PT87350B

PT87350B - Processo para a preparacao de peptideos com accao de inibicao de fosfolipase a2 e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT87350B
Application number: PT87350A
Authority: PT
Inventors: Wolfgang Konig; Peter Schindler
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-04-29
Filing date: 1988-04-28
Publication date: 1992-08-31
Also published as: IL86195A0; JPS63284197A; AU1526388A; KR880012640A; DK233088D0; EP0288965A2; PT87350A; ZA883033B; DK233088A

Description

Memória Descritiva

A presente invenção refere-se a peptídeos com acção de inibidor de fosfoiipase Ag cujo grupo cc -carboxilo C-terminal pode estar protegido por uma função éster ou amida, ou estar reduzido a um álcool.

Os inibidores de fosfoiipase Ag de tipo peptídico já conhecidos são a lipocortina e a plipastatina. A lipocortina, que pode ser formada por até 346 aminoácidos /~Β.P. Wallner et al., Nature 320 (1986) 77-81; K.-S. fíuang et al., Cell 46 (1986) 191-199; C. J. M. Saris et al., Cell 46 (1986) 201-2127, tem propriedades antigénicas ^/“F. R., Hirata et al, Proc. Natl Acad. Sei. USA 78 (1981) 31927 ^epor conseguinte tem uma aplicação terapêutica duvidosa.: As lipastatinas são decapeptídeos cíclicos que são produzidos

pelo Bacíllus Cereus (T. Nishikiori et al, J. of Antibiotics 39 (19θ6) 755-7617. A actividade das plipastatinas foi descri ta apenas para a fosfolipase A₂ isolada do pâncreas de porco, não tendo sido afirmada a sua importância para os processos inflamatórios. i

I !

A invenção resulta pois do problema de se descobrirem novos pept^deos que inibem a fosfolipase Α₂<

Este objectivo é solucionado de acordo com a invenção pelos peptídeos com acção de inibídores de fosfolipase A₂ cujo grupo α -carboxilo G-terminal está protegido por uma função éster ou por uma função amida, de fórmula geral I

L-B-A (I), em que

L pode estar ausente ou representa um radical lipófilo, B representa um aminoácido básico e

A representa um aminoácido aromático, assim como pelos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

São preferidos os radicais L, B e A que derivam de aminoácidos de ocorrência natural (ver por exemplo Schroder, Lubke, The Peptides, vol. I, Nova Iorque 1965, páginas 137-270) dos seus antípodas ou dos seus metabolitos simples.

radical 1 representa em especial um aminoácido lipófilo na configuração L ou D, N-terminal, protegido por radicais acilo lipófilos, como por exemplo aril- alcoxicarbonilo tendo 5 a 14 átomos de oarbono na parte arilo e 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, arilcarbonilo com 5 a 14 átomos de carbono na parte arilo, ou alquilcarbonilo com 1 a 17 átomos de carbono na par+e. alquilo; ou por radicais peptídicos constituídos por 1 a 4

- 2 I

aminoáoidos de ocorrência natural, que está ligado em configuração acilo ao grupo <2>-amino do aminoácido básico, ou representa um radical acilo lipófilo, como por exemplo aril-alquiloxicarbonilo tendo 5 a 14 átomos de carbono na parte arilo e 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, especialmen te benziloxicarbonilo, aril-alquilcarbonilo tendo 5 a 14 átomos de carbono na parte arilo e 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, espeeialmente indol-3-butirilo, arilcarbonilo com 5 a 14 átomos de carbono na parte arilo, especialmente indol-2-carbonilo; ou um radical alquilcarbonilo com a 17 átomos de carbono na parte alquilo, bem como os seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Os compostos de fórmula I preferidos são a queles em que

L representa isoleucina, leucina, metionina, cisteina protegida em S, valina, fenilalanina, triptofano ou naftilalanina eventualmente substituídos por halogénio, alquilo ou alcoxi, tendo cada um 1 a 4 átomos de carbono; tirosina, serina ou treonina substituídos no grupo hidroxi por alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; histidina substituída no átomo de azoto do anel imidazol por alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; ácido espárgico, ácido glutâmico ou ácido aminoadípiho esterifiçados na cadeia lateral por alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, ou postos na forma de amidas por meio de aminas lipófilas, como por exemplo alquilaminas com 1 a 6 átomos de carbono ou ciclohexilamina; ou lisina ou ornitina não substituídas ou substituídas no grupo ijj -amino por alquilcarbonilo com 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo; radicais lipófiloo como por exemplo benziloxicarbonilo, indol-3-butirilo ou indol-2-carbonilo, ou alquilcarbonilo com 1 a 17 átomos de carbono na parte alquilo (radicais de ácidos gordos);

- 3 V

í i

representa arginina ou homoarginina eventualmente alquilados no grupo guanidino com alquilo possuindo 1 a átomos de carbono, lisina, ornitina, hidroxilisina ou citrulina nas configurações L ou 1 e representa fenilalanina, triptofano, naftilalanina, tienilalanina ou ácido tetrahidro-isoquinolino-3-carboxílico eventualmente substituidos nos grupos aromáticos por 1 a 5 radicais iguais ou diferentes da série halogénio, alquilo ou alcoxi possuindo cada um a 4 átomos de carbono; ou tirosina eventualmente substituída no grupo hidroxi por alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, cada um nas configurações 1 ou D, cujos grupos carboxilo estão protegidos por ésteres alquilicos com 1 a 4 átomos de carbono, ou de aril-alquilo com 5 a 14 átomos de carbono na parte arilo e 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, ou pelo grupo amido, por radicais alquilamido primário com 1 a 4 átomos de carbono, por aril-alquilamido com 5 a 14 átomos de carbono na parte arilo e 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, e radicais peptídicos constituídos por até 4 aminoácidos de ooorrência natural, assim como os seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Como sais interessam particularmente sais com ácidos orgânicos ou inorgânicos, como por exemplo ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico, maleico, fumárico, cítrico, tartárico, e acético. Os centros de quiralidade nos novos peptídeos podem possuir, cada um, a configuração R, S ou R,S.

grupo alquilo pode ter cadeia linear ou ramificada. 0 mesmo é válido para radicais dele derivados, como por exemplo alcoxi e alquilearbonilo. São preferidos por exemplo metilo, metoxi e metanoilo.

Por radicais arilo com 5 a 14 átomos de carbono entendem-se também radicais heteroarilo, como por

exemplo fenilo, naftilo, bifenililo, fluorenilo, pirrolilo, imidazolilo, piridilo, e indolilo. São preferidos fenilo e indolilo. 0 mesmo é válido também para os radicais derivados daqueles, como por exemplo aralquilo, aralquiloxicarbonilo e áràlcarbonilo.

Halogénio significa fluor, cloro, bromo ou iodo, de preferência cloro ou bromo.

As aril-alquilamidas possuindo 5 a átomos de carbono no grupo arilo e 1 a 4 átomos de carbono no grupo alquilo derivam de preferência de aminas biógenas, como por exemplo fenetilamina, triptamina, serotonina, p-metoxifenetilamina, 3,4-dimetoxifenetilamina, p-hidroxifenetilamina, 3,4-dihidroxifenetilamina ou fenllalaninol.

L-B-A pode ser também um constituinte de um peptídeo mais longo ou de um oiclopeptídeo, podendo a estrutura L-B-A existir naqueles repetida, em parte ou no todo.

A invenção refere-se ainda a um processo para a preparação de peptídeos de fórmula I, o qual é caracterizado pelo facto de se acoplar um fragmento com um grupo carboxilo terminal, ou um seu derivado reactivo, com um correspondente fragmento com um grupo amino livre, de eventualmente se dissociarem um ou mais grupos de bloqueio introduzidos temporariamente para proteger outros grupos funcionais, e de se transformar o composto assim obtido nos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

A síntese dos peptídeos de acordo com a invenção é realizada de acordo com os métodos gerais da química doa peptídeos por construção em várias fases de extrimidades C-terminais ou por condensação de segmentos, como se encontra descrito minuciosa mente por exemplo em Wunsch. et al, Houben-Weyl, vol. 15/1 e 2 /Thieme, Estugarda 1974/.

No processo por meio de acoplamento por meio de segmentos deve ter-se em atenção para utilizar o mais possível métodos de acoplamento que não conduzem a racemização. Nos exemplos aqui apresentados utilizou-se para condensação de segmentos sobretudo o método do DCC/HOObt, que produz bons resultados com fraca racemisação durante a síntese de peptídeos.

A fosfolipase A₂ liberta ácido araquidónico de fosfolípidos /“G. J. Blackwell e R. J. Flower, Br. Med. Buli. 39 (1983) 260-2647» Como o ácido araquidónico é transformado através da cascata de icozanoido, em compostos como por exemplo prostaglandina e leucotrieno, através de uma inibição da fosfolipase A₂ pode-se impedir a formação destes metabolitos de ácido araquidónico com actividade inflamatória nas fases iniciais da biosíntese. Os inibidores de fosfolipase A₂ de acordo com a invenção são pois utilizáveis terapeuticamente especialmente nos casos em que a prostaglandina, por exemplo do tipo E₂, o leucotrieno, mas também tromboxano, participam desisivamente na patogénese ou no proces so patofiológico de manutenção. Contam^se entre estes sobretudo estados inflamatórios, alérgioos, reumáticos e autoimu nológicos, por exemplo asma de brônquios, febre dos fenos, alergias medicamentos, urticária, doenças da pele e eczemas e dermatites, febra reumática aguda, inflamações reumáticas das articulações e reumatismo mustular. Outros cam pos de aplicação são doenças do sangue, como anemias hemolíticas adquiridas, trombopenias idiopáticas, agranulocitose, mieloblastose, linfogranulomatose, hepatite, colite ulcerosa, síndroma neofrótico, doenças da pele como pênfigo, eritemas, dermatomiosite, bem como para o tratamento de reacções de rejeição depois de transplantações.

A invenção refere-se também, por conseguinte, à utilização dos peptídeos de fórmula I como medicamentos para as indicações acima referidas.

Os peptídeos de acordo com a invenção foram ensaiados com as fosfolipases A₂ provenientes de leu- 6 -

cócitos polimorfonucleádos (PMN’S). Como os PMN‘s pertencem ao tipo de células tue tomam parte essencial em processos ! inflamatórios /“D.F.Bainton em G. Weissmann (Ed). The Cell | Biology of Inflammation, Volume 2, ρ 1 e seguintes, Elsevier/Nobth Holland Biomedical Press, Amesterdão, 19807 esta descoberta assume uma importância particular no que se refere à sua utilização terapêutica. Como fontes de enzima foram utilizados PMN’s do peritoneu de coelhos isolados /Cunningham, J. Pathol. 128 (1979) 15-207 que foram tomaQ das numa concentração de 3x10 células/ml em água destilada e foram utilizadas tal qual para os ensaios. A determinação da concentração à qual a fosfolipase k^ é inibida em 50$ pelos compostos de acordo com a invenção (valor ΙΟ^θ) foi determinada de acordo com métodos correntes com auxílio de uma série de concentrações. As substâncias de ensaio foram para este efeito dissolvidas em 80 milimoles/litro de tampão tris-HCl (pH 7,5). 0 oálculo dos valores ΙΟ^θ foi realizado com auxílio de um programa de computador correspondente à igualdade.

+ na qual ^“iJ representa a concentração do inibidor utilizado

Inibição fosfolipase A₂

Exemplo	NS	IC_5Q( /imol/l
1.	Z-Lys-Tyr-OMe	530
2.	Z-Trp-Lys-Tyr-OMe	8,5
3.	Z-Trp-Lys-Tyr-NHg	10
4.	Z-Lys-Tyr-Phe-OMe	11
5.	H-Lys-Tyr-Phe-OMe	160
6.	Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-OMe	11
7.	Z-Lys-Tyr-Phe-NH₂	30
8.	Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂	3,1
9.	H-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂	26
10.	Z-D-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂	33
11.	H-D-Phe-CyL-Phe-D~Trp-Lys-Tyr(Et)-Cys-Thr--
	-ol	12
12.	Z-Phe-Lys-Phe-Tyr-OMe	37
13.	H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OtBu	21

14. Ac-Trp-lys-Trp-NH-(CH₂)₄CH₅

H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Trp-Cys-Thr-ol12

H-Arg-Tyr(tBu)-OtBu160

Fmoc-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu41

Fmoc-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu5,2

H-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu24

Z-Trp-Asp(OtBu)-Arg-Phe-NH₂16

H-Arg-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH220

Z-Asp(0tBu)-Arg-Trp-NH239

Z-Arg-Ile-Asp(0tBu)-Arg-Trp-NH213

H-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH₂90

Z-D-Phe-Trp-Lys-Tyr-Phe-OBzl c icle-(D-Phe-Trp-Lys-Tyr-Phe)220

Z-Lys-Lys-Tyr-Phe-OMe69

Fmoc-Arg-Tyr(tBu)-Phe-NH230

Fmoc-D-Arg-Tyr(tBu)-Phe-NH244

Z-Trp-Arg-Tyr-Phe-NH₂29

Z-Trp-D-Arg-Tyr-Phfe-NH₂28

Z-Trp-D-Lys-Tyr-Phe-NH₂34

Indolil-3-butiril-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH26,1

Indol il-3-butyril-Lys-Tyr-Phe-NH₂68

Indolii-2-carbon ii-Lys-Tyr-Phe-N^7,5

H-Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-Gly-OH 2,4

C‘l<;lo-(Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-Gly) 2,0 Z-Trp-D-Lys-Tyr-Ile-Lys-Pro-OBzl7,2

?.iclo(Trp-D-Lys-Tyr-I1e-Lys-Pro)69

Z-Trp-Lys-Tyr- benzilamida Z-Trp-Lys-Tyr -fenetilamida Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-ol Z-Trp-Lys-Tic-NI·^ Z-D-Phe-D-Tyr-D-Lys-D-Trp-NH₂

As substâncias são aplicadas principal· mente por via parentérica, nasal ou tópica. Todavia, também é possível uma aplicação p.o. se se pretender evitar, por meio de cápsulas apropriadas uma desagregação das substâncias sensíveis no estômago.

Exemplos

1. Z-Lys-Tyr-OMe la. Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-0Me, Ο^Η^Ι^Οθ (PM 613,7)

15,95 g de DCC (66 milimoles) são adicionados sob agitação a 0°C a uma solução de 25,08 g (cerca de 60-66 milimoles) de Z-Lys(Boc)-0H, 17,28 g (60 milimoles) de H-Tyr)tBu)-0Me. HC1 e 7,78 ml de N-etilmorfolina em 120 ml de dimetilformamida. Agita-se 2 h a 0°C e 6 h à temperatura ambiente. Deixa-se em repouso uma noite à temperatura ambiente, filtra-se para separação do sedimento e concentra-se 0 filtrado em vácuo. 0 resíduo é dissolvido em acetato de etilo e é extraído sucessivamente com água, solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, solução de hidrogenosulfato de potássio, solução de hidrogenocarbonato de sódio e água. A fase em acetato de etilo é seca com sulfato de sódio e concentrada. 0 resíduo cristaliza a partir de 200 ml de éter diisopropílico e 200 ml de éter de petróleo, Rendimento 30,95 g, p.f. 58-61°C -6,8° (c=l,

Metanol/.

lb. Z-Lys-Tyr-OMe-acetato, 0₂6^Η34^Ν3⁰ ₈ (PM 516,57)

2,5 g de Z-Lys(Boc)-Dyr(tBu)-OMe são dissolvidos em 40 ml de ácido trifluoracético aquoso a 90%. Deixa-se em repouso 2 h à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo, 0 resíduo é dissolvido em água e é triturado com um permutador iónico fracamente básico na forma acetato até se ajustar o pH a um valor entre 4 e 5.0 permutador iónico é removido por filtração e o filtrado é liofilizado.

Rendimento 1,87 g.

Para a purificação 800 mg da substância assim obtida são cromatografados através de uma coluna de slica-gel no sistema eluente cloreto de metileno/metanol/ /ácido acético/água a 80:20:1:1. As fracçães unitárias são reunidas e concentradas em vácuo. 0 resíduo é dissolvido em água e é liofilisado.

Rendimento: 322 mg, = + 4.2° ( (c=l, em ácido acético aquoso a 80$). Teor em peptídeo base de acordo com análise de aminoácidos: 88$.

2. Z-Trp-Lys-Tyr-OMe

2a. H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-OMe.HCl, ^C25^H42^C11^W3°6 (PM 516,08)

12,28 g (20 mmoles) de Z-lys(Boc)-Tyr)tBu)-0Me são dissolvidos em metanol e hidrogenados cataliticamente com hidrogénio, utilizando-se paládio/carvão. Deste modo o grupo amino posto na forma livre é titulado com ácido clorídrico metanólico IN por meio de um autotitulador a pH 4.5. Depois de terminada a reacção o catalisador é separado por filtração e concentra-se o filtrado. 0 resíduo solidifica mediante tratamento com éter dietílico/éter de petróleo (1:1) e pode ser isolado por filtração.

Rendimento 9,31 g, pf. 150-152°0, /73-/22 ss + 16,9° (c=l, metanol)

2b. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-OMe, (PM 800)

A uma solução de 6,0 g (10 mmoles) de H-Lys(Boc)-Tyr-(tBu)-OMe.HCl, 3,3 g (10 mmoles) de Z-Trp-0H e 1,86 g (10 mmoles) de HOBt em 50 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C mediante agitação 2,31 g de DCC. ProΊ cede-se depois como descrito no exemplo la. 0 resíduo cristalisa a partir de éter dietílico/éter de petróleo (1:1).

Rendimento 6,11 g.

Para purificação cromatografa-se em

200 g de sílica-gel utilizando o eluente cloreto de metileno/ /metanol a 95;5.

Rendimento 3,75 g, p.f. 132°C

- - 12,9° (c=l, em metanol).

2c. Z-Trp-Lys-Tyr-OMe-acetato Ο^Η^Ι^Οθ (PM 703,8)

1,5 g de Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-OMe são dissolvidos numa mistura formada por 20 ml de ácido trifluoracético aquoso a 90% e 4 ml de 1,2-dimercaptoetano. Deixa-se repousar uma hora à temperatura ambiente e concentra-se era vácuo. 0 resíduo é dissolvido era água e é agitado cora um permutador iõnico fracamente básico na forma acetato até se obter um pH de 3. 0 permutador de iões é removido por filtração e o filtrado é liofilisado.

Rendimento: 0,86 g

Para a purificação a substância anteriormente obtida é cromatografada em slica-gel com uma mistura de 275 ml de água, 90,5 ml de ácido acético e 778 ml de n-butanol. As fracções unitárias são reunidas e concentram-se em vácuo. 0 resíduo é dissolvido em água e liofilizado.

O O

Rendimento 677 mg ⁼ <

(c-1, em ácido acético a 10%).

Teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos: 87%.

3. Z-Trp-Lys-Tyr-NH₂

3a. Z-lys(Boc)-Tyr(tBu)-OH, C^2^H45^N3°8 (EM 599,7)

A uma solução de 12,28 g (20 mtnoles) de Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-0Me em 75 ml de dioxano adicionam-se 25 ml de água e 21 ml de soda cáustica IN. Passados 2,5 h o pH da solução é a justado ao valor 4 com hidrogenosulfato de potássio e concentra-se em vácuo até à secura. Reparte-se o resíduo entre uma solução de hidrogenosulfato de potássio/sulfato de potássio e acedsato de etilo. A fase em acetato é eitraída com água, é seca com sulfato de sódio e concentrada. 0 resíduo solidifica por trituração com éter diisopropílico e pode ser isolado por filtração.

Rendimento 6.56 g, pf. 119-121°C com decomposição, - ⁺ 5,3 (c=l, metanol)

3b. Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-NH₂, (PM 598,75)

A uma solução de 5,99 g (10 mmoles) de Z-Lys-(Boc)-Tyr(tBu)-OH e 1,52 g (10 mmoles) de HOBt-NH^ em 100 ml de dimetilformamida adicionam-se mediante agitação a 0°C 2,47 g (12 mmoles) de DCO. Agita-se 2 h a 0°0 e 2 h à temperatura ambiente e deixa-se em repouso um dia à temperatura ambiente. 0 sedimento é removido por filtração e o filtrado é concentrado em vácuo. 0 resíduo é triturado com solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. 0 sedimento é filtrado, lavado com solução de hidrogenosulfato de potássio e com água e é seco com pentóxido de fósforo em vácuo.

Rendimento 5,21 g

Para a purificação a substância é dissolvida a quente em 30 ml de metanol e é precipitada com 20 ml de água (banho de gelo). 0 sedimento é removido por filtração e seco.

Rendimento 4,87 g

Para a 2® purificação a substância é precipitada a partir de acetato de etilo/éter metil-t-bu- 13 -

tílico.

Rendimento 4,3 g, p.f. 153°G, p¹ = - 22,4° (o=l, em Metanol).

3c. H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-NH₂.HCl, ^C24^H41^C11^N4°5 (PM 501,07) g de Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-NH₂ são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2 a. 0 resíduo é triturado oom éter dietílico e filtrado.

Rendimento 2,14 g, pf. 187-189°C com o

decomposição, <#/_7 = + 18,5° (c=l, metanol)

3d. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-NH₂, Ο^Η^Ι^Οθ (PM 784,9)

A uma solução de 1,35 g (4 mmoles) de

Z-Trp-OH, 2,0 g (4 mmoles) de H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-NH₂.HGl, 0,57 g (4 mmoles) de HOBt e 0,52 ml (4 mmoles) de N-etilmorfo lina em 25 ml de dimetilformamida adiciona-se mediante agitação a 0°C 0,93 g (4,5 mmoles) de DCC. Trabalha-se como no exemplo la. 0 resíduo é dissolvido em 20 ml de metanol e precipita com 20 ml de água. 0 sedimento é removido por filtração e seco em vácuo com pentóxido de fósforo.

Rendimento

Γ)Ί decomposição, ^/2^= - 14,3°

2,05 g, pf. 158-160°E com (c=l, Metanol).

3e. Z-Trp-Lys-Tyr-NH₂-acetato, (PM 688,78)

1,5 g de Z-Trp-Jjys-, -Boc)-Tyr(tBu)-NH₂ são submetidos a reacção e purificados analogamente ao exemplo 2o.

Rendimento 851 mg, ~ ⁺ ^5° (c=l, ácido acético aquoso a 10%). Teor em peptídeo base de aoordo com a análise de aminoácidosí 87%.

4. Z-Lys-Tyr-Phe-OMe

4a. Z-Tyr(tBu)-Phe-OMe, C₃₁H₃₆N₂O₆ (PM 532,6)

A uma solução de 40,7 g de Z-Tyr (tBu) -OH, 21,6 g de H-Phe-OMe, HC1, 13,5 g de HOBt e 13 ml de N-etilmorfolina em 200 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C mediante agitação 22 g de DCC. Trabalha-se como no exemplo la. O resíduo e triturado com eter de petróleo, filtra-se e seca-se em vácuo.

Rendimento 50,3 g (94_#4%), pf. 1O3-1O4°C 2~a* -12,3° (c«l, em Metanol).

4b. H-Tyr(tBu)-Phe-OMe.HCl, ^C23^H31^C11^N2°4 <^{MG 434}'⁹⁾

49,5 g de Z-Tyr(tBu)-Phe-OMe são hidrogenados cataiiticamente em metanol analogamente ao exemplo 2a.

Rendimento 49 g de uma substância untuosa que não cristaliza.

4c. Z-Lys (Boc)-Tyr (tBu) -Phe-OMe, C₄₂ ^H5₆ ^N4°9 ^^{MG 76}°'⁹>

A uma solução de 21,5 g de H-Tyr (tBu) -Phe-OMe.HCl, 6,67 g de HOBt e 6,43 ml de N-etilmorfolina em 150 ml de dimetilformamida adiciona-se a 0°C sob agitação

27,67 g de Z-Lys (Boc) -OTcp. Agita-se 1 hora a 0°C e duas horas à temperatura ambiente e concentra-se. 0 tratamento pós-reactivo é realizado analogamente ao exemplo la. o resíduo é dissolvido num pouco de acetato de etilo e faz-se precipitar com éter de petróleo. 0 sedimento e removido por filtração e seco em vácuo.

Rendimento 29,1 g (77,4%) pf. 93-94°C, Ζ” ^a_7^ ^a -19,2° (c«l, em Metanol).

4d. Z-Lys-Tyr-Phe-OMe, ^α33^Η4ο^Ν ₄°₇ (MG 604,7)

0,8 g Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMe são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c.

o

Rendimento 0,44 g /” a_—7_D « -18,2 (c“l, em metanol).

Teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos; 81%.

5. H-Lys-Tyr-Phe-OMe

5a. H-Lys(Boc)-Tyr-tBu)-Phe-OMe.HCl, (MG

663, 2) g de Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMe são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a, 0 resíduo á tritutado com éter dietílico, filtrado e seco em vácuo.

Rendimento 22,4 g (92 %), pf. 145-147°C £ α + 18, 2° (ol, em Metanol) ·

5b.

H- Lys-Tyr-Phe-OMe- acetato, ^G27^H38^N4°7 ^{(MG 53o}'⁶⁾

0,4 g de H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMeHC1 são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c.

o

Rendimento 293 m g, =+16,0° (c=lf em metanol). T_eor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos; 66%.

6. Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-OMe

6a. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMe, ^α53^Η66^Ν ₆°₁₀(MG 947,16)

A uma solução de 1,58 g (4,7 milimoles) de Z-Trp-OH, 3,11 g (4,7 milimoles) de H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMe.HCl, 0,64 g (4,7 milimoles) de HOBt e 0,6 ml (4,7 milimoles) de N-etilmorfolina em 35 ml de dimetilformamida

adiciona-se a 0°C mediante agitação 1,07 g (5,2 milimoles) de DCC. No restante procedimento como no exemplo la. 0 resíduo e dissolvido em metanol e precipitando com água. 0 sedimento e removido por filtração e é seco em vácuo com pentóxido de fósforo.

Rendimento 5,21 g, ponto de fusão 158-159°C “ -25,5° (c*l, em dimetilformamida).

^D ! 6b. Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-OMe-acetato, (MG 850,9) .

i

I

0,947 g (1 milimole) de Z-Trp-Lys (Boc)-Tyr (tBu)-Phe-OMe são submetidos a reacção analogamente I ao exemplo 2c. 0 resíduo e triturado com eter metil-t-butílico e filtra-se. 0 composto é recristalizado em metanol.

Rendimento 0, 28 g.

j

A substância acima obtida & dissolvida completamente em 1,5 ml de ácido acético, diluída com 150 ml de água e liofilizada, α* -1,7° (c«l, em água)

Teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidost 88%.

I

7. Z-Lys-Tyr-Phe-NH₂

7a. Z-Tyr-(tBu)-Phe-NH₂, C_1QH₃₅N₃O₅ (MG 517,6)

A uma solução de 19, 9 g (53 milimoles) de Ζ-Tyr(tBu)-OH, 10 g (50 milimoles) de H-Phe-NH₂.HC1, 6,8 g (50 milimoles) de HOBt e 6,7 ml (50 milimoles) de N-etilmorfolina em 75 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 11,33 g (55 milimoles) de DCC. Agita-se 1 hora a 0°C e em seguida deixa-se em repouso 1 noite à temperatura ambiente. O sedimento e isolado por filtração e o filtrado e concentrado. 0 resíduo é triturado com solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. 0 sedimento é removido por filtração

- 17 - !

e lavado com água. A substância ainda húmida é fervida com 150 ml de metanol e deixa-se arrefecer durante 1 noite.

Rendimento 23,1 g, pf. 182°C

- 3,6° (c=l, em ácido acético).

7b. H-Tyr(tBu)-Phe-NH₂.HCl, C^H^CljN^ (MG 419,96)

22,43 g de Z-Tyr(tBu)-Phe-NH₂ são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a. 0 resíduo é triturado com éter dietílico.

Rendimento 17,45 g, ponto de fusão 130-140°C com decomposição, +56,1° (c=l, em ácido acético).

7o. Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂, θ₄₁Η₅₅Ν₅0θ (MG 745,9)

A uma substância de 16 g (42 milimoles) de Z-Lys(Boc)-OH, 16.76 g (40 milimoles) de H-Tyr(tBu)-Phe-NH₂.HC1, 6,56 g (40 milimoles) de HOObt e 5,12 ml (40 milimoles) de N-etil-morfolina em 100 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 9,27 g (45 milimoles) de DCC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo 7a. Recristaliza-se em etanol anidro.

Rendimento 21,41 g, ponto de fusão 208°C = -54,7° (c-1, em dimetilformamida).

7d. Z-Lys-Tyr-Phe-NH₂, C^H^Og (MG 589,7)

5,75 g (5 milimoles) de Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂ são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c. 0 resíduo é dissolvido em água e é ajustado a pH 6 com solução de hidrogenocarbonato de sódio. A solução aquosa é extraída com acetato de etilo e em seguida com solução saturada de cloreto de sódio. Finalmente dá-se a cristalização.

Rendimento 2,41 g.

A partir de etanol absoluto recristaliza-se.

Rendimento 1,82 g, = -9,7° (o=l, em ácido acético aquoso a 80$). Teor em peptideo base de acordo com a análise de aminoácidoss 52$.

8. Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂

8a. H-lys(Boc)-Tyr-tBu)-Phe-NH₂.HCl, C^H^Cl·^^ (MG 647,25) g de Z-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a.

Rendimento 10,7 g ponto de fusão 203-205° com decomposição, £~ ⁺ 12,8° (o=l, em metanol).

8b. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr)tBu)-Phe-NH₂, Ο^Η^ΝγΟθ (MG 932,15)

A uma solução de 2,7 g (8 milimoles) de Z-Trp-OH, 5,1 g (8 milimoles) de H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂.HC1, 1,31 g (8 milimoles) de HOObt e 1,02 ml (8 milimoles) de N-etilmorfolina em 50 ml de dimetilformamida adiciona-se a 0°C sob agitação 1,85 g (9 milimoles) de DOO. Agita-se 1 hora a 0°C e deixa-se repousar 1 noite à temperatura ambiente, 0 sedimento é isolado por filtração e o filtrado é concentrado em vácuo. 0 resíduo é dissolvido em 100 ml de acetato de etilo. A esta solução adicionam-se 100 ml de éter dietilico e arrefece-se. 0 sedimento é removido por filtração e seco em vácuo.

Rendimento 6,11 g, ponto de fusão 186°C com decomposição, C - -3²,6° (c=l, em dimetilformamida·

8o. Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-NR₂, (MG 775,9)

2,0 g de Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂ são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c.

resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado. A substância é triturada com solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio e agita-se 1 hora. 0 sedimento é removido por filtração e recristalizado em etanol.

Rendimento 0,98 g, = -7,5° (o=l, em ácido acético aquoso a 80%). Teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos: 70%).

9. H-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂-diacetato, ^42^51^7% (MG 797,9)

500 mg de Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂ são hidrogenados cataliticamente em ácido acético aquoso a 90% utilizando®se paladio/carvão. Depois de terminada a hidrogenação o catalisador é recuperado por filtração e o filtrado é concentrado. 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtra-se. Seguidamente a substância é triturada com etanol, filtra-se e lava-se com uma mistura de etanol/éter dietílico e seca-se em vácuo.

Rendimento 500 mg, - + 6,5° (c= 1, em ácido acético a 80%). Teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos; 74%.

10. Z-D-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂

10a. Z-D-Trp-lys(Boo)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂, 0₅₂ ^Η65^Ν7°9 (MG 932,15)

Preparado como descrito no exemplo 8b.

p.f. 192-194°C Z^_7p⁹= -21,3° (c=l, em Dimetilformamida).

10b. Z-D-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂, Ο^Η^ΝγΟγ (MG 775,9)

Submetem-se a reacção analogamente ao exemplo 8c 2 g de Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂.

Rendimento 0,98, ~ “7,5° (c=l, em ácido acético aquoso a 80%). Teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos 70%.

I “Ί

11. H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Iys-Tyr (Et/-Cys-Thr-ol

11a. Z-D-Trp-Lys(Boc)-OH, O^H^N^O? (PM 566,6)

A uma suspensão de 19,71 g de H-Lys(Boc 11,38 g de HOBt em 160 ml de dimetilformamida adicioà temperatura ambiente e sob agitação 41,43 g de Z-D)-0H e na-se

-Trp-OOcp. Depois de 4 horas de agitação à temperatura ambiente todas as substâncias estão dissolvidas. Deixa-se repousar uma noite e concentra-se em vácuo. 0 resíduo é submetido a uma repartição em oontracorrente em 3 fases, em porções de 400 ml, entre acetato de etilo e solução semisaturada de hidrogenocarbonato de sódio. As 3 fracções em acetato de etilo são reunidas e extraídas com solução de hidrogenosulfato de potássio/sulfato de potássio e água, secam-se com sulfato de sódio e concentram-se. 0 resíduo é triturado com éter de petróleo, filtrado e seco.

Rendimento 55,6 g.

Para purificação posterior a substância é cromatografada através de 600 g de slica-gelo Primeiro eluiu-se apenas com cloreto de metileno e depois com uma mistura de cloreto de metileno/metanol/água a 80:20:5,

Rendimento 45,2 g, ponto de fusão 94°C com decomposição zyo~ ⁺θ»7° (°=1, ^em metanol).

- 21 11b.

H-D-Trp-Lys(Boc)-OH-acetato, (MG 492,6

g de Z-D-Trp-Lys(Boc-OHsão dissolvidos em I5OO ml de ácido acético aquoso a 90$ e hidrogenados cataliticamente com hidrogénio utilizando-se paládio/ /carvão. Depois do termo da reacção 0 catalisador é recuperado por filtração e concentra-se 0 filtrado. 0 resíduo é triturado com éter, filtrado e seco em vácuo.

Rendimento 32 g (89$), -52,4^o (o=l, Metanol).

11o. Z-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-OH-Ciclohexilamino, °45^Η60^Ν6°8 ⁸¹⁵’°>

A uma solução de 31,53 g de H-D-Trp-Lys(Boc)-0H-acetato e 9,11 g de HOBt em 150 ml de dimetilfor mamida adiciona-se à temperatura ambiente e sob agitação 25,37 g de Z-Phe ONSu. Agita-se 4 h à temperatura ambiente e deixasse repousar uma noite à temperatura ambiente. No dia seguinte adicionam-se 450 ml de água e 64 ml de solução saturada de hidrocarbonato de sódio. 0 sedimento é separado por filtração e bem lavado com água e seco com pentóxido de fósforo.

Rendimento 45,4 g (94,4$)

A substância anteriorrnente obtida é repartida entre acetato de etilo, a que se adicionou um pouco de n-butanol, e solução de hidrogenosulfato de potássio/ /sulfato de potássio. A fase em acetato de etilo/n-butanol é seca sobre sulfato de sódio e concentrada. 0 resíduo é dissolvido em acetato de etilo e misturado com 7,3 ml de ciclohexilamina. Mantem-se uma noite a 4°C e filtra-se depois para isolamento do sedimento. Este é novamente fervido em 350 ml de acetato de etilo, arrefecido, filtrado e seco.

Rendimento 39,5 g (75,9$) pf 148-152°C

— -22 ο com decomposição, / ^α—<d ^{β 6} (^C3,l» ^em Metanol), lld. H-Phe-D-Trp-Lye(Boc) -OH, C^H^Ng 0_fi (MG 579,7) g de Z-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-OH.Ciclohexilamina são repartidas entre acetato de etilo e 48 ml de ácido sulfórico IN, mediante arrefecimento por gelo. A fase em acetato de etilo e extraída com solução de hidrogenosulfato de potássio/sulfato de potássio e água, seca-se com sulfato de sódio e concentra-se. 0 resíduo á dissolvido em 600 ml de ácido acético a 90% e e hidrogenado cataliticamente com hidrogénio na presença de paládio/carvão. Depois de terminada a reacção o catalisador é recuperado por filtração e o filtrado é concentrado. 0 resíduo e triturado com éter, filtrado e seco.

Rendimento 28,7 g

A substância é recristalizada em isopropanol.

Rendimento 21,85 g (78,6%) pf. 142-144°C 22 o com decomposição α« + 41 (c=»l, em metanol) lie. Fmoc-Cys(StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-OH, ^C53^H64^N6°9^S2 ^{(MG 993}'³⁾

A uma suspensão de 5,8 g de H-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-OH e 1,42 g de HOBt em 20 ml de dimetilformamida adiciona-se à temperatura ambiente e sob agitação 6,11 g de Fomc-Cys(StBu)-OTcp. Agita-se 4 h à temperatura ambiente e deixa-se repousar uma noite à temperatura ambiente. A mistura reactiva é concentrada em vácuo e o resíduo é dissolvido em acetato de etilo e e extraído sucessivamente com água, solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, solução de hidrogenosulfonato de potássio/sulfato de potássio e água, seca-se com sulfato de sódio e concentra-se, 0 resíduo é triturado com éter de petróleo e filtrado.

Rendimento 8,18 g

Para a purificação a substância anterior mente obtida é cromatografada através de 100 g de silica-gel. Como eluente é utilizado 1° cloreto de metileno e seguidamente uma mistura de cloreto de metileno/metanol a 80:20. As fracções unitárias são reunidas, concentradas em vácuo e o resíduo é triturado com éter de petróleo e filtrado.

Rendimento 6,42 g (64,6%) pf. 126-132°C — — 25 o com decomposição, / α_/ * -68,4 (c=l, em Metanol).

llf. Fmoc-Cys(StBu)-Thr-ol, ^G ₂6^H34^N2°5^S2 ⁵¹⁸'⁷>

A uma solução de 5,36 g (20 mmoles) de H-Thr-ol-HOObt em 35 ml de dimetilformamida adicionam-se e 0 C e sob agitação 12,2 g de Fmoc-Cys(StBu)-OTcp. Agita-se 1 hora a 0°C e 4 h à temperatura ambiente, concentra-se em vácuo e dissolve-se o resíduo em acetato de etilo. A fase em acetato de etilo é extraída sucessivamente com água, com solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, com solução de hidrogenosulfato de potássio/sulfato de potássio e água, seca-se com sulfato de sódio exconcentra-se. A substância é lavada com eter de petróleo.

Rendimento 6,63 g, pf. 155°C com de- o

composição, £ α^a + 86,5 (c«l, em metanol).

llg. H-Cys (StBu) -Thr-ol. HOObt, gH₂9^N5°5^S2 (MG 459,6)

A uma solução de 6,47 g (12,5 mmoles) de Fmoc-Cys(StBu)-Thr-ol em 55 ml de dimetilformamida adicionam-se 12,87 ml (125 mmoles) de dietilamina. Deixa-se em repouso 5 min. à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 resíduo é dissolvido em metanol. Filtra-se para eliminar os insolúveis. 0 filtrado é misturado com 2,03 g (12,5 mmoles) de HDObt e concentrado. 0 resíduo é triturado com eter dietílico, filtrado e seco em vácuo.

_ -23

Rendimento 5,25 g# amorfo# / * « -26#3° (c®l, em metanol).

llh. Fmoc-Tyr (Et) -Cys (StBu) -Thr-ol# ^C37^H4g^N3°7^S2 (MG 710# 9)

A uma solução de 4#31 g (10 mmoles) de Fmoc-Tyr (Et)-OH e 4# 58 g (10 mmoles) de H-Cys(StBu)-Thr-ol. .HOObt em 40 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 2# 26 g (11 mmoles) de DCC. Procede-se depois como descrito no exemplo la. 0 resíduo 6 triturado com éter dietílico# filtrado e seco em vácuo.

Rendimento 5,61 g.

Para a purificação a substância é cromatografada em silica-gel. Elui-se primeiro com uma mistura de cloreto de metileno/metanol a 95:5 e posteriormente com cloreto de metileno/metanol a 90:10. As fracções unitárias são reunidas e concentradas em vácuo. O resíduo e triturado com éter dietílico# filtrado e seco.

Rendimento 4,5 g# pf. 126 C /~ α 7_ ^β ο “* ^D

73#4 (c*l» em Metanol).

lli. H-Tyr(Et)-Cys(StBu)-Thr-ol, C₂₂H₃₆N₃O₆S₂ (MG 503# 2)

A uma solução de 4#35 g (6 mmoles) de Fmoc-Tyr (Et)-Cys (StBu)-Thr-01 em 20 ml de dimetilformamida adicionam-se à temperatura ambiente mediante agitação 6# 2 ml (60 mmoles) de dietilamina. Agita-se 5 minutos à temperatura ambiente# concentra-se e tritura-se o resíduo com éter dietílico.

Rendimento 2#68 g (88#7%)# pf. 113°C » -69# 8^o (c=l# em metanol).

llk. Fmoc-Cys (StBu) -Phe-D-Trp-Lys '3oc) -Tyr (Et) -Cys-StBu) Thr-ol# ^c ₇₅H₉₉N₉O₁₃S₄ (MG 1462# 7) de de

4, 26

2,16 (4,3 g (4,3 mmoles) g (4,3 mmoles) mmoles) de HOObt o_ . ·. _«

A uma solução de Fmoc-Cys(StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)OH Η-Tyr (Et) rCys (StBu) -Thr-ol e 0, 72 g 15 ml de dimétilformamida adicionam-se a 0^wC sob agitação em g (4,5 mmoles) de DCC e trabalha-se depois analogamente ao exemplo 7a. A substância bruta 4 triturada com eter dietílico, seca-se e em seguida precipitada a partir de 60 ml de metanol e 30 ml de água. 0 sedimento e removido por filtração e seco em vácuo nom P^g.

Rendimento 5,26 g (83,7 %)

1. H-Cys (StBu) -Phe-D-Trp-Lys (Boc) -Tyr (Et) -Cys (StBu) -Thr °1, C6o^H89^N9⁰11^S4 ^{(MG 124O}'⁵⁾

A uma solução de 5, 26 g (3,59 mmoles) de Fmoc-Cys (StBu)-Phe-D-Trp-Lys (Boc)-Tyr (Et)-Cys(StBu)-Thr-ol em 15 ml de dimétilformamida adicionam-se à temperatura antoiente sob agitação, 14,36 ml (35,9 mmoles) de uma mistura de dietilamina-dimetilformamida. Passados 5 minutos concentra-se em vácuo e o resíduo á triturado com áter dietílico. 0 sedimento á separado por filtração e seco.

Rendimento 3,93 g, pf, 145-147°C com 22 o decomposição, o_7_D * -81,8 (c=»l, em Dimétilformamida) llm. Boc-D-Phe-Cys (StBu) -Phe-D-Trp-Lys (Boc) -Tyr (Et) -Cys (StBu)-Thr-ol, C74^hiq6ⁿio°14^S4 ^{(MG 1487}'⁷>

A uma solução de 0,87 g (3,3 mmoles) de Boc-D-Phe-OH, 3,7 g e (3 mmoles) de H-Cys(StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr (Et)-Cys (StBu)-Thr-ol e 0,54 g (3,3 mmoles) de HOOBt em 15 ml de dimétilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 0,72 g (3,5 mmoles) de DCC e trabalha-se analogamente ao exemplo 7a. A substância bruta é precipitada com 20 ml de água a partir de 20 ml de metanol.

Rendimento 4,29 g pf. 212-213°C com 'X.mf_a;χ./-^..'h:'z?-.· -·_:,·._Μ ........

_ 2 ο q decomposição, / ^α—* ^{66/ 2} ^^Ca‘^^{/ em D}i^metilf°^rmamida).

1ln. H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Tyr(Et)-Cys-Thr-oldiacetato, ^C5Q^HgQ^Ni₀°i4^S2 ¹²²⁹'⁵)

A uma solução de 4,16 g (2,9 mmoles) de Doc-D-Phe-Cys(StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Tyr (Et)-Cys (StBu)-Thr-ol em 50 ml de trifluoretanol adicionam-se 3,5® ml de tri-n-butilfosfina. Agita-se 4 horas à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 residuo é triturado com acetato de etilo/áter de petróleo e filtrado.

Rendimento 2, 24 g.

A substância obtida acima (1,71 mmoles) á dissolvida em 150 ml de ácido acético e e adicionada gota a gota sob agitação à temperatura ambiente a uma mistura de 1500 ml de ácido acético, 34,52 ml de solução O,1N de iodo, 500 ml de água e 471 mg de acetato de sódio trihidratado. Agita-se 5 minutos d descora-se o excesso de iodo com solução aquosa de ácido ascorbico. A mistura reactiva é concentrada em vácuo e o resíduo á triturado com água. 0 sedimento e filtrado, é bem lavado com água e seco com pentóxido de fósforo em vácuo.

Rendimentos 2,07 g.

Para uma purificação posterior 1 g da substância obtida anteriormente é cromatografada em sílica-gel utilizando-se cloreto de metileno/metanol a 9sl. As fracçães unitárias são reunidas e concentradas em vácuo.

Rendimento 690 mg.

680 mg da substância acima obtida são tratados analogamente ao exemplo 2c. O diacetato bruto (rendimento 451,3 mg) é cromatografada para purificação, uti(r) lizando-se cromatografia de repartição em S_ephadex 1H 20.

J é saturado com uma mistura ácido acético e 778 ml de n-butauma mistura de 4300 ml de água, de ácido acético.

— 9^ o

Rendimento 306 mg, £ a« -65,8 em ácido aeético a 1%).

c, (R)

Neste caso o Sephadex LH de 275ml de água, 90,5 ml de nol. Como eluente utiliza-se 430 ml de n-butanol e 350 ml (e»l_#

12. Z-Phe-Lys-Phe-Tyr-OMe

12. Z-Phe-Tyr-OMe, ^27^8^6 (MG 476,5)

A uma solução de 14,95 g (50 mmoles) de Z-Phe-OH, 11,58 g (50 mmoles) de H-Tyr-OMe.HCl, 7 g (50 mmoles) de HOBt e 6,4 ml de N-etilmorfolina em 150 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C e mediante agitação 11,33 g (55 mmoles) de DCC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter de petróleo.

Rendimento 21,2 g (89 %), pf. 127°C / - 15,1° (c =* 1, em Metanol).

12b. H-Phe-Tyr-OMe.HCl. ^{ÍM3 378}'⁸>

9,52 g (20 mmoles) de Z-Phe-Tyr-OMe são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a. 0 resíduo á triturado com éter dietílico.

Rendimento: 7,05 g, pf. 128-131°C, / ®_7_D · +7,6 (c“lf em Metanol).

12c. Z-Lys (Boc)-Phe-Tyr-OMe, C^H^N^ (MG 704,8)

A uma solução de 6,84 g (18 mmoles) de Z-Lys(Boc)-OH, 6,82 g (18 mmoles) de H-Phe-Tyr-0MeH21_# 2,43 g (18 mmoles) de HOBt e 2,3 ml (18 mmoles) de N-etilmorfolina em 60 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 4, 2 g de DCC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo la.

O resíduo á triturado com eter dietílico.

filtrado e seco

Rendimento 4,48 g, pf. 98°C, α_7ρ^1β -9,2° (c«l, em Metanol).

12d. H-Lys(Boc)-Phe-Tyr-OMe.HC1, C_3Q ^H43^C11^N4°7 (MG 607,16)

4,3 g de Z-Lys(Boc)-Phe-Tyr-OMe são hidrogenados jcataliticamente analogamente ao exemplo 2a. 0 resíduo e triturado com eter dietílico.

Rendimento 3,65 g, pf. 132°C, / -4,0° (c=l, em Metanol)

A uma solução de 1,79 g (6 mmoles) de Z-Phe-OH, 3,64 g (6 mmoles) de H-Lys(Boc)-Phe-Tyr-OMe.HC1, 0,81 g (6 mmoles) de HOBt e 0, 77 ml de N-etilmorfolina em 35 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 1,35 g (6,6 mmoles) de DCC. A mistura reactiva á tratada analogamente ao exemplo 7a. 0 resíduo bruto e dissolvido em 30 ml de metanol e faz-se precipitar com 30 ml de água.

Rendimento 6,19 g, ponto de fusão, 151°C / 4-7^ * ^em dimetilformamida).

12f. Z-Fhe-Lys-Phe-Tyr-OMe-acetato, (MG 811,9)

C„H„N_cO._a

53 5 10 de Z-Phe-Lys(Boc)-Pheexemplo 2c. 0 resíduo

0,852 g (1 mmol)

-Tyr-OMe são tratados analogamente ao e trittnrado com áter metil-t-butílico e em seguida e recristalizado em metano1/água.

Rendimentos 0,34 g

A substância obtida anteriormente á dissolvida em 2 ml de ácido acético. A solução é misturada com 150 ml de água e liofilizada.

Rendimento 231 mg, ponto de fusão 2O5°C, a. 7^1 _w 19,8° (c»l, em dimetilformamida).

A_nálise de aminoácidos: Phe 2,0, Tyr 0,78, Lys 1,0; teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos: 91%.

13. H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OtBu

13a. Fmoc-Lys (Z)-Phe-OtBu, (MG 705,86)

A uma solução de 5,03 g (10 mmoles) de Fmoc-Lys (Z)-OH, 2,6 g (10 mmoles) de H-Phe-OtBu.HCl, 1,35 g (10 mmoles) de HOBt e 1,3 ml (10 mmoles) de N-etilmorfolina em 50 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 2, 2 g de DCC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter dietílico, filtrado e seco.

o

Rendimento 6, 2 g, ⁼ “6/74 (c=l, em ácido acético aquoso a 90%)

13b. Fmoc-Lys (Z)-Phe-OH, CggH^N^ (MG 649,75)

2,95 g de Fmoc-Lys(Z)-Phe-OtBu são dissolvidos em 30 ml de ácido trifluoracético em solução aquosa a 90%. D_eixa-se repousar uma hora à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 resíduo á triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 2,3 2 g

13c. Fmoc-Leu-Lys(Z)-Phe-OtBu, Ο^θΗ^ί^Οθ (MG 819,0 2)

A uma solução de 3,17 g (4,5 mmoles) de Fmoc-Lys(z)-Phe-OtBu em 20 ml de dimetilformamida, adicionam30

-se 4,7 ml (45 mmoles) de dietilamina. Agita-se 10 minutos à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 resíduo á dissolvido num pouco de cloreto de metileno, filtra-se e á purificado cromatograficamente atravás de silica-gel. Utiliza

-se como eluente 12 cloreto de metileno para remover as impu- ; rezas em forma de solução, e posteriormente, para eluição do ί tripáptideo, uma mistura formada por cloreto de metileno/me- i i tanol a 95:5.

Rendimento2,3 g de uma substância oleosa».

A uma solução de 1,53 g (4,5 mmoles) de Fmoc-Leu-OH, 2,3 g de H-Leu-Lys(Z)-Phe-OtBu acima obtidos í e 607,5 mg de HOBt em 20 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 940 mg de DCC. A mistura reactiva 6| tratada analogamente ao exemplo la. 0 resíduo á triturado com | éter dietílico, filtrado e seco em vácuo.

j Rendimento 2,7 g)

13d. Fmoc-Lys (Z)-Phe-Leu-Lys (Z)-Phe-OtBu, (MG 1244,5)

A uma soltção de 2,67 g (3,26 mmoles) de í Fmoc-Leu-Lys(Z)-Phe-OtBu em 20 ml de dimetilformamida adicionam-se à temperatura ambiente 3,42 ml (32,6 mmoles) de dieti- ί lamina e agita-se 10 minutos à temperatura ambiente. Trabalha-se analogamente ao exemplo 13c.

Rendimento 2 g de uma substância oleosa .

A uma solução de 2, 2 g (3, 27 mmoles) de Fmoc-Lys(Z)Phe-OH, 2 g do óleo obtido acima e 533 mg de HOObt em 20 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 720 g de DCC. A mistura á tratada analogamente ao exemplo 7a.

Rendimento 3,14 g, pf. 178-182°C,

2 £* - 20,8° (c»l, em ácido acético em solução aquosa a 90%).

13e.

H-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-OtBu-triacetato, ^C46^H75^N7°12 ^{(MG 918}'^1}

g de Fmoc-Lys(Z)-Phe-Leu-Lys(Z)-Phe-OtBu são dissolvidos em 20 ml de ácido acético aquosa a 90% e hidrogenados cataliticamente na presença de paládio/carvão. Depois do termo da reacção o catalisador é recuperado por filtração e concentra-se o filtrado. A substância que fica como resíduo e triturada com áter dietílico e filtrada.

Rendimento 750 mg

A substância e cromatografada através de silica-gel para purificação. Como eluente utiliza-se uma mistura de 450 ml de cloreto de metileno, 200 ml de metanol. 150 ml de metilglicol, 100 ml de água e 5 g de acetato de amónio·

Rendimento 450 mg, £ *-7^ “ -25,5° (c«l, em água).

Análise de aminoácidos: Leu 1,0; Phe

I, 96; Lys 2,03; teor de peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos : 62%.

14. Ac-Trp-Lys-Trp-NH-(CH₂)₄-CH₃

14a. Z-Trp-n-pentilamida, ^C24^ÍÍ29^N3°3 (M^{0 407}*⁵)

A uma solução de 16,9 g (50 mmoles) de Z-Trp-OH, 4,35 g (50 mmoles) de N-pentilamina e 7 g de HOBt em 100 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação :

II, 33 g (55 mmoles) de DCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. 0 resíduo á recristalizado em áter dietílico/áter de petróleo a ltl.

Rendimento: 18,35 g (90%) pf. 146°C, £ α* -22,3° (c=*l, em dimetilformamida)

D i

14b. H-Trp-n-pentilamido.HCl, ^C16^H24^C1A^O1 (M3 309,85)

16,28 g (40 mmoles) de Z-Trp-n-pentilamida são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a. 0 resíduo separa-se cristalinamente a partir de éter dietílico/éter de petróleo.

Rendimento 12,28 g (99%), pf. 152°C, £ a« + 44,1° (c”!, em Metanol).

14c. Z-Lys(Boc)-Trp-n-pentilamida C35H49N5O6 (MG 635,8)

A uma solução de 6,2 g (20 mmoles) de H-Trp-n-pentilamida.HCl, 7,6 g (20 mmoles) de Z-Lys(Boc)-0H, 2,7 g de HOBt e 2,56 ml (20 mmoles) de N-etilmorfolina em 70 ml de dimetilformamida adicionaram-se a 0°C sob agitação 4,73 g (23 mmoles) de DCC. A mistura reactiva á tratada analogamente ao exemplo la. A substância cristaliza a partir de éter dietílico/éter de petróleo.

Rendimento 11 g (86,6%), pf. 126°C Z ^a--7_D “ -14,1 (c^al, em dimetilformamida).

14d. H-Lys(Boc)-Trp-n-pentilamida.HCl, ^C27^H44^C11^N5°4 (MG 538,1)

9,52 g (15 mmoles) de Z-Lys (Boc)-Trp-n-pentilamida são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a. 0 resíduo cristaliza a partir de éter dietílico

Rendimento 5,91 g, pf. 100-128°C com decomposição, £ “ + 23, 6^o (c=»l, em Metanol).

14e. Z-Trp-Lys(Boc)-Trp-n-pentilamida C₄₆H_5gN₇0_? (MG 822)

A uma solução de 5,38 g (10 mmoles) de H-Lys(Boc)-Trp-n-pentilamida.HCl, 3,38 g (10 mmoles) de Z-Trp-OH, 1,4 g (10 mmoles) de HOBt e 1,28 ml (10 mmoles) de

N-etilmorfolina em 40 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 2,47 g (12 mmoles) de DOC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo la. A substância bruta é precipitada em etanol/água, é filtrada e seca com pentóxido de fósforo.

Rendimento 5,63 g, pf. 188-190°C com p η λ decomposição, = -22,7° (c=l, em Dimetilformamida).

14f. H-Trp-Lys(Boc)-Trp-n-pentilamida.HC1,

C^gH^Cl-jlLjOs )MG 724,36)

3,7 g (4,5 mmoles) de Z-Trp-Lys(Boc)-Trp-n-pentilamida são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a. 0 resíduo cristaliza em éter dietílico.

Rendimento 3,04 g (93%), pf 200-202°C p Ί λ com decomposição, = + 4,2° (c=l, em Metanol)

14g. Ac-Trp-Lys(Boc)-Trp-n-pentilamida °4O^H44^N6°6 ^{(MS 704}-⁸⁴⁾

A uma solução de 2,89 g (4 mmoles) de H-Trp-Lys(Boc)Trp-n-pentilamida.HCl e 0,51 ml (4 mmoles) de N-etilmorfolina em 25 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 0,7 g de acetato de N-hidroxisuccinimido. Deixa-se repousar uma noite à temperatura ambiente e concentra-se. 0 resíduo é triturado com água, filtrado e seco com pentóxido de fósforo. A substância é dissolvida a quente em 75 ml de metanol e é misturada também a quente com 40 ml de água. Arrefece-se a 0°C. Deste podo a substância cristaliza.

Rendimento 2,52 g, pf. 192-194°C com p γ _ deoomposição, = -20,3° (c=l, em Dimetilformamida).

14h. Ac-Trp-Lys-Trp-n-pentilamida-triac etato

C₄₁H₅₉N₇O_1O (MG 809,9)

- 34 í‘s ' g de Ac-Trp-Lys(Boc)-Trp-n-pentilamida são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c. 0 j resíduo é triturado com éter metil-t-butílico e filtrado. Seguidamente a substância é triturada com solução de hidrogenocarbonato de sódio, filtrada e lavada com água. A substância assim obtida é dissolvida em 50 ml de ácido acético a 3%. Filtra-se para eliminar os insolúveis e liofiliza-se o filtrado.

(o=l, se de

15.

15a.

-OH e ml

Rendimento 798,3 mg, Z”íX/_7·^⁰ = +21,5° em água), teor de peptídeo base de acordo com a análiaminoáoidos : 71%.

I----------------------------------------------------------1

H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lye-Trp-Cys-Thr-ol

Fmoc-Trp-Cys)StBu)-Thr-ol, C yH^^N^^O^Sg (MG 704,9)

A uma solução de 2,13 g de Fmoc-Trp2,3 g de H-Cys)StBu)-Thr-ol.HOOBt (ver exemplo llg) em de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 1,13 g de DC0_o

A mistura resíduo é em vácuo.

turada 30 reactiva é tratada analogamente ao exemplo la. 0 triturado com éter de petróleo, filtrado e seco

Rendimento 3,13 g.

Para a purificação a substância é triminutos oom éter dietilico, filtrada e seca.

Rendimento 2,23 g (63%).

pf. 101-lll°C, Ζ“#<7§⁵= -77,5° (c=l, metanol)

15b. Fmoc-Cye(StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Trp-Cys(StBu)Thr-ol, θ7₅Η96^Ν12°12³4 ¹⁴⁸⁵» ⁹⁵)

A uma solução de 1,97 g (2,8 mmoles) de Fmoc-Trp-Cys(StBu)-Thr-ol em 28 ml de dimetilformamida

adicionam-se à temperatura ambiente mediante agitação 12,2 ml (28 mmoles) de solução de dietilamina em dimetilformamida. Agita-se 5 minutos à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 resíduo é cromatografado através de 60 g de silica-gel analogamente ao exemplo 13c.

Rendimento 0,9 g (66,6%) de uma substância oleosa.

A uma solução de 0,9 g de H-Trp-Cys( (StBu)-Thr-ol obtidos acima, 1,85 g de Fmoc-Cys(StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-OH (ver exemplo lie) e 0,31 g de HOObt em 6 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 0,41 g de DCC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo 7a.

Rendimento 2,58 g (93,4%).

Para purificação a substância anterior mente obtida é crornatografada em sílica-gel. Elui-se com uma mistura de cloreto de metileno/metanol a 92:8. As fracções uni· táriae são concentradas em vácuo e o resíduo é triturado com éter de petróleo.

Rendimento 1,8 g (65,2 %) pf. 180-182°C rx η com decomposição ÓV- - 113,9° (c=, em Metanol).

15c. H-Cys(StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Trp-Cys(StBu)-Thr-ol, ^C60^H86^N10°10^S44 ^{(MG 1235}’⁷⁾

A uma solução de l,64g de Fmoc-Cys (StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Trp-Cys(StBu)-Thr-ol (1,1 mmole) em 11 ml de dimetilformamida adicionam-se 4,4 ml (11 mmole) de solução de dietilamina em dimetilformamida. Agita-se 5 minutos à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 resíduo é cromatografado através de sílica-gel analogamente ao exemplo 13o. As fracções unitárias são reunidas, concentradas em vácuo e trituradas com éter de petróleo.

Rendimento 0,74 g (54,4 %), pf. 144- 36 -

A uma solução de 0,41 g de Boc-D-Phe--Oh., 0,62 g de H-Cys(StBu)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Trp-Cys(StBu)-Thr-ol e 0,071 g de HOBt em 3 ml de dimetilformamida adicionam-se 1 Ο^ϋΟ sob agitação 0,11 g de DCC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo 7a.

Rendimento 0,74 g

Para purificação a substância obtida acima é cromatografada através de sílica-gel. Elui-se com uma mistura de cloreto de metileno/metanol a 93íZ.

Rendimento 350 mg.

A uma solução de 0,34 g (0,23 mmoles) do Boc-D-Phe-Cys(StBu)-Phe-D-Trp-Ly»(Boc)-Trp-Cys(StBu)-Thr-ol obtido acima em 5 ml de trilfluoretanol adicionam-se à temperatura ambiente 0,58 ml (2,3 mmoles) de tri-n-butilfosfina. Agita-se 4 horas à temperatura ambiente e concentra-se. 0 resíduo é triturado com uma mistura de acetato de etilo/éter de petróleo e filtra-se.

Rendimento 290 mg.

281 mg do Boc-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lis(Boc)-Trp-Cys-Thr-ol obtido acima são dissolvidos em ácido acético. Esta solução é adicionada sob agitação à temperatura ambiente, rapidamente, a uma mistura de 215 ml de ácido acético, 71,6 ml de água, 58,8 mg de acetato de sódio e 4,4 ml de solução 0,1 N de iodo. Mantem-se a agitação ainda 5 minutos e descolora-se a solução com uma solução aquosa de ácido ascórbico. A solução é concentrada e o resíduo é triturado com água, filtrado e seco com pentóxido de fósforo.

A substância é oromatografada através de silica-gel. Elui-se com uma mistura de cloreto de metileno/metanol a 95:5. As fracções concentradas são trituradas com éter de petróleo.

Rendimento 120 mg.

110 mg do j ₁

Boo-D-Phe-Cys-Ph.e-D-Trp-Lys(Boc )-Trp-Cys-Thr-ol obtido acima são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c. 0 resíduo é repartido entre acetato de etilo e água. A fase em acetato de etilo é novamente extraída com água. As fases aquosas reunidas são agitadas na presença de um permutador de iões fracamente básico na forma de acetato até se obter um pH ção e de 3 a 4. 0 permutador de iões é separado por filtrao filtrado é liofilisado.

Rendimento 65 mg.

Análise de aminoáciáos í Cys m,83; Phe

Lys 1,0; Trp 1,0 (determinado por meio do espectro

10,0;

UV); teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos : 55$.

16. H-Arg-Tyr(tBu)-OtBu

16a. Z-Arg(Z₂)-Tyr(tBu)-OtBu, (MG 852,0)

A uma solução de 2,89 g (5 mmoles) de Z-Arg(Z₂)-0H, 1,65 g de H-Tyr(tBu)-0tBu.H01, 0,68 g de HOBt e 0,65 ml de N-etilmorfolina em 20 ml de dimetilformamida adicionam-se sob agitação a 0°C 1,1 g de DCC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é cromatografado para purificação através de silica-gel com cloreto de metileno/mdanol a 95:5. As fracções unitárias são reunidas e concentradas em vácuo. 0 resíduo é triturado com éter de petróleo.

Rendimento 2,57 g, pf. 123-124°0 + 9,6° (c=l, em ácido acético).

16b. H-Arg-Tyr(tBu)-0tBu.2HCl, C₂₅H₄₁C1₂N₅O₄ (MG 522,5)

2,04 g de Z-Arg(Z₂)-Tyr(tBu)-0tBu são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a. 0 resíduo é triturado com éter dietílico.

Rendimento 1,06 g, substância amorfa, Z~£t_/|² = + 22,6° (o=l, metanol).

17. Fmoc-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu

17a. Z-Arg(Z₂)-Phe-OtBu, (MG 779,9)

A uma solução de 17,3 g (30 mmoles) de Z-Arg(Z₂)-0H, 7,73 g de H-Phe-OtBu.HCl, 4,9 g de HOOBt e 3,9 ml de N-etilmorfolina em 70 ml de dimetilformamida adicionam-se sob agitação a 0°C 6,6 g de BCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter dietílico, filtrado e seco em vácuo.

Rendimento 19 g, = -θ>5° (c=l, em ácido acético aquoso a 80%).

17b. H-Arg-Phe-0tBu.2HC10₄, Ο^Η^Ι^Ο-^ (MG 578,4)

18,6 g de Z-Arg(Z₂)-Phe-OtBu são dissolvidos em 200 ml de dimetilacetamida e hidrogenados cataliticamente com hidrogénio na presença de paládio/carvão. Por meio de um titulador automático mantem-se o pH num valor 5 durante a hidrogenação por adição de solução IN de HC10_4> Depois do termo da hidrogenação o catalisador é separado por filtração e o filtrado é concentrado. 0 resíduo é dissolvido em água, filtrado através de uma camada clarificadora e liofilizado.

Rendimento 21,1 g de um óleo.

b ...

7'

Rendimento 21,1 g de um óleo.

óleo é triturado 2 vezes com éter tílico, o éter é separado por decantação e o resíduo oleoso é seco em vácuo.

Rendimento 18,5 g )155$), contém portanto ainda dissolvente)

17c. Fmoc-Cys(StBu)-Arg.Phe~OtBu-acetato, (MG 851,1)

A uma solução de 4,31 g (10 mmoles) de Fmoc-Cys(StBu)-OH, (substân

7.74 g de H-Arg-Plie-0tBu-2HC10₄ cia oleosa anteriormente obtida) 1,35 g de HOBt e 1,3 ml de N

-etilmorfolina em 40 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 2,2 g de DCC. A mistura reaotiva é tratada analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter dietílioo e seco.

Rendimento 8 g.

1,3 g da substância anteriormente obtida são dissolvidos em 30 ml de ácido acético a 55$ e cromatografados através de um permutador de iões fracamente básico na forma acetato. Elui-se com ácido acético a 55$. 0 eluido é concentrado, tomado em água, e liofilisado.

Rendimento 1,05 g ~ -45,5° (c=l, em metanol), teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos: 79$.

18. Fmoc-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu

18a. Rmoc-Arg-Pro-OtBu. Ο^θΗ^Ν^Ο^ (MG 549,68)

A uma solução de 5,95 g (15 mmoles) de Pmoc-Arg.OH, 2,57 g de H-Pro-0tBu, 2,02 g de HOBt e 2,7 g de perclorato de piridínio em 30 ml de dimetilformamida

adicionam-se a 0°C sob agitação 3,3 g de DOC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 9,4 g

Para caracterização 750 mg de substância anteriormente obtida são dissolvidos em ácido acético aquoso a 40% e oromatografado através de um permutador de iões fracamente básico na forma acetato. 0 eluído é concentrado e liofilisado.

Rendimento 690 mg de Pmoo-Arg-Pro-OtBu-Aoetato θ32^43^5^7 (MG 609,7), Ζ“<^ζ_7ρ°

-44,2° (o=l, em Metanol), Teor em substância de acordo com a análise de aminoácidos: 93%.

18b. Pmoo-Arg-Pro-0H, θ₂6^Η31^Ν5°5 ⁴93,57)

8,5 g da substância bruta acima obtida são dissolvidos em 85 ml de ácido trifluoracético aquoso a 90%. Deixa-se repousar 1 hora à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 7,9 g

7,16 g da substância anteriormente obtida são postos em suspensão em 100 ml de água e esta é ajustada a um pH de 6 com solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. Durante um fim-de-seraana mantem-se a 4°C e depois filtra-se para separar 0 sedimento, e seca-se em pentbxido de fósforo em vácuo.

Rendimento 6,15 g £ - -32,2° (o=l, em ácido acético aquoso a 80%).

18c. H-Oys(StBu)-Arg-Phe-OtBu, 02^1144^^0482 (MG 568,8)

A uma solução de 17,84 g (20 mmoles) j de Pmoc-Cys(StBu)-Arg-Phe-0tBu.HC10₄ (preparado analogamen- , te à substância bruta do exemplo 17c) em 100 ml de dimetilformamida adicionam-se à temperatura ambiente 21 ml (200 mmoles) de dietilamina. Agita-se 10 minutos à temperatura ambiente e conoentra-se em vácuo. 0 resíduo é triturado 2 ;

vezes com éter dietílico e decantado. 0 resíduo oleoso é seco em alto vácuo.

Rendimento 14,6 g.

18d. Fmoc-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu-diacetato °56^H8A1°12^S2 (^MG 1164,46)

A uma solução de 4,94 g (10 mmoles) de Pmoc-Arg-Pro-0H, 5,7 g (10 mmoles) de H-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu, 163 mg de HOObt e 1,8 g de perclorato de piridínio em 100 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 2,2 g de DCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter dietílico.

Rendimento 8,7 g.

500 mg de substância anteriormente obtida são cromatografados através de sílioa-gel. Como eluente utilizou-se a seguinte mistura: 450 ml de cloreto de metileno, 200 ml de metanol, 150 g de ácido acético até à obtenção de um pH de 6,8.

Rendimento 341 mg /“<£>_7|² _ _6o,8° (c=l, água) teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos : 77%,

19. H-Arg-Pro-Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu-triacetato,

C₄₅H₇₅N₁₁O₁₂S₂ (MG 1002,27)

A uma solução de 3,3 g de Pmoc-Arg-Pro -Cys(StBu)-Arg-Phe-OtBu em 20 ml de dimetilformamida adieio nam-se 3,32 ml de dietilamina. Deixa-se repousar 10 minutos

à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 2,7 g.

A substância anteriormente obtida é purificada cromatograficamente analogamente ao exemplo 18d.

Rendimento 1,23 g /“bL·- -42,4° (c=l, em água) teor do peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos ; 71%.

20. 2-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂

20a. Z-Arg(Z₂)-Phe-NH₂, Ο^Η^ΝθΟθ (MG 722,8)

A uma solução de 8,65 g (15 mmoles) de Z-Arg(Z₂)-0H, 3,01 g de H-Phe-NHg.HCl, 2,45 g de HOObt e 1,95 ml de N-etilmorfolina em 30 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0 C sob agitação 3,3 g de DCC. Trabalha-se no restante tratamento como no exemplo la. No dia seguinte a mistura reaotiva está solificada. Tritura-se então com solução semi-saturada de hidrogenocarbonato de sódio, filtra-se, tritura-se com solução de hidrogenosulfato de potássio-sulfato de potásio, filtra-se, lava-se com água e seca-se com pentóxido de fósforo. A substância contém em quantidades aproximadamente equimolecular diciclohexilureia.

Rendimento 13,9 g

20b. H-Arg-Phe-NH₂.2HG10₄, ^Gi5^H26^C12^N6°10 (MG 521,33)

13,5 g da substância obtida acima (Z-Arg(Z₂)-Phe-NH₂, diclohexilureia) são agitados em 200 ml de dimetilacetamida e hidrogenados catalíticamente com hidrogénio e paládio/carvão. Por meio de um titulador automático o pH é mantido no valor 5 por adição de solução IN de HCIO^. Depois de terminada a hidrogenação filtra-se para separar o

sedimento e concentra-se o filtrado. 0 resíduo é triturado | com água e filtra-se para separação dos insolúveis. 0 filtrado é liofilizado. 0 resíduo oleoso é triturado 2 vezes com éter dietílioo e decantado. 0 óleo é seco em alto vácuo.

Rendimento 9,6 g. 0 óleo contém ainda algum dissolvente.

20c. Z-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂.HC10₄, C^H^Cl-^0(MG 726,2)

A uma solução de 5,9 g de Z-Asp(OtBu)-0H, 9,5 g de H-Arg-Phe-NH₂.2HC10₄, 2,48 g de HOBt e 2,37 ml de N-etilmorfolina em 50 ml de dimétilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 4 g de DCC. A mistura reactiva é tratada analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter dletílico e filtrado.

Rendimento 9 g.

20d. H-Aep(0tBu)-Arg-Phe-NH₂.2HC10₄,

C₂₅H₅₉C1₂N₇O₁₅ (MG 692,5)

8,7 g de Z-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂.HC10₄são dissolvidos em 150 ml de metanol e hidrogenados analogamente ao exemplo 20b. 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 7,8 g, /“όΖχ= -4,0° (c»l, em Metanol).

20e. Z-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂-acetato C₄₄H₅₇N₉0₁₀ (MG 872)

A uma solução de 3,4 g de Z-Trp-OH (10 mmoles), 6,92 g de H-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂.2HC10₄, 1,35 ml de N-etilmorfolina em 40 ml de dimétilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 2,2 g de DCC. Procede-se ao tratamento analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com

éter dietílico e filtrado.

Rendimento 7,3 g.

220 mg da substância obtida acima são dissolvidos em 15 ml de ácido acético aquoso a 55% e são cromatografadoe através de um permutador de iões fracamente básico na forma acetato. Elui-se oom ácido acético a 55%. 0 eluído é concentrado e o resíduo é tomado em água e liofilisado.

Rendimento 180 mg, /óC= -19,2° (c=l, em metanol) teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos : 75%.

21. H-Arg-Trp-Asp-(OtBu)-Arg-Phe-NH₂

21a. Z-Arg(Z₂)-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂, Cg^H^N-^O(MG 1238,4)

A uma solução de 576 mg (1 mmoles de Z-Arg(Z₂)-0H, 879 mg de H-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂.H010₄, 163 mg de HOObt e 0,13 ml de N-etilmorfolina em 10 ml de dimetilformamida adicionam-se sob agitação a 0°C 220 mg de DCC. Deixa-se repousar uma noite à temperatura ambiente, filtra-se para separar 0 sedimento e concentra-se 0 filtrado em alto íácuo. 0 resíduo é repartido entre n-pentanol e solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. Deste modo a maior parte da substância fica insolúvel e separa-se por filtração .

Rendimento 910 mg.

A fase em n-pentanol é concentrada.

Rândimento 250 mg, C~ -15,2° (c=l, em ácido acético aquoso a 80%).

21b. H-Arg-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Phe-NH₂~triac etato ^C46^H7A3°13 3.014,15)

g de Z-Arg(Z₂)-Trp-Asp(0tBu)-Arg-Ph.e-NH₂ são dissolvidos em 50 ml de ácido acético aquoso a 90% e hidrogenados cataliticamente com hidrogénio na presença de paládio/carvão. Depois de terminada a hidrogenação o catalisador é removido por filtração e o filtrado é concentrado. 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 2,33 g.

960 mg da substância anteriormente obtida são purificados cromatograficamente analogamente ao exemplo 18d.

Rendimento 540 mg - -14,2° (c=l, em água) teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos : 84%.

22. Z-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH₂

22a. Z-Arg-(Z₂)-Trp-NH₂, Ο^Η^ΝγΟθ (MG 761,85)

A uma solução de 17,3 g (30 mmoles) de Z-Arg(Z₂)-0H, 7,2 g de H-Trp-NH₂.HC1 4,9 g de HOObt e 3,9 ml de N-etilmorfolina em 150 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 6,6 g de DCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo 7a.

Rendimento 20,5 g.

cia com metanol, -se em vácuo.

(c=l,

Para purificação tritura-se filtra-se, a substânlava-se com éter dietílico e secaRendimento 20,3 g, pf. 172-174°C em dimetilformamida).

22b.

H-Arg-Trp-NH₂.2 p-toluenosulfonato,

31^H41^N7°8^S2 (MG 703,8)

- 46 P .....

17,2 g de Ζ-Arg (Z₂)-Trp~NH₂ são postos em suspensão em 350 ml de metanol e hidrogenados catalitioamente analogamente ao exemplo 2a (em vez de ácido clorídrico metanólico utiliza-se uma solução IN de ácido p-toluenossulfónico em metanol). 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 12,3 g, = + 13,3° (c=l, em Metanol).

22c. Z-Asp(0tBu)-Arg-Trp-NH₂-acetato Ο^^Η^θΝθΟ^ (MG 724,8)

A uma solução de 13,5 g de H-Arg-Trp-NH₂.2p-toluenosulfonato e 2,49 ml de N-etilmorfolina em 50 ml de dimetilformamida adicionam-se à temperatura ambiente sob agitação 8,06 g de Z-Asp(0tBu)-0Nu, Deixa-se repousar uma noite à temperatura ambiente. Concentra-se e reparte-se o resíduo entre n-pentanol e água.

A fase orgânica é concentrada e o resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 14,4 g de Z-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NIL·.p-Toluenosulfonato, /“= -16,4° (c=l, em Metanol).

850 mg de substância obtida acima são dissolvidos em 15 ml de ácido acético aquoso a 30$ e cromatografados através de um permutador de iões fracamente básico na forma de acetato. Elui-se com ácido acético aquoso a 30$. 0 elu'do é concentrado e o resíduo é dissolvido em água. A solução é liofilizada.

Rendimento 750 mg, - -16,6° (c=l, em metanol). Teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos : 85$.

23. Z-Arg-Ile-Asp(0tBu)-ArgTTrp-NH₂

23a. H-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH₂.p-Toluenossulfoneto

Cj 9^54OqOj jS 2 (MG875/O5)

13,2 g de Z-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH₂.-p-Toluenossulfoneto são hidrogenados cataiiticamente ao exemplo 22b.

λ

Rendimento 13,04 g, 7_D ^a “M (c=“l, em Metanol),

23b. Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH₂-diacetato C49H75N13O13 ^{ÍMG 1O54}#2)

A uma solução de 843 mg (2 mmoles) de Z-Arg-Ile-OH, 1,75 g de H-Asp(OtBu)-Arg-Trp-NH₂·2 p-Toluenossulfoneto e 326 mg de HOObt em 20 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 440 mg de DOC. Deixa-se repousar uma noite à temperatura ambiente, filtra-se para se separar o sedimento e concentra-se o filtrado. 0 resíduo é submetido a uma repartição em contra-corrente em 5 fases entre acetato de etilo e água. 0 peptídeo encontra-se na fase aquosa que á líofílízada.

Rendimento 2,01 g de Z-Arg-Ile-Asp(OtBu)· _ 2q _o

-Arg-Trp-NH^· 2 p-Toluenossulfonato, /” ^a_7p -25° (c=l, em Metanol).

150 mg do peptídeo obtido acima são convertidos no acetato analegímente ao exemplo 22c.

Rendimento 120 mâj, /” ” “^3o#⁸° (c»l, em metanol). Teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos t 73%.

24, H-Arg-Ile-Asp (OtBu) -Arg-Trp-NI^-tri acetato °43^H73^N13°13 ^(MG

1,73 g de Z-Arg-Ile-Asp(OtBu) -Arg-Trp-NH₂.2 p-Toluenossulfonato são hidrogenados cataliticamente

í na presença de paládio/carvão em ácido acát.ico aquoso a 90%.

catalisador á recuperado por filtração, o filtrado é concentrado e o resíduo á triturado com áter dietllico e filtrado.

A substância á dissolvida em água e é agitada na presença de um permutador de iões fracamente básico na forma acetato até se obter um pH de 4,4. 0 permutador de iões á separado por filtração e o filtrado é liofilisado.

Rendimento 1,06 g.

A substância obtida acima e purificada cromatograficamente analogamente ao exemplo 18d.

Rendimento 634 mg £ * -31, ⁹° (c»l, em água). Teor em peptídeo base de acordo com o espectro UV: 72%).

25. Z-D-Phe-Trp-Lys-Tyr-Phe-OBzl

25a. Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-OBzl

A uma solução de 9,18 g (20 mmoles) de Fmoc-Tyr (tBu)-OH, 8,5 g (20 mmoles) de H-Phe-OBzl.p-toluenossulfonato, 2,8 g de HOBt e 2,56 ml de N-etilmorfolina em 50 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 4,74 g de DCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. Recristaliza-se em acetato de etilo/éter de petróleo.

Rendimento 11,4 g (85%) ponto de fusão 158°C com decomposição, £ =* -34,5° (c=l, em Dimetilformamida).

25b. H-Tyr(tBu)-Phe-OBzl i

A uma solução de 10,44 g (15 mmoles) de I Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-OBzl em 100 ml de dimetilformamida adicionam-se 15,64 ml (150 mmoles) de dietilamina. Agita-se 10 minutos I à temperatura ambiente, concentra-se e tritura-se o resíduo I j com éter de petróleo. O éter de petróleo s separado por decan- j

tação e o resíduo é dissolvido em éter dietílioo. Filtra-se para eliminar alguns constituintes insolúveis e concentra-se o filtrado. 0 resíduo é seco am alto vácuo.

Rendimento 5,2 g.

25c. Fmoc-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OBzl, Ο^Η^Ν^Οθ (MG 925,15)

A uma solução de 4,58 g de Fmoc-Lys (Boc)-OH, 5,2 g de Fmoc-Lys(Boc)-0H, e 1,31 g de HOObt em 50 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 1,97 g de DCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. A cristalização é feita em acetato de etilo/éter de petróleo.

Rendimento 6,5 g.

25d. H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OBzl, (MG 702,9)

A uma solução de 6,5 g (7 mmoles) de Fmoc-Lys(Boc)-Tyr)tBu)-Phe-OBzl em 50 ml de dimetilformamida adicionam-se 7,3 ml de dietilamina e agita-se 10 minutos à temperatura ambiente. Seguidamente conentra-se em vácuo e o resíduo é triturado com éter dietílico.

Rendimento 5,53 g, ponto de fusão 132°C a 0^o (c=l, em dimetilformamida)

25e. Z-D-Phe-Trp-OMe, C₂₉H₂₉N₅0₅ (MG 499,5)

A uma solução de 7,47 g (25 mmoles) de Z-D-Phe-OH, 6,37 g (25 mmoles) de H-Trp-OMe.HCl, 3,37 g de H0B e 3,2 ml de N-etilmorfolina em 50 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C sob agitação 5,56 g de DCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. A substância cristaliza em acetato de etilo.

Rendimento 8,13 g, ponto de fusão 181°C = + 2,5° (c=l, em dimetilformamida).

25f. Z-D-Phe-Trp-OH, 0₂8^H27^N3°5 (MG 485,5)

A uma solução de 2,9 g de Z-D-Phe-Trp-OMe em 20 ml de dioxono/água (4:1) adicionam-se 6,1 ml de soda cáustica IN. Agita-se duas horas à temperatura ambiente e mistura-se depois com 6,1 ml de ácido clorídrico IN. A solução é concentrada e o resíduo é triturado com água. 0 sedimento é separado por filtração e seco com pentóxido de fósforo.

Rendimento 2,27 g, pf. 143-145°C /“ct-J7²^- = + 4,4° (c=l, em Dimetilformamida).

25g. Z-D-Phe-Trp-iys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OBzl, ^G63^H72^7°11 (MG 1170,4)

A uma solução de 2,4 g (5 mmoles) de Z-D-Trp-OH, 3,1 g de H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OBzl e 0,7 g de HOBt em 30 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°0 sob agitação 1,13 g de DCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. Reoristaliza-se em éter dietílico/éter de petróleo.

Rendimento 5,62 g(96%) ponto de fusão 194°C com decomposição, _ -8,5° (c=l, em

Dimetilformamida).

25h. Z-D-Phe-Trp-Lys-Tyr-Phe-OBzl-acetato, ^G81^67^7^11 (MG 1074,2)

1,1 g (1 mmole) de Z-D-Phe-Trp-Lys(Boo)-Tyr(tBu)-Phe-OBzl são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c. 0 resíduo é triturado com éter metil-t-butílico e filtrado. A substância é agitada com solução semi-saturada de hidrogenocarbonato de sódio e filtrada. A substância é dissolvida em 20 ml de metanol e faz-se precipi-! tar com 20 ml de água. i

Rendimento 0,51 g.

Para transformação no acetato a subs- 51 -

tância obtida acima é dissolvida em 3 ml de ácido acético.

Mistura-se com 70 ml de água e liofiliza-se.

Rendimento 0,4 g.

Análise de aminoácidosí Tyr 0,66;

Phe 1,97; Lys 1,0; teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos : 75%.

26. C iclo-(D-Phe-Trp-Lys-Trp-Phe)

26a. H-D-Phe-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-0H,

C₅₃H₆₇N₇O₉ (MG 946,2)

4,45 g (3,8 mmoles) de Z-D-Phe-Lys (Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OBzl são hidrogenados cataliticamente na presença de paládio/carvão em 100 ml de ácido acético a 90%. Depois do termo da hidrogenação o catalisador é separado por filtração e o filtrado é concentrado. 0 resíduo é triturado com éter dietílico, filtrado e seco.

Rendimento 3,25 g (90,5%).

Para a eliminação do ácido acético arrastado a substância é agitada com solução a 10% de hidrogenocaobonato de sódio numa quantidade suficiente para se obter um pH de 6,0. Seguidamente filtra-se a substância, lava-se com água e seca-se com pentóxido de fósforo.

Rendimento 2,81 g, ponto de fusão 225-227°C com decomposição, = -22,7° (c=l, em

Dimetilformamida).

A uma solução de 0,946 g (1 mmole) de H-D-Phe-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OH em 125 ml de dimetilformamida adicionam-se 0,35 ml (2,5 mmoles) de uma solução a 50% de anidrido de ácido etil-metil-fosfínico em cloreto de metileno. Durante 30 minutos adicionam-se gota a gota à temperatura ambiente e lentamente 0,64 ml (5 mmoles) de N-etilmorfolina dissolvidos em 25 ml de dimetilformamida.

Agita-se 3 horas à temperatura ambiente e concentra-se depois a solução. 0 resíduo é triturado com água, filtrado e seco.

Rendimento 0,79 g.

Para separação dos produtos não ciclizados dissolve-se a quente am 20 ml de metanol e 20 ml de água. Depois do arrefecimento filtra-se.

Rendimento 0,35 g.

Para a purificação posterior a substância é cromatografada em sílica-gel com cloreto de metileno/ /metanol a 95:5.

Rendimento 131 mg.

26c. Ciclo-(D-Phe-Trp-Lys-Tyr-Phe)-acetato, Ο^Η^ΝγΟθ (MG 832)

105 mg de Ciclo-(D-Phe-Trp-lys(Boc)-Tyr (tBu)-Phe são tratados analogamente ao exemplo 2c. Procede-se ao tratamento analogamente ao exemplo 25h.

Rendimento 50,3 mg.

Análise de aminoácidos: Tyr 0,89; Phe 2,03; Dys 1,0; teor em peptídeo base de acordo com a análise de aminoácidos : 76%.

27. Z-Lys-Lys-Tyr-Phe-OMe

27a. H-Ly s(B o o)-Tyr(tBu)-Phe-OMe.HC1 g de Z-lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMe (ver exemplo 4c) são hidrogenados cataliticamente em metanol analogamente ao exemplo 2a.

Rendimento 22,4 g (91,8%). Ponto de fusão 145-147°C

_ ₊ 18,2° (c=l, em metanol).

27b. Ζ-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMe

A uma solução de 21,9 g de H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMe.HCl, 4,46 g de HOBt e 4,3 ml de N-etilmorfolina em 130 ml de dimetilformamida adicionam-se à temperatura ambiente 18,5 g de Z-Lys(Boc)-OTop e agita-se 3 horas à temperatura ambiente. Mistura-se o preparado com 400 ml de água e 35 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. 0 sedimento é separado por filtração. Precipita-se a partir de 200 ml de acetato de etilo e 800 ml de éter de petróleo.

Rendimento 30,4 g (93 %), pf. 159-160% =s -17,5° (c=l, em Metanol).

27c. Z-Lys-Lys-Tyr-Phe-OMe-acetato

1,0 g de Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-OMe são dissolvidos em 10 ml de ácido trifluoracético a 90%. Deixa-se repousar uma hora à temperatura ambiente. Seguidamente concentra-se e o resíduo é triturado oom éter dietílito e filtrado. 0 resíduo é dissolvido em água e é cromatografado através de um permutador de iães fracamente básico na forma de acetato. 0 eluído é liofilisado.

Rendimento 73§8mg. Depois da purificação cromatográfica em silica-gel:

= -31,1° (c=l, em água)

28. Fmoc-Arg-Tyr(tBu)-Phe-NH₂-acetato ^C45^H55^N7°8 ^{(MG 822} >

A uma solução de 3,96 g (10 milimoles) de Fmoc-Arg-0H, 4,3 g (10 milimoles) de H-Tyr(tBu)-Phe-NH₂.HCl (ver exemplo 7b) e 1,4 g (10 milimoles) de HOBt em 50 ml de d imetilformamida adicionam-se a 0°C 2,2 g de DCC. Agita-se uma noite à temperatura ambiente. Seguidamente concentra-se

- 54 *^s*^,gV^; e o resíduo é triturado com solução saturada carbonato de sódio. 0 sedimento é filtrado e em metanol/água.

de hidrogenofaz-se precipitai

Rendimento 6,1 g. Para purificação a substância é cromatografada em sílica-gel (eluente: cloreto de metileno/metanol/água/ácido acético a 9:1:0, 1:0,1).

Rendimento 3,85 g = -7,1° (c=sl, em ácido acético a 90%).

29. F mo c-D-Arg-Tyr(tBu)-Phe-NH₂-ace tat o

C₄₅H₅₅N₇0₈ (MG 822)

Preparado analogamente ao exemplo 28.

9P n _7_D = + 8,7° (c=l, em ácido acético a 90%).

30. Z-Trp-Arg-Tyr-Phe-NHg

Oa. H-Arg-Tyr(tBu)-Phe-NHg-ac et ato,

C₅₀H₄₅N₇0₆ (MG 599,7)

A uma solução de 3,05 g Fmoc-Arg-Tyr(tBu)-Ph.e-NH2-acetato em 25 ml de dimetilformamida adicionam-se 4,2 ml de dietilamina. Deixa-se repousar 5 minutos à temperatura ambiente e concentra-se em vácuo. 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 2,23 g.

30b. Z-Trp-Arg-Tyr(tBu)-Phe-NH₂-ac^etato ^ο49^Η61^π9°9 ^(MG 920,1)

A uma solução de 2,15 g (3,59 milimoles) de H-Arg-Tyr (tBu)-Phe-NH2~-^^ce'^ta‘^to 0,56 g de HOBt e 0,64 g (3,59 milimoles) de perclorato de piridínio em 25 ml de dimetilformamida adicionam-se à temperatura ambiente 2,17 g de Z-Trp-OTcp. Deixa-se repousar uma noite à tempera- 55 -

tura ambiente e concentra-se no dia seguinte. Reparte-se o resíduo entre acetato de etilo e solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. A fase em acetato de etilo á seca com sulfato de sódio e concentrada. O resíduo e triturado com éter dietílico.

Rendimento: 2,51 g. Para purificação em silica-gel procede-se à cromatografia como no exemplo 28a.

Rendimento 1 grama.

30c. Z-Trp-Arg-Tyr-Phe-NH₂-acetato, C₄₅H₅₃N_gO_g (MS 864)

700 mg de Z-Trp-Arg-Tyr(tBo)-Phe-NH₂são tratados analogamente ao exemplo 2c.

Rendimento 0,38 ^a-7p^{2 31} - 5,7° (c»l, em ácido acético a 90%).

31. Z-Trp-D-Arg-Tyr-Phe-NH₂-acetato, C₄₅H₅₃N₃O₃(MG 864)

Preparado analogamente ao exemplo 30. Ζ” * + ⁶/°° (oi# em ácido acético a 90%).

i i

i

32. Z-Trp-D-Lys-Tyr-Phe-NH₂, ^C43^H49^N7^O7 (MG 775,9) | í

I

Preparado analogamente ao exemplo 8. Ζ” α_7q² = + 6, 5° (c«l, em ácido acético a 90%).

33. Indol-3-butiril-Trp-Uys-Tyr-Phe-NH₂

33a. Indol-3-butiril-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂

C₅₆H₇₀N₈0_q (MG 983,24) J

A uma solução de 509 mg de ácido inI dol-3-butlrico, 2,1 g de H-Trp-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂.HCl j (ver exemplo 8c. hidrogenação catalítica analogamente ao

exemplo 2a) 337 mg de HOBt e 0,325 ml de N-etilmorfolina em 20 ml de dimetilformamida, adicionam-se a 0°0 550 mg de DCO. Tratamento idêntico ao do exemplo la, 0 resíduo é triturato com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 2,15 g, pf. 148-155°0

- -15,4° (c=l, em Metanol).

33b. Indol-3-but iril-Trp-Lys-Tyr-Phe-NH₂-ac e ta to ^C49^H58^N8°8 ^{(MG 887}’⁵⁾

1,97 g de Indol-3-butiril-Trp-lys (Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂ são submetidos a reacção analogamente ao Exemplo 2c.

Rendimento 1,29 g. Purifica-se por oromatografia em coluna através de silica-gel com cloreto de metileno/metanol/água/ácido acético 7:2:0,3:0,15.

Rendimento 397 mg, (c=l, em ácido acético a 10%).

34. Indol-3-butiril-Lys-Tyr-Phe-NH₂

34a. Indol-3-butiril-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂°45^H60^N6°7 ^(MG 797,02)

A uma solução de 1,95 g (3 milimoles) de H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-NH₂.HCl, 610 mg de ácido indol-3-butírico, 405 mg de HOBt e 0,39 ml de N-etilmorfolina em 20 ml de dimetilformamida adiciona-se a 0°C 660 mg de DCC. Tratamento idêntico ao do exemplo la. A substância precipita a partir de acetato de etilo/éter de petróleo.

Rendimento 2,4 g, pf. 168°, = -21,4° (c=l, em Metanol).

34b. Indol-3-butiril-Lys-Tyr-Phe-NH₂-acetato, ^C38^H48^N6°7 700,85)

- 57 I

2,15 g de Indol-3-butiril-Lys(Boc) Tyr (tBu)-Phe-NH2 são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 33b e purificados.

Rendimento 402 mg, c^j²/ - -22,5° (c=l, em água).

35. Indol-2-carbonil-Lys-Tyr-Phe-NH2

5a. Indol-2-car bonil-Lys (Boc) -Tyr (tBu) -Ph.e-NH₂,

C₄₂H₅₄N₆0₇ (MG 754,9)

485 mg (3 milimoles) de ácido indol-2-carboxílico são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 34a com 1,95 g (3 milimoles) de H-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-nh₂.hci

Rendimento 2,25 g, pf. 228-230°0, = -56,7° (c=l, em Metanol).

5b. Indol-2-carbonil-Lys-Tyr-Phe-NH2-aoetato, ^C35^H42ⁿ6°7 ^{(MG 658}’⁷⁾ g de Indol-2-carbonil-Lys(Boc)-Tyr(tBi.)-Phe-NH2 são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 33b, Rendimento 1,55 g - -44,8° (c=l, em Metanol).

6. H-Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-Gly-OH

36a. Fmoc-Trp-Gly-OtBu, (MG 539,64)

A uma solução de 21,3 g (50 milimoles) de Fmoc-Trp-OH, 16,7 g de (50 milimoles) de H-Gly-OtBu.HCl e 7 g de HOBt em 100 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 11,33 g de DCO. Tratamento como no exemplo la. 0 composto cristaliza a partir de éter dietílico.

i

Rendimento 17,26 g, ponto de fusão 141°C - - 26,6° (c=l, em dimetilformamida) j

56b. Fmoc-Trp-Arg-OH, C₅₂ ^H34^1Í6°5 582,67(

A uma suspensão de 6,09 g (55 milimoles) de arginina e 6,25 g (55 milimoles) de perclorato de piridínio em 75 ml de dimetilformamida adicionam-se 19,98 g (37 milimoles) de Fmoc-Trp-OObt. Agita-se até que todas as substâncias se tenham dissolvido. Seguidamente conoentra-se e tritura-se o resíduo com solução de hidrogenocarbonato de sódio (o pH da suspensão deve estar compreendido entre aproximadamente 6 a 7). 0 sedimento é removido por filtração e seco.

Rendimento 17,65 g, ponto de fusão 185°C (com decomposição), - -24,2° (c=l, em dimetilformamida) .

36c. Fmoc-Trp-Arg-Trp-Gly-OtBu, ^9^55^9307 (MG 882,05)

A uma solução de 5,4 g (10 milimoles) de Fmoc-Trp-Gly-OtBu em 25 ml de dimetilformamida adicionam-se 10,3 ml (100 milimoles) de dietilamina. Deixa-se em repouso 10 minutos à temperatura ambiente e concentra-se₀ 0 resíduo é digerido várias vezes com éter de petróleo. 0 resíduo é dissolvido em éter dietílico, filtra-se para eliminar os insolúveis e concentra-se.

Rendimento 4,2 g de um óleo amarelo (impuro).

A uma solução de 4,2 g do óleo obtido acima, 5,82 g (10 mmoles) de Fmoc-Trp-Arg-OH e 1,6 g de HOObt em 30 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 2,2 g de DCC. Deixa-se em repouso uma noite à temperatura ambiente, filtra-se para separar o sedimento, conoentra-se e reparte-se entre acetato de etilo e solução saturada de hidrogeno- 59 r

carbonato de sódio. A solução em acetato de etilo é extraída com água e concentrada. 0 resíduo é triturado com éter dfetílioo, filtrado e seco.

Rendimento 8,48 g, ponto de fusão 145-152°C, ~ -22,4° (o»l, em dimetilformamida)_o

36d. Fmoo-Trp-Arg-Trp-Gly-OH

2,64 g (3 mmoles) de Fmoc-Trp-Arg-Trp-Gly-OtBu são levados a reagir analogamente ao exemplo 2c. 0 resíduo é triturado com éter metil-butílico e filtrado. Depois da secagem a substância é triturada com solução de hidrogenocarbonato de sódio (pH da suspensão 6a 7). A substância é filtrada e seca.

Rendimento 1,82 g, ponto de fusão 190-192°C (com decomposição), - -43,7° (c=l, em dimetilformamida).

6e. Fmoc-Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-Gly-OtBu

Uma solução de 2,64 g (5 mmoles) de Fmoc-Trp-Arg-Trp-Gly-OtBu em 20 ml de dimetilformamida são misturados com 3,3 ml de dietilamina. Depois de 5 minutos à temperatura ambiente concentra-se e 0 resíduo é triturado com éter dietílico e filtrado.

Rendimento 2,04 g de H-Trp-Arg-Trp-Gly-OtBu. A uma solução de 1,81 g (2,2 mmoles) de Fmoc-Trp-Arg-Trp-Gly-OH, 1,45 g (2,2 mmoles) de H-Trp-Arg-Trp-Gly-OtBu, 0,9 g (2,2 mmoles) de perclorato de piridínio e 0,36 g (2,2 mmoles) de HOObt em 25 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 0,51 g (2,5 mmoles) de DCC. Deixa-se em repouso uma noite à temperatura ambiente, filtra-se 0 sedimento e concentra-se 0 filtrado. 0 resíduo é triturado oom solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, filtrado e lavado com água.

Rendimento 3,3 g, ponto de fusão 2 0460 -

ο ο

-205°C (com decomposição), ⁼ -27,6° (c=l, em dimetilformamida).

6f. H-Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-Gly-OH-dlace tato, °64^H80^H18°15 <^{MS 1?O9}>⁵>

A uma solução de 2,93 g (2 moioles) de Pmoo-Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-Gly-OH em 20 ml de dimetilformamida adicionam-se 2,1 ml (20 mmoles) de dietilamina. Deixa-se repousar 5 minutos à temperatura ambiente e concentra-se. 0 resíduo é triturado com éter dietílico. Rendimento 2,7 g de H-Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-Gly-OH.

g de substância anteriormente obtida são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c. Purificação da substância com um gel de dextrano alquilado.

Rendimento 210 ml. Caracterização por UV : banda oaracterística para Trp a 280 nmj análise de aminoácidos em HC1 6N : 2,00 Gly, 2,04 Arg? teor o

em peptídeo base: 70%, = + 1° (c=l, em ácido acético a 9θ%)·

7. Ciolo-(Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-(Gly)-diao etato, ^C64^H78^H18°14 ^{(MG 1291}’⁴⁾

1,6 g de H-Trp-Arg-Trp-Gly-Trp-Arg-Trp-Gly-OtBu são dissolvidos à temperatura ambiente numa mistura de 16 ml de ácido trifluoracético a 90% e 1,4 ml de 1,2-dimercaptoetano. Depois de 1 hora concentra-se e o resíduo é triturado com éter metil-butílioo e filtrado. Rendimento 1,42 g. 0 produto assim obtido depois de seco é triturado com uma solução saturada de hidrocarbonato de sódio (pH da suspensão aproximadamente 7) filtrado e seco.

Rendimento 0,92 g de H-Trp-Arg-Trp-Gly^Trp-Arg-Trp-Gly-OH-ditrifluoracetato.

A uma solução da substância acima obtida e 0,185 g de HOBt em 6 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 0,2 g de DCC. Deixa-se repousar uma noite à temperatura ambiente. No dia seguinte filtra-se para separar o sedimento, o filtrado é concentrado e o resíduo é triturado com solução de hidrogenocarbonato de sódio, filtrado e seco.

Rendimento 1,05 g. Dissolve-se depois numa mistura formada por 10 ml de ácido acético e 40 ml de água e cromatografa-se através de um permutador de iões fracamente básico na forma acetato. 0 eluído é concentrado.

Rendimento 0,83 g.

Para purificação cromatografa-se através de um gel de dextrano alquilado numa mistura de metanol/ /água/ácido acético 50 í 50 »3.

Rendimento lOlmg. Caracterização por UV : banda característica para Trp a 280 nm; análise de aminoácidos em HC1, 6N: 2,00 Gly, 1.9 Arg; teor em páptideo base $ t 82%.

38. Z-Trp-D-Lys-Tyr-Ile-Lys-Pro-OBzl

38a. Fmoc-Ile-Lys (Boc)-OH, ^G32^H43N₃O₇ (MG 581,7)

A uma suspensão de 19,76 g de H-Lys (Boc)-OH em 120 ml de dimetilformamida adicionam-se 40 g de Fmoc-Ile-OObt. Agita-se ate tudo estar dissolvido e concentra-se, 0 resíduo 4 repartido entre acetato de etilo e solução semi-saturada de hidrogenocarbonato de sódio. A fase em acetato de etilo é extraída mais duas vezes com a solução de hidrogenocarbonato de sódio, duas vezes com solução de hidrogenossulfato de potássio e 1 vez com água, seca-se com sulfato de sódio e concentra-se. A substancia contém ainda como impureza Fmoc-Ile-OH e é por isso aquecida em banho-maria 5 minutos com 100 ml de éter metil-t-butílico e filtra-se.

Rendimento 28,85 g, pf. 162-164°, /” « -13,5° (c=l, em Metanol).

38b. Fmoc-Ile-Lys (Boc)-P_ro-OBzl, (MG 768,9)

A uma solução de 28 g de Fmoc-Ile-Lys (Boc)-OH, 11,6 g de H-Pro-OBzl.HCl. 7,8 g de HOObt e 6,3 ml de N-etilmorfolina em 250 ml de dimetilformamida adiciona-se a O°C 10,6 g de DCC. /Tratamento como no exemplo 12. Fica como resíduo um óleo que á cromatografado através de sílica gel em cloreto de metileno/metanol/água a 9:1:0,1.

Rendimento 30.4 g de um óleo amarelado.

38c. H-Ile-Lys (Boc)-PrO-OBzl, ^C ₂9^H46^N4°6 <^{MG 546}'

A uma solução de 28,86 g de Fmoc-Ile-Lys (Boc)-Pro-OBzl em 200 ml de dimetilformamida adicionam-se 39 ml de dietilamina. Deixa-se repousar 10 minutos à temperatura ambiente, concentra-se e cromatografa-se o resíduo através de sílica-gel em cloreto de metileno e depois em cloreto de metileno/metanol a 9:1.

Rendimento 18,4 g de um óleo amarelado.

38d. Fmoc-D-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-OH, Ο^Η^Ϊ^Οθ (MG 687,8)

A uma suspensão de 11,6 g de H-Tyr (tBu)-OH em 150 ml de dimetilformamida adicionam-se 30 g de Fmoc-D-Lys (Boc)-OObt. Procede-se como no exemplo 38a. Fara purificação o peptídeo e precipitado duas vezes em éter meti lico-t-butílico/éter de petróleo.

Rendimento 16,45 g, ponto de fusão 92-94°C £ ^a-7p^{3 3} 12,8° (c«l, em metanol).

38e. Fmoc-D-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ile-Lys(Boc)-Pro-OBzl,

C₆₈H₉₃N₇O₁₃ (MG 1216,5)

A uma solução de 16,1 g de Fmoc-D-Lys (Boc) -Tyr (tBu) -OH, 12,8 g de H-Ile-Lys(Boc)-Pro-OBzl e

3,8 g de HOObt em 150 ml de dimetilformamada adicionam-se

5,15 g de DCC. D_epois de cerca de 4 horas de tempo de reacção à temperatura ambiente o sedimento é separado por filtração e o filtrado á concentrado. 0 resíduo é triturado sucessil vamente com acetato de etilo, solução semi-saturada de hidrogenocarbonato de sódio e água e filtra-se. Faz-se precipitar a partir de isopropanol/áter de petróleo.

Rendimento 18,9 g, ponto de fusão 147-149°C ^a_/q ^a -31/7° (c=*l# em metanol).

!

i 38f. H-D-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ile-Lys(Boc)-Pro-OBzl, ^C53^H83^N7°11 ^{(MS 994}'³⁾ !

í

A uma solução de 18 g (14,8 mmoles) de j

Fmoc-D-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ile-Lys(Boc)-Pro-OBzl em 150 ml de ί dimetilformamida adicionam-se à temperatura ambiente 15,4 j ml de dietilamina. Depois de 20 minutos concentra-se e o resí-, duo á cromatografado em sílica-gel. A_s impurezas são elimina- i das com cloreto de metileno/metanol a 98:2 e a substância á | eluída com cloreto de metileno/metanol a 90s10.

i Rendimento 10,4 g de um óleo amarelado, i

I 38g. Z-Trp-D-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ile-Lys(Boc)-Pro-OBzl, ^C72^H93^N9°14 ^{(MG 13o8}'⁶> ί ΐ

I

A uma solução de 10,4 g de H-D-Lys(Boc)-: -Tyr(tBu)-Ile-Lys(Boc)-Pro-OBzl, 3,54 % de Z-Trp-OH e 1,41 g de HOBt em 150 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C

2,3 g de DCC. Tratamento como no exemplo la. 0 resíduo é precipitado em éter dietílico/éter de petróleo.

Rendimento 12,65 g, pf. 111-113°C, /* α_7q³⁼* -26,4° (c^al< em Metanol).|

I !

38h. Z-Trp-D-Lys-Tyr-Ile-Lys-Pro-OBzl-diacetato, ^C62^H83^N9°14 ^{(MG 1178}'⁴⁾i

-Ile-Lys(Boc)-Pro-OBzl são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c. Para purificação faz-se precipitar em isopropanol/éter de petróleo.

•*22 o

Rendimento 892 mg, £ (c«l, em água)

39. ciclo-(Trp-D-Lys-Tyr-Ile-Lys-Pro)

39a. H-Trp-D-Lys (Boc)-Tyr (tBu)-Ile-Lys (Boc)-Pro-OH,

C₅₇H_8?N₉O₁₂ (MG 1090,4)

10,5 g de Z-Trp-D-Lys (Boc)Tyr (tBu-Ile-Lys(Boc)-PrO-0Bzl são hidrogenados cataiiticamente em ácido acético a 90%. 0 resíduo á repartido entre água e aceta-l to de etilo. A fase em acetato de etilo e seca com sulfato | i de sódio e concentrada. 0 resíduo é triturado com eter dietílico e filtrado.

Rendimento 7,0 g. Para eliminação de resíduos de ácido acético tritura-se com solução de hidrogenocarbonato de sódio a pH 7.|

Rendimento 7,0 g, pf. 174-176°C,i £ a. 7^³ * ~ 18,9° (c^el, em Metanol).

** JUi

39b. ciclo-(Trp-D-Lys(Boc)-Tyr-(tBu)-Ile-Lys(Boc)-Pro), ^C57^H85^N9°11 ^{(MG 1o72}'⁴⁾I

A uma solução de 1,09 g de H-Trp-D->

-Lys (Boc)-Tyr (tBu)-Ile-Lys (Boc)-Pro-OH em 270 mg de HOBt em | 200 ml de dimetilformamida adiciona-se uma solução de 440 g de DCC. Em 100 ml de dimetilformamida. Depois de 2 dias à temperatura ambiente adiciona-se novamente 135 mg de DCC e deixaJ -se reagir novamente 2 dias à temperatura mabiente. Seguida- i mente concentra-se e o resíduo é triturado com água e solu- j ção de hidrogenocarbonato de sódio e filtrado. A substância | é cromatografada através de sílica-gel com cloreto de meti- : leno/metanol/ácido acático/água a 150:8:1:1.

Rendimento 500 mg.

39c. ciolo-(Trp-D-Lys-Tyr-Ile-Lys-Pro)-diacetato

Ο^Η^ΝθΟ-^ (MG 936,12)

500 mg de Trp-D-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ile-Lya-Pro são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c.

Rendimento 234 mg. Para purificação cro matografa-se num gel de dextrano alquilado.

Rendimento 109,5 mg. Análise de aminoácidos (hidrólise em HC1 6N, 24 horas a 120°C; 0,98 Pro, 1,01 Ile, 2,00 Lys, 1,04 Tyr; espectro UV í bandas caracterís ticas a 280 nm para Trp.

40. Z-Trp-Lys-Tyr-benzilamida

40a. Z-Trp-Lys(Boc)-OH, Ο₅ο^Η38^Κ4°7 ⁵⁶⁶»⁷>

A uma suspensão de 18,45 g (75 mmoles) de H-Lys(Boc)-0h em 120 ml de dimetilformamida adicionam-se 38,64 g (80 mmoles) de Pmoc-Trp-OObt. Agita-se até à dissolução completa. Seguidamente concentra-se, dissolve-se o resíduo em acetato de etilo e extrai-se com solução de hidrogenooarbonato de sódio, solução de hidrogenossulfato de potássio e água. A fase em acetato de etilo é seca com sulfato de sódio e concentrada. 0 resíduo é cromatografado em sílica-gel. Para eliminação as impurezas elui-se primeiro com cloreto de metileno/acetona a 9:1 e para eluição da substânoia elui-se com cloreto de metileno/metanol a 95:5.

Rendimento 30 g, ponto de fusão 95 - 97°C, ~ “16,4° (c=l, em dimetilformamida).

40b. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr-OMe, (MG 743,9)

A uma solução de 16,68 g (30 mmoles de Z-Trp-Lys(Boc)-0H, 6,95 g (30 mmoles) de H-Tyr-OMe.HC1 e

4,92 g (30 mmoles) de HOObt em 120 ml de dimetilformamida adi cionam-se a 0°C 3,84 ml de N-etilmorfolina e 6,8 g de DCO.

Tratamento como no exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter de petróleo e seco em alto vácuo.

Rendimento 25,3 g de uma substância amorfa.

40c. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr-OH, C^H^^Og (MG 729,8)

A uma solução de 25 g de

Z-Trp-Lys(Boc )-Tyr-OMe em 1 20 ml de dioxano adicionam-se 70 ml de água e ml de soda cáustica IN. Depois de 6 horas de agitação à temperatura ambiente 0 dioxano é eliminado por destilação e acidifioa-se com solução de hidrogenossulfato de potássio até pH 2. 0 Ó1 o que se separa deste modo é extraído com acetato de etilo. A fase em acetato de etilo é seca com sul fato de sódio e concentrada. 0 óleo resultante é cromatografado através de slica-gel em cloreto de metileno/metanol/ água/ácido acético a 110:10:1:1.

Rendimento 13,3 g de uma substância amorfa, ponto de fusão 142-150°C (com decomposição), 22 o * -12,2° (c= 1, em dimetilformamida).

40d. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr-benzílamida ^C46^H ₅A°8 (MG 819)

A uma solução de 2,19 g (3 mmoles) de Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr-0H e 0,492 g de HOObt em 20 ml de dimetilformamida adicionam-se 0,33 ml (3 mmoles) de benzilamina e, a 0°C, 0,68 g de DCC. Tratamento como no exemplo la. Precipitação a partir de metanol/água.

Rendimento 1,5 g, ponto de fusão 218-221°C (com decomposição)

i)^{2 =} “25,5° (o=l, em dimetilformamida).

40e. Z-Trp-Lys-Tyr-benzilamida-acetato ^4-5^50^6% (⁷⁷⁸»9)

1,3 g de Z-Trp-Lys(Boc)-Tyrbenzilamida são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c.

Rendimento 0,92 g. Purificação em silica-gel com cloreto de metileno/metanol/água/ácido acético a 130:30:4:2.

Rendimento 355 mg, ~ -6,1° (c=l, em ácido acético a 90$).

41. Z-Trp-lys-Tyr-f ejaetilamida

41a. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr-fenetilamida, °47^H56^IÍ6°8 (MG 835,0)

Preparação análoga ao exemplo 40d com 0,38 ml (3 milimoles) de fenetilamina.

Rendimento 1,48 g, ponto de fusão 215O PP Q

-218°C (com decomposição /“rrc_/^ = -23,6° (c=l, em dimetilformamida).

41b. Z-Trp-Lys-Tyr-fenetilamida-acetato, Ο^Η^ΝθΟθ (MG 792,9)

1,3 g de Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr-fenetilamida são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 40e e purificados.

Rendimento 458 mg, ~ “3,9° (c=l, em áoido acético a 90$).

42. Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-ol

42a. Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr-Phe-ol, Ο^θΗ^θΝθΟθ (MG 863,0)

Preparação análoga à do exemplo 40c com 0,95 g (5 milimoles) de H-Phe-ol.HOObt.

Rendimento 1,47 g, ponto de fusão 194-196°C (com decomposição) ί

·*ν..

Ç)Ç) = -44,9° (c=l, em dimetilformamida)

42b.

Z-Trp-Lys-Tyr-Phe-ol-acetato, O^H^N^O^ (MG 822,9)

1,3 g de Z-Trp-Lys(Boc)-Tyr-Phe-ol são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 40e e purificados.

Rendimento 423 mg, C~ -1θ,θ° (c=l, em ácido acético a 90%)

43. Z-Trp-Lys-Tic-NBL)

43a. Z-Trp-Lys(Boc)-Tic-NH₂, C^H^NgO?

(MG 720,8)

A uma solução de 0,99 g (1,75 milimoles) de Z-Trp-Lys(Boc)-OH, 0,6 g de H-Tic-NH₂-tosilato e 0,29 g de HOObt em 10 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C, 0,23 ml de N-etilmorfolina e 0,38 g de ^CC. Tratamento analogamente ao exemplo la. A substância é precipitada em acetato de etilo/éter de petróleo.

Rendimento 1,05 g, ponto de fusão 160-175°C (oom decomposição) £ - -14,3 (c=l, em dimetilformamida).

43b. Z-Trp-Lys-Tic-NH₂-acetato, C^H^NgO? (684,8)

0,85 g de Z-Trp-Lys(Boc)-Tic-NH₂ são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 40e e purificados.

Rendimento 195 mg ~ -24,1° (c=l, em ácido acético a 90%).

44. Z-D-Phe-D-Tyr-D-Lys-D-Trp-NH₂

44a. Z-D-Lys(Boc)-D-Trp-NH₂ (C^^^Og (MG 565,7)

A uma solução de 4,3 g (18 milimoles) de H-D-Trp-NH₂.HC1, 2,52 g de (18 milimoles) de HOBt e 7,22 g de Z-D-Lys(Boc)-OH em 75 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 2,3 ml de N-etilmorfolina e 3,91 g de DCC. Trabalha-se analogamente ao exemplo la. 0 resíduo é triturado com éter metil-t-butílico.

Rendimento 9,05 g, Ponto de fusão 2002 2

-205°C (oom decomposição £^- 11,2° (c=l, em dimetilformamida) .

44b. H-D-Lys(Boc)-D-Trp-NH₂, Ο^Η^ΟΙχΝ^ (MG 468,0)

8,75 g de Z-D-Lys(Boc)-D-Trp-NH₂ são hidrogenados cataliticamente analogamente ao exemplo 2a.

Rendimento 7,25 g, ponto de fusão 17O-175°C (com decomposição) » -1,7° (c=l, em dimetilformamida).

44c. Z-D-Tyr(tBu)-D-Dys(Boc)-D-Trp-NH₂ ^C43^H56^N6°8 ^{(MG 784}’⁹⁾

A uma solução de 7,02 g (15 milimoles) de H-D-Lys(Boo)-D-Trp-NH₂.H01 6 g (16 milimoles) de Z-D-Tyr(tBu)-OH e 2,1 g de HOBt em 75 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 1,92 ml (15 milimoles) de N-etilmordhLina e 3,5 g de DCC. Tratamento idêntico ao do exemplo la. Resíduo triturado com éter dietílico.

Rendimento 8,54 g, ponto de fusão 178-185 C (com decomposição) £ = 10,8° (c=l, em dimetilformamida).

44d. H-D-Tyr(tBu)-D-Lys(Boc)-D-Trp-NH₂.HC1 ^C35^H51^C11'6°6 ^{(MS 687}’⁵⁾

8,3 g (10,5 mmoles) de Z-D-Tyr(tBu)-D-Lys(Boc)-D-Trp-NH₂ são hidrogenados cataliticamente ao exemplo 2a.

- 70 Δ

Rendimento 7,14 g, ponto de fusão 19O-192°C com decomposição.

= -11,2° (c=l, em dimetilformamida).

44e. Z-D-Phe-D-Tyr(tBu)-D-Lys(Boc)-D-Trp-NH₂ ^C52^H65^N7°9 ^{(MG 932}1)}

A uma solução de 2,74 g (4 mmoles) de H-D-Tyr(tBu)-D-Lys(Boc)D-Trp-NH₂.HCl, 1,21 g (4 mmoles) de Z-D-Phe-θΗ e 0,66 g de HOObt em 25 ml de dimetilformamida adicionam-se a 0°C 0,52 ml de N-etilmorfolina e 1,1 g de DCC. Tratamento como no exemplo la.

Rendimento 2,77 g, ponto de fusão 179

-185°C (com decomposição) ⁼ 20,1 (c=l, em dimetilformamida)

44f. Z-D-Phe-D-Tyr-D-Lys-D-Trp-NH₂-acetato, ^C45^N55^N7°7’ <^{mg 836}>

g de Z-D-Phe-D-Tyr(tBu)-D-Lys(Boc)-D-Trp-NH₂ são submetidos a reacção analogamente ao exemplo 2c.

Rendimento 434,1 mg, - 4,9° (c=l, em ácido acético a 90$).

Abreviaturas utilizadas:

As abreviaturas utilizadas para os aminoácidos correspondem ao código de 3 letras correntemente utilizado na química dos peptídeos como está descrito por exemplo em Europ. J. Biochem. 138-9 (1984). Algumas das outras abreviaturas estão explicadas adiantes

Ac-	acetilo
Soc-	t-butil-oxicarbonil
DCC	diciclohexilcarbodiimida
DMP-	dimetilformamida
Et-	etilo
Pmoc-	9-fluorenil-meti1-oxicarbonilo
HOBt	1-hidroxi-benzotriazol
HOOBt	3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-l,2,3-benzotriazol
-ol	um grupo óV-carboxik) de um resíduo de aminoácido C-terminal reduzido a álcool
-OMe	éster metílico
-ONSu	éster de N-hidroxissucoinimida
-OtBu	éster t-butílico
-OTop -StBu	2,3,4 ester triclorofenilo t-bútilmercapto
-tBu	t-butilo
Tic	ácido tetrahidroisoquinolino-3-carboxílico
Z-	benzil-oxicarbonilo. REIVINDICAÇÕES

- lê -

Claims

Processo para a preparação de um peptídeo cujo grupo Q -carboxilo C-terminal está protegido por uma função éster ou uma função amida, de fórmula geral I

L-B-A (I) na qual

1 pode estar ausente ou representa um radical lipófilo,

B representa um aminoácido básico e

A representa um aminoácido aromático, assim como dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, caracterizado pelo facto de se acoplar um fragmento com um grupo carboxilo terminal ou um seu derivado reactivo, com um correspondente fragmento com um grupo amino livre, de eventualmente se dissociarem um ou mais grupos de bloqueio introduzidos temporariamente para proteger outros grupos funcionais, e de se transformar o composto assim obtido nos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

- 2ô Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se preparar um composto de fórmula geral I em que L representa um aminoácido lipófilo N-terminal na configuração L ou D, protegido por radicais acilo ou peptídeo lipófilos, o qual está ligado numa configuração acilo ao grupo ££z-amino do aminoácido básico ou representa um radical acilo lipófilo ou um radical alquilcarbonilo com 1 a 17 átomos de carbono na parte alquilo_oassim como os seus sais fisiologicamente aceitáveis.

- 3* Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de se preparar um peptídeo de fórmula I em que L representa isoleucina, leucina, metionina, cisteína protegida por S, valina; fenilalanina, triptofano ou naftilalanina eventualmenté substituídos por halogénio, alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono ou alcoxi com 1 a 4 átomos de carbono; tirosina, serina ou treonina eventualmente substituídos no grupo hidroxi por alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; histidina substituída no átomo de azoto do anel imidazol por alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; ácido aspárgico, ácido glutâmico ou ácido aminodípico esterificado na cadeia por alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, ou postos na forma de amidas com aminas lipófilas; ou lisina ou ornicina não substituídas ou substituídas no grupo W -amino por alquilcarbonilo com 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo; radioaie lapófilos ou alquilcarbonilo com 1 a 17 átomos de carbono no grupo alquilo;

B representa arginina ou homoarginina eventualmente alquilados no grupo guanidino com alquilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, lisina ornitina, hidroxilisina ou citrulina nas configurações D ou L e

A representa fenilalanina, triptofano, naftilalinina, tienilalanina ou ácido tetrahidro-isoquinolino-3-carboxílico eventualmente substituídos nos grupos aromáticos por 1 a 5 radicais iguais ou diferentes da série halogéneo, alquilo ou alcoxi possuindo cada um 1 a 4 átomos de carbno; ou tirosina eventualmente substituída no grupo hidroxi por alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, cada um nas configurações L ou D, ou|os grupos carboxilo estão protegidos por ésteres de alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou de aril-alquilo com 5 a 14 átomos de carbono na parte arilo e 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, pelo grupo amido, por radicais alquilamido primários com 1 a 4 átomos de carbono, por arilalquilamido com 5 a 14 átomos de carbono na parte arilo e 1 a 4 átomos de carbono na parte alquilo, e radicais pertido constituídos por até 4 aminoácidos de ocorrência natural, assim como og seus sais fisiologicamente aceitáveis.

- _

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica contendo como ingrediente activo um peptídeo de fórmula geral I, quando preparado por um processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se incorporar o peptídeo ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis conjuntamente com uma substância veicular fisiologicamente aceitável e eventualmente outros

- 74 ί aditivos, substâncias auxiliares e/ou conservantes, numa forma apropriada para administração.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 29 de Abril de 1987, sob o n2 P 37 14 277.1.