SU1433415A3

SU1433415A3 - Способ получени пептидов

Info

Publication number: SU1433415A3
Application number: SU3974503A
Authority: SU
Inventors: Есино Хироси; Цутия Ютака; Канеко Такеру; Наказава Такахиро; Икеда Масухиро; Араки Син; Ямацу Киеми; Татибана Синро; Аракава Есихиро
Original assignee: Эйсай Ко.,Лтд (Фирма)
Priority date: 1984-11-09
Filing date: 1985-11-06
Publication date: 1988-10-23
Also published as: AU588837B2; NO854435L; PH23847A; EP0181001B1; KR880000765B1; ES548667A0; US4707468A; CN85109722A; DK513385D0; CA1267997A; IL76924A0; PT81441A; DK171300B1; EP0614913A3; AU4938985A; FI92935B; NO169347C; HU203563B; IL76924A; FI854227L

Abstract

Изобретение касаетс пептидов, в частности способа получени пептидов общей формулы: R,Rj-L-Tyr-A-Gly- B-C-D-E-F, где R, R Н или R т э R,: Н и С,-С4-алкш1, А Gly; D-Cys, св занный с С, если С Cys; В Phe или (n-N05)Phe; С ;Leu, Met(O), Cys, св занный с А, если А D-Cys; D Arg, CH,-Arg, Lys; E Arg, CHj- Arg; F NH, D-Leu-X (при X OH, NH, OCjHy, ,.) или D-Leu-Arg-X . (при X NH, ), обладающих анальгетической активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных веществ указанного класса. Синтез ведут фрагментарной конденсацией мето- .дом постепенного наращивани пептидной цепи, исход из БОС защищенной С - конечной аминокислоты, с использованием дл активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов. В случае необходимости от полученного защищенного пептида отщепл ют имеющиес защитные группы. Новые пептиды обладают анальгетической активностью при эффективной дозе ЕДуо 0,22-,5 мг/кг (внутривенно) и 0,32-1,5 мг/кг (подкожно ), против 25 мг/кг дл динор- фина, при токсичности 20 - 100 мг/кг. 6 табл. ш 43 С«9 сд

Description

ы

Изобретение относитс к способу получени пептидов - новых биологи- чески активных соединений, которые могут найти применение в медицине,

Цель изобретени - получение новых пептидов, обладающих более высо- кой анальгетической активностью.

П р и м е р 1, Синтез СН -Тир- 1:Гли-Пли-Фен-Лей-Арг-СН Арг-Л-Лей- .

А. Раствор ют в 200 мл тетрагид- рофурана 25 г БОК-В-Лей-ОИ-Н О.Раствор охлаждают до и добавл ют

него 11 мл N-метилморфолина и

h

9,56 мл этилового эфира хлоруголь- |ной кислот 1. Через 5 мин добавл ют в раствор 12,9 г 70 -ного водного раствора этиламина, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в те- чение 2 ч. После концентрировани остаток раствор ют в этилацетате и промывают водным раствором гидрокарбоната натри и водой последовательно. После концен- ировани досуха получа- ют 24,5 г БОК-Д-Лей-ШС Нд, Т.пЛ.ЮЗ- 106°С.

Тонкослойна хроматографи (ТХС): значение Rf 0,77 (этилацетат). Оптическое вращение: (а).р +20,0 (, метанол).

Вычислено, %: С 60,44; Н 10,14; N 10,84. , C,.

Найдено, %: С 60,42; Н 10,33; N 10,86.

Б. Синтез г-СН5Арг(Тос)-Д-ЛейNHC HC . Раствор ют в 15 мл тетрагидрофу;рана 1,43 г Z-CHjApr(Тос)-ОН, (а)д : -15, , диметилформамид, синтезированного из Н-Арг(Тос)-ОН. После охлаждени до -30°С в раствор добавл ют 0,33 m N-метилМорфолина и 0,29 МП этилового эфира хлоруголь- ной кислоты. Через 5 мин в смесь до- .бавл ют раствор 817 мг .H-Д- -Лeй-NHC, (синтезирован обработкой БОК-Д-Лей-ННС Нд трифторуксусной кис

лотой в присутствии анизола) и 0,83 мл триэтиламина в 7 мл тетрагидрофурана и смесь перемешивают приблизительно при -5°С в течение 2 ч. После концентрировани остаток раствор ют в этил ацетате, промывают, водным раствором гидрокарбоната натри и водой, последовательно и концентрируют досуха, получа 1,58 г стеклообразного Z- (Тос)-Д-Лей-ШС.гН5 .

,

5

0 5

0

.-

о ,

0

ТСХ: значение Rf 0,68 (метанол/ /хлороформ 1/7).

Вычислено, %: С 58,42; Н 7,19; N 13,63,

СзоН44 0 3

Найдено, %: С 58,29; Н 7,19; N 13,40.

В. Синтез БОК-Арг(Тос).(Тос)- -Д-Лей-МНС Н.

Раствор ют в 4 мл диметилформами- да 1,1 г .Н,Арг(Тос)-Д-Лей-ШС,Н5, получе шого каталитическим восстановлением г-,СН.Арг(Тос)-Д-Лей-ШС.Н5 в пpиcvтcтвии катализатора Pd/C, 983мг .БОК-Арг(Тос)-ОН и 372 мг N-гидрокси- бензотриазола. В этот раствор при охлаждении льдом добавл ют 520 мг дициклогексилкарбодиимида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Полученные таким образом осадки отфильтровывают, а фильтрат концентрируют. Концентрированный остаток очищают с помощью хроматографии на колонке с силикаге- лем (элюент: смесь метанол/СНС 1/15), чтобы получить 1,2 г стеклообразного продукта БОК-Арг(Тос)-СНз- -Арг(Тос)-Д-Лей-ЫНС Н.

ТСХ: Rf 0,64 (метанол/хлороформ 1/7). Оптическое вращение:.(а)д -20,6(, метанол).

Вычислено, %: С 52,72; Н 7,30; N 15,37.

C oH64N,

Найдено, %: С 52,82; Н 7,22; N 15,06.

Г. Синтез БОК-Лей-Арг(Тос)-СН5Арг (Тос)-Д-Лей-ЫНС2Н5.

Раствор ют в 12 мл диметилформами- да 1,645 г ВОК-Лей . Раствор охлаждают до и добавл ют в него 0,726 ил N-метилморфолина и 0,631 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин k раствору добавл ют раствор 4,986 г СР5СООН.Н-Арг(Тос)- (Тос)-Д-Лей-№1С,Е55, синтезированного путем обработки БОК-Арг (Тос)-СНзАрг.СТос)-Д-Лей-ШС2Н5 трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,726 мл N-метилморфолина в 12 мл диметилформамида, и смесь перемешивают приблизительно при -5 с в течение 2 ч. После концентрировани и последующего отвердевани с помощью смеси метанол/эфир получают 5,283 г БОК-Лей-Арг(Тос)-CHj Apr(Toe)-Д-Лей- . Т.пл. 120-125 С (разложение).

ТСХ: Rf 0,66 (метанол/хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (а). 25,8 (, метанол).

Вычислено, %: С 54,36; Н 7,67; N 14,84.

,,0,oS,,.

Найдено, %: С 54,49; Н 7,63; N 14,62.

Д. Синтез БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)- (Тос)-Д-Лей-ШС,Н5.

Раствор ют в 12 МП диметилформа- мида 1,465 г БОК-Фен-ОН. Раствор охлаждают до -З0 с и добавл ют в него 0,608 мл Ы-метш1морфолина и 0,528 мл этилового эфира хлоругольной кислоты Через 5 мин в раствор добавл ют 4,691 г .Н-Фен-Лей-АргСТос)- -CHjApr(Toc)-fl-neft-NHC H5, синтезированного обработкой БОК-Фен-Лей- -Арг(Тос)-СН,Арг(Т(с)-Д-Лей-рС Н5 трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,608 мл N-метилморфо лина в 12 мл диметилформамида, и смесь перемешивают приблизительно при -5°С в течение 2 ч. После концентрировани остаток раствор ют в этилацетате, и раствор промывают водным раствором гидрокарбоната натри и водой последовательно. После концентрировани с последующим отвердеванием под действием смеси метанол/ /эфир получают 5,072 г БОК-Фен-Лей- -Арг{Тос)(Тос)-Д-Лей-ННС2Н5-. Т.пл. 127-132- С (разложение).

ТСХ: Rf 0,66 (метанол/хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (a)jj -25,4 (, метанол).

Вычислено, %: С Н 7,48; N 14,18.

C55H64NiiO VSj СН,ОН.

Найдено, %: С 56,64; Н 7,33; N 13,86.

Е. Синтез БОК-СН,Тир(С1 Бзл)-Гли- -Гли-ОН.

Раствор ют в 150 мл тетрагидрофу- рана 9,09 г БОК-СН Тир-(С1 Бзл)ОН, (а).р -49° (, этанол), синтезирован по способу С.Т.Чеунг и 2,53 г N- оксисукцинимида. После охлаждени льдом к раствору добавл ют 4,12 г дициклогексилкарбодиимида, и смесь перемешивают в холодильнике в течени ночи. Полученные таким образом белые кристаллы отфильтровывают и к фильтрату добавл ют 2,91 г Н-Гли-Гли-ОН и 38 мл водного раствора 1,848 г гидрокарбоната натри . Смесь перемешивают при комнатной температуре в тече

0

5

0

5

0

5

Р

5

ние 2 суток и затем концентрируют. Разбавленный водный раствор лимонной кислоты и этилацетат добавл ют к смеси и отдел ют этилацетатный слой. После промывки водой с последующим концентрированием продукт очищают хроматографически на колонке с сили- кагелем элюируемой смесью метанол/ /хлороформ 1/30 и отверждают смесью эфир/н-гексан, получа 9,23 г БОК- -СНзТирСС Бзл)-Гли-Гли-ОН. Т.Ш1.70- (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,79 (метанол/ /уксусна киспота/хлороформ 4/1/12). Оптическое вращение: (а) -17 (С- 1, метанол).

Вычислено, %: С 55,54; Н 5,99; N 6,94.

, N,0,С1 OjSCjHjOC Hs.

Найдено, %: С 55,45; Н 5,81; N 6,89.

Ж. Синтез БОК-СН-Тир(С12Бзл)-Гли- -Гли-Фен-Лей-Арг(Тос)-СН Apr(Toe)-Д- Лей-ШС Ну.

Раствор ют в 4 мл диметилформамида 682 мл БОК-СН,Тир(С12Бзл)-Гли-Гли- -ОН и 195 мг N-гидроксибензстриазола. При охлаждении этого раствора льдом в него добавл ют 272 мг дициклогексилкарбодиимида . После перемешивани в течение 2 ч в раствор добавл ют раствор 1,167 г CF,COOH.H-Фeн-Лeй- -Apг(Toc)(Toc)-Д-Лeй-NHCJHy, синтезированного путем обработки БОК-Фен-Лей-Арг(Тос)СНзАрг(Тос)-Д- -Лей-ШС.Н. трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 0,132 мл N- метиЛморфолина в 8 мл диметилформамида , и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи. Образовавшийс таким образом осадок отфильтровывают, и фильтрат концентрируют и очищают хроматографически на колонке с сили- кагелем (элюент: метанол/хлороформ 1/20). После отвердевани смесью метанол/эфир получают 1,391 г БОК- -CHJTиp-()-Гли-Гли-Фeн-Лeй- Арг(Тос)-СНзАрг(Тос)-Д-Лей-МНС Н5.. Т.пл. 130-135 С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,64 (метанол/ /хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (а).р -35,3 (, метанол).

Вычислено, %: С 55,92; Н 6,77; N 12,70.

CT6««..,-CH,

Найдено, %: С 55,06; Н 6,49; N 12,52.

S143

3. Синтез СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН Арг-Д-Лей-ШС Нр ,

Раствор ют, в 10 мл фтористого водорода в присутствии 0,2 мл анизола в герметичном дл HF реакционном сосуде при -5°С 220. мг БОК-СН Тир (ICl Взл)-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг (Тос)- -|СНзАрг(Тос)-Д-Лей-ШС Н5. Раствор п1еремешивают в течение 1 ч и затем HiF отгон ют из реакционной смеси. Остаток промывают эфиром и раствор ют в воде. Раствор обрабатывают ионо- с бменной смолой Амберлит 1РА-93 (укС 52,73; Н 7,50;

Вычислено, %: N15,37,

СггН4оНбОб81„.Н,,0

Найдено, %; С 52,77; Н 7,60; N 15,14.

Б. Синтез (Тос)-Д-Лей- Apr(Toc)-NH.

Раствор ют в 30 мл тетрагидрофура- на 3,336 г г-СНзАрг(Тос)-ОН. Раствор охлаждают до -20 С и добавл ют в него 0,77 мл N-метилморфолина и 0,67 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин к смеси добавл ют раствор

ауснокислый тип) и высушивают вымора- 15 3,882 г CF COOH Н-Д-Лей-Арг(Toc)-NH,

живанием. Полученный таким образом неочищенный пептид (120 мг) очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешени (фаза Нуклеосил 5с 18, диаметр колонки 2, длина 25 см, элюент 0,1% НС1 в растворе воды: ацетонитрила 81:91)-и затем сушат вымораживанием, чтобы получить 70 мг СН Тир-Гли-Гли-Фен-Лей-Арг-СН,- -Арг-Д-Лей-ННС Н у.

ТСХ: значение Rf 0,70 (бутанол/ ./уксусна кислота/пиридин/вода 15/5/5/8).Оптическое вращение: Са)., -21,8° (,4, 0,01 н. НС1). acc-cпeктp (FAB) : 1036 (М+Н). Аминокислотный анализ: Гли 1,87 (2); Лей 1,96 (2); Фен 1,00 (1); Apr 0,95 (1) (пшси, соответствующие CHj и , не обсчитаны). : П р и и е р 2. Синтез Тир-ДЧ нс- 1 ли-Фен-Цис-Арг-СН5Арг-Д-Лей-Арг-Ш,

А. Раствор ют в 10 мл диметилфор- Мамида 2,493 г БОК-Д-Лей-ОН-Н О. Раст- Яор охлаждают до и добавл ют в него 1,1 мл Н-метилморфолина и 0,96 МП этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в смесь добавл - Й)т раствбр 4,414 г CFjCOOH.H-Apr(Toc)- Н и 1,65 мл N-метилморфолина в 20 мл

синтезированного путем обработки БОК- Д-Лей-Apr(Toc)-NH трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 1,17 мл триэтиламина в 30 мл тетра- 2Q гидрофурана, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в течение .2 ч. После концентрировани с последующим отверждением смесью метанол/ /вода получают 6,14 г 2-СИзАрг(Тос)- 25 Д-Лей-Ар г (Тос)-Ш,. Т.пл. 100-113° С (разложение).

ТСХ: Rf 0,44 (метанол/хлороформ 1/7), Оптическое вращение: (а) -3,4° (, метанол).

Вычислено, %: С 54,18; Н 6,71; N 15,04,

C4iH58N,oO,Sj CH ОН

Найдено, %: С 54,12; Н 6, б2; N 14,85.

В. Синтез БрК-Арг(Тос)-СНдЛрг(Тос)- Д-Лей-Арг(Тос) -Ш,г.

Раствор ют в 17 мл диметилформами- да 4,734 г СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)- -NHj, полученного каталитическим .вос- Q становлением (Тос)-Д-Лей- -Арг{Тос)-Ш в присутствии Pd/C, 2,918 г БОК-Арг(Тос)ОН и 1,1 N-гидро- ксибензотриазола. К этому раствору при охлаждении льдом добавл ют 1,543 г

30

диметилформамида и смесь перемешива- дс дициклогексилкарбодиимида, и смесь

- ft

ют приблизительно при -5 С в течение 2 ч. После концентрировани остаток раствор ют в этилацетате и последовательно промывают раствором гидрокарбоната натри и водой. После концентрировани к остатку добавл ют Эфир, чтобы вызвать затвердение про- йукта. Таким образом получают 4,96 г БОК-Д-Лей-Арг(Тос)-Ш2. Т.пл. 110 - 120 С (разложение),

ТСХ: Rf 0,49 (метанол/хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (а).р: р +13,0 (, метанол).

50

перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Образовавшийс таким образом осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (элюент: смесь метанол/ /хлороформ 1/15) и отверждают эфиром , получа 4,917 г БОК-Арг(Тос)- gg -СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-МН,. Т.пл. 131-13б с (разложение).

ТСХ: Rf 0,44 (метанол/хлорофорй 1/7). Оптическое вращение: (a)j, -16,7° (, метанол).

синтезированного путем обработки БОК- Д-Лей-Apr(Toc)-NH трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и 1,17 мл триэтиламина в 30 мл тетра- Q гидрофурана, и смесь перемешивают приблизительно при -5 С в течение .2 ч. После концентрировани с последующим отверждением смесью метанол/ /вода получают 6,14 г 2-СИзАрг(Тос)- 5 Д-Лей-Ар г (Тос)-Ш,. Т.пл. 100-113° С (разложение).

Вычислено, %: С 54,18; Н 6,71; N 15,04,

C4iH58N,oO,Sj CH ОН

Найдено, %: С 54,12; Н 6, б2; N 14,85.

0

перемешивают в холодильнике в течение суток и затем при комнатной температуре в течение суток. Образовавшийс таким образом осадок отфильтровывают и фильтрат концентрируют. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (элюент: смесь метанол/ /хлороформ 1/15) и отверждают эфиром , получа 4,917 г БОК-Арг(Тос)- -СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-МН,. Т.пл. 131-13б с (разложение).

Вычислено, %: С 51,32; Н 6,76; N 16,43.

Csi itsNuOnS,-

Найдено, %: С 51,15; Н 6,54; ,48.

Г. Синтез БОК-Цис(СНзБзл)-Арг(Тос.) 7СН5Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-НКа.

V Раствор ют в 4 мл диметилформами- да 747 мг ВОК-Цис-(СН,Бзл)-ОН, Раст- вор охла цают до -20 С и в него добавл ют 0,254 МП N-метилморфолина и 0,221 мл этилового эфира хлоруголь- ной кислоты. Через 5 мин в раствор добавл ют раствор 2,497 г Арг(Тос)-СН Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)- -NHij, синтезированного путем обработки БОК-Арг-(Тос)-СН,Арг(Тос)-Д-Лей- Apr(Toc)-NH,j, трифторуксусной кислотой в присутствии анизола иО,277мп N-метилморфолина в 6 мл диметилформа мида, и смесь перемешивают в течение 2 ч приблизительно при -5°С. После концентрировани смесь раствор ют в этилацетате и затем промывают раство ром гидрокарбоната натри и водой . последовательно. После дополнительного концентрировани продукт отвержда ют смесью метанола и эфира, получа 2,548 г БОК-Цис(СН5Бзл)-Арг(Тос)- -СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-Ш2.Т.пл. 126-132 0 (разложение).

ТСХ: Rf 0,51 (метанол/хлороформ 1/7), Оптическое вращение: (а). -20,6 (, метанол).

Вычислено, %: С 52,81; Н 6,82; N 14,66.

С q, N 150 ,э S4 СН ОН Н2.0

Найдено, %: С 52,78; Н 6,43; N 14,29.

Д. Синтез БОК-Фен-Цис(СНэБзл)- Apr(Тос)-СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-NH ..

Раствор ют в диметилформамиде 467 мг БОК-Фен-ОН. Раствор охлаждают до и в него добавл ют 0,194 мл N-метилморфолина и 0,168 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в смесь добавл ют раствор 2,234 г СР,СОрН-Н-Фен-Цис(СНзБзл)- Apr(Тос)-СН,Арг(Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)- -NHj, синтезированного путем обработки БОК-Фен-Цис(СН,Бзл)-Арг(Тос)- (Toe)-Д-Лей-Apr(Toe)-NH трифторуксусной кислотой в присутствии анизола, и мл N-метилморфолина в 5 МП диметилформамида, и смесь перемешивают в течение .2 ч при температуре -5 с. После концейтрировани ос

таток раствор ют в этилацетате, и раствор промывают водным раствором гидрокарбоната натри и водой последовательно . После дополнительного концентрировани продукт отверждают добавкой смеси метанола к эфира, получа 2,126 г БОК-Фен-Цис(СН5Бзл)- Арг(Тсс)-СН Apr(Toe)-Д-Лей-Apr( -Ш. Т, пл. 124-130 С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,56 (метанол/ /хлороформ 1/7). Оптическое вращение: (a)j5 -18,9 (, метанол).

Вычислено, %: С 54.,83; Н 6,89; N .

,60i4Sv 5/2CH,OH

Найдено., %: С 54,62; Н 6,34; N 13,64.

Е. Синтез БОК-Д-Цис-(СН Бзл)-Гли- -OC,lH5.

Раствор ют в 15 мл диметилформамида 3,233 г БОК-Д-Цис(СН,Бзл)-ОН.Раствор охлаждают до и в него добавл ют 1,1 мл N-метилморфолина и 0,956 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин к этому раствору добавл ют раствор 1,396 г НСГ Н-Гли-ОС Ну и 1,1 мл Н-метилмор- фолина в 20 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в течение 2 ч при температуре около -5 с. После концентрировани остаток раствор ют в этил- ацетате, и раствор промывают последовательно водным раствором гидрокарбоната натри и водой. После концентрировани к остатку добавл ют н-гексан, чтобы вызвать затвердевание продукта. Таким образом получают 3,6 г БОК-Д- Цис-Гли-ОС КS-. Т.пл. 80-82 С.

ТСХ: значение Rf 0,74 (хлороформ/ /этилацетат 2/1). Оптическое вращение: (a)jj +30,2 (, метанол).

Вычислено, %: С 58,51; Н 7,37; N 6,82.

Найдено, %: С 58,35; Н 7,23} N 6,69.

Ж. Синтез БОК-Тир()-Д-Цис - (СН, Бзл ) -Гли-OCjH 5-.

Раствор ют 2,068 г БОК-Тир()- -ОН в 20 мл тетрагидрофурана. Раствор охлаждают до -20 С и добавл ют в него 0,517 мл N-метилморфолина и 0,45 мл этилового эфира хлоругольной кислоты. Через 5 мин в этот раствор добавл ют раствор 1,94 г CFjCOOH-H-Д-Цис (СН,Бзл)- Гли-ОС Ну, синтезированного путем обработки БОК-Д-Цис(СН,Бзл)-Гли-ОС4Н, трифторуксусной кислотой в присутстВИИ анизола, и 1 мл триэтил ат-гана в 20 мл тетрагидрофурана, и смесь перемешивают в течение 2 ч при температуре около -5 С. После концентрировани s К остатку добавл ют воду, чтобь обра- э|овалс осадок, который отфильтровы™ Е|ают и раствор ют в смеси метанола и з лороформа. После концентрировани к остатку добавл ют эфир, чтобы выз 10 Еать затвердевание продукта. Таким сбразом получают 2,661 г С1, Бэл)-Д-Цис(СН,Взл)-Гли-ОС Н5.

15

149-150 С.

ТСХ: значение Rf 0,63 (хлороформ/ этиладетат 2/1), Оптическое вращение: (а).р +17, (, диметилфор-.. амид),

Вычислено, %: С 59,01; Ы 5,91; 5,73,

.

Найдено, %: С 58,94; Н 5,75; 5,62.

3. Синтез ВОК-Тир()-Д- IjUac (СНз, Вал )-Гли-ОН.

Раствор ют в 30 мл тетрагидрофура- ija 2,345 г ВОК-Тир(С15.Бзл)-Д-15ис ()-Гли-ОС Н5 и затем добавл ют

раствор 3j2 МП 1 и, раствора гидро- ксида натри . Смесь переме1Г1ивают при 1|:омнатной температуре в течение 1 ч 4 добавл ют к ней 3,2 мл 1 н. сол ной 1|сислоты. Полученную смесь концентри- .фуют. К остатку добавл ют воду, чтобы продукт отвердел. Таким образом получают 1,899 г БОК-Тир()-Д- Цис()-Гли-ОН. Т.пл, 133-138°С (разложение).

ТСХ: значение Rf 0,25 (метанол/ /хлороформ 1/7). Оптическое враще- ше: (a)j, +3 5,8° (, метанол).

Вычисл-eHOs %: С 57,95; Н .5,58; N 5,96.

,..

Найдено, %: С 57,81; Н 5,33; N 5,92,

И„ Синтез БОК-Тир()-Д-1Ь1С (СН|Бзл)-Гли-Фен-Цис(СН,Бзл)-Apr(Toe) CHj Apr (Тос)-Д-Лей--Арг (Тос)-Шг.

Раствор ют 983 мг БОК-Тир()- Д-Цис(СНзВзл)-Гли-ОН и 226 мг N-гид- роксибензотриазола в 5 мл диметилфор- мамида. При охлаж,а;ении льдом в раствор добавл ют 316 мг дициклогексил- :карбодиимида. -После перемешивани в течение 2 ч в этот раствор добавл ют раствор 1,94 г .Н-Фен-Цис , (СН5Бзл)-Арг(Тос)(Тос)-Д--Лей20

35

40

45

50

55

обработки БОК-Фен-Цис(СНзВзл)-Арг (Трс)-Д-Лей-Apr(Тос)-Ш2 трифторук- .сусной кислотой в присутствии анизола S и 0,167 МП N-метилморфолина в 10 мл диметилформамида, и смесь перемешивают в холодильнике в течение ночи , Полученньй таким образом осадок фильтруют. После хроматографической очистки на колонке с силикагелем (элюируемой смесью метанол/хлороформ 1/20) с последующим отвержде- кием смесью метанол/эфир получают 2,0 г БОК-Тир()-Д-Цис.(СН,Бзл)- Гли-Фен-Цис(СНзБзл)-Арг(Тос)-СН5Арг (Тос)-Д-Лей-Арг(Тос)-Ш2., Т.пл, 123- 130 с (разложение),

ТСХ: значение Rf 0,63 (метанол/ /хлороформ 1/7), Оптическое вращение: (а)и -17j5° (, диметилфор- мамид).

Вычислено, %: С 56,60;-Н 6,52; N 11,89.

C,,2,N,,0 gSyCLi-CjHjOCjH53/2CK Найдено, %: С 56,38; Н 6,18; N 11.,,72,

К, Синтез Тир-Д-Цис-Гли-Фен-ЦисАрг-СН рг-Д-Лей-Арг-МН .

Раствор ют 515 мг БОК-Тир()-Д-Цис (СНзБзл)-Гли-Фен-Цис(СНзБзл)- Арг(Тос)-С% Apr(Toe)-Д-Лей-Apr(Toe)- -NHj в 20 мл фтористоводородной кислоты в присутствии 5 мл анизола при-5 С в реакционном сосуде 5 герметичном дл фтористого водорода(HF).Раствор перемеши вают в течение 2 ч,и затем отгон ют HF водорода (HF), Раствор перемешивают в течение 2 ч, и затем отгон ют HF из реакционной системы. Остаток промывают эфиром и раствор ют в воде, Раствор обрабатывают смолой Амберлит 1РА-93 (уксусно-кислый тип) и затем сушат вымораживанием. Раствор ют 320 мг высушенного продукта в 1,3 л воды и раствор.подщелачивают до рН 8 водным аммиаком. Затем в раствор ввод т воздух при перемешивании в течение 2 суток, и смесь подкисл ют до рН 6 и. затем сушат вымораживанием, Полученньш таким образом неочищенный пептид очишдют методом жидкостной хроматографии высокого разрешени (фаза Нуклеосил 5 С 18, диаметр и длина колонки 2 и 25 см, элюент: 0505%-ный раствор НС1 в смеси вода/ /ацетонитрил 88/12) и сушат живанием, получа 140 мг Тир-Д ЦисApr (Toc)-NH, синтезированного путем , Гли-Фен-Цис-Арг-СНзАрг-Д-Лей-Арг-НН,

s 0

5

0

5

0

5

0

5

Вычислено, %: С 56,60;-Н 6,52; N 11,89.

Раствор ют 515 мг БОК-Тир()-Д-Цис (СНзБзл)-Гли-Фен-Цис(СНзБзл)- Арг(Тос)-С% Apr(Toe)-Д-Лей-Apr(Toe)- -NHj в 20 мл фтористоводородной кислоты в присутствии 5 мл анизола при-5 С в реакционном сосуде 5 герметичном дл фтористого водорода(HF).Раствор перемешивают в течение 2 ч,и затем отгон ют HF водорода (HF), Раствор перемешивают в течение 2 ч, и затем отгон ют HF из реакционной системы. Остаток промывают эфиром и раствор ют в воде, Раствор обрабатывают смолой Амберлит 1РА-93 (уксусно-кислый тип) и затем сушат вымораживанием. Раствор ют 320 мг высушенного продукта в 1,3 л воды и раствор.подщелачивают до рН 8 водным аммиаком. Затем в раствор ввод т воздух при перемешивании в течение 2 суток, и смесь подкисл ют до рН 6 и. затем сушат вымораживанием, Полученньш таким образом неочищенный пептид очишдют методом жидкостной хроматографии высокого разрешени (фаза Нуклеосил 5 С 18, диаметр и длина колонки 2 и 25 см, элюент: 0505%-ный раствор НС1 в смеси вода/ /ацетонитрил 88/12) и сушат живанием, получа 140 мг Тир-Д Цис ,1А3

ТСХ: значение Rf 0,56 (бутанол/ /уксусна кислота/пиридин/вода 15/5/5/8). Оптическое вращение; (a)j, -29 (,4, 0,01 н. HCl). Масс-спектр (FAB): 1183 (M+H). Ами- нокислотный анализ: Гли 1,02(1); Цис 1,83(2); Лей 1,04(1); Тир 0,80(1); Фен 1,00(1); Apr 2,66(2);Цис, обус- лоеленный СН,Арг, не рассчитывалс .

Примеры 3-29. Приведенные в табл. 1 соединени синтезирозань аналогичным обычным жидкофазным способом , как в примерах 1 и 2. В этих экспериментах производные динорфина, модифицированные в положени х 1-3 (Тир-Гли-Гли), в положени х 4-7 (Фен- Лей Арг-Арг), в положени х 4-8 (Фен- Лей-Арг-Илей) и в положени х 4-9

Пример

СН ТирСН ,ТирСН ,ТирСН Тир- СН5Тир- СН,Тир- СН,Тир- Тир -Л - СН,ТирCHjTHp-

В

Гли-Гли-Фен- Гли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен- Тли-Гли-Фен

Тли-Гли-Фен{ Цис- Гли-Фен-Гли-Гли-Фен- Тли-Гли-ФенА

Тли-Гли-Фен- -Гли-Гли-Фен5 . 2

(Фен-Лей-Арг-Арг-Лей-Арг), синтези- .рованы стадийным способом, исход из С-терминальной группы в каждом пептиде . Затем эти производные в положени х 1-3 и производные в положени х 4- 7, 4-8 или 4-9 конденсировали совместно по методу дициклогексилкарбоди- имидов или методом смешанного ангидрида . Все защищающие группы удал ют фтористым водородом (HF), и продукт очищают методом препаративной жидкостной хроматографии вьзсокого разрешени , использу носитель обратимой фазы . В примере 13 все защищающие группы удалены KF, а соединение окислено воздухом и затем очищено методом препаративной жидкостной хроматографии высокого разрешени .

Таблица 1

Соединение

F

NH

-Д-Лей-ОН -Д-Лей-ОС Ну -Д-Лей-Ш -Д-Лей-ШС Н5.

СД Е

Лей- Apr-Apr

-Лей-Арг-АргЛей-Арг-Арг-Лей-Арг-АргЛей-Арг-Apr (napa-NO) -Лей-Арг-Д-Лей-Ш. -Лей-СН-Арг-Арг-Д-Лей-Ш, -Лей-Арг-СН-Арг-Д-Лей-Ш

(пара-Ш4)-Лей-Арг-СНзАрг-Д-Лей-ШС.гН -Лей-Лиз-СН-Арг-Д-Лей Ш, с Арг-СН, Арг-Д-Лей-ШС Н -Лей-Арг-Арг-Д-Лей-Арг-Ш -Лей-Арг-СН-Арг-Д-Лей-Арг-ШС Н у

ВС Д Е :

- (napa-NO,j) -Лей-Арг-ОН-Арг-Д-Лей-Арг-Ш -Мет(0)-Арг-СН5Арг-Д-Лей-Арг-НН2

Трет-Лей: (СН),ОСН.(МН)СООН

Гомо Apr: N Н4С(«МН)ШСН СН4СН СН СН(Ш4)СООН

Фен (пара-Ш)N02- -CH2CH(NH2) СООН

Сар:

В табл. 2 перечислены соединени , состав, величины угла оптического полученные в услови х предлагаемого 15 вращени и значени Rf. способа, с указанием аминокислотногс

...«.

.Таблица2

Примечание. В аминокислотном анализе рассчитывают соотношение только

аиинокислот: Гли,Лей, Фен, Apr, Ала, Тир, Лиз, Сер, Цис и Глу.

г.о - определение С « 0,4 н, НС1. Определение значени Rf в ТСХ: бутанол/уксусна кислота/пнрндин/вода- - 15/5/5/8.

Результаты испытаний на животных иллюстрируют эффективность соединений в качестве обезболивающих агентов .

15 . 143

Испытание 1. Испытание на обезболивание . Испытываемое соединение раствор ют в физиологическом солевом растворе и ввод т его внутривенно или подкожно самцам мьппей линии ddy (вес тела 20-27 г, при изучении обычно разбивают на группы по 8). Обезболивающую активность измер ют в испы

тании с ущемлением хвоста.

В этом испытании ущемление хвоста в основании хвоста, включа анальную слизистую оболочку, помещают зажим, развивающий давление около 300 г, и измер ют латентность кусани этого зажима. До эксперимента проводили отбор животных на ноцицептивность зажима хвоста, причем исключали из эксперимента тех мышей, которые не кусали зажим в пределах 3 с. В качестве критери обезболивани примен ли латентность, превьппающую 6 с.

Величины EjtjQ (доза, вызьшающа 50% обезболивани ) рассчитывают по методу Литчфилда и Уилкоксона. Результаты показаны в табл. 3 (при внутривенной инъекции) и в табл. 4 (при подкожной инъекции).

Таблица 3

16

Продолжение табл.3

-

14

15

16

17

Динорфин (1-13)

1,8 0,7 0,7 2,0 более 25,0

15

Таблица 4

соепри

Ущемление хвоста ЕДдо, мг/кг (подкожно)

25

5

0

5

0

5

Испытание 2. Опиоидна активность. Опиоидные активности соединений определ ют по предлагаемому способу с использованием семенного канала кролика . В этом испытании взрослых самцов кроликов умерщвл ют, ввод воздух в ушную вену. Сразу после смерти провод т лапаротомию и удал ют правый и левый семенные каналы. Сем вьздавли- вают из каналов в раствор Ринджера. Каждый канал нарезают на части (2,5см длиной от конца со стороны предстательной железы). Эти кусочки семенного канала суспендируют с помощью винта в стекл нной чейке емкостью 6 мл при посто нной температуре и стимулируют электрическим стимул тором, имеющим платиновые электроды при следующих услови х: частота 0,1 Гц, 1 млс и 90 В. Сокращение, вызванное электрическим стимулированием, записывают через преобразователь.

Опиоидную активность определ ют на основании ингибировани сокращени , вызванного электрическим стимулированием .

Результаты представлены в табл. 5 в единицах концентрации 50%-ного ин- гибировани (ЙКуд).

Таблица 5

Из табл. 5 очевидно, что соединени предлагаемого способа про вл ют весьма большую активность по сравне- нию с динорфином А. Кроме того, они имеют высйкне активности при ингиби- ровании сокращени илеальных продольных мышц морской свинки и семенных каналов мьппи, .вызванного электричес- КИМ стимулированием.

Пептидные соединени , полученные в услови х предлагаемого способа, обладают опиоидными активност ми, аналогичными активности динорфина, при- чем их действие вл етс весьма сильным , про вл ютс значительные обезболивающие эффекты при внутривенной инъекции или подкожной инъекции.

Очень ценно, что соединени , получанные по предлагаемому способу про вл ют сильное обезболивающее действие при систематическом введении посредством внутривенной или подкожной инъекции, в то врем как динорфин и его производные обладают едва заметным обезболивающим действием при внутривенной инъекции, поскольку эти соединени нестабильны в крови.

Соотношение между токсичностью (минимальна летальна доза) пептидных соединений, полученных в примерах 1 и 2, и эффективной.дозой показано в табл. 6.

Таблица 6

Таким образом, соединени , полученные в услови х предлагаемого способа , могут быть отнесены к категории среднетоксичных и обладают более высокой анальгетической активностью, чем динорфин.

Claims

Формула изобретени

Способ получени пептидов общей формулы

Rf

г

X

LTyr-А-Uly--В - С - D-Е-Т

где R, г водород или один из R, и R - водород, другой С -С -алкил; А - Gly D-Cys, св занный

с С, если С - Cys; Б - Phe, (n-N02)Phe; С - Leu, Met(O), Суз, св занный с А, если А - D Cys;

D - Arg, CH,Arg, Lys; E - Arg, CHjArg; F - NH, D-.eu-X, где X - OH, NHj, ., или D-Leu-Arg-X, где Х-Шд, ,

ОТЛИ1 чающийс тем, что осуществл ют постепенное наращивани пептидной цепи, исход из БОС защищенной С - конечной аминокислоты, с использованием дл активации карбоксильных групп карбодиимидного метода и метода смешанных ангидридов и от полученного защищенного пептида, в случае необходимости, отщепл ют, имеющиес защитные группы.