FI92935B - Menetelmä analgeettisena aineena käyttökelpoisten polypeptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

92935

MENETELMÄ ANALGEETTISENA AINEENA KÄYTTÖKELPOISTEN POLYPEPTIDIEN VALMISTAMISEKSI

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää analgeettisten poly-peptidien tai niiden farmakologisesti sopivien suolojen valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava (I): (

Rl\ (L-Tyr)-A-Gly-B-C-D-E-F (I) R2^ 1 2 3 45678 jossa kaavassa R1 ja R2 ovat kumpikin vetyatomeja tai toinen on metyyliryhmä; A on D-Ala, D-Ser, D-Cys, Gly tai Sar, edellyttäen että kun A on D-Cys, se muodostaa S-S-sidoksen välityksellä 5-asemassa sijaitsevan L-Cys:n kanssa molekyylinsisäisen renkaan; B on L-Phe tai D-Phe, jossa benseenirengas voi olla subs-tituoitu metyyli- tai nitroryhmällä; C on L-Leu, L-tert.-Leu, L-Met(O), L-Ser, tai L-Cys, tai jonkin näiden metyylijohdannainen, sillä edellytyksellä, että kun A on D-Cys, C on L-Cys ja on sidottu A:n kanssa mainitun S-S-sidoksen välityksellä; D ja E on kukin L-Arg, L-lys tai L-homo-Arg tai jonkin näiden metyyli johdannainen; F on -0R3, jossa R3 on vety tai alempi alkyyli-ryhmä, tai kaavan mukainen ryhmä: .-R4 -N C . R5 'jossa R4 ja R5 ovat samanlaiset tai erilaiset ja kumpikin on vety tai alempi alkyyliryhmä; tai kaavan: -G-OR* mukainen ryhmä, jossa G on D-Ala, D-Leu, D-Glu, L-Ile, Sar, L-Asp tai R-alaniini tai jonkun näiden metyylijohdannainen, ja R6 on vety tai alempi alkyyliryhmä; tai kaavan: R7

-G-N

R8 mukainen ryhmä, jossa G on yllä esitetyn määritelmän mukainen ja R7 ja R8 ovat samanlaiset tai erilaiset ja kukin on vety tai alempi alkyyliryhmä; 92935 2 tai kaavan:

RiO RIO

-G-(L-Arg)tai -G-(D-Arg)-N

^Rn V1 jossa G on yllä esitetyn määritelmän mukainen ja R10 ja R11 ovat samanlaiset tai erilaiset ja kukin on vety tai alempi alkyyli-ryhmä; tai kaavan: -G-J-OR12 mukainen ryhmä, jossa G:llä on yllä määritelty merkitys, J on L-Phe, L-Asp tai D^Asp, ja R12 on vety tai alempi alkyyliryhmä; tai kaavan: -G-Arg-D-Glu-OR13, mukainen ryhmä, jossa R13 on vety tai alempi alkyyliryhmä.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilta polypeptideil-ta edellytetään, etteivät kaikki aminohapot, jotka muodostavat jonkin yllä esitetyn kaavan mukaisen polypeptidin, samanaikaisesti merkitse seuraavan yleisen kaavan mukaista aminohappoa:

R

nh2-ch-cooh jossa kaavassa R merkitsee ryhmää, joka vastaa aminohapon rakennekaavaa, josta puuttuu seuraavan kaavan mukainen ryhmä:

-CH-COOH

NHj Täten ainakin yhden keksinnön mukaisen polypeptidin aminohapoista täytyy olla D-aminohappo tai D- tai L-aminohapon metyyli johdannainen.

Kyseessä olevia peptidejä muodostaviin aminohappoihin kuuluu D-ja L-aminohappoja. Jollei muutoin ole mainittu, aminohapot ovat L-aminohappoja. Kyseessä olevassa keksinnössä käytetyillä symboleilla on samat merkitykset kuin yleisesti on käytössä pep-tidikemian alueella. Ne ovat nimittäin seuraavat:

Tyr tyrosiini

Gly glysiini

Sar sarkosiini 3 92955

Cys kysteiini

Phe fenylalaniini

Arg arginiini

Leu leusiini

He isoleusiini

Met(O) metioniinisulfoksidi

Ser seriini homo-Arg homoarginiini

Glu glutamiinihappo

Asp asparagiinihappo

Ala alaniini

Phe(p-N02) p-nitrofenylalaniini

Phe(p-CH3) p-metyylifenylalaniini β-Ala β-alaniini BOC tert-butoksikarbonyyli Z bensyylioksikarbonyyli C12Bzl 2,6-diklooribentsyyli CH3Bzl 4-metyylibentsyyli

Tos p-tolueenisulfonyyli ja

Bzl bensyyli

Tekniikan taso

Morfiinin analgeettisten vaikutusten mekanismia koskevissa tutkimuksissa saadut tulokset antavat aihetta olettaa, että keho sisältää niin sanottuja endogeenisia, morfiinin kaltaisia aineita, jotka säätelevät erilaisia elintärkeitä aistihavaintoja, kuten esimerkiksi kipua ja aivotoimintaa. Erään tutkimussarjan jälkeen eristettiin enkefaliini ja endorfiini opioidipeptideinä ja niiden rakenteet määritettiin. Tämän jälkeen suoritettiin tällä alueella edelleen intensiivistä tutkimustyötä ja löydettiin erilaisia opioidipeptidejä, kuten esimerkiksi β-neoendor-fiini, β-kasomorfiini, kyotorfiini, dermorfiini ja dynorfiini.

Näiden joukossa dynorfiini on seuraavan rakennekaavan mukainen opioidipeptidi, jonka muutamat kyseessä olevan keksinnön ‘ tekijät ovat löytäneet: Λ 92935 4 H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-

Asn-Gln-OH

Dynorfiini on luonnossa esiintyvä opioidipeptidi, jolla on spesifisiä vaikutuksia K-reseptoreillaf ja jonka käytöllä analgeettisena aineena ei ole odotettavissa mitään sivuvaikutuksia, kuten esimerkiksi toleranssia tai riippuvuutta.

Kyseessä olevaan keksintöön liittyvät ongelmat

Dynorfiinilta puuttuu kuitenkin kyky toimia analgeettisena aineena sellaisenaan, kun sitä annostellaan suonensisäisenä ruiskeena, koska se on veressä epästabiili.

Edelleen on toivottu erittäin aktiivista peptidiä, jolla on lyhyempi ketju, koska dynorfiini on heptadekapeptidi, jolla on suhteellisen pitkä, ketju.

Keksinnön lyhyt kuvaus

Kyseessä olevat tutkijat ovat intensiivisesti tutkineet peptidejä, joilla on lyhyemmät Ketjut kuin dynorfiinilla ja jotka pystyvät tuomaan esiin analgeettista vaikutusta, kun niitä annetaan sekä suonensisäisenä että ihonalaisena ruiskeena, ja lopuksi on havaittu, että tämä tavoite voidaan saavuttaa käyttämällä alla esitetyn kaavan (I) mukaisia peptidejä, jotka koostuvat 7-9 aminohaposta.

Täten kyseessä olevalla keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan seuraavan yleisen kaavan (I) mukaisia polypeptidejä, tai niiden farmakologisesti sopivia suoloja: (L-Tyr) -A-Gly-B-C-D-E-F (I) R2 1 2 3 45678 jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin yllä, ja keksinnöl- 92935 5 le on tunnusomaista se mitä on esitetty patenttivaatimuksen tunnusmerkkiosassa.

Esimerkkeihin farmakologisesti hyväksyttävistä suoloista tässä yhteydessä kuuluvat epäorgaanisten happojen suolat, kuten esimerkiksi hydrokloridi, sulfaatti, hydrobromidi ja hydrojodidi sekä orgaanisten happojen suolat, kuten esimerkiksi maleaatti, fumaraatti, sukkinaatti, asetaatti, malonaatti, sitraatti ja bensoaatti.

Termi "alempi alkyyliryhmä" yllä mainitussa R3:n - R13:n määritelmässä tarkoittaa suoraketjuisia, haaroittuneita, syklisiä tai renkaan sisältäviä alkyyliryhmiä, joissa on 1-6 hiiliatomia, kuten esimerkiksi metyyliä, etyyliä, n-propyyliä, isopro-pyyliä, n-butyyliä, isobutyyliä, 1-metyylipropyyliä, tert.-butyyliä, syklopropyylimetyyliä, n-pentyyliä, 1-etyylipropyy-liä, isoamyyliä, tai n-heksyyliryhmiä.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisilta yhdisteiltä, puuttuvat dynorfiinin tai sen johdannaisten vakavat puutteet, nimittäin se, että niillä ei voi olla analgeettisiä vaikutuksia sellaisenaan, kun niitä annostellaan suonensisäisinä ruiskeina, koska ne ovat veressä epästabiileja. Kyseessä olevalla keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavat yhdisteet ovat erittäin arvokkaita, koska ne ovat erittäin stabiileja in vivo ja ne ovat käytännössä käyttökelpoisia analgeetteina.

Alla annetaan tyypillisiä esimerkkejä keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavista peptideistä, rajoittamatta kuitenkaan keksintöä.

CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-Arg-NHCH2CH3 Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Glu-Arg-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Met (0) -Arg-CH3Arg-D-Leu-Arg-NH2 Tyr-Sar-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH (CH2) 5CH3 92935 6 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-tert.-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-NHCH2CH3 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-CH3Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH2

Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Ser-Arg-CH3Arg-D-Leu-NHCH2CH3 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-Arg-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-D-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH2

CHjTyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-OH

CH3Tyr-Gly-Gly-Phe (p-N02) -Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-Arg-NHCH2CH3 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-OH , CH3Tyr-D-Ala-Gly-CH3Phe-Met (0) -Arg-CH3Arg-Ile-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-CH3Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH2 CH3Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH2 CHjTyr-Gly-Gly-Phe (p-N02) -Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-NHCH2CH3 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-NHCH2CH3 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Ch3Arg-D-Leu-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-OCH2CH3

Tyr-D-Cys-Gly-Phe-Cys-Arg-CH3Arg-D-Leu-Arg-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-NHCH2CH (CH3) CH2CH3 CHjTyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Lys-CHjArg-D-Leu-NHj CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-homoArg-Arg-D-Leu-NH2 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-CH3Leu-OC2C5

Kyseessä olevan keksinnön mukaiset peptidit voidaan syntetisoida jokaisen sopivan menetelmän avulla. Suojattuja peptidejä voidaan syntetisoida tavanomaisen liuosfaasimenetelmän tai kiinteäfaasimenetelmän avulla. Tavallisesti on edullista, että aminohappojen sivuketjuissa sijai .sevat toiminnalliset ryhmät ovat suojatut. Viimeisessä vaiheessa kaikki suojaavat ryhmät poistetaan. Aminohappojen sivuketjuissa sijaitsevien toiminna-listen ryhmien suojaaviin ryhmiin kuuluvat kaikki aiemmassa tutkimustyössä käytetyt suojaavat ryhmät. Niiden tyypillisiiin esimerkkeihin sisältyvät tosyyli (Tos), nitro (N02), bentsyyli (Bzl), tert.-butyyli (But), bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja tert.-butoksikarbonyyli (BOC)-ryhmät.

Aminohapoissa sijaitsevien α-amino-ryhmien suojaaviin ryhmiin kuuluvat kaikki aiemmassa tutkimustyössä esitetyt suojaavat ryhmät. On kuitenkin edullista valita suojäävien ryhmien yh 92935 7 distelmä siten, että ainoastaan a-amino-ryhmien suojaavat ryhmät voidaan poistaa selektiivisesti vaikuttamatta sivuketjuissa sijaitsevien toiminnallisten ryhmien suojääviin ryhmiin. Esimerkiksi, kun tert.-butoksikarbonyyli-ryhmää käytetään a-ami-noryhmän suojaavana ryhmänä, bentsyyli- tai bentsyylioksikarbonyyliryhmä on edullinen sivuketju(i)ssa si-jaitsev(ie)an toiminnallis(t)en ryhm(ien)än suojaukseen. Kun bentsyylioksikarbonyyliryhmää käytetään α-aminoryhmän suojaukseen, tert.-butyyli- tai tert.-butoksikarbonyyliryhmä on edullinen sivuketju(i)ssa sijaitsev(ien)an toiminnallis(t)en ryhm-(ien)än suojaukseen. Kun Tyr:n N-terminaalinen aminoryhmä dial-kyloidaan, aminoryhmä voidaan jättää sellaisenaan, ilman li-säsuojausta. Rasemaation estämiseksi, suojattu peptidi syntetisoidaan mieluummin asteittaisen menetelmän avulla, jossa kaikki sekvenssissä sijaitsevat aminohapot sidotaan aloittamalla C-terminaalisesta päästä, tai menetelmällä, jossa frag-menttikondensaatio suoritetaan Gly:n asemassa. Fragmenttikon-densaatio on mahdollista suorittaa myös jokaisessa halutussa paikassa.

Joko kiinteän faasin menetelmässä tai nestemäisen faasin menetelmässä, kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, peptidistä poistetaan suojaavat ryhmät ja peptidi puhdistetaan toistamalla seuraavia reaktiokaavioita peptidien syntetisoimiseksi. Tämän menetelmän vaiheita valaistaan seuraavan nestefaasimenetelmän .*· avulla: X2 Y2 X1 Y1

Il II kondensaatio R" - N - CHCOOH + HN - CHCOR' -> X2 Y2 X1 Y1

I I I I

R" - N - CHCON - CHCOR' X2 Y2 X1 Y1 suojaavan ryhmän poistaminen | | | | o-aminoryhmästä R" - N - CHCON - CHCOR' -> X2 Y2 X1 Y1

I I I I

·. HN - CHCON - CH - COR' 8 92935 joissa X1 ja X2 kumpikin merkitsevät H:ä tai alkyyli-ryhmää, Y1 ja Y2 kumpikin merkitsee aminosivuketjua ja R' ja R" merkitsevät suojaavaa ryhmää tai peptiditäh-dettä.

1. Peptidisidoksen muodostumisreaktio:

Peptidisidos voidaan muodostaa millä tahansa sille esitetyllä menetelmällä. Tavanomaisessa menetelmässä seuraavan yleisen kaavan mukaisen happamen komponentin karboksyyliryhmä aktivoidaan, X2 Y2

I I

R" - N - CHCOOH

tavanomaisen menetelmän avulla, kuten esimerkiksi atsidi-menetelmällä, disykloheksyylikarbodi-imidi (DDC)-menetelmällä, seosanhydridimenetelmällä tai aktiivisen esterin menetelmällä tai antamalla aktivoidun yhdisteen reagoida seuraavan yleisen kaavan mukaisen amiinikomponentin kanssa: X1 Y1

I I

HN - CHCOR'

Reaktio-olosuhteita, kuten esimerkiksi reaktioliuotinta ja lämpötilaa voidaan vaihdella karboksyyliryhmän aktivointiin käytetystä menetelmästä riippuen. Seosanhydridimenetelmä, joka on yksi tyypillinen kondensaatiomenetelmä, suoritetaan seuraavasti: seuraavan yleisen kaavan mukainen hapan komponentti: X2 Y2

I I

R" - N - CHCOOH

liuotetaan aproottiseen liuottimeen, kuten esimerkiksi dimetyyliformamidiin, tetrahydrofuraaniin tai etyyliasetaattiin, syntyvä liuos jäähdytetään n. -20°C:een ja sitten liuokseen lisätään peräkkäin ekvimolaariset määrät N-metyylimorfo-liinia ja etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua siihen 92935 9 lisättiin ekvimolaarinen määrä seuraavan yleisen kaavan mukaista amiinikomponenttia: X1 Y1

I I

HN - CHCOR' ja seosta sekoitettiin -15-0°:ssa 2-5 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten tavanomaisella tavalla seuraavan yleisen kaavan mukaisen peptidin saamiseksi: X2 Y2 X1 Y1

I I I I

R' ' - N - CHCON - CHCOR' 2) Suojaavan ryhmän poistaminen e-aminoryhmästä:

Suojaava ryhmä poistetaan tavanomaisen menetelmän avulla, kuten esimerkiksi katalyyttisen pelkistysmenetelmän avulla, menetelmällä, jossa käytetään happoa, menetelmällä, jossa käytetään emästä ja menetelmällä, jossa käytetään hydratsiinia. Edullinen menetelmä valitaan näiden menetelmien joukosta, a-aminory-hmän suojaukseen käytetyn ryhmän perusteella. Luonteenomaisiin menetelmiin kuuluu menetelmä, jossa suojaava ryhmä poistetaan bentsyylioksikarbonyyliryhmän katalyyttisen pelkistyksen avulla ja jossa tert.-butoksikarbonyyliryhmä poistetaan trifluorietik-kahapolla. Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti menetelmän suoritusmuotoa tert.-butoksikarbonyyliryhmän poistamiseksi: 0,25 ml anisolia sekä 5 ml trifluorietikkahappoa lisätään 1 g:aan α-Ν-butoksikarbonyylipeptidiä, joka on seuraavan yleisen kaavan mukainen: X2 Y2 X1 Y1

I I I I

BOC - N - CHCON - CHCOR' jäähdyttäen samalla jäiden avulla. Seosta sekoitetaan 60 minuutin ajan ja sitten sitä käsitellään eetterillä, jotta saadaan seuraavan yleisen kaavan mukaisen peptidin trifluoriasetaatti: X2 Y2 X1 Y1

I I I I

; HN - CHCON - CHCOR' 92935 10 Tämä tuote liuotetaan liuottimeen ja neutraloidaan amiinilla, esim. trietyyliamiinilla, jotta saadaan yhdiste, jolle suoritetaan seuraava reaktio.

3) Suojäävien ryhmien poistaminen:

Sen jälkeen kun yllä mainittu kondensaatio on toistettu ja a-aminoryhmiä suojaavat ryhmät on poistettu, tarkoituksena pidentää peptidiketjua, poistetaan kaikki suojaavat ryhmät aiotun raa'an peptidin saamiseksi. Suojaavat ryhmät poistetaan tavanomaisin menetelmin, kuten esimerkiksi katalyyttisen pelkistyksen avulla, menetelmällä, jossa käytetään nestemäistä am-moniakkia/alkalimetallia, menetelmällä, jossa käytetään happoa, menetelmällä, jossa käytetään emästä tai menetelmällä, jossa käytetään hydratsiinia. Käytännössä menetelmä valitaan poistettavan, suojaavan ryhmän tyypin perusteella. Erääseen usein käytetyistä menetelmistä sisältyy suojaavan ryhmän poistaminen fluorivedyllä (HF) seuraavasti: 1 g suojattua peptidiä liuotetaan n. 30 ml:aan HF:a, siten, että läsnä on 0,5 ml anisolia, -15-0eC:ssa, suljetussa reak-tioastiassa. Liuosta sekoitetaan 60 minuutin ajan, ja HF poistetaan tislaamalla reaktiojärjestelmästä. Jäännös pestään eetterillä ja liuotetaan veteen. Liuosta käsitellään Amberlite IRA-93:lla (etikkahappotyyppiä) ja kuivataan jäädyttäen, jotta saadaan raaka peptidi, josta suojaavat ryhmät on poistettu.

4) Raa'an peptidin puhdistaminen:

Raaka peptidi saatetaan puhdistaa tavanomaisin menetelmin, kuten esimerkiksi ioninvaihtokromatografiän avulla, gee-lisuodatuksella, partitiokromatografiällä, vastavirtajakaantumisen avulla ja suurpainenestekromatografiällä. Puhdistus suoritetaan esimerkiksi seuraavan suurpainenestekromatografiän avulla: 100 mg raakaa peptidiä sijoitetaan pylvääseen, jonka läpimitta on 20 mm ja korkeus 250 mm ja joka sisältää Nucleosil 5 c 18:a kantaja-aineena, ja sitten sitä eluoidaan 0,05% HCl:lla (H20-CH3CN). Jakeet joissa olivat aiottua peptidiä vas- 92935 11 taavat huiput, koottiin havaitsemalla ne UV 210 nm:ssä, ja ne kuivattiin jäädyttäen aiotun peptidin saamiseksi.

Kun peptidi sisältää kaksi Cys- tai D-Cys-yksikköä molekyylissä, raaka peptidi hapetetaan tavanomaisen hapetusmenetelmän avulla, ilmaa tai vetyperoksidia käyttäen, ennen puhdistusta, niin että saadaan erittäin puhdas tuote, joka sisältää suljetun renkaan. ,

Seuraavat eläinkokeiden tulokset valaisevat edelleen kyseessä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden vaikutuksia, kun niitä käytetään lääkkeinä.

*

Koe 1

Kivuntunnottomuutta koskevat kokeet.

Koeyhdiste liuotettiin fysiologiseen keittosuolaliuokseen. Koiraspuolisia hiiriä, jotka olivat kantaa ddY (ruumiinpaino 20-27 g, tavallisesti tutkittu kahdeksan ryhmissä), käsiteltiin koeyhdisteellä, jota annosteltiin laskimonsisäisesti tai ihon alle. Kivuntunnottomuusaktiivisuudet mitattiin hännännipistys-kokeen avulla.

Hännännipistyskokeessa 1), nipistin, joka sai aikaan 300 g:n paineen, asetettiin hännäntyveen, peräaukon limakalvo mukaanluettuna, ja mitattiin nipistimen puristusajan pituudet. Ennen koetta eläimet seulottiin hännän nipistyksen aistihavainnon suhteen, ja ne hiiret, jotka eivät purreet 3 sekunnin kuluessa, poistettiin kokeista. Kestoa, joka oli pitempi kuin 6 sekuntia, pidettiin kivuntunnottomuuden kriteerinä.

ED50-arvot (50%:sesti analgeettisesti tehokas annos) laskettiin Litchfield & Wilcoxon'n menetelmän 2) avulla. Tulokset esitetään taulukoissa 1 ja 2. Taulukko 1 esittää tulokset, jotka on saatu laskimonsisäistä ruisketta käytettäessä. Taulukko 2 esittää tuloksia, jotka on saatu ihonalaisella ruiskeella.

92935 12

Taulukoissa 1 ja 2 esiintyvät numerot sarakkeessa, jonka otsikko on "Koeyhdiste", vastaavat alla esitetyissä esimerkeissä valmistettujen lopullisten yhdisteiden numeroita.

Taulukko 1

Laskimonsisäinen ruiske

Koeyhdiste Hännännipistys- (esimerkin no) menetelmä (i.v.) 1 ED50 (mg/kg) 1 0,75 2 0,24 5 3,4 6 4,3 7 3,9 8 3,3 10 1,2 18 4,5 19 2,0 21 0,8 22 3,0 24 0,22 25 1,8 27 0,7 28 0,7 29 2,0 dynorfiini(1-13) >25,0

Taulukko 2 ihonalainen ruiske

Koeyhdiste Hännännipistys- (esimerkin no) menetelmä (s.c.) ED50 (mg/kg) 1 1,0 2 0,44 21 0,8 24 0,32 27 0,8 28 1,5 (Huomautus 1) Hännännipistysmenetelmä suoritettiin Takagi, H., et ai.:n mukaisesti, (Jap. J. Pharmacol., osa 16, 287-294 (1966)).

: (Huomautus 2) Litchfield-Wilcoxon-menetelma suoritettiin J.T. Litchfieldin ja F. Wilcoxonin mukaisesti 13 92935 (J. Pharmacol. Exp. Ther., osa 96, 99-113 (1949)).

Koe 2

Opioidiaktiivisuus

Kyseessä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden opioidiaktiivi-suudet tutkittiin menetelmällä, jossa käytettiin kaniinin sie-menjohdinta, T. Okan, K. Negishin, M. Sudan, T. Matsumiyan, T. Inazan ja M. Uekin mukaisesti, "Europ. J. Pharmacol.", osa 73, 235 (1980). Tässä kokeessa tapettiin täysin kehittyneitä koi-raspuolisia kaniineita viemällä ilmaa näkölaskimoon. Välittömästi kuoleman jälkeen suoritettiin vatsan avaus ja oikea ja vasen siemenjohdin poistettiin. Siemenneste puristettiin tie-hyeistä Ringerin liuokseen. Osa tiehyestä leikattiin (2,5 cm pituinen pää eturauhasen puoleisesta päästä). Siemenjohtimien palaset upotettiin langan avulla 6 ml:n vetoiseen lasikammioon, jonka lämpötila oli vakio, ja niitä stimuloitiin sähköisesti sähköisellä stimulointilaitteella, jossa olivat platinaelektro-dit, olosuhteissa, jotka olivat 0,1 Hz, 1 ms ja 90 V. Siirtojärjestelmän avulla rekisteröitiin sähköisestä stimuloinnista johtuva supistus. Tulokset esitetään taulukossa 3 50%:sen inhibition aiheuttamana konsentraationa (IC50).

Taulukko 3

Koeyhdiste Kaniinin siemenjohdinmenetelmä| (esim. no) IC50 (nM) | 1 3,5 2 0,04 3 6,03 6 4,5 8 6,2 19 2,8 24 0,08 25 0,58 27 2,0 28 6,5 . dynorfiini A 17,4 *' (1-17)__ 92935 14

Taulukosta 3 käy ilmi, että kyseessä olevan keksinnön mukaisilla yhdisteillä on voimakasta aktiivisuutta dynorfiini A:n verrattuna.

Edelleen, ne inhiboivat voimakkaasti marsun sykkyräsuolen pit-kittäislihasten sekä hiiren siemenjohtimien supistusta, ~ -ka on saatu aikaan sähköstimuloinnin avulla.

(

Edellä esitetyistä farmakologisista koetuloksista käy ilmi, että kyseessä olevan keksinnön mukaan saaduilla peptidiyhdis-teillä on samanlaista opioidiaktiivisuutta kuin dynorfiinilla, niiden vaikutukset ovat jokseenkin voimakkaat, ja merkittäviä analgeettisiä vaikutuksia tuodaan esille laskimonsisäisen tai ihonalaisen ruiskeen avulla.

On erittäin arvokasta, että kyseessä olevan keksinnön mukaisilla yhdisteillä on voimakkaita analgeettisiä vaikutuksia kun niitä annetaan systeemisesti, laskimonsisäisen tai ihonalaisen ruiskeen avulla, kun taas dynorfiinilla ja sen johdannaisilla, sikäli kun niistä on tietoja esitetty, tuskin on analgeettisiä vaikutuksia laskimonsisäisenä ruiskeena, koska ne ovat veressä epästabiileja.

Taulukossa 4 esitetään kyseessä olevan keksinnön esimerkeissä 1 ja 2 saadun peptidiyhdisteen myrkyllisyyden (pienin tappava annos) ja tehokkaan annoksen välinen suhde.

Taulukko 4

Tehokas annos ja pienin tappava annos, ihonalaisesti annettuna hiirelle

Koeyhdiste Hännännipistys | Pienin tappava annos| (esim. no) ED50 (mg/kg) | (mg/kg) | 1 1,0 100 2 0,44 20

Kyseessä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saaduilla peptidiyhdisteillä on huomattavia analgeettisiä vaikutuksia, ja 92935 15 ne ovat hoitoalalla lääkkeinä käyttökelpoisia.

Käytettäessä kyseessä olevan keksinnön mukaisia yhdisteitä analgeetteina, niitä annetaan suun kautta tai parenteraalises-ti. Tavallisesti niitä annetaan parenteraalisesti, laskimon-sisäisenä ruiskeena, ihonalaisena tai lihaksensisäisenä ruiskeena tai peräpuikkoina tai kielen alle sijoitettavina tabletteina. Annos vaihtelee oireiden ankaruudesta, potilaan iästä, sukupuolesta, kehonpainosta, herkkyydestä, annostelutavasta, sairauden vaiheesta, annosteluväleistä, lääkevalmisteen ominaisuuksista, formulaatiosta, valmisteen tyypistä ja aktiivisen aineen tyypistä riippuen. Vaikka annos täten ei ole erityisesti rajoitettu, se on tavallisesti noin 0,1 - 1000 mg/päivä, mieluummin noin 1 - 300 mg/päivä, aikuisille ihmisille.

Kyseessä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan formuloida ruiskeiksi, peräpuikoiksi, kielen alle sijoitettaviksi tableteiksi, tableteiksi ja kapseleiksi tavanomaisin, farmakologian alalla käytetyin menetelmin.

Ruiskevalmisteessa, lisäaineet, kuten esimerkiksi pH:n säätely-aine, puskuroiva aine, suspendoiva aine, liuottava aine, stabilisaattori, isotoniseksi tekevä aine ja säilytysaine lisätään aktiiviseen aineeseen ja saatu seos formuloidaan laskimon-sisäiseksi, ihonalaiseksi tai lihaksensisäiseksi ruiskeliuok-·, seksi tavanomaisella menetelmällä. Jos on tarpeen, seos saatetaan lyofilisoida tavanomaisin menetelmin.

Suspendointiaineiden esimerkkeihin kuuluvat metyyliselluloosa, polysorbaatti 60, hydroksietyyliselluloosa, akaasia, tragantti-jauhe, natriumkarboksimetyyliselluloosa ja polyoksietyleenisor-bitaanimonolauraatti.

Liuottavien aineiden esimerkkeihin sisältyy polyoksietyleenillä kovetettu risiiniöljy, polysorbaatti 80, nikotiiniamidi, poly-oksietyleenisorbitaanimonolauraatti, makrogol, ja risiiniöljyn rasvahappojen etyyliestereitä.

l6 92935

Stabiloivien aineiden esimerkkeihin sisältyy natriumsulfiitti, natriummetasulfiitti ja eettereitä. Säilöntäaineiden esimerkkeihin sisältyvät metyyliparahydroksibentsoaatti, etyylip-hyd-roksibentsoaatti, sorbiinihappo, fenoli, kresoli ja kloorikres- oli.

Kyseessä olevaa keksintöä valaistaan seuraavin tyypillisin esimerkein, (joiden tarkoituksena ei ole rajoittaa keksintöä.)

Esimerkki 1 CH,Tvr-Glv-Glv-Phe-Leu-Arq-CH,Arq-D-Leu-NHC,Hc: n synteesi 25 g Boc-D-Leu-OH-H20 liuotettiin 200 mitään THFta. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Liuokseen lisättiin 11 ml N-metyylimorfo-liinia ja 9,65 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua siihen lisättiin 12,9 g 70%:sta etyyliamiinin vesiliuosta, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Konsentroinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaatissa ja pestiin NaH-C03:n vesiliuoksella ja vedellä peräkkäin. Kuivaksi suoritetun konsentroinnin jälkeen saatiin 24,5 g Boc-D-Leu-NHC2H5:ä. Sp.

103 - 106°C

Ohutlevykromatografia: Rf-arvo 0,77 (etyyliasetaatti)

Optinen kierto: [e]D * +20,0° (C=l, metanoli)

Alkuaineanalyysi C13H2SN203:lle

C H N

laskettu (%) 60,44 10,14 10,84 määritetty (%) 60,42 10,33 10,86 2. Z-CH,ArgfTos)-D-Leu-NHC?H«:n synteesi 1,43 g Z-CH3Arg(Tos)-0H:a, [e]D = -15® (0*1, dimetyyliforma-midi), syntetisoitu H-Arg(Tos)-OH:sta P. Quitt et ai.:n menetelmän mukaisesti [Helvetica Chimica Acta, 32, 327 (1963)], liuotettiin 15 ml:aan tetrahydrofuraania. -30°Cseen suoritetun 17 92935 jäähdytyksen jälkeen liuokseen lisättiin 0,33 ml N-metyylimor-foliinia sekä 0,29 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua siihen lisättiin liuos, jossa oli 817 mg CF3COOH·H-D-Leu-NHC2H5:a (syntetisoitu käsittelemällä Boc-D-Leu-NHC2H5: a CF3C00H:lla anisolin läsnäollessa) sekä 0,83 ml trietyyliamii-nia, joka oli 7 ml:ssa tetrahydrofuraania, ja seosta sekoitettiin n. -5°:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin NaHC03:n vesiliuoksella ja tämän jälkeen vedellä ja väkevöitiin kuivaksi, jotta saatiin 1,58 g lasin kaltaista Z-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H5:a.

Ohutlevy- kromatografia: Hf-arvo 0,68 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = 0 + 0,5° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C30H44N6O6S:lle

C H N

laskettu (%) 58,42 7,19 13,63 määritetty (%) 58,29 7,19 13,40 31 Boc-Arq(Tos^-CH,ArqfTos)-D-Leu-NHC-'Hc:n synteesi 1,1 g CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H5:a, joka oli saatu pelkistämällä Z-CH3Arg (Tos)-D-Leu-NHC2H5:a katalyyttisesti Pd/C:n läsnäollessa, 983 mg Boc-Arg(Tos)-0H:a ja 372 mg N-hydroksibentsotriatso-lia liuotettiin 4 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuokseen lisättiin, samalla jäiden avulla jäähdyttäen, 520 mg disykloheksyy-likarbodi-imidiä, ja seosta sekoitettiin jääkaapissa yhden päivän ajan ja sitten huoneenlämpötilassa yhden päivän ajan. Täten muodostunut saostuma poistettiin suodattamalla, ja suodos väkevöitiin. Väkevöintijäännös puhdistettiin silikageelipylväs-kromatografiän avulla (eluentti: MeOH/CHC13 = 1/15), jotta saatiin 1,2 g lasimaista Boc-Arg(Tos) -CH3Arg(Tos) -D-Leu-NHC2H5:a

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,64 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen • « 18 92935 kierto: [a]D = -20,6° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C40H64NloO9S2-H2O: lie:

C H N

laskettu (%) 52,72 7,30 15,37 määritetty (%) 52,82 7,22 15,06 ·{ 4. Boc-Leu-Arq (Tos) -CH,Arg f Tos) -D-Leu-NHC-,Hc :n synteesi 1,465 g Boc-Leu-OH·H20:a liuotettiin 12 ml:aan dimetyylifor-mamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Liuokseen lisättiin 0,726 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,631 ml etyylikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua, liuos, jossa oli 4,986 g CF3C00H·H-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H5:a, syntetisoitiin käsittelemällä Boc-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H5:a CF3COOH:lla anisolin läsnäollessa, ja liuokseen lisättiin 0,726 ml N-metyylimorfoliinia 12 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, ja liuosta pestiin NaHC03:n vesiliuoksella ja sitten vedellä. Väkevöinnin ja sitä seuranneen jähmettämisen jälkeen, joka suoritettiin metanoli/eetterillä, saatiin 5,283 g Boc-Leu-Arg (Tos) CH3Arg (Tos) -D-Leu-NHC2H5: a.

sp.: 120 - 125°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,66 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kiertokyky: [a]D = -25,8° (0 = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C^H^NhOjqSj- CH3OH:lle:

C H N

laskettu (%) 54,36 7,67 14,84 määritetty (%) 54,49 7,63 14,62 5. Boc-Phe-Leu-Arg(Tosl-CH-,Arq(Tosl-D-Leu-NHC.»H«:n synteesi 92935 19 1,465 g Boc-Phe-OH:a liuotettiin 12 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytettiin -30°C:een. Liuokseen lisättiin 0,608 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,528 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua liuos, jossa oli 4,691 g CF3C00H-H-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg-(Tos)-D-Leu-NHC2H5:a, syntetisoitiin käsittelemällä Boc-Phe-Leu-Arg- (Tos) -CH3-Arg(Tos) -D-Leu-NHC2H5 :a CF3COOH:lla anisolin läsnäollessa, ja liuokseen lisättiin 0,608 ml N-metyylimorfoliinia 12 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja liuos pestiin NaHC03:n vesiliuoksella ja tämän jälkeen vedellä. Väkevöinnin jälkeen seurannut kiinteyttäminen, joka suoritettiin me-tanoli/eetterillä, antoi 5,072 g Boc-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg (Tos ) -D-Leu-NHC2H5: a.

sp.: 127 - 132°C

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,66 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = ~25,4e (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C55H84N12OnS2· CH3OH: lie:

C H N

laskettu (%) 56,74 7,48 14,18 määritetty (%) 56,64 7,33 13,86 » 6. Boc-CH,Tvr (C12Bzl)-Glv-Glv-OH:n synteesi 9,09 g Boc-CHjTyr(Cl2Bzl)OH:a, [ct]D = -49° (C = 1, C2H5OH), syntetisoitiin S. T. Cheung et al.:n menetelmällä (Can. J.

Chem., 55, 906 (1977)), ja 2,53 g N-hydroksisukkinimidiä liuotettiin 150 ml:aan tetrahydrofuraania. Jäiden avulla suoritetun jäähdyttämisen jälkeen liuokseen lisättiin 4,12 g disyklohek-syylikarbodi-imidiä ja seosta sekoitettiin yli yön jääkaapissa. Täten muodostuneet valkoiset kiteet poistettiin suodattamalla, ja suodokseen lisättiin 2,91 H-Gly-Gly-OH:a sekä 38 ml vesiliuosta, jossa oli 1,848 g NaHC03:a. Seosta sekoitettiin huoneen- ψ · lämpötilassa 2 päivän ajan ja sitten se konsentroitiin. Siihen 92935 20 lisättiin sitruunahapon laimeaa liuosta sekä etyyliasetaattia, ja etyyliasetaattikerros erotettiin. Vedellä suoritetun pesun ja sitä seuranneen väkevöinnin jälkeen tuote puhdistettiin silikageelipylväskromatografiän avulla, jossa eluointi tapahtui MeOH/CHCl3:11a (1/30) ja kiinteytettiin eetteri/n-heksaanilla, jotta saatiin 9,23 g Boc-CH3Tyr-Cl2Bzl)-Gly-Gly-OH:a.

sp.: 70 - 80°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,79 (metanoli/etikkahappo/kloroformi, 4:1:12) )

Optinen kierto: [a]D - ”47° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C26H31N307C12· ^jHjOCjHs:lie:

C H N

laskettu (%) 55,54 5,99 6,94 määritetty (%) 55,45 5,81 6,89 7 . Boc-CH,Tvr(Cl,Bzl) -Glv-Glv-Phe-Leu-Arq(Tos) -CH,Arq (Tos)-D-Leu-NHC?H«:n synteesi 682 mg Boc-CH,Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-OH:a ja 195 mg N-hydroksi-bentsotriatsolia liuotettiin 4 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuokseen lisättiin, jäähdyttämällä samalla jäiden avulla, 272 mg disykloheksyylikarbodi-imidiä. 2 tunnin mittaisen sekoituksen jälkeen syntetisoitiin liuos, jossa oli 1,167 g CF3COOH'H-Phe-Leu-Arg(Tos) -CH3Arg(Tos)-D-Leu-NHC2H5:a, käsittelemällä Boc-Phe-Leu-Arg (Tos) CH3Arg (Tos) -D-Leu-NHC2H5: a CF3COOH: 11a anisolin läsnäollessa, ja liuokseen lisättiin 0,132 ml N-metyylimorfo-liinia 8 mlrssa dimetyyliformamidia ja seosta sekoitettiin jääkaapissa yli yön. Täten muodostunut saostuma poistettiin suodattamalla, ja suodos konsentroitiin ja puhdistettiin silikageelipylväskromatograf iällä (eluentti: MeOH/CHC13 = 1/20). Metanoli/eetterillä suoritetun kiinteyttämisen jälkeen saatiin 1,391 g Boc-CHjTyr(Cl2Bzl) -Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos) -CH3Arg (Tos) - 21 92935 D-Leu-NHC2H5: a.

sp.: 130 - 135°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,64 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -35,3° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi Ο76Η105Ν15Ο1582Ο12· CH3OH· H20: lie:

C H N

laskettu (%) 55,92 6,77 12,70 määritetty (%) 56,06 6,49 12,52 8. CH,Tvr-Glv-Gly-Phe-Leu-Arq-CH.Arq-D-Leu-NHC,H«:n synteesi 220 mg Boc-CH3Tyr (C12Bzl) -Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos) -CH3Arg(Tos) -D-Leu-NHC2H5:a liuotettiin 10 ml:aan fluorivetyä (HF), siten että läsnä oli 0,2 ml anisolia, suljetussa HF-reaktioastiassa, -5°C:ssa. Liuosta sekoitettiin yhden tunnin ajan, ja sitten HF poistettiin reaktiojärjestelmästä tislaamalla. Jäännös pestiin eetterillä ja liuotettiin veteen. Liuosta käsiteltiin Amberlite IRA-93:lla (etikkahappotyyppi) ja jäädytyskuivattiin. Täten saatua raakaa peptidiä 120 mg puhdistettiin suurpainenestekro-matografian avulla (Nucleosil 5 C 18, 2 φ x 25 cm, eluointi 0,1 %:lla HCltllä (H20-CH3CN, 81/91)), ja sitten se jäädytyskui-. vattiin, jotta saatiin 70 mg CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-NHC2H5.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,70 (butanoli/etikkahappo/pyridiini/vesi, 15:5:5:8)

Optinen kierto: [e]D = -21,8° (C = 0,4, 0,01 N - HC1) M.S. (FAB): 1036 ([M+H]+)

Aminohappoanalyysi: 22 9 2 9 3 5

Gly 1,87(2) Leu 1,96(2) Phe 1,00(1)

Arg 0,95(1) (CH3Tyr:stä ja CH3Arg:stä johtuvia huippuja ei laskettu.) ESIMERKKI 2 I I ·<

Tvr-D-Cvs-Gly-Phe-Cvs-Arq-CH,Ara-D-Leu-Arq-NH7;n synteesi 1. Boc-D-Leu-Arg(Tos)-NH2: n synteesi 2,493 g Boc-D-Leu-OH·H20:a liuotettiin 10 ml:aan dimetyylifor-mamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Liuokseen lisättiin 1,1 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,96 ml etyylikloorikarbonaat-tia. 5 minuutin kuluttua siihen lisättiin liuos, jossa oli 4,414 g CFjCOOH· H-Arg(Tos)-NH2:a ja 1,65 ml N-metyylimorf oliinia 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin peräkkäin NaHC03:lla ja vedellä. Väkevöinnin jälkeen siihen lisättiin eetteriä tuotteen kiinteyttämiseksi. Täten saatiin 4,96 g Boc-D-Leu-Arg(Tos)-NH2:a.

sp.: 110 - 120°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,49 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [«Id = +13,0° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C24H40N606S· l/3H20:lle:

C H N

laskettu (%) 52,73 7,50 15,37 määritetty (%) 52,77 7,60 15,14 2. Z-CH,Arg(Tos) -D-Leu-Arg(Tos) -NH7:n synteesi 3,336 g Z-CH3Arg(Tos)-OH:a liuotettiin 30 ml:aan tetrahydrofu-raania. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Liuokseen lisättiin 0,77 n 92935 23 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,67 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua syntetisoitiin liuos, jossa oli 3,882 g CH3-COOH-H-D-Leu-Arg(Tos)-NH2:a, käsittelemällä Boc-D-Leu-Arg(Tos)-NH2: a CF3COOH:lla anisolin läsnäollessa, ja liuokseen lisättiin 1,17 ml trietyyliamiinia 30 ml:ssa tetrahydrofuraania, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa, 2 tunnin ajan. Väkevöinnin ja sitä seuranneen kiinteyttämisen jälkeen, joka suoritettiin metanoli/vedellä, saatiin 6,14 g Z-CH3Arg(Tos)-D~beu-Arg(Tos)-NH2: a.

sp.: 100 - 113°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,44 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D — “3,4° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C41H58N10O9S2* CH30H: lie:

C H N

laskettu (%) 54,18 6,71 15,04 määritetty (%) 54,12 6,62 14,85 3. Boc-Arq(Tos )-CH,Arq(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH,in synteesi 4,734 g CH3Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2: a, joka oli saatu pel-. kistämällä katalyyttisesti Z-CH3Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2:a Pd/C:n läsnäollessa, 2,918 g Boc-Arg(Tos)OH:a ja 1,1 g N-hyd-roksibentsotriatsolia liuotettiin 17 mitään dimetyyliformami-dia. Liuokseen lisättiin, jäiden avulla samalla jäähdyttäen, 1,543 g disykloheksyylikarbodi-imidiä, ja seosta sekoitettiin jääkaapissa yhden päivän ajan ja sitten huoneenlämpötilassa yhden päivän ajan. Täten muodostunut saostuma poistettiin suodattamalla, ja suodos väkevöitiin. Jäännös puhdistettiin sili-kageelipylväskromatografian avulla (eluoitiin MeOH/CHCl3:11a, 1/15) ja kiinteytettiin eetterillä, jotta saatiin 4,917 g Boc-Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Leu-Arg (Tos) -NH2: a.

sp.: 131 - 136°C (hajoaa) ·. Ohut levy- 24 92935 kromatografia: Rf-arvo 0,44 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -16,7° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C51H78N14012S3· H20:lle:

C H N

laskettu (%) 51,32 6,76 16,43 määritetty (%) 51,15 6,54 16,48 4 , Boc-Cvs (CH-,ΒζΙ) -Arq f Tos) -CH,Arq (Tos) -D-Leu-Arq (Tos) -NH-,: ri synteesi 747 mg Boc-Cys(CH3Bzl)-OH:a liuotettiin 4 ml:aan dimetyylifor-mamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Siihen lisättiin 0,254 ml N-metyylimorfoliinia sekä 0,221 ml etyylikloorikarbonaattia.

5 minuutin kuluttua liuos, jossa oli 2,497 g CF3COOH· H-Arg-(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2:a syntetisoitiin käsittelemällä Boc-Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Leu-Arg (Tos) -NH2: a CF3COOH:lla anisolin läsnäollessa, ja liuokseen lisättiin 0,277 ml N-metyylimorfoliinia 6 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5eC:ssa 2 tunnin ajan. väkevöinnin jälkeen seos liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin sitten peräkkäin NaHC03:lla ja vedellä. . ^äkonsentroinnin jälkeen tuote kiinteytettiin metanoli/eetterillä, jotta saatiin 2,548 g Boc-

Cys (CH3Bzl) -Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Leu-Arg (Tos) -NH2: a. sp.: 126 - 132°C (hajoaa) . Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,51 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]0 = -20,6° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C62H,1N15013S4· CH3OH· H20:lle:

C H N

laskettu (%) 52,81 6,82 14,66 määritetty (%) 52,78 6,43 14,29 5 . Boc-Phe-Cvs (CH.Bz 1) -Ara (Tos) -CH,Arq (Tos) -D-Leu-Ara (Tos) -NH,: n * synteesi 25 9 2 9 3 5 467 mg Boc-Phe-OH:a liuotettiin dimetyyliformamidiin. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Siihen lisättiin 0,194 ml N-metyyli-morfoliinia ja 0,168 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua syntetisoitiin liuos, jossa oli 2,234 g CF3COOH·H-Phe-Cys (CHjBzl) -Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Leu-Arg(Tos ) -NH2: a, käsittelemällä Boc-Phe-Cys (CH3Bzl) -Arg(Tos)-CH3Arg (Tos) -D-Leu-Arg-(Tos)-NH2:a CF3COOH:lla anisolin läsnäollessa, ja 0,221 ml N-metyylimorfoliinia 5 mlrssa dimetyyliformamidia lisättiin liuokseen, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, ja liuos pestiin peräkkäin NaHC03:n vesiliuoksella ja vedellä. Lisäväkevöinnin jälkeen tuote kiinteytettiin metanoli/eetteril-lä, jotta saatiin 2,126 g Boc-Phe-Cys(CH3Bzl)-Arg(Tos)-CH3Arg-(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2: a.

sp.: 124 - 130°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,56 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -18,9° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C71H100N16O14S4- 5/2CH3OH:lie:

C H N

laskettu (%) 54,83 6,89 13,91 määritetty (%) 54,62 6,34 13,64 .· 6 . Boc-D-Cvs (CH,Bzl Ϊ -Gly-OC,Hg: n synteesi 3,233 g Boc-D-Cys(CH3Bzl)OH:a liuotettiin 15 ml:aan dimetyyli-formamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Liuokseen lisättiin 1,1 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,956 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua siihen lisättiin liuos, jossa oli 1,396 g HCl*H-Gly-OC2H5:a ja 1,1 ml metyylimorfoliinia 20 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin n. -5eC:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen siihen lisättiin n-heksaa-nia tuotteen kiinteyttämiseksi. Täten saatiin 3,6 g Boc-D-Cys-Gly-OC2H5:a.

26 92935

s.p. 80-82°C

Ohutlevykromatografia: Rf-arvo 0,74 (kloroformi/etyyliasetaatti 2:1)

Optinen kierto: [a]D = +30,2° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C20H30N205S: lie:

C H N

laskettu (%) 58,51 7,37 6,82 määritetty (%) 58,35 7,23 6,69 7. Boc-Tvr (Cl-,ΒζΙ) -D-Cvs (CH,Bzl) -Glv-0C,Hc: n synteesi 2,068 g Boc-Tyr (Cl2Bzl) -OH: a liuotettiin 20 ml: aan tetrahydro-furaania. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Siihen lisättiin 0,517 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,45 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua liuos, jossa oli 1,94 g CF3COOH* H-D-Cys-(CH3Bzl)-Gly-OC2H5:a syntetisoitiin käsittelemällä Boc-D-Cys-(CH3Bzl)-Gly-OC2H5:a CF3COOH:lla anisolin läsnäollessa, ja liuokseen lisättiin 1 ml trietyyliamiinia 20 ml:ssa tetrahydro-fur^ania, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen siihen lisättiin vettä, jotta muodostui saostuma, joka suodatettiin ja liuotettiin metanolin ja veden seokseen. Väkevöinnin jälkeen siihen lisättiin eetteriä tuotteen kiinteyttämiseksi. Täten saatiin 2,661 g Boc-Tyr(Cl2Bzl)-D-Cys (CH3Bz1) -Gly-°C2H5:a.

sp.: 149 - 150°C

Ohutlevykromatograf ia: Rf-arvo 0,63 (kloroformi/etyyliasetaatti, 2:1)

Optinen kierto: [e]D = +17,0° (C = 1, dimetyyliformamidi)

Alkuaineanalyysi C36H43N307SC12: lie:

C H N

laskettu (%) 59,01 5,91 5,73 määritetty (%) 58,94 5,75 5,62 92935 27 8. Boc-Tyr(Cl2Bzl)-D-Cys(CH3Bzl)-Gly-OH:n synteesi 2,345 g Boc-Tyr (Cl2Bzl)-D-Cys (CHjBzl)-Gly-OC2H5: a liuotettiin 30 ml:aan tetrahydrofuraania, ja sitten siihen lisättiin 3,2 ml N-NaOHia. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Seokseen lisättin 3,2 ml N-HCl:a. Syntyvää seosta väkevöitiin. Siihen lisättiin vettä tuotteen kiinteyttämiseksi, Täten saatiin 1,899 g Boc-Tyr(Cl2Bzl)-D-Cys(CH3Bzl)-Gly-OH:a.

sp.: 133 - 138°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,25 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [ct]D = +35,8° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C34H39N307SC12: lie:

C H N

laskettu (%) 57,95 5,58 5,96 määritetty (%) 57,81 5,33 5,92 9 . Boc-Tvr (Cl,Bzl Ϊ -D-Cvs (CH,Bzl) -Gly-Phe-Cvs f CH,Bzl) -Arq (Tos) -CH,Arq(Tos)-D-Leu-Arq(Tos)-NH,: n synteesi * « 983 mg Boc-Tyr (Cl2Bzl)-D-Cys (CH3Bzl)-Gly-OH: a ja 226 mg N-hyd-roksibentsotriatsolia liuotettiin 5 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuokseen lisättiin 316 mg disykloheksyylikarbodi-imidiä jäähdyttäen samanaikaisesti jäiden avulla. 2 tunnin mittaisen sekoituksen jälkeen liuos, jossa oli 1,94 g CF3C00H· H-Phe-Cys-(CH3Bz 1) -Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Leu-Arg (Tos) -NH2: a, syntetisoitiin käsittelemällä Boc-Phe-Cys (CH3Bzl)-Arg (Tos)-CH3Arg (Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2:a, CF3C00H:lla anisolin läsnäollessa, ja liuokseen lisättiin 0,167 ml N-metyylimorfoliinia 10 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin jääkaapissa yön yli. Täten muodostunut saostuma suodatettiin. Silikageelipylväskro-.' matografian (eluoitiin MeOH/CHCl3:lla, 1/20) sekä sitä seuraa- „ 92935 28 van kiinteyttämisen avulla, joka suoritettiin metanoli/eette-rillä, saatiin 2,0 g Boc-Tyr (Cl2Bzl)-D-Cys (CH3Bzl)-Gly-Phe-Cys-(CH3Bz 1) -Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Leu-Arg (Tos ) -NH2: a. sp.: 123 130°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,63 (metanoli/kloroformi, 1:27)

Optinen kierto: [a]D = -17,5° (C = 1, dimetyyliformamidi)

Alkuaineanalyysi C100H129N19O18S5Cl2· 05Η5002Η5· 3/2CH3OH: lie:

C H N

laskettu (%) 56,60 6,52 11,89 määritetty (%) 56,38 6,18 11,72 I-1 10. Tyr-D-Cvs-Glv-Phe-Cvs-Arq-CH,Arq-D-Leu-Arg-NH-,:n synteesi 515 mg Boc-Tyr (Cl2Bzl)-D-Cys (CH3Bzl)-Gly-Phe-Cys (CH3Bzl) -Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Leu-Arg(Tos)-NH2 liuotettiin 20 ml:ssa HF:a 2 ml:n läsnäollessa anisolia, -5eC:ssa, suljetussa fluo-rivety(HF)-reaktiolaitteessa. Liuosta sekoitettiin 2 tunnin ajan, ja sitten HF poistettiin reaktiojärjestelmästä tislaamalla. Jäännös pestiin eetterillä ja liuotettiin veteen. Liuosta käsiteltiin Amberlite IRA-93:lla (etikkahappotyppi) ja sitten se jäädytyskuivattiin. 320 mg kuivattua tuotetta liuotettiin 1,3 l:aan vettä, ja liuoksen pH säädettiin ammoniakin vesiliuoksella. Siihen laskettiin ilmaa sekoittaen sitä 2 päivän ajan, ja seoksen pH säädettiin 6:ksi, ja sitten se jäädytyskuivattiin. Täten saatu raaka peptidi puhdistettiin suur-painenestekromatografiaa käyttäen (Nucleosil 5 C 18, 2 φ x 25 cm, eluoitu 0,05 %:lla HCl H20/CH3CN:llä, 88/12)) ja jäädytys- I-1 kuivattiin, jotta saatiin 140 mg Tyr-D-Cys-Gly-Phe-Cys-Arg-CH3Arg-D-Leu-Arg-NH2: a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,56 (butanoli/etikkahappo/pyridiini/vesi, 29 92935 15:5:5:8)

Optinen kierto: [α]„ = -29° (C = 0,4, 0,01 N-HCl) M.S- (FAB): 1183 ( [M+H] + )

Aminohappoanalyysi:

Gly 1,02(1) Cys 1,83(2) Leu 1,04(1)

Tyr 0,80(1) Phe 1,00(1) Arg 2,06(2) (CH3Arg:stä johtuvaa huippua ei laskettu) ESIMERKIT 3-29

Taulukossa 5 esitetyt yhdisteet syntetisoitiin samalla tavanomaisella nestefaasimenetelmällä kuin esimerkeissä 1 ja 2. Näissä kokeissa syntetisoitiin dynorfiini-johdannaisia, jotka oli muunnettu asemissa 1-3 (Tyr-Gly-Gly), asemissa 4-7 (Phe-Leu-Arg-Arg), asemissa 4-8 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile) ja asemissa 4-9 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg), käyttäen asteittaista menetelmää, aloittamalla kunkin peptidin C-terminaalisesta päästä. Sitten, johdannaiset asemissa 1 - 3 ja johdannaiset asemissa 4-7,4-8 tai 4-9 kondensoitiin yhteen käyttäen DCC-HOBt- tai seosanhydridi-menetelmää. Kaikki suojaavat ryhmät poistettiin fluorivedyn (HF) avulla, ja tuote puhdistettiin preparatiivisen suurpainenestekromatografiän avulla, käyttämäl- . lä käänteisfaasikantajaa. Esimerkissä 24 poistettiin kaikki • « suojaavat ryhmät HF:llä, ja yhdiste hapetettiin ilmalla ja puhdistettiin sitten preparatiivisen suurpainenestekromatogra-fian avulla. Vastaavien suojattujen peptidien synteesien reak-tiotiet esitetään reaktiokaavioissa 1-5.

Taulukossa 6 esitetään tulokset optisen kiertokyvyn [a]D20 määrityksestä, ohutlevykromatografiän (TLC) Rf-arvo ja aiottujen, yllä esitetyllä tavalla saatujen peptidien aminohappoana-lyysit.

30 92935

Taulukko 5

Jusin. . Yhdiste 5 CKjTyr-QI.y- O £7-Phe-Leu-Arg-Arg-NH; < CHjTyr-0 £7 - 0 i y - P h e - L e u - Λ r g - Λ r g - N H C H j C H ( C H j ) C H j C H j

5 CH j Ty r -Q£y-0£y - Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-OH

6 CHjTyr-O/y - O £,7 - Phe - Leu-Arg-Arg-D- Leu-OC^H 5 7 C H j T y r - O /y - O £,7 -Phs-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NHj 6 CHjTyr-0^y-0/y-Phe“Leu-Arg-Arg-D-L9u-NHG2H5 ? CHjTyr-G/7-OAty-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-Ml(CH2) ,CHj 1 0 CHjTyr-O/y-O^y-Phe(p-NOj)-L»u-Arg-Arg-P-Leu-NHj 1 1 CHjTyr-O^y-O/y-Phe-Leu-horr. oA r g - A r g-I1 - Le u - NH 2 1 2 CH j Ty r - D-AZ-a-0/y - Ph a-Le u-A r g-A r g - D-Leu - NH j i i

1 i CHjTyr - O^y-O^y-CHjPhe-Leu-Arg - Arg-D-Leu-NHj I

1 4 CH j Ty r - O/y - O/y - Phe - CH j Le u - A r g-Ar g - D-Le u - Nti ? 1 5 CUjTyr-Oiy-O/y-D-Phe-Lea-Arg-Arg-D-Leu-IMIj > 6 Tyr-D-A/a-Oiy-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-NHj ! 1 7 Tyr-Sar-Q£j-Ph e - Leu-Arg-Arg-D-Leu-NH2 1 8 CHjTyr-O/y-O/y-Phe-Leu-CHjArg-Arg-D-Lea-ΝΗ? 1 ? CHjTyr-OXy-O/y-Phe-Leu-Arg-CH,Arg-D-Leu-NHj 31 92935

Taulukko 5 (jatkoa)

Esiou Yhdiste 1

_._____________ ____________I

2 0 OHjTyr - O.gy - Q£y - Phe· tert-Leu^Arg'CH jAr B“D'Leu*NllCjH j j 2 1 CH,Tyr-0^r-0^r*Phe(p-W02)-Leu-Arg-CH,Arg-D-Leu-NHCjH, ^ 2 2 CH } Ty r-0/.y-0.£y-Phe - Lbu-Ly e - CH j Ar g-D - Leu - NH 2 2 5 Tyr-D-Ser-O/y-Phe-Ser-Arg-CH,Arg-D-Leu-NHC?H, i-1 2 4 Tyr-D-Cyb-O/y-Phe-Cye - Arg-CHjΛrg-D-Leu-NHCjHj 2 5 CIljTyr-O/y-O^y-Phe-Leu-Arg-Arg-D-Leu-Arg-NHj 2 A CH j Ty r-0£,J-0£7 - Phe - Lb u - A r g - A r g - D-0.£u - A r g - NH 2 2 7 CH jTy r-O^-y-0/y-Ph e - Le u-Ar g-CH j Ar g - D-Leu - A r g - NHCj H 5 2 B CH jTyr -O^y-O^y-Phe f p-N02 j-LBU-Arg-CHjArg-D-Leu-Arg-tiHCjH, 2 9 CHjTyr-O^y-O^y-Phe-MBt(O) - Arg-CHjArg-D-Leu-Arg-NHj

tert-Leu I (CHj ),CCH(HHj)COOH

horcoArg I WH2C( = MH )NHCHjCHzCHzCH2CH(WH2)COOH Phe(p-NOj) : NQ2 -^~^-CH;CH(NH;)COOH Bar I CHjMHCHjCOOH

32 92935

Rsaktiokaavio 1

Esimerkit 3 ja~^ < CH3T7r(C^23z^·) G.£y G^y Phe Leu Arg(TOs) ΑτεζΓοε)

Boc -- OH E -- R

Eo c---R

Eoc—OE E-R

Eoc-—--R

Boc—OE E--R

Eo c-- R

to c - 0 E E R

E C C —i-:-----j-p R

.: R I NE j , KECE2CE(CE3)CH2CHj I) 92935 33

Reaktiokaavio 2 Esimerkit 5 - 13 > A B 0/-7 C D E A r g ( T O 'e ) D - Leu

Ecc - - OH H -- P.

B o c--- - E

Bc c -- OH H---P

Ecc----R

Be C -- OH H----P.

Eoc-----B

Bo c -- OH H-----R

Boc-----P

Eoc-- OH H-----LR.

pcc--------r f Λ : Tyr(C/jEz/·) , CH ,Τχ r ( C/-j B z/) . B 0/7 , D - Λ/a , S a r . C : Ti.e , Γ - ΐ P. e , CH jFhe , Fhe( j-PO j ) . D : Leu.CKjLeu. E : A r g ( 7 0 e ) , > o ~ o a r g ( T c 6 ) .

B : OP:/,OC?H, ,,BHC?H , ,NK(CH? ) ,CH , (Esimerkeissä 11 ja 18 käytettiin Z-homoArg(Tos)OH:a ja :. Z-CH3Arg(Tos)OH:a vastaavasti kuten suojattua aminohappoa E) 92935 34

Reaktiokaavio 3 Esimerkit 19 - Ί ® C D E CHjArB(Toe) D-Leu

2 - OH H - R

Z---1 R

B 0 c - OH H---P.

Bo c------R

Eo c -- OH H----R

Eoc------

Eoc - OH H -------- -----------

Be c----OH H------p

Bee -J- 1_ f A : Tjr(Ci Bz/),CH,T7r(C/jEz/). B I 0£y ,D-Eer(Bzl) , D - Cy6(CH,BzI ).

C : Fhe ,Phe(p-ROj ). D : Leu , t e r t - Lbu , E e r (Bz/) , Cy ε ( CH }Br/.) .

E : Arg(Toe), Lye(Z). R \ NHj,NHC,Hj 92935 35 ΝΝΝνΝΝΝΓ»Ν(\>ΝΝ 'Ξ'χχχχχχχχχχχχ

OZZZZzZZZZZZZ

£-1-------^----ι- “ S «<

X

o < —i—|---1---1---1--

o o o O X

ά ©

T X

0 o ^-1-------1--- “ ου 1 o o se ^ « n ^ -r O s 0 o £·_I________ « o u

S o o S

^ m « x 9 ° ®-1- [· "* o o o o x n n

X

vc o ™ ®_I____ XT O' ® u o

' ^ o O x Q

O ® ® N

•r ^ S

> <Aj X o cö O e- ^ -H N- 4 O JX ° 2 •H f-, ° +3 Φ Λ

^: £ Q

CC ·Η

0) CO

o: ω >* ^ ^ s__3 : ° 3 .

t

P

/""N

1 _14 <' S o o

w O O

£ « ® s' 36 92935

Reaktlokaavio 5 Esirnerkit 27 - 2? CHjTyr 0/y 0/.y Λ B Λ r g(Toe) CH}Arg(T06) D-Leu Arg(Toe)

Boc - OH H - R

Boc---R

Z - OH H---R

Z----R

Bo c - OH H----R

Boc-----R

Boc -- OH H-----R

Bo c------R

Boc - OH H —-----R

Bo c-------P

Eoc-----OH H-------P

Boc-I--------f * Λ : ?ne , Phe(p-NOj) . B : Leu , Met(O). R : ΝΗ?> RHCjH, « li 4 37 92935 i " ~ ““““ %rt ο- α u is ίο »O O- '(

O O CD

— o

Φ «3 U

^ N is

< < H

0^·^·ΓΝ.Γχ.0ν>^ν<0^)·ΟνΟ»000» •OOfr-O-CK^-CKOOO'OO&wCKOC^O-

fM CM ·“ CM CM *“CMCM^^fMOO

,r? ecfiotoeceoecccfeoöototcccticöcitftf ζ' UUSUU1-1_L.SUUS_1_L.'-L- ^ <<<<<<<<<<<<<<<<< r—I _

^ O O O O O O O OO O O © O O O

>3 OOOOOOO OO OOOOOO

O ^ J J J J J J

a ,.-, Q4 © ® © ® © © φ ΟΦ ΟΟΦΟΟΦ ^ (¾ £££££££ £ £ £.£££££ Q O P, P* P* Ph P« P, tn Ph Ph C- Ch P, P, p.

ä .5 .................

-j H »OOOOOVinO^OOCMiO^CD — m ^ ^ ooo^o-^o-oe^e^oci&.c^cKc^c*· 3 .................

Ε-» 3333333S53S=:3353 2 ΦΟΦΦΦΦΦΦΦΟΟΦΟΟΦΦ©

fs.*o*-»ciD»-tvr«s.lrt*“SjeKOrs.C«Ors( ^C^OCkO-Ck C^CvC^OC^^CkOOCVO

^ ^ S S

OOOOCDOOOOOOOOOCC* o >

£ *> «Μ lT> n·) CM ^ CD Ο» *-Οβ·- Ot -v»>CM

r^rtll/lOOOOOOinOOO^^eO^O'©} ·· ϋ I ...... ...........

F_4Q_OOOOODOOOOOOOOOOO

cc Q ο·«ρο·ο θοο»οοοοοο |(NQrv^-0 ΟΙΛΟΟ^ CM ^ CM if) o o c ^ ^ 1 Ό €Μ^·Οί*«»»η^·*0^··0^ — ΓΜ»Λ*00··0 I >—I 1-1 + 1+ + +1-----1-^ j I +111+(1 j - - I .§ o^“CM«o^ru^Of^.oo* j ^ ·Ο^ΙΛΌΓμΟ©* ; ω I______ 1 38 92935 rv o o.

O CD ^ J J E~i *1 u e cd N i—1 HO < v »O PV CN co b£ O rv co o- — — o o <L U V. 3 I1

K © *s S £ OO

J CO H o ^ LT\ ^ o* ·- «n m ·- «o »v. g ΙΙΛ cv fr o o r* e* o cv Q · . . ....... *—1 LP\ oo *o e* *- p* «- i—i ♦ H ^

Peflec ececfcflbCfcCäOee M

ζ> ί* U U.UUUUUU 7^ £ < < <<<<<<<! ° cd ...... _ C w

.—. S <=> DOOOOO O ~ P

rrJQO OOODDO O Q

O G. ^ ...... . a 4, ^ G. ~ - - Q. c -P Cfl CÖ .3 φ x: ° ® ® ® ® ® ° ® x -h »r—;, O — O f7-< v_ £ &, P, k k P, t. P, Ch g ,¾ — oo^omocooo c3 Q5 VC O o o. O O O Cv O* O C s^4 • ♦ · · · * · · · * c o O — tM — — C^ — CO Q_, -X Gj n ^ 3333333333 40 Cd Ξ , ®a>CCff©CCC C CQ r* i—· cd i—i 2> g o ^ cd -......... c x‘ 2 0-1 'OCvrs.^-^-iO^O^^Oo · i~ I J .p-j

0&»CvOOOCvCvc>*0 Gj X4O

.......... _ O) C 1—I s.

•H O *rH

,f~* ** r I

^ 00

OOGOOOOOOO dd S

ö [“ ' X x) -=r ij > . w 3 -> 3

G «3 3 o jO

Cd 00· r* » ir> O »ocscsixo r-HC/D

Oi O H.λ

»-J^-i·········· »Cd CO

E-»Dd 0000000000 co x o >, CO rH 43

♦H O -H

------- CO .rv £_.

>3 Cd co :S

...... e e e ^ :g

0 03 w -h E

G^Qo.^*o<r&.rv-c*-rv»o C £>i £_< £ ^ — — CM | C4 | |«VtMCM O ^ Icä > - I I I 1 1 I I & ä .- CÖ Φ 1 E X co o <p

•H o — ^«o^mOrvoe» O C\J O CC

(S *

ξ >> X

- < En tl 39 92935

Esimerkki 30 CH,-Tvr-Glv-Glv-Phe-Leu-Ara-CH-,Arq-D-Ala-OH: n synteesi !♦ Z-CH,Arq(Tosl-D-Ala-OBut :n synteesi 3,336 g Z-CH3Arg(Tos)OH:a liuotettiin 20 ml:aan tetrahydrofu-raania. Liuosta jäähdytettiin -30°C:een. Liuokseex? lisättiin 0,77 ml N-metyylimorfoliinia sekä 0,669 ml etyylikloorikarbo-naattia. 5 minuutin kuluttua siihen lisättiin liuos, jossa oli 1,272 g HCl-H-D-Ala-OBut:a sekä 1,16 ml N-metyylimorfoliinia 20 ml:ssa tetrahydrofuraania, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja sitä pestiin peräkkäin NaHC03:n vesiliuoksella ja vedellä. Kuivaksi suoritetun väkevöinnin jälkeen saatiin 4,16 g lasimaista Z-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBut:a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,69 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -15,5° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C29H41N507S: lie:

C H N

. laskettu (%) 57,70 6,85 11,60 määritetty (%) 57,74 6,59 11,31 2. Z-Arg(Tos)-CH,Arq(Tos)-D-Ala-OBut:n synteesi 2,87 g CH3Arg(Tos)-D-Ala-0But:a, joka oli saatu Z-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBut:n katalyyttisen pelkistyksen avulla Pd-C:n läsnäollessa, 3,392 g Z-Arg(Tos)-OH:a sekä 1,188 g N-hydroksibentsot-riatsolia liuotettiin 10 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuokseen lisättiin 1,662 g disykloheksyylikarbodi-imidiä jäähdyttäen Sennalla jäiden avulla, ja seosta sekoitettiin jääkaapissa kahden päivän ajan. Täten muodostunut saostuma poistettiin suodattamalla, ja suodos väkevöitiin. Jäännös puhdistettiin sili- 92935 40 kageelikromatografiän avulla (eluentti: metanoli/kloroformi = 1/20), jotta saatiin 2,04 g lasimaista Z-Arg(Tos)-CH3Arg (Tos ) -D-Ala-OBut:a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,57 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -31,6° (C =* ; metanoli) ,

Alkuaineanalyysi C42H59N9O10S2* lie:

C H N

laskettu (%) 54,65 6,62 13,66 määritetty (%) 54,64 6,48 13,72 3» Z-Leu-Arg(Tos)-CH,Arq(Tos>-D-Ala-OBut :n synteesi 0,629 g Z-Leu-OH:a liuotettiin 15 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Siihen lisättiin 0,261 ml N-metyylimorfoliinia sekä 0,277 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua liuokseen lisättiin 1,76 g HC1·H-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBut:a, joka oli valmistettu pelkistämällä Z-Arg(Tos)-CHjArg(Tos)-D-Ala-OBut:a katalyyttisesti Pd-C:n läsnäollessa, sekä 0,356 ml N-metyylimorfoliinia 15 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin . ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja liuos pestiin NaHC03:n vesiliuoksella sekä vedellä, peräkkäin. Kuivaksi suoritetun väkevöinnin jälkeen saatiin 2,11 g lasimaista Z-Leu-Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Ala-OBut: a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,57 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -36,2° (C * 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C48H70N10OnS2· ^H3COOC2H5: lie:

C H N

41 92935 laskettu (%) 56,06 6,96 13,07 määritetty (%) 56,02 6,85 13,08 4« Z-Phe-Leu-Arq(Tos) -CH3Arq( Tos) -D-Ala-OBut; n synteesi 595 mg Z-Phe-OH:a liuotettiin 15 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Siihen lisättiin 0,219 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,190 ml etyylikloorikarbon^attia. Liuokseen lisättiin 5 minuutin kuluttua liuos, jossa 1,68 g HC1* H-Leu-Arg(Tos) -CH3Arg(Tos) -D-Ala-OBut:a, joka oli valmistettu katalyyttisesti pelkistämällä Z-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBut:a Pd-C:n läsnäollessa, sekä 0,299 ml N-metyylimor-foliinia 15 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin NaHC03:n vesiliuoksella ja vedellä peräkkäin. Liuotin poistettiin tislaamalla, ja jäännökseen lisättiin eetteriä. Dekantoinnin ja sitä seuraavan kuivaksi suoritetun väkevöinnin jälkeen saatiin 1,87 g lasi-maista Z -Phe-Leu-Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -D-Ala-OBut: a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,61 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [o]D = -34,7° (C * 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi ^'57H7jNii012S2‘ C2HsOC2H5 : lie: 0

C H N

laskettu (%) 58,68 7,19 12,34 määritetty (%) 58,66 6,83 12,42 5 . Boc-CH,Tvr (ClTBzl) -Glv-Glv-Phe-Leu-Ara (Tos) -CH-,Arq l Tos) -D-Ala-OBut:n synteesi 969 mg Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-OH:a liuotettiin 12 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Liuokseen lisättiin 0,188 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,163 ml etyylikloo-rikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua liuokseen lisättiin liuos, jossa oli 1,67 g HC1 . H-Phe-Leu-Arg(Tos)-CHjArg(Tos)-D-Ala- 92935 42 OBut:a, joka oli valmistettu pelkistämällä Z-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-D-Ala-OBut:a Pd-C:n läsnäollessa, sekä 256 ml N-metyylimorfoliinia 15 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja liuos pestiin peräkkäin NaHC03:n vesiliuoksella ja vedellä. Liuotin poistettiin tislaamalla vähennetyssä paineessa, ja jäännös kiinteytettiin metanoli/eetterillä, jotta saatiin 2,196 g Boc-CHjTyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -DAla-OBut: a. sp.: 130 - 135°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,61 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -40,7° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C75H102N14O16S2Cl2· 2CH3OH: lie:

C H N

laskettu (%) 55,89 6,70 11,85 määritetty (%) 55,95 6,42 11,78 6. CH,Tvr-Glv-Glv-Phe-Leu-Arq-CH,Arq-D-Ala-OH:n synteesi 200 mg Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg (Tos )-CH3Arg( Tos)-D-Ala-OBut:a liuotettiin 10 ml:aan HF:a -5eC:ssa, siten, että ·. läsnä oli 0,2 ml anisolia, suljetussa fluorivety(HF)-reak- tiolaitteessa. Liuosta sekttettiin 1 tunnin ajan, ja HF poistettiin tislaamalla reaktiojärj' 'telmästä. Jäännös pestiin eetterillä, ja itten se liuote -iin veteen. Liuosta käsiteltiin Amberlite IRA-93:lla (etikkahappotyyppi), ja sitten se jäädytyskuivattiin. 120 mg täten saatua raakaa peptidiä puhdistettiin suurpainenestekromatografiän avulla [Nucleosil 5 C 18, 2<J> x 25 cm, eluoitu 0,05 %:sella (H20/CH3CN:llä, 92:8)], ja se jäädytyskuivattiin, jotta saatiin 60 mg CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Ala-OH: a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,54 92935 43 (butanoli/etikkahappo/pyridiini/vesi, 15:5:5:8)

Optinen kierto: [o]D = -35,1° (C = 0,4, 0,01 N-HCl) M.S. (FAB): 967 ([M+H]+)

Aminohappoanalyysi:

Gly 1,95(2) Leu 1,00(1) Phe 1,00(1)

Arg 0,99(1) Ala 1,01(1) (CH3Tyr:stä ja CH3Arg:stä johtuvia huippuja ei laskettu) ESIMERKKI 31 CH,Tvr-Glv-Glv-Phe-Leu-Ara-CH,Ara-CH,-Ala-OH: n synteesi 1. Z-CH,Arq(Tos)-CH,Ala-OBut:n synteesi 4,508 g Z-CH3Arg(Tos)-OH:a, 1,683 g HCl* CH3Ala-OBut: a, 1,533 g N-hydroksibentsotriatsolia sekä 1,04 ml N-metyylimorfoliinia liuotettiin 10 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuokseen lisättiin 2,144 g disykloheksyylikarbodi-imidiä, jäähdyttäen samalla jäiden avulla, ja seosta sekoitettiin jääkaapissa yön yli.

Täten muodostunut saostuma poistettiin suodattamalla, ja suodos *. väkevöitiin. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, ja liuosta pestiin sitruunahapon vesiliuoksella, NaHC03:n vesiliuoksella ja vedellä peräkkäin. Kuivaksi suoritetun väkevöinnin jälkeen saatiin 4,24 g lasimaista Z-CHjArgJTos)-CH3Ala-OBut:a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,61 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -57,8° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C30H43N5O7S: lie:

C H N

laskettu (%) 58,33 7,02 11,33 määritetty (%) 58,11 6,88 11,41 44 92935 2. Z-Arq(Tos) -CH,Arq(Tos)-CH,Ala-OBut:n synteesi 2,90 g CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut:a, joka oli saatu pelkistämällä Z-CH3Arg(Tos) -CH3Ala-OBut:a katalyyttisesti Pd-C:n läsnäollessa, 3,329 g Z-Arg(Tos)OH:a ja 1,166 g N-hydroksibentsotriatso-lia liuotettiin 10 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuokseen lisättiin 1,359 g disykloheksyylikarbodi-imidiä, jäähdyttäen samalla jäiden avulla, ja seosta sekoitettiin jääkaapissa kahden päivän ajan. Täten muodostunut saostuma poistettiin suodattamalla, ja suodos väkevöitiin. Jäännös puhdistettiin piihappogeelikromatografiän avulla (eluentti: MeOH/CHCl3 = 1/15), jotta saatiin 2,1 g lasimaista Z-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut:a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,46 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = “57,1° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C43H61N,O10S2· 3/2H20:lle:

C H N

laskettu (%) 54,07 6,75 13,20 määritetty (%) 54,10 6,35 13,18 » « 3. Z-Leu-Arq(Tosl-CH,Arq(Tosl-CH,Ala-OBut:n synteesi 247 g Z-Leu-0H:a liuotettiin 10 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Siihen lisättiin 0,102 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,089 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua liuokseen lisättiin liuos, jossa oli 700 mg HC1 . H-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut:a, joka oli saatu Z-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut:n katalyyttisen pelkistyksen avulla, joka suoritettiin Pd-C:n läsnäollessa, ja 0,139 ml N-metyylimorfoliinia 10 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja liuosta pestiin pe- 92935 45 rakkain NaHC03:n vesiliuoksella ja vedellä. Liuotin poistettiin tislaamalla ja jäännökseen lisättiin eetteriä. Dekantoinnin ja sitä seuranneen, kuivaksi saakka suoritetun väkevöinnin jälkeen saatiin 0,86 g Z-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg (Tos)-CH3Ala-OBut:a, joka oli lasimaista.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,48 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen kierto: [a]D = -60,3° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C49H72N10On· C2H5OC2H5: lie:

C H N

laskettu {%) 57,07 7,41 12,55 määritetty (%) 56,83 7,02 12,64 4. Z-Phe-Leu-Arq(Tos)-CH,Arq(Tos)-CH,Ala-OBut:n synteesi 224 mg Z-Phe-OH:a liuotettiin 7 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Siihen lisättiin 0,082 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,071 ml etyylikloorikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua liuokseen lisättiin liuos, jossa oli 640 mg HC1* H-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut:a, joka oli valmistettu pelkistämällä Z-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut:a katalyyttisesti Pd-C:n läsnäollessa, sekä 0,112 ml N-metyyli-morfoliinia 7 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, ja liuos pestiin NaHC03:n vesi-liuoksella ja vedellä, peräkkäin. Liuotin poistettiin tislaamalla, ja jäännökseen lisättiin eetteriä. Dekantoinnin ja kuivaksi saakka suoritetun väkevöinnin jälkeen saatiin 770 mg lasimaista Z-Phe-Leu-Arg(Tos) -CH3Arg(Tos) -CH3Ala-OBut: a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,54 (metanoli/kloroformi, 1:7)

Optinen 92935 46 kierto: [a]D = ~59,6e (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi CjgH^Nj^^Sj· C2H5OC2H5:lle:

C H N

laskettu (%) 58,98 7,26 12,20 määritetty (%) 58,68 6,91 12,24 < 5 . Boc-CH,Tvr (Cl?Bzl) -Glv-Glv-Phe-Leu-Arq f Tos ) -CH,Arq (Tos ) -CH,Ala-OBut:n synteesi 350 mg Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-OH:a liuotettiin 5 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuos jäähdytettiin -20°C:een. Siihen lisättiin 0,068 ml N-metyylimorfoliinia ja 0,059 ml etyylikloo-rikarbonaattia. 5 minuutin kuluttua liuokseen lisättiin liuos, jossa oli 610 mg HC1· H-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos) -D-Ala-OBut:a, joka oli valmistettu pelkistämällä Z-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut :a katalyyttisesti Pd-C:n läsnäollessa, sekä 0,092 ml N-metyylimorfoliinia 6 ml:ssa dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin noin -5°C:ssa 2 tunnin ajan. Väkevöinnin jälkeen jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, ja liuosta pestiin peräkkäin NaHC03:n vesiliuoksella ja vedellä. Väkevöinnin ja sitä seuranneen, metanoli/eetterillä suoritetun kiinteyttämisen jälkeen saatiin 760 mg Boc-CH3Tyr (Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg (Tos) -CH3Arg (Tos) -CH3Ala-OBut: a. sp.: 125-133°C (hajoaa)

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,55 (metanoli/kloroformi, 1:7

Optinen kierto: t«]D = ~56,4° (C = 1, metanoli)

Alkuaineanalyysi C7SH104N14O16S2Cl2· ½C2H50C2H5: lie:

C H N

laskettu (%) 57,06 6,69 11,94 määritetty (%) 56,71 6,46 11,49 6. CH-,Tvr-Glv-Glv-Phe-Leu-Arq-CH,Arg-CH,Ala-OH: n synteesi 92935 47 210 ml Boc-CH3Tyr(Cl2Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg(Tos)-CH3Arg(Tos)-CH3Ala-OBut:a liuotettiin 10 ml:aan HF:a -5°C:ssa, siten että läsnä oli 0,2 ml anisolia, suljetun järjestelmän HF-reak-tiolaitteessa. Liuosta sekoitettiin 1 tunnin ajan, ja sitten HF poistettiin tislaamalla reaktiojärjestelmästä. Jäännös pestiin eetterillä ja liuotettiin veteen. Liuosta käsiteltiin Amberlite IRA-93:lla (etikkahappotyyppi), ja sitten se jäädytyskuivat-tiin. 130 mg täten saatua raakaa peptidiä puhdistettiin suur-painenestekromatografiän avulla [Nucleosil 5 C 18, 2 φ x 25 cm, eluoitu 0,05 %:isella HClilla (H20/CH3CN, 91:9)] sekä jäädytys-kuivattiin, jotta saatiin 50 mg CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-CH3Ala-OH: a.

Ohutlevy- kromatografia: Rf-arvo 0,54 (butanoli/etikkahappo/pyridiini/vesi, 15:5:5:8)

Optinen kierto: [a]20D = -64,7° (C = 0,4, 0,01N-HC1) M.S. (FAB): 981 ([M+H]+)

Aminohappoanalyysi:

Gly 1,92(2) Leu 1,04(1) Phe 1,00(1)

Arg 0,986(1) (CH3Tyr:sta, CH3Arg:sta ja CH3Ala:sta johtuvia huippuja ei laskettu) ESIMERKIT 32-41

Taulukossa 7 esitetyt yhdisteet syntetisoitiin samalla, tavanomaisella nestefaasimenetelmällä kuin esimerkeissä 30 ja 31. Näissä esimerkeissä syntetisoitiin dynorfiini-johdannaisia, jotka olivat muunnetut asemissa 1-3 (Tyr-Gly-Gly), asemissa 4-8 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile), asemissa 4-9 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg), sekä asemissa 4-10 (Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro), vaiheittaisella menetelmällä, aloittamalla synteesi kun- 48 92935 kin peptidin C-terminaalisesta päästä. Sitten johdannaiset asemissa 1 - 3 ja johdannaiset asemissa 4 - 8, 4 - 9 tai 4 -10, kondensoitiin yhteen DCC-HOBt-menetelmällä tai seoshappo-anhydridimenetelmällä. Kaikki suojaavat ryhmät poistettiin fluorivedyllä (HF), ja tuote puhdistettiin preparatiivisella suurpainenestekromatografiällä, käyttämällä käänteisfaasikanta-jaa. Kuvissa 6-8 esitetään vastaavien, suojattujen peptidien synteesien reaktiotiet.

Optisen kiertokyvyn [a]20„ määrityksen tulokset, TLC:n Rf-arvo ja aiottujen, yllä esitetyllä tavalla saatujen peptidien anii-nohappoanalyysien tulokset esitetään taulukossa 8.

li 49 92935

Taulukko 7 ·{

Esimerkki Yhdiste

32 CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH -jArg-1 le-OH

33 CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-Asp-OH

3 4 CH^Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH^Arg-D-Leu-OH

35 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Glu-OH

3 6 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-CH3Ile-OH

37 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-Sar-OH

38 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg=CH3Arg-8-Ala-OH

39 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-Asp-OH

4 0 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CH3Arg-D-Leu-Phe-OH

41 CH3Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-CK3Arg-D-Leu-Arg-D-

Glu-OH

92935 50

+J4-)4->+J-P+J4J-P-l-)-P

:s :J :t :1 :j :j :j :j :: :j φ

n n n n n n n η η η rH

_ o o o o o o o o o o < :: ö ' ^ O' ro ~ w < ω <) r-ι O------------ κ Eh n η :: Φ

O ~ Γ rH

S , » ;; s O' p----------- I m h t: cj :: ~ O < -—· 4->

Ή C\] O

> K> g

cti O

cd -p 5 O — ^ -H ^-------------3 ο λ: J n m :: m

•HP. O

ί e :: q cti -H <H c> 0) co £· — — — ———— tr t-. ^ ο m :: 3 03 E)

. :: I

>? O Q

|-~i “ ' — — —— —1 - —— — —

U

-P

i?-----------2 . O 0, U) _ <

I rH

P N m

>1 «------------rH

H fM M

(ΊΗ 13 0

E O 0 O

O'- ¢3 O Pi 92935 51 4J.P-P-P-P.M4J p p p p p :3 3 :3 :3 :3 :3 3 :3 :3 :3 :3 (3 ¢3 n n n n n n n » n co

<3 <3 (3 O <) () (3 O (3 O O O

03-------------- :: d qj :: j _<3 q to to :o ο oi ^ :3 .a- P W (3 < O------------- f- cO ro E-t to CO :: •1—^ 33 o <-> •H CT, > ro ' ' Γ 3 λ L « o cd p O' O-------------- v; ,H S-4 E-* M to :3 o

•H

P 0) . ** ε 2 ° ® co ·Η <» ---------------ä οι co 1-3 c o m ¢: cp K £0 .

q> οχ: -------------p Ö4 co to :3 3

DO

^ - ° Ή---- Qi O tn <

‘. >i K

r—A " 1 1 1 I " " I - o

I rH

P N

>, m-------------

EH CN

(ΛΗ OP

33 O 0 3 o — __LJ__n n 52 92935 •P 4J 4J -P 4J4-J-P4-I-P-P.IJ4J.U4-> _ ^ :3 :3 :3 3 :3 ;j 3 :3 3 :s 3 :3 3 ·3 ^ 53 53 53 53 η iQ n ¢3 n iq n iq n ^ _O_O_O_O_O_O_<:>_0_O_O_<5_C)., O () • o :: Q ~ ^ * -»

i W O

tT> O--------------- PH C Q c 3 t: 3 :: <d o ---------------- i n to ::

Q

D> p ~ :: < « o ro O----------------- cc K H CJ m :: 0 — o

•H i—I

> -=r :: cö l W C)

Cj ·I 1 O' O —' *— - ------ -il — _ _______ .___ _ _ - PH c] n E’ O Ssi < ^ •H Sh -p a> s:

-^5 3 O

ai -h ------------------- Φ PJ r) m 13 CU] -. ::

St o £l--------— —— . _ °* ci m :: s*______________<>__

: · O

>1 pH — — — — —— i . i — — , —. . - - - - - o

1 -—I

P N

>1 ---------------------- H rN i) o

Jp Tl o<i * ^ n d li 92935 53 O O O O O O O 0(0 o oooooooooo

'—I <—I'—I r-il—Il—| I—i i—IfNJi—I

to i > <1) 0) tl) 0) <D Q) 0) U <D 11) l < jz x: jz jz jz jz jz jz jz jz

j ,—CU Cu CU CU CU CU CU CU CU CU

l cZ

I £ ^ ^ *· ^ ·*· ** ** V -» [^LncnoNr-tLO ο.—ιγ' r-< i—i ooor-i r^i—i , q O CT> CTi O CTi O O O) O O CTi o o cd o

'p »-tOOl—Il—I I—Il—ΙΟ 1—I I—l r—I r—| (N iH r—I

I ® 3 Hl D Q. 3 p P p p p P Q, P P P

O Φ Ή tl) t/) d) tl) '—I 0) (1) 0) QJ 00 Cl) 0) I—I

^ O vJ j JCJ J U

•H

* *» * ·» <* V 1. *.«**. N N

<ζ \£>r-H UD cr\ m CTi Γ0Ο LT) <D p** O Or-ί KD O ΓΟ<Χ» \£> CTi o o cr> o &\ &\ (T\ o en σι o eri o cr> o ^ σ»α>

Ή Γ l Ή O > i O r“l i-ί r—f O iH r“H ι-W r—i rH »H rU O rH rH

NO) >i 0) NO) NO) NO) NO) NO) NO) NO> NO) ] ·—I M —· l-ι Ή ^ f—I V-t r—I >H rH )-i >—t Μ Ή Μ Ή Ih rH Vh co j Ο < O < O < (J <C (J < LD < O «< (J < OC O <

8 I

= j g t—I r

CTj^rn 00 CD r-l n rH CD 00 O rH

E-^'cDtTCOlOCDLOlOLDr-'LO UH . . . . . . . . . .

cdoooooooooo

U

1-1

Eh

OvD^rTroOrHcnrNvoooo (N Q · —I OincMor-rocriooino 0>-Η00Γ0Γ0)Ο(ΝΓΜ(»ΓΜη '—'1111111 ill

H

λ: s-,

CL) OH ΟΊ rr lD CO Γ-~ OOCDOrH

E. rornmromrororoTr'T

•H

09 w

Aminohappoanalyysissä laskettiin ainoastaan aminohappojen Gly,

Leu, Phe, Arg, Ile, Asp ja Glu suhteet.

,4 92935 54 [cc]20d :n määrittäminen; C = 0,4, 0,01N-HC1 TCL·Rf-arvon määrittäminen; butanoli/etikkahappo/pyridiini/vesi = 15:5:5:8

Seuraavat esimerkeissä saadut yhdisteet tutkittiin samalla tavalla kuin yllä on kuvattu.

Taulukko 9 Hännännipi s tysmenetelmä (ED50, mg/kg) i.v. s.c.

Esimerkki 30 0,7 1,9 31 0,5 1,2 34 2,1 0,9 36 0,2 0,4 38 1,7 0,6

Dynorfiini (1-13) >25,0

Taulukko 10

Kaniinin siemen-j ohdinmenetelmä IC50 (nM)

Esimerkki 30 17,8 31 24,5 36 11,2

Dynorfiini A (1-17) 17,4

Taulukko 11

Testiyhdiste Hännännipistys- Pienin tappava menetelmä annos ED50 (mg/kg) (mg/kg)

Esimerkki 30 1,9 >100 31 1,2 >100 36 0,4 >100

Claims (2)

1. 55 92935