DK171300B1 - Polypeptider, fremgangsmåder til deres fremstilling og analgetikum indeholdende et sådant polypeptid - Google Patents

Description

i DK 171300 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte polypeptider, der har fremragende medicinske virkninger.

Mere specielt angår opfindelsen polypeptider med den almene formel (I) (se krav 1), hvori symbolerne har den i 5 krav 1 anførte betydning, eller farmakologisk acceptable salte deraf. Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af disse polypeptider samt lægemidler, der indeholder dem.

De aminosyrer, der udgør de her omhandlede peptider, 10 omfatter D- og L-aminosyrer. Med mindre andet er angivet er aminosyrerne L-aminosyrer. De her anvendte symboler har samme betydning som i sædvanlig praksis inden for dette felt af peptidkemi. De har således følgende betydninger: 15 Tyr: tyrosin

Gly: glycin

Sar: sarcosin

Cys: cystein 7 Π u Phe: pher.ylalanin

Arg: argir.in

Leu: leucin 25 Ile: isoleucin

Nle: norleucin

Met: methicniri

Met(O): methioninesulfoxid 30 Ser: serin

Val: valir.

homo-Arg: homoarginin

Orn: ornithin· 35

Glu: glutaminsyre.:

Trp: tryptophan 2 DK 171300 B1

Asp: asparaginsyre

Ala: alanin

Pro: prolin ^ Gin: glutarr.in

Aib: 2-aminoiso smørsyre

Phe(p-Cl): p-chlorphenyl-alanin

Phe(p-Br): p-brcr.phenylalanin 1 0

Phe(p-N02): p-nitrophenylalanin

Phe(p-I): p- iodphenylalanin

Phe(p-F): p-fluerphenylalanin 15 Phe(p-CH3): p-methylphenylalanin

Phelp-CH^O): p-methoxyphenylalanin

Phe(p-CF3): p-trifluormethylphenylalanin BOC: tert-butoxycarbonyl 20 Z: benzyloxycarbonyl

CljBzl: 2,6-dichlorbenzyl CH^Bzl: 4-methylbenzyl 25 Tos: p-toluensulfony1 og

Bzl: benzyl 1 2 3 4 5 6

Kent teknik 2

De iagttagelser der er gjort ved undersøgelser 3 af mekanismen ved morphons analgetiske virkninger lader 4 formode, at det levende legeme indeholder såkaldte 5 endogene morfinlignende stoffer, der kontrollerer 6 forskellige vitale følelser såsom smertefølelse og mental funktion. Efter en række studier blev enkephalin og endorphin isoleret som opioide peptider og deres 3 DK 171300 B1 strukturer blev bestemt. Der blev derefter foretaget yderligere intensive undersøgelser på dette område, og der blev fundet adskillige hidtil ukendte opioide peptider såsom Ø-neoendorphin, Ø-casomorphin, kyotor-5 phin, dermorphin og dynorphin.

Blandt disse er dynorphin et opioidt peptid med følgende strukturformel, der er fundet af nogle af opfinderne af foreliggende opfindelse: H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-10 „

Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln-OH

Dynorphin er et naturligt opioidt peptid med specifikke virkninger på en K-receptor, og man forventer derfor anvendelse deraf som analgetikum uden 15 bivirkninger såsom tolerance eller tilvænning.

Problemer der skal løses gennem opfindelsen

Dynorphin har imidlertid den mangel, at det ikke kan udøve en analgetisk virkning som sådant ved 20 intravenøs injektion, idet det er ustabilt i blodet.

Desuden ønskes et yderst aktivt peptid med en kortere kæde, idet dynorphin er et peptid med en forholdsvis lang kæde. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Beskrivelse af opfindelsen 2

Opfinderne har foretaget intensive undersøgel 3 ser af peptider med en kæde, der er kortere end dynor- 4 phinets ,og som er i stand til at udøve deres analge- 5 tiske virkning ved såvel intravenøs scm subkutan injek- 6 tion, og de har til slut fundet, at dette formål kan 7 opnås ved anvendelse af hidtil ukendte peptider med 8 den almene formel I, eller farmakologisk acceptable 9 salte deraf.

10

Eksempler på farmakologisk acceptable salte 11 omfatter salte af uorganiske syrer såsom hydrochlorid, sulfat, hydrobromid og hydroiodid såvel som salte af organiske syrer såsom maleat, fumarat, succinat, acetat, malonat, citrat og benzoat.

4 DK 171300 B1

Et formål for foreliggende opfindelse er følgelig at tilvejebringe hidtil ukendte peptider, der er nyttige som lægemidler, især som analgetika.

Et andet formål for opfindelsen er at tilveje-5 bringe en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte peptider, der er nyttige som lægemidler.

Et yderligere formål for opfindelsen er at tilvejebringe nye analgetika, der indeholder nævnte peptider.

10 Udtrykket "lavere alkyl" i definitionerne i krav 1 er benyttet til betegnelse af ligekædede, forgrenede, cycliske og ringholdige alkylgrupper med 1 til 6 carbonatomer såsom methyl-, ethyl-, n-propyl-, isopropyl-, n-butyl-, iso-butyl-, 1-methylpropyl-, tert-15 butyl-, cyclopropylmethyl-, n-pentyl-, 1-ethylpropyl-, isoamyl- og n-hexylgrupper.

Strukturen af forbindelsen I ifølge foreliggende opfindelse er karakteristisk ved, at polypeptider, hvori alle de aminosyrer, der udgør peptidet, er L-ami- 20 nosyrermed den almene formel:

R

H2N-CH-C00H

(hvori R betegner en gruppe svarende til en strukturformel for en aminosyre berøvet en gruppe med formlen: 25 -CH-COOH) er udelukket derfra, dvs. at mindst én af nh2 de indgående aminosyrer er en a-N-alkylaminosyre eller D-aminosyre.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfin-30 delse, hvori mindst én af de indgående aminosyrer er en α-N-alkylaminosyre eller D-aminosyre,er fri for de alvorlige mangler hos det ovennævnte dynorphin og dets derivater, at de ikke kan udøve en analgetisk virkning som sådanne ved intravenøs injektion, idet 35 de er ustabile i blodet. Da forbindelserne ifølge opfindelsen har en særdeles høj stabilitet in vivo og i praksis er anvendelige som analgetika er de således yderst værdifulde.

5 DK 171300 B1

For at lette forståelsen af den foreliggende opfindelse vil der nedenfor blive givet eksempler på typiske forbindelser ifølge opfindelsen: e CH,Tyr-G2.y-G2.y-Phe-Leu-Arg-Arg-NH_ 5 j o Tyr-D-Met-GZy-Phe (p-Ci.) -Leu-Orn-D-Arg-D -A£a-NHCH2CH2CH3 0 CH3Tyr-Gi.y-GJly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-10 Arg-NHCK2CH3 o CE3T7r-D-A^a-C-^7-p-®-T7r-Ars-Arg-D-Leu- ne2 .

'5 . CEj >Tyr-Gi^-e/7-?E<>(P-CE5>-Msΐ-ArS'L75'

C^S

Asp-Arg-NECEjCEj -nvie — T.sii- «ts-Ar£ — D - Es u. “ NEg o T7r-D-A^a-C-^7'?l16 u *"6 6 2 20 _ r„ r e - Le u - Arg - Ar g - D- ~ Ar 5 ~ o CE j T7r-G£,γ-&£/Υ -“ 0 ne2 _ „-_-'ae-MetiO)- Arg- CE, Arg-2>Leu-0 CE - T7r -Gj&t-Gj&T · 5 25

Arg-NE.

I-- pv^e-D- C7S - Ar g - CE, Arg^eu~ o T7r-D-C7s-G^7"Pl1 3 nece2 CEj 30 - e.I/eu*Arg-Arg'D-Leu'NE2 o T7r-Sar-G^7-^“·® 35 N^CE5 CEj L7S-D-Met"^ cE5 6 DK 171300 B1 o CE. Tjr - G.47- Gi&y - Phe - Le u- Ar g - Ar g - D- Le u -NE(CH2)5 CEj 5 o CE-T7r-G.47"G.47-?he-tert-Leu-Arg-CE3Arg-D - Leu — ri .n C .c.» CE $ 0 Tjr - D- Tjr-G^7~ Piie -G.4u-D- Ar g-Ar g - Asp - NH2 10 0 CE - Tjr-G.47-G.47-Phe - CE 5 Lsu-Ar g-Arg-D-Leu- ne2 c Tjr-D-ε er-G/ 7- Phe - Ser-Arg-CE.Arg-D-Leu- NECE-CE, 15 ‘ 3 o CE j T7r-G47-G.47-Phe-Lea-Arg-Arg-D-Leu-Arg-NE2 o CEjT7r-G^7-G^7-D-Ph.e-Leu-Arg-Arg-D-Leu-ne2

o CE jT7r-G^7-GJ7-Pb.e -Leu-Arg-Arg-D-Leu-OE

o CE, T7r-G.47-0-.47-Phe(p-N0?)-Leu-Arg-CE,Arg-25 5 3 D-Lea-Arg-NECEjCS3 !-i o T7r-D-C7s -G.47“Phe - C7S - Arg - CE 5 Ar g -D-Leu- nece2ce3 30 o CE j CH2 T7r-G.47-G.47-Ph.e-Leu-Arg-Arg-D-Ph.e-Arg-NE2 o CE,T7r-G^7-G^7-Phe-Leu-Arg-CE,Arg-D-A^a-35 5 5 0Ξ 7 DK 171300 B1 o Tyr-D-Cys -G^y-Phe - Cy s - Arg -D- Ar g -Lys -D-Arg-NE2 5 o cEjTyr-G^y-C-^y-Piie-Leu-Arg-CEjArg-OCE2CH5 o. CE2 Tyr-D-A^-a-GJy-CE - Phe-Me ΐ ( 0} -Arg-CE3 Arg -I^e-NE2 10 o CEjTyr-G^y-G^y-CE5Phe-Lea-Arg-Arg-D-Leu-NE2 o Tyr - D - A^a - G^y -Phe-CEjMet-Arg-Arg-Leu-Arg-15 j NECE 2 CE j D-G<£n-Arg-NE2 o CE j Tyr-G^y-G^-y-Plie - Leu-Arg-CE- Arg-D-Leu-

20 OE

o CEj Tyr - G^y-G^-y-Piie - Me t - Lys - CE 5 Lys -Me t -NE2 o CE j Tyr - G„£y - G.£y - Ph. e - L6u-Arg -Arg-25 NECE2CE(CEj)CE2CE-

° CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Lys-CH3Arg-CH3Ile-OH 0 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Ala-OH 30 0 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-CH3Ala-OH

® CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-Ile-OH 0 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-Asp-OH e CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-CH3Ile-OH 35 0 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-Sar-OH

e CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-B-Ala-OH

8 DK 171300 B1

Peptiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan syntetiseres ved en vilkårlig passende fremgangsmåde. De beskyttede peptider kan syntetiseres ved 5 hjælp af en almindelig flydende-fase-proces eller fast-fase-proces. Det foretrækkes sædvanligvis, at en funktionel gruppe i en sidekæde i aminosyrer beskyttes. Alle beskyttelsesgrupperne fjernes i slut-trinnet. Beskyttelsesgrupperne for de funktionelle 10 grupper i sidekæderne i aminosyrerne omfatter alle de beskyttelsesgrupper, der hidtil er blevet rapporteret. Typiske eksempler på disse grupper omfatter tosyl (Tos)-, nitro (NOj)-, benzyl (Bzl)-, tert-butyl (But)-, benzoyloxycarbonyl (Z)- og tert-butoxycarbonyl 15 (BOC)-grupper.

Som beskyttelsesgrupper for a-aminogrupperne i aminosyrerne kan benyttes alle de beskyttelsesgrupper, der hidtil er blevet rapporteret. Det foretrækkes imidlertid at udvælge kombinationen af beskyttelsesgrupper-20 ne på en sådan måde, at kun beskyttelsesgrupperne for α-aminogrupperne kan fjernes selektivt uden at beskyttelsesgrupperne for de funktionelle grupper i sidekæderne påvirkes. Når der f.eks. benyttes en tert-but-oxycarbonylgruppe som beskyttelsesgruppe for a-amino-25 gruppen foretrækkes f.eks. en benzyl- eller benzyloxy-carbonylgruppe til beskyttelse af den funktionelle gruppe i sidekæden. Når der benyttes en benzyloxy-carbonylgruppe til beskyttelse af α-aminogruppen foretrækkes en tert-butyl- eller tert-butoxycarbonylgruppe 30 til beskyttelse af den funktionelle gruppe i sidekæden.

Når aminogruppen i Tyr ved N-terminalen er dialkyleret, kan man lade aminogruppen være som den er uden yderligere beskyttelse. For at forhindre racemisering syntetiseres det beskyttede peptid fortrinsvis ved 35 9 DK 171300 B1 hjælp af en trinvis proces, hvori alle aminosyrerne successivt forbindes, idet man starter fra C-terminalen, eller ved en proces,hvori fragmentkondensationen udføres ved Gly's stilling. Det er også muligt at udføre 5 fragmentkondensationen i en vilkårlig ønsket stilling.

Ved såvel fast-fase-processen som flydende-fase-processen ifølge den foreliggende opfindelse fjernes beskyttelsesgrupperne fra peptidet, og dette renses ved at gentage reaktionerne i nedenstående skema for 10 syntese af peptidet. Trinnene i denne proces illustreres med henvisning til flydende-fase-processen: 2 2 11 Y* v- V- i j j , kondensation R" - N - CHC00H + KN - CKCOR' -» 15 γ2 yl γΐ * * , , fjernelse af beskyttelses- r" - n - CHCON - CHCOR' gruppen fra a-aminogrup- pen X2 Y2 x1 2 y1 R" - N - iHCON - CHCOR' 20 2211

Y* Xx Y

HN - CHCON - CH - COR’ 1 2 hvori X og X hver især betegner H eller en alkyl- 2 25 gruppe, Y og Y betegner en aminosyresidekæde, og R' og R" betegner en beskyttelsesgruppe eller en peptidrest.

(1) Reaktion til dannelse af en peptidbinding:

Peptidbindingen kan dannes under anvendelse af en 30 vilkårlig af de hidtil rapporterede fremgangsmåder.

En almindelig anvendt fremgangsmåde omfatter aktivering af carboxylgruppen i en syrekomponent med den almene formel: 2

2 X^ YZ

i i

35 R" - N - CHCOOH

ved en i og for sig kendt metode såsom azidmetoden, dicyclohexylcarbodiimid (DCC)-metoden, blandet anhy-drid-metoden eller aktiv ester-metoden og omsætning af 10 DK 171300 B1 den aktiverede forbindelse med en aminkomponent med den almene formel:

X1 Y1 I I

HN - CHCOR' 5 Reaktionsbetingelserne såsom opløsningsmiddel og temperatur ved reaktionen kan variere alt efter fremgangsmåden til aktivering af carboxylgruppen. Blandet an-hydrid-metoden, der er en af typiske kondensationsmetoder, udføres på følgende måde: 10 en syrekomponent med den almene formel:

2 2 I I

R" - N - CHCOOH

opløses i et aprotisk opløsningsmiddel såsom dimethyl-formamid, tetrahydrofuran eller ethylacetat, den resul-15 terende opløsning afkøles til ca. -20°C, og der tilsættes derpå successivt ækvimolære mængder N-methyl-morpholin og ethylchlorcarbonat til opløsningen. Efter 5 minutters forløb tilsættes en aminkomponent med den almene formel: 20 X1 Y1 i i HN - CHCOR' i ækvimolær mængde, og blandingen omrøres ved -15 til 0°C i 2 til 5 timer og behandles derpå på sædvanlig måde til opnåelse af et beskyttet peptid med den almene 25 formel:

2 2 11 X Y X Y

i i I J

R" - N - CHCON - CHCOR' (2) Fjernelse af en beskyttelsesgruppe fra en a-amino-30 gruppe:

Fjernelsen af en beskyttelsesgruppe udføres ved hjælp af en i og for sig kendt fremgangsmåde såsom en katalytisk reduktionsmetode, en metode hvorved der benyttes en syre, en metode hvorved der benyttes en 35 base og en metode, hvorved der benyttes hydrazin.

En foretrukket fremgangsmåde udvælges blandt disse fremgangsmåder alt efter arten af beskyttelsesgruppen for α-aminogruppen. Typiske metoder omfatter en metode, 1 1 DK 171300 B1 hvorved beskyttelsesgruppen fjernes ved katalytisk reduktion af benzyloxycarbonylgruppen, og en metode hvorved tert-butoxycarbonylgruppen fjernes med tri-fluoreddikesyre.

5 Nedenfor vil en udførelsesmåde for fremgangs måden til fjernelse af tert-butoxycarbonylgruppen med trifluoreddikesyre blive beskrevet i enkeltheder: 0,25 ml anisol og 5 ml trifluoreddikesyre sættes til 1 g af et α-N-butoxycarbonylpeptid med den almene 10 formel: 2 2 11 X Y X I I i i BOC - N - CHCON - CHCOR' under afkøling med is. Blandingen omrøres i 60 minutter og behandles derpå med ether til opnåelse af et tri- 15 fluoracetat af et peptid med den almene formel:

2 2 11 X Y X1 Y

I I I I

HN - CHCON - CHCOR'

Dette produkt opløses i et opløsningsmiddel og neutraliseres med en amin såsom triethylamin til opnåelse 20 af en forbindelse, der underkastes den efterfølgende reaktion. 1

Fjernelse af samtlige beskyttelsesgrupper:

Efter gentagelse af den ovenfor nævnte konden-25 sation og fjernelse af beskyttelsesgrupperne for a-ami-nogrupper for forlængelse af peptidkæden fjernes samtlige beskyttelsesgrupper til opnåelse af det ønskede rå peptid. Beskyttelsesgrupperne fjernes på i og for sig kendt måde, f.eks. ved katalytisk reduktion, 30 en fremgangsmåde hvorved der benyttes flydende ammoniak/ alkalimetal, en fremgangsmåde hvorved benyttes en syre, en fremgangsmåde hvorved benyttes en base eller en fremgangsmåde, hvorved der benyttes hydrazin. I praksis vælges fremgangsmåden alt efter arten af beskyttel-35 sesgruppen. Een af hyppigt anvendte fremgangsmåder består i fjernelse af beskyttelsesgruppen med hydrogenfluorid (HF) på følgende måde: 12 DK 171300 B1 1 g af et beskyttet peptid opløses i ca. 30 ml HF i nærværelse af 0,5 ml anisol ved -15 til 0°C i en lukket HF reaktionsbeholder. Opløsningen omrøres i 60 minutter og HF afdestilleres fra reaktionssystemet.

5 Remanensen vaskes med ether og opløses i vand. Opløsningen behandles med Amberlite IRA-93 (eddikesyretype) og frysetørres til opnåelse af etjråt peptid, hvorfra beskyttelsesgrupperne er blevet fjernet.

10 (4) Rensning af råt peptid:

Det rå peptid kan renses på i og for sig kendt måde såsom ved ionbytningschromatografi, gelfiltrering, fordelingschromatografi, modstrømsfordeling og HPLC (high performance liquid chromatography). Rens-15 ningen kan f.eks. udføres ved følgende HPLC: 100 mg af det rå peptid påføres en søjle med en diameter på 20 mm og en højde på 250 mm, hvilken søjle indeholder Nucleosil 5 c 18 som bærer og elueres med 0,05% HCl (H2O-CH2CN). Fraktioner med toppe, der svarer til 20 det ønskede peptid, blev opsamlet ved påvisning ved UV 210 nm og frysetørret til opnåelse af det ønskede peptid.

Når peptidet indeholder 2 Cys- eller D-Cys-en-heder i molekylet oxideres det rå peptid ved en i og 25 for sig kendt oxidationsproces med luft eller hydrogen-peroxid før rensningen, hvorved der opnås et ringsluttet produkt af høj renhed.

Resultaterne af nedenstående dyreforsøg vil 30 yderligere illustrere virkningerne af forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse benyttet som lægemidler.

Forsøg 1 35 Analgetiske prøver

En prøveforbindelse blev opløst i fysiologisk saltopløsning. Hanmus af ddY-stammen (20-27 g legemsvægt, sædvanligvis studeret i grupper på 8) blev be- 1 3 DK 171300 B1 handlet intravenøst eller subkutant. Analgetiske virkninger blev målt ved hjælp af haleknibningsprøven.

Ved haleknibningsprøven 1) blev en klemme, der udøvede et tryk på 300 g,anbragt ved haleroden inklusive 5 anal mycosa, og latenstiden for bidning efter klemmen blev målt. Dyrene blev screenet for haleklemmenocicep-tion før forsøgene, og de mus, der ikke bed i løbet af 3 sekunder, blev fjernet fra forsøgene. En latenstid på mere 6 sekunder blev benyttet som kriterium for 10 analgi.

ED^g-Værdierne (50% analgetisk effektiv dosis) blev beregnet ved Litchfield og Wilcoxon's metode 2). Resultaterne er vist i tabellerne 1 og 2. Tabel 1 viser de resultater, der er opnået ved intravenøs injek-15 tion. Tabel 2 viser de resultater, der er opnået ved subkutan injektion.

Numrene i prøveforbindelsekolonnen i tabellerne 1 og 2 svarer til numrene på slutforbindelserne fremstillet ifølge nedenstående eksempler.

o 14 DK 171300 B1 ___Tabel 1 _

Prøveforbindelse Haleknibningsmetode (i.v.) (Eksempel nr) ED50 1 0,75 2 0,24 5 3,4 _6_j_ 4,3_ 7 I 3,9 8 j 3,3 ! 10 I .1,2 i _18_j_4^5_j 19 i 2,0 _I________ i 21 ; 0,8 22 ; 3,0 24 0,22

25 ! 1,8 I

_ ! i 27 j 0,7 1 _28_I_017_j 29 I 2,0

I I

dynorphin (1-13) j >25,0 , _Tabel 2_

Prøveforbindelse Haleknibningsmetode (s.c.) (Eksempel nr.) ED50 1 1,0 2 0,44 21 0,8 24 0,32 27 0,8 28 1,5 15 DK 171300 B1 (Note 1) Haleknibningsmetoden blev udført ifølge Tagaki, H., et al. "Jap. J. Pharmacol." Vol. 16, 287-294 (1966).

(Note 2) Lichtfield-Wi]coxon metoden blev udført ifølge 5 Lichtfield, J. T., og F. Wilcoxon, "J. Pharma col. Exp. Ther." Vol. 96, 99-113 (1949).

Forsøg 2 Opioid virkning 10 Forbindelsernes opioide virkninger blev under søgt ved den metode, hvorved der benyttes kanin vas deferens ifølge T. Oka, K Negishi, M. Suda, T. Matsumiya, T. Inaza og M. Ueki, "Europ. J. Pharmacol." Vol. 73, 235 (1980).

15 Ved denne prøve blev voksne hankaniner dræbt ved indføring af luft i en otisk åre. Umiddelbart efter døden blev udført en laparotomi og højre og venstre vasa.deferens blev fjernet. Sæden blev presset ud af kanalerne og ud i Ringer’s opløsning. En del 20 af hver kanal blev afskåret (2,5 cm lang, fra en ende fra prostata-siden). Stykkerne fra de deferentiale kanaler blev ved hjælp af en tråd ophængt i en 6 ml glascelle med konstant temperatur og blev stimuleret elektrisk med et apparat til elektrisk stimulering 25 med platinelektroder under betingelserne 0,1 Hz, 1 ms og 90 volt. En kontraktion, der skyldtes den elektriske stimulering, blev optegnet ved hjælp af en transducer.

Den opioide virkning blev bestemt på basis af hæmningen af kontraktionen, der skyldtes den elek-30 triske stimulering.

Resultaterne er vist i tabel 3 udtrykt som 50% hæmningskoncentration (IC^q).

DK 171300 B1 16

Tabel 3

Prøveforbindelse Kanin vas deferens -metode (Eksempel nr.) 1 3,5 5 2 0,04 3 6,03 6 4,5 10 8 6»2 19 2,8 24 0,08 25 0,58 15 27 Ϊ 2,0 i 28 ! 6,5 i dynorphin A (1-17) j l"7»4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Det fremgår af tabel 3, at forbindelserne ifølge 2 den foreliggende opfindelse har en meget stærk virkning 3 sammenlignet med dynorphin A.

4

De har endvidere stærke virkninger hvad angår 5 hæmning af kontraktionen af ileumlængdemuskler hos 6 marsvin og deferentiale kanaler hos mus som følge af 7 elektrisk stimulering.

8

Det fremgår af ovenstående farmakologiske for 9 søgsresultater, at peptidforbindelserne ifølge den 10 foreliggende opfindelse har opioide virkninger svarende 11 til virkningerne af dynorphin, og at deres virkninger 12 er særdeles stærke og endvidere, at de bemærkelses 13 værdige analgetiske virkninger udøves såvel ved intra 14 venøs som ved subkutan injektion.

15

Det er overordentlig værdifuldt, at forbindel- 16 serne ifølge den foreliggende opfindelse udøver de stærke analgetiske virkninger ved systemisk administrering ved intravenøs eller subkutan injektion, medens dynorphin og dettes derivater efter hvad der hidtil er rapporte- DK 171300 Bl 17 ret næppe udøver deres analgetiske virkninger ved intravenøs injektion, idet de er ustabile i blodet.

Forholdet mellem toxiciteten (mindste letale dosis) af peptidet, der er fremstillet ifølge eksemp-5 lerne 1 og 2 nedenfor, og den effektive dosis er vist i tabel 4.

Tabel 4

Effektiv dosis og mindste letale dosis ved subkutan 10 indgift i mus._

Forbindelse Haleknibning Mindste letale (Eksempel nr.) ED50 aosis (mg/kg)

Eksempel 1 1,0 100 15 _

Eksempel 2 0,44 20

Peptidforbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse har bemærkelsesværdige analgetiske virknin-20 ger, og de er nyttige som lægemidler indenfor det terapeutiske område.

Ved anvendelse af forbindelserne som analgetika indgives de peroralt eller parenteralt. Sædvanligvis indgives de parenteralt i form af intravenøs, subkutan 25 eller intramuskulær injektion eller som suppositorier eller sublinguale tabletter. Dosis varierer alt efter symptomerne, patientens alder, køn, legemsvægt, følsomhed, administreringsmåde, sygdommens trin, intervaller, lægemiddelpræparatets egenskaber, formulering, præpara-30 tets art og arten af den aktive bestanddel. Selvom doseringen således ikke ligger indenfor specielle grænser, andrager den sædvanligvis ca. 0,1 til 1000 mg, fortrinsvis ca. 1 til 300 mg/dag for voksne.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindel-35 se kan formuleres til injektionspræparater, suppositorier, sublinguale tabletter, tabletter og kapsler ved en indenfor dette tekniske område almindelig fremgangsmåde.

18 DK 171300 B1

Ved fremstillingen af injektionspræparaterne sættes additiver såsom pH-kontrollerende midler, puffermidler, suspenderingsmidler, opløseliggørende midler, stabilisatorer, isotoniserende midler og konserverings-5 midler til den aktive bestanddel, og den opnåede blanding formuleres til et intravenøst, subkutant eller intramuskulært injektionspræparat på vilkårlig kendt måde. Om nødvendigt kan blandingen lyofiliseres ved konventionelle metoder.

10 Eksempler på suspenderingsmidler er methylcellu- lose, Polysorbat 60, hydroxyethylcellulose, akacie, tragacanthpulver, natriumcarboxymethylcellulose og polyoxyethylensorbitanmonolaurat.

Eksempler på opløseliggørende midler er polyoxy-15 ethylen-hærdet ricinusolie, Polysorbat 80, nicotinamid, polyoxyethylensorbitanmonolaurat, macrogol og ethyl-estere af ricinusoliefedtsyrer.

Eksempler på stabilisatorer er natriumsulfit, •natriummetasulfit og ethere. Eksempler på konserverings-20 midler er methyl-p-hydroxybenzoat, ethyl-p-hydroxyben-zoat, sorbinsyre, phenol, cresol og chlorcresol.

Den foreliggende opfindelse vil blive nærmere illustreret ved hjælp af følgende typiske eksempler, der på ingen måde begrænser opfindelsen.

25

Eksempel 1 1) Syntese af CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-D-Leu-nhc2h5 25 g Boc-D-Leu-0H*H20 blev opløst i 200 ml THF.

30 Opløsningen blev afkølet til -20°C. Der blev til opløsningen sat 11 ml N-methylmorpholin og 9,56 ml ethyl-chlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb tilsattes 12,9 g af en 70%'s vandig ethylaminopløsning, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentre-35 ring blev remanensen opløst i ethylacetat og successivt vasket med en vandig NaHC03~opløsning og vand. Efter koncentrering til tørhed opnåedes 24,5 g Boc-D-Leu- nhc2h5.

19 DK 171300 B1

Snip.: 103-106°C

TLC: Rf-værdi 0,77 (ethylacetat)

Optisk drejning: [a]D = +20,0° (C = 1, methanol) Elementaranalyse for ci3H26N2°3:

5 C Η H

beregnet (%) 60,44 10,14 10,84 fundet (%) 60,42 10,33 10,86 2) Syntese af Z-CH^Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H^ 10 1,43 g Z-CH3Arg(Tos)-OH, [α]β = -15° (C * 1, dimethylformamid), syntetiseret ud fra Η-Arg(Tos)-OH ifølge den af P. Quitt et al. beskrevne metode [Helvetica Chimica Acta, 3^2 , 327 (1963)],blev opløst i 15 ml tetrahydrofuran. Efter afkøling til -30°C sattes 0,33 15 ml N-methylmorpholin og 0,29 ml ethylchlorcarbonat til opløsningen. Efter 5 minutters forløb tilsattes en opløsning af 817 mg CF3COOH-H-D-Leu-NHC2Hg (syntetiseret ved behandling af Boc-D-Leu-NHCjHg med CF^COOH i nærværelse af anisol) og 0,83 ml triethylamin i 7 ml 20 tetrahydrofuran, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat, vasket med en vandig NaHCO^-opløsning og derpå med vand og koncentreret til tørhed, hvorved opnåedes 1,58 g glasagtig Z-CH^Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H^.

25 TLC: Rf-værdi 0,68 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [α)^ = 0*0,5° (C = 1, methanol) Elementaranalyse for C^øH^NgOgS:

C Η N

beregnet (%) 58,42 7,19 13,63 30 fundet (%) 58,29 7,19 13,40 3) Syntese af Boc-Arg (Tos) -CH^Arg (Tos) -D-Leu-ittK^Hg 1,1 g CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHCjHg opnået ved katalytisk reduktion af Z-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHCjHg i nær-35 værelse af Pd/C, 983 ml Boc-Arg(Tos)-OH og 372 mg N-hy-droxybenzotriazol blev opløst i 4 ml dimethylformamid.

Der blev til opløsningen sat 520 mg dicyclohexylcarbo- DK 171300 Bl 20 diimid under afkøling med is, og blandingen blev omrørt i køleskab een dag og derpå ved stuetemperatur een dag.

De således dannede bundfald blev frafiltreret, og filtratet blev koncentreret. Koncentrationsremanensen 5 blev renset ved silicagelsøjlechromatografi (eluerings-middel: MeOH/CHCl^ = 1/15), hvorved opnåedes 1,2 g glasagtig Boc-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos^-D-Leu-NHC2H5.

TLC: Rf-værdi 0,64 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a]D = -20,6° (C = 1, methanol) 10 Elementaranalyse for C4oH64Nio°9S2*H20:

C Η N

beregnet (%) 52,72 7,30 15,37 fundet (%) 52,82 7,22 15,06 15 4) Syntese af Boc-Leu-Arg (Tos) -CH^Arg (Tos) -D-Leu-NH^H^ 1,645 g Boc-Leu-OH·Η20 blev opløst i 12 ml di-methylformamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C.

Der sattes 0,726 ml N-methylmorpholin og 0,631 ml ethylchlorcarbonat til opløsningen. Efter 5 minutters 20 forløb tilsattes en opløsning af 4,986 g CF^COOH'HArg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H^, syntetiseret ved behandling af Boc-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-NI^H^ med CF^COOH i nærværelse af anisol, og 0,726 ml N-methylmorpholin i 12 ml dimethylformamid, 25 og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer.

Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethyl-acetat, og opløsningen blev vasket med vandig NaHCO^-opløsning og derpå med vand. Efter koncentrering efterfulgt af størkning med methanol/ether opnåedes 5,283 g 30 Boc-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-NHCjH^.

Smp.: 120-125°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,66 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a)D = -25,8° (C = 1, methanol) Elementaranalyse for C^H^N^O^qSj ‘CH^OH:

35 C Η N

beregnet (%) 54,36 7,67 14,84 fundet (%) 54,49 7,63 14,62 21 DK 171300 B1 5) Syntese af Boc-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-__ 1,465 g Boc-Phe-OH blev opløst i 12 ml dimethyl-formamid. Opløsningen blev afkølet til -30°C. Der sattes 5 til opløsningen 0,608 ml N-methylmorpholin og 0,528 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb tilsattes en opløsning af 4,691 g CF3COOH*H-=Phe-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H3, syntetiseret ved behandling af Boc-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H^ med 10 CF^COOH i nærværelse af anisol, og 0,608 ml N-methyl-morpholin i 12 ml dimethylformamid til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer.

Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylace-tat, og opløsningen blev vasket med en vandig NaHCO^-15 opløsning og derpå med vand. Efter koncentrering efterfulgt af størkning med methanol/ether opnåedes 5,072 g Boc-Phe-Leu-Arg(Tos)-CHjArg(Tos)-D-Leu-NHC2H3.

Smp.: 127-132°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,66 (methanol/chloroform, 1:7) 20 Optisk drejning: [a]D = -25,4° (C = 1, methanol)

Elementaranalyse for C55H84N12°11S2‘CH30H:

C Η N

beregnet (%) 56,74 7,48 14,18 fundet (%) 56,64 7,33 13,86 25

6) Syntese af Boc-CHgTyr((CljBzl)-Gly-Gly-OH

9,09 g Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)0H, Ια]d = -49° (C - 1, C2H3OH), syntetiseret ved en af S.T. Cheung et al. beskrevet metode (Can. J. Chem., 5J3, 906 (1977) }f og 30 2,53 g N-hydroxysuccinimid blev opløst i 150 ml tetra- hydrofuran. Efter afkøling med is sattes 4,12 g dicyclo-hexylcarbodiimid til opløsningen, og blandingen blev omrørt natten over i køleskab. De således dannede hvide krystaller blev frafiltreret, og der blev til 35 filtratet sat 2,91 g H-Gly-Gly-OH og 38 ml af en vandig opløsning af 1,848 g NaHCO^. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i to dage og derpå koncentreret.

22 DK 171300 B1

Der blev tilsat en fortyndet vandig citronsyreopløsning og ethylacetat, og ethylacetatlaget blev fraskilt.

Efter vask med vand efterfulgt af koncentrering blev produktet renset ved silicagelsøjlechromatografi 5 elueret med MeOH/CHCl^ = 1/30 og størknet med ether/n-hexan, hvorved opnåedes 9,23 g Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-OH.

Smp.: 70-80°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,79 (methanol/eddikesyre/chloro-10 form, 4:1:12)

Optisk drejning: [a]D = -47° (C = 1, methanol) Elementaranalyse for C26H31N307C12·l/2C2H5OC2H5:

C Η N

beregnet (%) 55,54 5,99 6,94 15 fundet (%) 55,45 5,81 6,89 7) Syntese af Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Årg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H5 682 mg Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-OH og 195 mg 20 N-hydroxybenzotriazol blev opløst i 4 ml dimethylform-amid. Der blev til opløsningen sat 272 mg dicyclohexyl- carbodiimid under afkøling med is. Efter omrøring i 2 timer sattes en opløsning af 1,167 g CFjCOOH*H-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H5, syntetiseret 25 ved behandling af Boc-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHCjH^ med CFjCOOH i nærværelse af anisol, og 0,132 ml N-methylmorpholin i 8 ml dimethylformamid til opløsningen, og blandingen blev omrørt i et køleskab natten over. Et således dannet bundfald blev frafiltreret, 30 og filtratet blev koncentreret og renset ved silicagelsøjlechromatograf i (elueringsmiddel: MeOH/CHCl3 = 1/20). Efter størkning med methanol/ether opnåedes 1,391 g Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H5.

35 Smp.: 130-135°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,64 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a)D = -35,3° (C = 1, methanol) 23 DK 171300 B1

Elementaranalyse for 3S2C12*CH30H‘H20

C Η N

beregnet (%) 55,92 6,77 12,70 fundet (%) 56,06 6,49 12,52 5 8) Syntse af CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-D-Leu-_____ 220 mg Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2Hg blev opløst i 10 ml 10 hydrogenfluorid (HF) i nærværelse af 0,2 ml anisol i en lukket HF-reaktionsbeholder ved -5°C. Opløsningen blev omrørt 1 time og derpå blev HF afdestilleret fra reaktionssystemet. Remanensen blev vasket med ether og opløst i vand. Opløsningen blev behandlet 15 med Amberlite IRA-93 (eddikesyretypen) og frysetørret.

120 mg af et således opnået råt peptid blev renset ved HPLC [Nucleosil 5 C 18, 2 0 x 25 cm, elueret med 0,1% HC1 (H^O-CH^CN, 81/91)] og derpå frysetørret, hvorved opnåedes 70 mg CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-20 CH3Arg-D-Leu-NHC2H5.

TLC: Rf-værdi 0,70 (butanol/eddikesyre/pyridin/ vand, 15:5:5:8)

Optisk drejning: [a]D = -21,8° (C = 0,4, 0,01 N-HC1) 25 M.S. (FAB) : 1036([M+H] + )

Aminosyreanalyse:

Gly 1,87(2) Leu 1,96(2) Phe 1,00(1)

Arg 0,95(1) (toppe, der skyldes CH3Tyr og CH3Arg;blev 30 ikke beregnet).

Eksempel 2 1--1

Syntese af Tyr-D-Cys-Gly-Phe-Cys-Arg-CH3Arg-D-Leu-Arg-NHj ' ^ 1) Syntese af Boc-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 2,493 g Boc-D-Leu-0H*H20 blev opløst i 10 ml dimethylformamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C.

24 DK 171300 B1

Der tilsattes 1,1 ml N-methylmorpholin og 0,96 ml ethyl-chlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb blev der tilsat en opløsning af 4,414 g CF^COOH»Η-Arg(Tos)-NH2 og 1,65 ml N-methylmorpholin i 20 ml dimethylformamid, og blan-5 dingen blev omrørt ved ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat og vasket med NaHCO^ og derpå med vand. Efter koncentrering blev der tilsat ether til størkning af produktet.

Der opnåedes således 4,96 g Boc-D-Leu-Arg (Tos) -NH2.

10 Smp.: 110-120°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,49 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [o] = +13,0° (C = 1, methanol)

Elementaranalyse for C24H40N6°6S·1/31^0:

C Η N

15 beregnet (%) 52,73 7,50 15,37 fundet (%) 52,77 7,60 15,14 2) Syntese af Z-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 3,336 g Z-CHjArg(Tos)-OH blev opløst i 30 ml 20 tetrahydrofuran. Opløsningen blev afkølet til -20°C.

Der blev til opløsningen sat 0,77 ml N-methylmorpholin og 0,67 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb tilsattes en opløsning af 3,882 g CF^COOH-H-D-Leu-Arg(Tos)-NHj,syntetiseret ved behandling af 25 Boc-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 med CF^COOH i nærværelse af anisol, og 1,17 ml triethylamin i 30 ml tetrahydrofuran, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering efterfulgt af størkning med methanol/vand opnåedes 6,14 g Z-CH^Arg(Tos)-D-Leu-30 Arg(Tos)-NH2.

Smp.: 100-113°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,44 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a]D =-3,4° (C = 1, methanol) :

Elementaranalyse for C4iH5gNio°9S2•CH3(-)H:

35 C Η N

beregnet (%) 54,18 6,71 15,04 fundet (%) 54,12 6,62 14,85 25 DK 171300 B1 3) Syntese af Boc-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-__ — 4,734 g CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2, opnået ved katalytisk reduktion af Z-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-5 NH2 i nærværelse af Pd/C, 2,918 g Boc-Arg(Tos)OH og 1,1 g N-hydroxybenzotriazol blev opløst i 17 ml dimethyl formamid . Der blev til opløsningen sat 1,543 g dicyclohexylcarbodiimid under afkøling med is, og blandingen blev omrørt i køleskab een dag og derpå 10 ved stuetemperatur een dag. Et således dannet bundfald blev frafiltreret, og filtratet blev koncentreret. Remanensen blev renset ved silicagelsøjlechroma-tografi (elueret med MeOH/CHCl^ = 1/15) og bragt til størkning med ether, hvorved opnåedes 4,917 g Boc-15 Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2.

Smp.: 131-136°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,44 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a)D = -16,7° (C = 1, methanol)

Elementaranalyse for C51H78N14°12S3*H20:

20 C Η N

beregnet (%) 51,32 6,76 16,43 fundet (%) 51,15 6,54 16,48 4) Syntse af Boc-Cys(CH^Bzl)-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D- 25 Leu-Arg(Tos)-NH2 747 mg Boc-Cys(CH^Bzl)-OH blev opløst i 4 ml dimethylformamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C.

Der blev tilsat 0,254 ml N-methylmorpholin og 0,221 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb blev der 30 til opløsningen sat en opløsning af 2,497 g ΟΕ^ΟΟΟΗ-Η-Arg(Tos)-CHgArg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2, syntetiseret ved behandling af Boc-Arg(Tos)-CHgArg(Tos)-D-Leu-Arg (Tos)-NH2 med CFgCOOH i nærværelse af anisol, og 0,277 ml N-methylmorpholin i 6 ml dimethylformamid, 35 og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer.

Efter koncentrering blev blandingen opløst i ethyl-acetat og derpå vasket med NaHCOg og derefter med vand. Efter yderligere koncentrering blev produktet 26 DK 171300 B1 størknet med methanol/ether, hvorved opnådes 2,548 g Boc-Cys(CH^Bzl)-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH^.

Smp.: 126-132°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,51 (methanol/chloroform, 1:7) 5 Optisk drejning: [a]^ = -20,6° (C = 1, methanol)

Elementaranalyse for C62H91N15°13S4*CH3OH*H20:

C Η N

beregnet (%) 52,81 - 6,82 14,66 fundet (%) 52,78 6,43 14,29 10 5) Syntse af Boc-Phe-Cys(CH^Bzl)-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 467 mg Boc-Phe-OH blev opløst i dimethylformamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C. Der blev 15 til opløsningen sat 0,194 ml N-methylmorpholin og 0,168 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb tilsattes en opløsning af 2,234 g CF^COOH-H-Phe-Cys (CH^Bzl)-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2, syntetiseret ved behandling af Boc-Phe-Cys(CH^Bzl)-Arg(Tos)-CH^Arg-20 (Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 med CF3COOH i nærværelse af anisol, og 0,211 ml N-methylmorpholin i 5 ml dimethyl-formamid, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en van-25 dig NaHCO^-opløsning og derpå med vand. Efter yderligere koncentrering blev produktet størknet med methanol/ether, hvorved opnåedes 2,126 g Boc-Phe-Cys(CH3Bzl)-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2.

Smp.: 124-130°C (dek.) 30 TLC: Rf-værdi 0,56 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a]D = -18,9° (C = 1, methanol)

Elementaranalyse for C^H^QQN^gO^S4.5/2CH3OH:

C Η N

beregnet (%) 54,83 6,89 13,91 35 fundet (%) 54,62 6,34 13,64 27 DK 171300 B1 6) Syntese af Boc-D-Cys(CH-jBzl)-Gly-OC^H^ 3,233 g Boc-D-Cys(CH^Bzl)OH blev opløst i 15 ml dimethylformamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C.

Der blev til opløsningen sat 1,1 ml N-methylmorpholin 5 og 0,956 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb tilsattes en opløsning af 1,396 g HC1*H-Gly-OC2H^ og 1,1 ml N-methylmorpholin i 20 ml dimethyl-formamid, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst 10 i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en vandig NaHCO^-opløsning og derpå med vand. Efter koncentrering blev tilsat n-hexan for størkning af produktet.

Der opnåedes således 3,6 g Boc-D-Cys-Gly-OC2H3.

Smp.: 80-82°C

15 TLC: Rf-værdi 0,74 (chloroform/ethylacetat, 2:1)

Optisk drejning: [a)D = +30,2° (C » 1, methanol)

Elementaranalyse for C2oH3oN2°5S:

C Η N

beregnet (%) 58,51 7,37 6,82 20 fundet (%) 58,35 7,23 6,69 7) Syntese af Boc-Tyr (Cl2Bzl) -D-Cys (CH^Bzl) -Gly-OC^H^ 2,068 g Boc-Tyr(Cl2Bzl)-OH blev opløst i 20 ml tetrahydrofuran. Opløsningen blev afkølet til -20°C.

25 Der sattes 0,517 ml N-methylmorpholin og 0,45 ml ethylchlorcarbonat til opløsningen. Efter 5 minutters forløb sattes en opløsning af 1,94 g CF3COOH*H-D-Cys(CH3Bzl)-Gly-OC2H3, syntetiseret ved behandling af Boc-D-Cys(CH3Bzl)-Gly-OC2H3 med CFjCOOH i nærværelse af ani-30 sol, og 1 ml triethylamin i 20 ml tetrahydrofuran til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering tilsattes vand for dannelse af et bundfald. Bundfaldet blev frafiltreret og opløst i en blanding af methanol og chloroform. Efter 35 koncentrering tilsattes ether for størkning af produktet. Der opnåedes således 2,661 g Boc-Tyr(Cl2Bzl)-D-Cys(CH3Bzl)-Gly-OC2H5.

28 DK 171300 B1

Snip. : 149-150°C

TLC: Hf-værdi 0,63 (chloroform/ethylacetat, 2:1)

Optisk drejning: [a]^ = +17,0° (C = 1, dime thyl formamid) 5 Elementaranalyse for C36H43N307SC12:

C Η N

beregnet (%) 59,01 5,91 5,73 fundet (%) 58,94 ~ 5,75 5,62

10 8) Syntese af Boc-Tyr (C^Bzl) -D-Cys (CH3Bzl) -Gly-OH

2,345 g Boc-Tyr(Cl2Bzl)-D-Cys(CH3Bzl)-Gly-OC2H5 blev opløst i 30 ml tetrahydrofuran og der tilsattes derpå 3,2 ml N-NaOH. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 1 time. Der sattes 3,2 ml N-HC1 til blan-15 dingen. Den resulterende blanding blev koncentreret. Der blev tilsat vand for størkning af produktet. Der opnåedes således 1,899 g Boc-Tyr(Cl2Bzl)-D-Cys(CHjBzl)-Gly-OH.

Smp.: 133-138°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,25 (methanol/chloroform, 1:7) 20 Optisk drejning [a]D = +35,8° (C = 1, methanol)

Elementaranalyse for c34H3gN307SCl2:

C Η N

beregnet (%) 57,95 5,58 5,96 fundet (%) 57,81 5,33 5,92 25 9) Syntse af Boc-Tyr(Cl2Bzl)-D-Cys(CH3Bzl)-Gly-Phe-Cys(CH3Bzl)-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 983 mg Boc-Tyr(Cl2Bzl)-D-Cys(CH3Bzl)-Gly-OH og 226 mg N-hydroxybenzotriazol blev opløst i 5 ml 30 dimethylformamid. Der blev til opløsningen sat 316 mg dicyclohexylcarbodiimid under afkøling med is. Efter omrøring i 2 timer blev der til opløsningen sat en opløsning af 1,94 g CF3COOH*H-Phe-Cys(CH3Bzl)-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2, syntetiseret ved be-35 handling af Boc-Phe-Cys(CH3Bzl)-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 med CFjCOOH i nærværelse af ani-sol, og 0,167 ml N-methylmorpholin i 10 ml dimethyl- 29 DK 171300 B1 formamid,og blandingen blev omrørt i køleskab natten over. Et således dannet bundfald blev frafiltreret.

Efter silicagelsøjlechromatografi (eluering med MeOH/ CHCl^ = 1/20) efterfulgt af størkning med methanol/ 5 ether opnåedes 2,0 g Boc-Tyr(CljBzl)-D-Cys(CH^Bzl)-

Gly-Phe-Cys(CH^Bzl)-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 .

Smp.: 123-230°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,63 (methanol/chloroform, 1:7) 10 Optisk drejning: [a]p = -17,5° (C = 1, dimethyl- formamid)

Elementaranalyse for cioOH129N19°18S5C12' C2H5OC2H5.3/2CH3OH:

C Η N

15 beregnet (%) 56,60 6,52 11,89 fundet (%) 56,38 6,18 11,72 I-, 10) Syntese af Tyr-D-Cys-Gly-Phe-Cys-Arg-CH^Arg-D-Leu-_____ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 515 mg Boc-Tyr(CljBzl)-D-Cys(CHjBzl)-Gly-Phe- 2

Cys (CH^Bzl)-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 3 blev opløst i 20 ml HF i nærværelse af 2 ml anisol ved 4 -5°C i en lukket hydrogenfluorid (HF)-reaktionsbehol 5 der. Opløsningen blev omrørt i 2 timer, og derpå blev 6 HF afdestilleret fra reaktionssystemet. Remanensen 7 blev vasket med ether og opløst i vand. Opløsningen 8 blev behandlet med Amberlite IRA-93 (eddikesyretype) 9 og derpå frysetørret. 320 mg af det tørre produkt blev 10 opløst i 1,3 liter vand, og opløsningen blev indstillet 11 på pH 8 med vandig ammoniak. Der blev indført luft 12 under omrøring i 2 dage, og blandingen blev indstillet 13 på pH 6 og derpå frysetørret. Det således opnåede rå peptid blev renset ved HPLC [Nucleosil 5 C 18, 2 0 x 14 25 cm, elueret med 0,05% HCl (Η,Ο/CH^CN, 88/12)] og 15 . ^ J 1-1 16 frysetørret til opnåelse af 140 mg Try-D-Cys-Gly-Phe-Cy9-

Arg-CH3Arg-D-Leu-Arg-NH2.

TLC: Rf-værdi 0,56 (butanol/eddikesyre/pyridin/ vand, 15:5:5:8) 30 DK 171300 B1

Optisk drejning: [a]D = -29° (C = 0,4, 0,01N-HC1) M.S. (FAB): 1183 ([M+H]+)

Aininosyreanalyse:

Gly 1,02(1) Cys 1,83(2) Leu 1,04(1) 5 Tyr 0,80(1) Phe 1,00(1) Arg 2,06(2) (En top, der skyldes CH3Arg,blev ikke beregnet)

Eksempler 3-29

De i tabel 5 viste forbindelser blev syntetise-10 ret ved den samme konventionelle flydende-fase-proces som i eksemplerne 1 og 2. Ved disse forsøg blev dynor-phinderivater, der var modificeret i stillingerne 1 til 3 (Tyr-Gly-Gly), i stillingerne 4 til 7 (Phe-Leu-Arg-Arg), i stillingerne 4 til 8 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile) og 15 i stillingerne 4 til 9 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg), syntetiseret ved den trinvise fremgangsmåde, idet man startede fra C-ter-minalen i hvert peptid. Derpå blev derivaterne i stillingerne 1 til 3 og derivaterne i stillingerne 4 til 7, 4 til 8 eller 4 til 9 sammenkondenseret ved 20 DCC-HOBt-metoden eller blandet anhydrid-metoden. Alle beskyttelsesgrupperne blev fjernet med hydroqenfluorid (HF),og produktet blev renset ved præparativ HPLC under anvendelse af en "reversed phase"-bærer. I eksempel 24 blev alle beskyttelsesgrupperne fjernet med HF, og 25 forbindelsen blev oxideret med luft og derpå renset ved præparativ HPLC. Reaktionsvejene ved syntesen af de respektive beskyttede peptider er vist i figurerne 1 til 5.

Resultaterne af bestemmelsen af optisk drejning 20 3 0 [a]D · TLC Rf-værdi og aininosyreanalyse af de opnåede ønskede peptider er vist i tabel 6.

31 DK 171300 B1

Tabel 5

Eks< "I-“ Forbindelse I CK Ty.r.0/y-0^r-rhe-Leu*ArB'Are-N'Hi 4 ch Tyr-o/y”0^P'Phe‘Leu"Ar8~Ar6"i,HCHiCH^CHj^CHiCH}

5 CH JTj-rO^‘0/y‘I,he‘Le'1‘ArB"Ar6*,:)’I,eU’0H

* CHjTrr-0^5r“0/r"Fhe'l’eU‘ArS’ArS’r>*l'eU’OC2K5 7 ςΗ ^ r _(j /.y-0/7 “PH· " Leu-Arg*Arg-D-Leu-HHZ

β CH}Tyr-o/y-o^7r"Phe*L,u'Ar8‘Ar8'I,’Leu'KHC*H’ 9 CHjT?.r-o/r'0^p'Ph,*1'®u'Are‘ArB”D“I,eu’i,H^CH! ^CH> 1 o CKjTrr-o/r-o^-phe(P-N0^*L’u‘Ar6'ArB'D'I'eu'NH* 1 1 cH^yr-O^r-O^y-Phe-Leu-horccArg-Arg-D-Leu-MHj 1 2 CHJT7r-D-A/»*0^-phe*Leu'Ar8_Ar6"D'LeU'KH* | 1 i CH jTrr-o/y-0^7_CH j^he-Leu-Arg-Arg-D-Leu-Nllj j 1 4 cH^yr-o/yO/y-Phe-CH^eu-Arg-Arg-D-Leu-HHj | 1 S CnjTyr-0^7-0^-0_Phe-Leu-Are'ArS'D'LeU'f,H* i 6 jy^D-A^a-O-ar-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NHj 1 7 Tyr-Sar-0^7-"Phe*1'*U'Ar6'Ar6’I>‘I'9U*NH* j 1 8 CH}Trr.o/y-0/r*phe-l,eu-CH jÅrg-Are-D-Leu-HKj 1 9 CK Tyr.0/y-0/r*Phe-Leu-Arg*CHjArg-D-Leu-i;H2 2 O OH}Trr.0/y-0/y*Ph**t*rt-L«u-Arg-CHjArg-D-Leu-HHCjH, 2 1 CH jTyr-0.£7"0^r'Phe( P*HO,)-Leu-Ar g -CH}Arg-D-Leu-NHC,H5 2 2 CjTyr-o^r-O/y-Phe-Leu-Lye-CHjArg-D-L.u-HHj 2 3 Trr-S-e«f't>/y‘Ph*'8>r'Arg~CH}Ar6'D'!'*U'>'HC?H} 2 4 T7r-C-cr»'0^'Phe’Cp,'Are'CH5ArB'D'LeU"NHCjH5 2 5 Qj^yr-o/y-O/yPhe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-Arg-HH, 2 4 CHjTyr-o/y-O^P*Ph*‘1'eu'Ar8'Ar8‘I:,'0^u'Ar8’NHi 2 7 CH JTyr-0/y-0^7r'Ph·‘I'·uAΓ8CHJAr8"D'1'·uΛΓ8*l)HC^K, 2 β CH,Tyr-0/yO-*r_Phe<.P*NOi)‘Leu‘Ar8*CH5Ar8’D'I'eU'Ar6'f,HCjH3 2 9 CH Tyr-0/y-0/y-Ph»-Met(0) "Arg-CHjArg-D-Liu-Arg-fiHj____ t.rt-L.u i (ΟΗ,),ΟΟΗ(ΗΗ,)ΟΟΟΗ

homoArg : HH,C(* HH)HHCH,CH, CH,CH,CH(HH,)COOH Phe( p-HO,) : HO,-Q,CH,CH(HH,)COOH

B*r : CH jHHCH,COOH

32 DK 171300 B1

Fig. 1 Eksempler 3 og 4 GEjiyrCc^Ez^) <*47 GJ>7 Phe Leu Arg(Tos) Arg(Tos)

Bo c -- OE E -- R

Eo c---R

Bo c - -OE E---R

Bo c----R

Bo c OE E----R

Bo c-----R

--------OE E---R

BC C *1—:--" · ' Γ ^ R : NE g , NECE2CE(CHj)CE2CE5

Fig. 2 Eksempler 5-18 A B o/r C D S Arg(Toe) D-Leu

Bo cOK H --R

B O c ---R

BOC--OH H---R

Boc----R

Boe ·· OH H---:--R

Boc-----R

Boc -OH H-----R

Boc-- R

Bo c - "- OH H - R

Boc----- R

A : T7T(0^2Bz^),CHjTrr(0/jB2^). B : O/r.D-A^a.Sar. C : Phe.D-Phe, CH,Phe,Phe(p-NOj). D Leu,CH,Leu. E : Arg ( Toe ), homo Arg(Toe). fl : OBz^.OCjH, ,NH?,RHC,H,.HH(CHj),CH, (I eksemplerne 11 og 18 benyttedes Z-homoArg(Tos)OH henholdsvis S-CH^Arg(Tos)OH som den beskyttede aminosyre E.) 33 DK 171300 B1

Fig. 3 Eksempler 19-24 A B 0A7 CDS CHjArg(Toe) D-Leu

2 - OH H - R

Z---R

Boc - OH H---R

Boc-·---R

Boc ·· 0H~ H----R

Boc ---- - - --- R

Boc -- OH H-----R

BOc------R

Boc----OH H------R

Boc -I-------[- R

A : Trr(C^jBz^), CHjTyrCc^jBz.é). B : O^r.D-Ser(Bz^) ,D-Cye(CHjBz^).

C l Phe , Phe( p-NO j ) . D l Lea , t e r t - Le u , Se r (Bz£i) , Cpe ( CH j Bz^) .

E : Ars(TOe),Lye(2). R : NHj,NKC Σ H 5 34 DK 171300 B1

NNNnNNNNNMNW

"bxxxxxxxxxxxx OZZZXXXZZSSZZ £·—I u Ϊ * -<

X

o < I___________ u o o o x e n s x 0 o £·-1 .------- VD J® o o

(N i O O X

ffl O

03 \ ^

O ® X

u o o

i” I

m '-j-1-------- (N “ O o 1 o O x l-ι < β ffl s α % ? _ ® — - — -< - —--—— · φ Λ o o

rn o O X

S ffl ffl ω a o %-1---- ^ ffl c o o o x O' β « £ cn « -H So kn ° v-/ S __L__ _ 3 0 5 o

S___S

»

P

1 ___; S o o o o έ " e Λ s 35 DK 171300 B1 /-s

W

°«κκκκ«η:κκ«<εκ ___________l.

? * < 5 5 J_|____________ Å « Ξ » o o a a a trt /-^ a æ »o ** 6 -Ϊ—l—I-------L s a n a a * C* ^ ΓΜ 2C rv C a a ^ ~ ° s o O-1----------

_ V-*' O V

P" a o o a K

(N ^ ae i-ι a ^ 0) o o r-t B " . -j --------- ^ & o o ® s o o a s CL) ae w w ° 2

<-1---L S

U V

in o o x ·· a a . ® tr> g

•HK

tu S----

O

0 z o.

s___I

O a a> t. = £-—μ * S o o ·.

* o o » a a < 36 DK 171300 B1 t ΙΛ 0> e w

- K

*- O o· o o es — — o e a u

S SK

< < ^ ©~Okfs*fN.eOLr>~~CS»0«*>^©*©0©* Μ*)00>0^0^^>000»00>0·00>0» o* *ν ·- ^•-og^CM — ^Ckirw^^pwec tc&CtteøGøueøtt&ccøttcceo&ocøGCtø UUUUUL.Li.WL i- U'-UUUL.

<<<<<<<<<<<<<<<<< ^eeooeoe eo oeeooc ^oooeooo co o o o o o o

>1 fc ^ ^ * k* ^ ^ H

^ ^ ^ ^ ·“ «-

(C

j-oeoeoeo o © © © © © © © «ΧΧΛΛΛΧΧ - - Z Z S. Z Z & ^C,p.&,pL,A<fc.C- C- C-, fk, C, p, t, fc, Ph u.................

^laooD'e'e^tnO'C'eorw^^e^m ^ [Οθ©00·0>~·0*©&··0··00€*©*^·0·0· o* ---------------- I—I j« »- ·- Γ» — — CN — «Μ — — PJ — — — — — — _n ^ 53333333333333333 ri Eeeeoeoeeeceeeesee jo E-i rk.’O^^’U^^CM^ift^r'iOkOfs.ewve^

Ok Ok O Ok o· o , o> o> . o- o o· o> o» o e Ok Ok *· p- ev *-.·- ·» ^ — ·“ «- »» ·- ~ *» X^'ksX^Kk.k.k.ksk.l-.Kk.Kk.^.

oooooooooc eodoodo •n i Ό i_i cj«ocvm«oc4«oo»^eeD^r*k^«Ok(v ^£ΐη'·β*©*β*β"β'βΗ·>Ό*ο*·ο*«*β'Ό^ιη'θ

Hl ooooooooocoooooco lu κ o *·*······*········ csO^k ^oeDinoo^cwo cww) © © es ** *r ^ «^TrkT^cT^m^fco^·^^ — cnu^**oo*»o 1_I 1-1 + 1+ + +1----- - |-n _I_+ 111 +_I I 1 & &1. - - - - S Ο^ΟΐΌ^ΐΛΌΙ-^βΟ* 37 DK 171300 B1 o

-- JC

o c O* o o - - 3 0) UB J 00 K K M ..

»•O - LA

>1 N N O i—I IT) o rv o o> U ·· - tn

- - o o Φ i—I

C u p s j~ „ k e k N 11

>2 B H C O

l-ι Ό

^ >1 C

o. o. — cv tv m - >o ω o-o. o o tv ► o ► q £ o o ·—»—") tv — tv — C \

•H C

to uj eceoeotcectcee E -H

w p p u p u p u p Uj »O

<< <<<<<<< .H

.vw S-i Φο o o © o o o © tn o ooooeo o uti >,. - O \

H — ------ - C O

c ® ® Ξ £ ® ® ® 2 o >1 — te f £ z z £ £ £ e . ό w

4Jfl) μ. μ. μ. p, p. p. P, <j, <D

tO μ.......... C

tfl — oe-oineeco© ftj -H

4J yjooo-ooo»-o-oe g Ό O c ' " ' ~ ' " " C 3 H « H-t -H 3353355" — S 3 Ή U ^ —· g eeeeeeeeee U ffi f· 10

to W (Τ' 2 C

*.......: οοήό -oe>p> — — ")">»>eo JJ OJ-) rt oe.o.oeocscec-0 « ,Q tv — — — — tv — — — rv 1) >ι O Λ te 4J u

Ph Xk,*,U.U,U»U,U.!sSv tn -3· ··· ^ <u ^ - Q>

oooocooooo ja M o W

— ———— Φ ι—I

tfl C W II o (Tjoo.cvtnoT-ot'jrxO U [y tv-e-c-otv-cv-οΐΛνΓ ”3 .* t-> S: E-l I OOOOOOOOOO 1—I >v 4-> £ te p3 o t n k C tn o - te - i λ • •••tic* (DUO) o 7 ^ "I e. B. " “ >i fT 1 T3

<*"J O "*< ^ ^ *o CO (DM

O — — e- I «Μ I I -» fM tx O - « uji til i ill G ίο <D >

III I III ·Η ι-l Λ I

—t------- ε < <+j i^rjcvtvtvtvfvtvtvtvcvrv Ό O1 - U ° s il O H B p3

- > < — EH

38 DK 171300 B1

Eksempel 30

Syntese af CH3 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Ala-OH

1) SYntese af X-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBuS

3,336 g Z-CH3Arg(Tos)OH blev opløst i 20 ml 5 tetrahydrofuran. Opløsningen blev afkølet til -30°C.

Der blev sat 0,77 ml N-methylmorpholin og 0,669 ml ethylchlorcarbonat til opløsningen. Efter 5 minutters forløb tilsattes en opløsning af 1,272 g HCl-H-D-Ala-OBut og 1,16 ml N-methylmorpholin i 20 ml tetrahydro-10 furan, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat og vasket med en vandig NaHC03-opløsning og derpå med vand. Efter koncentrering til tørhed opnåedes 4,16 g glasagtig Z-CH3Arg(Tos)-D-Ala-0But.

15 TLC: Rf-værdi 0,69 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a]D = -15,5° (C = 1, methanol)

Elementaranalyse for C29H41N5°7S:

C Η N

beregnet (%) 57,70 6,85 11,60 20 fundet (%) 57,54 6,59 11,31 2) Syntese af Z-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBu^ 2,87 g CH-Arg(Tos)-D-Ala-0But, opnået ved kata-J +· lytisk reduktion af Z-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBu i nær- 25 værelse af Pd/C, 3,392 g Z-Arg(Tos)-OH og 1,188 g N-hydroxybenzotriazol blev opløst i 10 ml dimethyl-formamid. Der blev til opløsningen sat 1,662 g dicyclo-hexylcarbodiimid under afkøling med is, og blandingen blev omrørt i køleskab i to dage. Det således dannede 30 bundfald blev frafiltreret, og filtratet blev koncentreret. Remanensen blev renset ved silicagelsøjle-chromatografi (elueringsmiddel: methanol/chloroform = 1/20), hvorved opnåedes 2,04 g glasagtig Z-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBut.

35 TLC: Rf-værdi 0,57 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: ta)D = -31,6° (C = 1, methanol) 39 DK 171300 B1

Elementaranalyse for C42H59NgOio^2 *1/2H20

C Η N

beregnet (%) 54,65 6,62 13,66 fundet (%) 54,64 6,48 13,72 5 3) Syntese af Z-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Ala-0But 0,629 Z-Leu-OH blev opløst i 15 ml dimethyl-formamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C. Der blev til opløsningen sat 0,261 ml N-methylmorpholin 10 og 0,227 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb sattes en opløsning af 1,76 g HCl*H-Arg(Tos)-CH^Arg (Tos)-D-Ala-OBu1", fremstillet ved katalytisk reduktion af Z-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Ala-OBu i nærværelse af Pd-C, og 0,356 ml N-methylmorpholin i 15 15 ml dimethylformamid til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en vandig NaHCO^-opløsning og derpå med vand. Efter koncentrering til tørhed op-20 nåedes 2,11 g glasagtig Z-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Ala-OBu1.

TLC: Rf-værdi 0,57 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [α]^ = -36,2° (C = 1, methanol) Elementaranalyse for C4gH70N10O11S2*l/2CH3COOC2H5:

25 C Η N

beregnet (%) 56,06 6,96 13,07 fundet (%) 56,02 6,85 13,08 4) Syntese af Z-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Ala-OBut 30 595 mg Z-Phe-OH blev opløst i 15 ml dimethyl- formamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C. Der blev sat 0,219 ml N-methylmorpholin og 0,190 ml ethylchlorcarbonat til opløsningen. Efter 5 minutters forløb sattes en opløsning af 1,68 g HC1*H-Leu-Arg(Tos)-35 CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBut, fremstillet ved katalytisk reduktion af Z-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBu i nærværelse af Pd-C, og 0,299 ml N-methylmorpholin 40 DK 171300 B1 i 15 ml dimethylformamid til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering opløstes remanensen i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en vandig NaHC03-opløsning og derpå 5 med vand. Opløsningsmidlet blev afdestilleret og der blev sat ether til remanensen. Efter dekantering efterfulgt af koncentrering til tørhed opnåedes 1,87 g glasagtig Z-Phe-Leu-Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Ala-OBu*1.

TLC: Rf-værdi 0,61 (methanol/chloroform, 1:7) 10 Optisk drejning: [a3D = -34,7° (C ® 1, methanol)

Elementaranalyse for C57H79Nn°i2S2*c2H5OC2H5:

C Η N

beregnet (%) 58,68 7,19 12,34 fundet (%) 58,66 6,83 12,42 15 5) Syntese af Boc-CH3Tyr (C^Bzl) -Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Ala-0But 969 mg Box-CH^Tyr (C^Bzl) -Gly-Gly-OH blev opløst i 12 ml dimethylformamid. Opløsningen blev afkølet til 20 -20°C. Der blev til opløsningen sat 0,188 ml N-methyl- morpholin og 0,163 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb sattes en opløsning af 1,67 g HCl-H-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-D-Ala-OBu^, fremstillet ved katalytisk reduktion af Z-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-25 D-Ala-OBu i nærværelse af Pd-C, og 0,256 ml N-methyl-morpholin i 15 ml dimethylformamid til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en vandig NaHCO^-opløs-30 ning og derpå med vand. Opløsningsmidlet blev afdestilleret under formindsket tryk, og remanensen blev størknet med methanol/ether, hvorved opnåedes 2,196 g Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBut.

35 Smp.: 130-135°C )dek.) TLC: Rf-værdi 0,61 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a)D = “40,7° (C = 1, methanol) 41 DK 171300 B1

Elementaranalyse for C75Hio2N14°16S2C*2'2CH3OH:

C Η N

beregnet (%) 55,89 6,70 11,85 fundet (%) 55,95 6,42 11,78 5

6) Syntese af CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-D-Ala-OH

200 mg Boc-CH^Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-E>-Ala-0But blev opløst i 10 ml HF ved -5°C i nærværelse af 0,2 ml ansiol i en lukket hydrogenfluorid 10 (HF) reaktionsbeheholder. Opløsningen blev omrørt i 1 time,og HF blev afdestilleret fra reaktionssystemet. Remanensen blev vasket med ether og derpå opløst i vand. Opløsningen blev behandlet med Amberlite IRA-93-(eddikesyretype) og derpå frysetørret. 120 mg af det 15 således opnåede rå peptid blev renset ved HPLC [Nucleo-sil 5 C 18, 2ø x 25 cm, eluering med 0,05% HC1 (H20/CH3CN, 92:8)] og frysetørret, hvorved opnåedes 60 mg CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-D-Ala-OH.

TLC: Rf-værdi 0,54 (butanol/eddikesyre/pyridin/ 20 vand, 15:5:5:8)

Optisk drejning: [a]D = -35,1°(C = 0,4, 0,01N- HC1) M.S. (FAB): 967 ([M+H)+)

Aminosyreanalyse: 25 Gly 1,95(2), Leu 1,00(1), Phe 1,00(1),

Arg 0,99(1), Ala 1,01(1) (Toppe, der skyldtes CH^Tyr og CH^Arg, blev ikke beregnet) 1 2 3 4 5 6

Eksempel 31 2

Syntese af CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CHjArg-CH^Ala-OH: 3 1) Syntese af Z-CH^Arg(Tos)-CH2Ala-OBut: 4 4,508 g Z-CH3Arg(Tos)OH, 1,683 g HCl-CH-jAla- 5 OBut, 1,533 g N-hydroxybenzotriazol og 1,04 ml N-methyl- 6 morpholin blev opløst i 10 ml dimethylformamid. Der blev til opløsningen sat 2,144 g dicyclohexylcarbodiimid under afkøling med is, og blandingen blev omrørt i 42 DK 171300 B1 køleskab natten over. Det således dannede bundfald blev frafiltreret, og filtratet blev koncentreret. Remanensen blev opløst i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en vandig citronsyreopløsning, vandig NaHCO^-5 opløsning og derpå med vand. Efter koncentrering til tørhed opnåedes 4,24 g glasagtig Z-CH^-Arg (Tos) -CH3-Ala-OBu1.

TLC: Rf-vaerdi 0,61 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a] = -57,8° (C = 1, methanol) 10 Elementaranalyse for C^H^N^O^S:

C Η N

beregnet (%) 58,33 7,02 11,33 fundet (%) 58,11 6,88 11,41 15 2) Syntese af Z-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut: 2,90 g CH^Arg (Tos)-CH^Ala-OBu^·, opnået ved katalytisk reduktion af Z-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut i nærværelse af Pd-C, 3,329 g Z-Arg(Tos)OH og 1,166 g N-hydroxybenzotriazol blev opløst i 10 ml dimethyl-20 formamid. Der blev til opløsningen sat 1,359 g dicyclo-hexylcarbodiimid under afkøling med is, og blandingen blev omrørt i køleskab i 2 dage. Det således dannede bundfald blev frafiltreret, og filtratet blev koncentreret. Remanensen blev renset ved silicagelsøjle-25 chromatografi (elueringmiddel: MeOH/CHCl^ = 1/15), hvorved opnåedes 2,1 g galsagtig Z-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-CH3Ala-OBut.

TLC: Rf-værdi 0,46 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: t<x]D = -57,1° (C = 1, methanol) 30 Elementaranalyse for *3/2H20:

C Η N

beregnet (%) 54,07 6,75 13,20 fundet (%) 54,10 6,35 13,18 35 3) Syntese af Z-Leu-Arg(Tos/-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut 247 g Z-Leu-OH blev opløst i 10 ml dimethyl-formamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C. Der blev til opløsningen sat 0,102 ml N-methylmorpholin og 0,089 43 DK 171300 B1 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb sattes en opløsning af 700 mg HC1Ή-Arg(Tos)-CH-Arg(Tos)- CH-Ala-OBu , opnået ved katalytisk reduktion af ^ t Z-Arg(Tos)-CH^Arg(Tos)-CH^Ala-OBu i nærværelse af 5 Pd-C, og 0,139 ml N-methylmorpholin i 10 ml dimethyl-formamid til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en vandig NaHCO^-opløsning og derpå med vand.

10 Opløsningsmidlet blev afdestilleret, og der blev sat ether til remanensen. Efter dekantering efterfulgt af koncentrering til tørhed opnåedes 0,86 g glasagtig Z-Leu-Arg (Tos) -CH-Arg (Tos) -CH^Ala-OBu*·.

TLC: Rf-værdi 0,48 (methanol/chloroform, 1:7) 15 Optisk drejning [a)D = -60,3° ( C = 1, methanol)

Elementaranalyse for C49H72N10°11S2 *C2H5OC2H5:

C Η N

beregnet (%) 57,07 7,41 12,55 fundet (%) 56,83 7,02 12,64 20 4) Syntese af Z-Phe-Leu-Arg (Tos) -CI^Arg (Tos) -CH^Ala-OBu1" 224 mg Z-Phe-OH blev opløst i 7 ml dimethyl-formamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C. Der blev til opløsningen sat 0,082 ml N-methylmorpholin og 0,071 25 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb sattes der en opløsning af 640 mg HC1 *H-Leu-Arg (Tos)-CH-Arg(Tos)-

t J

CH--Ala-0Bu , fremstillet ved katalytisk reduktion af 4* Z-Leu-Arg(Tos)-CH-Arg(Tos)-CH^Ala-OBu i nærværelse af Pd-C, og 0,112 ml N-methylmorpholin i 7 ml dime-30 thylformamid til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en vandig NaHCO^-opløsning og derpå med vand. Opløsningsmidlet blev afdestilleret og der blev sat 35 ether til remanensen. Efter dekantering efterfulgt af koncentrering til tørhed opnåedes 770 mg glasagtig Z-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH-Arg(Tos)-CHjAla-OBu^.

44 DK 171300 B1 TLC: Rf-værdi 0,54 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a]D = -59,6° (C = 1, methanol)

Elementaranalyse for C58H81NU°12S2-C2H5OC2H5!

C Η N

5 beregnet (%) 58,98 7,26 12,20 fundet (%) 58,68 6,91 12,24 5) Syntese af Boc-CH3Tyr (Cl2Bzl) -Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut~ — 10 350 mg Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-OH blev opløst i 5 ml dimethylformamid. Opløsningen blev afkølet til -20°C. Der blev til opløsningen sat 0,068 ml N-methyl-morpholin og 0,059 ml ethylchlorcarbonat. Efter 5 minutters forløb blev der sat en opløsning af 610 mg 15 HC1*H-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg]Tos)-CH3Ala-OBut, fremstillet ved katalytisk reduktion af Z-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-0Bu i nærværelse af Pd-C, og 0,092 ml N-methylmorpholin i 6 ml dimethylformamid til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved ca. -5°C i 20 2 timer. Efter koncentrering blev remanensen opløst i ethylacetat, og opløsningen blev vasket med en vandig NaHC03-opløsning og derpå med vand. Efter koncentrering efterfulgt af størkning med methanol/ether opnåedes 760 mg Boc-CH3Tyr (C^Bzl) -Gly-Gly-Phe-Leu-Arg (Tos ) -25 CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut.

Smp.: 125-133°C (dek.) TLC: Rf-værdi 0,55 (methanol/chloroform, 1:7)

Optisk drejning: [a]D = -56,4° (C = 1, methanol) Elementaranalyse for C75Hio4N14°16S2C12‘ 30 C2H5OC2H5:

C Η N

beregnet (%) 57,06 6,69 11,94 fundet (%) 56,71 6,46 11,49 45 DK 171300 B1

6) Syntese af CH-jTyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^rg-CH^Ala-OH

250 ml Boc-CH^Tyr (CljBzl) -Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos) -CH2Arg(Tos)-CH2Ala-OBut blev opløst i 10 ml HF ved -5°C i 5 nærværelse af 0,2 ml anisol i HF-reaktionsbeholderen i et lukket system. Opløsningen blev omrørt i 1 time og derpå blev HF afdestilleret fra reaktionssystemet. Remanensen blev vasket med ether ~og opløst i vand. Opløsningen blev behandlet med Amberlite IRA 93 (eddi-10 kesyretype) og derpå frysetørret. 130 mg af det således opnåede rå peptid blev renset ved HPLC [Nucleosil 5 C 18, 2 ø x 25 cm, elueret med 0,05% HCl (H20/CH3CN, 91:9)] og frysetørret, hvorved opnåedes 50 mg CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-CH^Ala-OH.

15 TLC: Rf-værdi 0,54 (butanol/eddikesyre/pyridin/ vand, 15:5:5:8)

Optisk drejning: ta]j^ = -64,7° (C = 0,4, 0,01N-HC1) M.S. (FAB): 981 ([M+H]+) 20 Aminosyreanalyse:

Gly 1,92(2), Leu 1,04(1), Phe 1,00(1),

Arg 0,986(1) (Toppe der skyldtes CHgTyr, CH^Arg og CH^Ala blev ikke beregnet).

25

Eksempler 32-41

De i tabel 7 viste forbindelser blev syntetiseret ved den samme konventionelle flydende-fase-proces som i eksemplerne 30 og 31. Ved disse forsøg blev dynor-30 phinderivater modificeret i stillingerne 1 til 3 (Tyr-Gly-Gly) , i stillingerne 4 til 8 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile), i stillingerne 4 til 9 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg) og i stillingerne 4 til 10 (Phe-Leu-Arg-Arg-1le-Arg-Pro) syntetiseret ved den trinvise proces, idet man gik ud fra C-termina-35 len i hvert peptid. Derpå blev derivaterne i stillingerne 1 til 3 og derivaterne i stillingerne 4 til 8, 4 til 9 eller 4 til 10 sammenkondenseret ved DCC-HOBt-metoden eller blandet syreanhydridmetoden. Alle be- 46 DK 171300 B1 skyttelsesgrupperne blev fjernet med hydrogenfluorid (HF),og produktet blev renset ved præparativ HPLC under anvendelse af en reversed phase bærer. Reaktionsvejene ved syntesen af de respektive beskyttede peptider er 5 vist i figurerne 6 til 8.

Resultaterner af bestemmelsen af optisk drejning 20 [α]β , TLC Rf-værdi og aminosyreanalyse af de på ovennævnte måde opnåede ønskede peptider er vist i tabel 8.

10 Tabel 7

Eksempel Forbindelse

32 CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arc-CH-jArg-Ile-OH

33 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-Asp-OH

15 34 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-OH

35 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Glu-OH

36 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-CH3Ile-OK

37 CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-Sar-OH

20 38 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg=CE3Arg-S-Ala-OH

3 9 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-Asp-OH

40 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arc-CK3Arg-D-Leu-?he-OH

41 cH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arc-CH3Arg-D-Leu-Arg-D-

25 Glu-OH

47 DK 171300 B1

Eksemplerne 32 til 38 _Fig. 6__

CH3Tyr (Cl2Bzl) Gly Gly Phe Leu Arg (Tos) CH-jArgCTos) R

-------Z--ΘΗ-Η--OBu1- -------g--- --------g--GH H---æth- --------_g-----OBut- -------g- OH -H----OBu1- -------g-----OBu1- ----g- OH· H-----GBa— ----g------OBu·— -Βθβ---OH- H------OBu1 -B©G---------GB&~ - R: Ile, Asp(OBu1), D-Leu, D-GlufOBu^', CHglle, Sar, Ø-Ala

Eksemplerne 39 til 40 ____Fie. 7_

Ci^yrtCl^zl) Gly Gly Phe Leu Arg (Tos) CH^g (Tos) D-Leu R

---------[ — --2—-ΘΗ—H--QBe^ -----j---g---©Bt£ ----i--2· OH-ti---©Bt£ -----j--g----©Βΐί ---!----g--ΘΗ-ti---- --;---1-2-----©Be^ --1----=rk)ti~ti-----©Bt£ li_' t· --1-η----- --1-i—I—*ί—i-1- i°Bu! -B©e--©H-H-j-j-- QSu -Bee—L---1-:--- OBu1 R: Asp(OBu ), Phe 48 DK 171300 B1 p" 3 -p 4J 4J +> .pi MJ 4J +j 4J .g, .p .p +J +> CQ :3 3 :3 :3 ±j :3 :3 i :j :3 :3 :j :j :i 0 (3 £3 £3 £3 g £3 CJ CO CJ £3 C3 Cl Cl Dl

~ O <3 O O O O O O O O O O O O

Ϊ 1: = Ό) g ci <3 M M 3! s 1 ___Li._________ w m dj :: g ^-----li--------- 6 ej c3 :: Ίλ

g B

tr> iH ei ei :: 00 fH 3 < <D · 3 o a ep Φ-------------- δ fe M «a :: w

M

«0)

P O

0-1-------------- n ta ::

å B

o---------------- £ o--------------

i-H

N

CQ

CM

rH

u--------------

Il i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I I I

49 DK 171300 B1

Tabel 8 ____

Eksempel [c]^0 TIC Ri- værdi Aminosyreanalyse_ 32 -10,6 0,63 Gly 1,96, Leu 1,05, Phe 1,00,

Arc 1,01, Ile 0,99 33 -35,4 0,43 Gly 1,96, Leu 0,99, Fhe 1,00,

Arc 0,99, Asp 1,01 34 -32,4 0,63 Gly 1,95, Leu 1,95, Phe 1,00,

Arc G 9 35 -20,8 0,51 Gly 1,93, Leu 1,00, Phe 1,00,

Arc 1,00, C-lu 1,01 36 -67,1 0,63 Gly 1,95, Leu 0,97, Phe 1,00,

Ar c 0,9 6 37 -23,9 0,51 Gly 1,97, Leu 1,01, Phe 1,00,

Arg 1,00 38 -29,2 0,56 Gly 1,96, Leu 1,01, Phe 1,00,

Arg 1,01 39 -28,6 0,58 Gly 1,96, Leu 1,98, Phe 1,00,

Arg 1,00, Asp 1,06 40 -25,0 0,70 Gly 1,53, Leu 2,01, Phe 2,00,

Arg 0,96 41 -30,8 0,51 Gly 1,56, Leu 1,57, Fhe 1,00,

Arg 1,59, Glu 1,01

Ved axninosyreanalysen blev kun mængderne af aminosyrerne Gly, Leu, Phe, Arg., Ile, Asp, og Glu bestemt.

[a]p bestemmelse; C = 0,4, 0,01N-HC1 TLC*Rf-værdi bestemmelse; butanol/eddikesyre/ pyridin/vand = 15:5:5:8 * 50 DK 171300 B1

Nogle af de forbindelser, der blev opnået ifølge eksemplerne, blev testet på samme måde som omtalt oven- f°r* Tabel 9

Prøveforbindelse Haleknibningsmetode 5 _ (ED50, mg/kfl __i .v.__S .C.

Eksempel 30 0,7 1,9 31 0,5 ' 1,2 34 2,1 0,9 10 36 0,2 0,4 38 1,7 0,6 dynorphin (1-13)__>25,0__

Tabel 10 15 Prøveforbindelse Kanin-vas-defirens metode IC50(nM)

Eksempel 30 17,8 31 24,5 20 36 11,2 dynorphin A (1-17)___17,4_

Tabel 11

Prøveforbindelse Haleknibnings- Mindste letale 25 metode dosis ED50 ^9/^9) (mg/kg)

Eksempel 30 1,9 >100 31 1/2 >100 __36_ 0,4__>1QQ_ 30 35

Claims (4)

51 DK 171300 B1

1. Polypeptider med nedenstående almene formel (I) R1

5 L-Tyr-A-Gly-B-C-D-E-F r2^ 1 2 3 45678 12. hvori R og R hver er hydrogen eller lavere alkyl, 10. er en D-aminosyre valgt fra D-Ala, D-Ser, D-Cys, Gly eller Sar med den betingelse, at når A er D-Cys er denne bundet til L-Cys eller D-Cys i 5-stillingen gennem en S-S-binding for at bevirke en intramolekylær ringslutning, 15. er L-Phe eller D-Phe, hvori benzenringen eventuelt er substitueret med nitro eller lavere alkyl, C står for L-Leu, L-CHgLeu, T-tert-Leu, L-Met(O), L-Ser, L-Cys eller D-Cys med den betingelse, at når A er D-Cys er C 20 L-Lys eller D-Cys og C er bundet til A gennem den nævnte S- S-binding, D er L-Arg, L-homo-Arg, L-CHgArg eller L-Lys, 25. er L-CH^Arg, L-Arg eller L-Leu, F er R4 R7

30. OR3, -N ^ , -Gi-OR6. -G2-N^ Xr5 r8 r9 r9 -G3-(L-Arg)N , -G3-(D-Arg)-N . 35 ^R10 ^ R10 -Leu-J-OR11 eller Leu-Arg-Glu-OR12, 52 DK 171300 B1 hvori R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 og R12 er ens eller forskellige og hver er hydrogen eller lavere alkyl, og 5 hvori G1 er L-CHg-He, Sar, D-Ala, L-Asp, L-Ile, L- CH^Ala, L-Leu, L-Ala, L-Glu eller Aib G2 er L-Leu, L-Arg eller D-Leu Gg er L-Leu, L-Glu eller D-Leu 10. er L-Phe, D-Phe, L-Asp eller D-Asp, eller et farmakologisk acceptabelt salt deraf, kendetegnet ved, at et beskyttet polypeptid med den ovennævnte formel fremstilles ved hjælp af væskefase-15 eller fastfasemetoden, og at en eller flere beskyttende grupper, for en eller flere reaktive grupper, derefter fjernes ved hjælp af en katalytisk reduktion eller brug af en blanding af flydende ammoniak og et alkalimetal, en syre, især flussyre, en base eller en hydrazinforbindelse, 20 til opnåelse af polypeptider, hvorefter et opnået polypeptid i baseform om ønsket omdannes til et farmakologisk acceptabelt salt.

2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er

25 CH3Tyr“Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-NHC2Hg, Tyr-D-Cys-Gly-Phe-Cys-Arg-CI^Arg-D-Leu-Arg-NHj» CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-NH2» Tyr-D-Cys-Gly-phe-Cys-Arg-CHjArg-D-Leu-NHCjHg, CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-D-Leu-Arg-NHC-H-,

30. J ^ 3 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Ala-OH, CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-CH3Ala-OH, CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-CH3Ile-OH/ CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-L€U-Arg-CH3Arg-Aib-OH, ^ CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-Sar-OH, eller Tyr-D-Cys-Gly-Phe-Cys-Arg-CH3Arg-CH3Ile-OH. 53 DK 171300 B1

3. Fremgangsmåde til fremstilling af polypep-tider ifølge kravene 1 eller 2, kendetegnet ved, at man ved en egnet fremgangsmåde fremstiller et polypeptid med en struktur svarende til formlen i krav 5 1, men i en beskyttet form, derpå fjernar beskyttelses grupperne til opnåelse af et polypeptid med den i krav 1 angivne formel og, om nødvendigt, omdanner polypep-tidet til et farmakologisk acceptabelt salt deraf på i og for sig kendt måde.

4. Analgetikum, der som aktiv bestanddel inde holder et polypeptid som angivet i krav 1 eller 2, eller et farmakologisk acceptabelt salt deraf.