью.

   1048702