PL104362B1 - Sposob wytwarzania polipeptydow - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydów wykazujacych dzialanie agonistyczne do luliberyny. „Luliberin" jest miedzynarodowa nazwa zwyczajowa czynnika uwalniajacego hormon luteinizujacy, oznaczonego LH-RF (J. Biol. Chem. 1975, 250, 3215).Znany jest fakt, ze jezeli w luliberynie w po¬ zycji 6 lub 10 podstawi sie a-aza-aminokwas to wytworzone zwiazki wykazuja mniejsza aktyw¬ nosc uwalniania hormonu luteinizujacego (LH) z przysadki mózgowej niz zwiazek pierwotny.Obecnie stwierdzono, ze jednoczesne podstawienie azaglicyny w pozycji 10 i podstawienie róznorod¬ nych D-a-aminokwasów w pozycji 6 luliberyny albo podstawienie azaglicyny lub azaalaniny w po¬ zycji 6 i zastapienie koncowego amidu glicyny grupa etyloaminowa w luliberynie prowadzi do zwiazków aktywniejszych od luliberyny jako czyn¬ nika uwalniajacego LH.Polipeptydy wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku objete sa wzorem Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -A-B-Arg-Pro-E-F, w którym A oznacza D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(But), D-Phe, D-Ala lub D-Trp, B oznacza Leu lub MeLeu, E oznacza Azgly, a F oznacza grupe aminowa albo A oznacza Azgly lub Azala, B oznacza Leu, E oznacza bezposrednie wiazanie, a F oznacza grupe etyloaminowa, przy czym powyzszy wzór obejmuje te zwiazki równiez w postaci soli addycyjnych z kwasami. 2 Wystepujace w niniejszym opisie reszty amino- kwasowe zostaly oznaczone standardowymi skró¬ tami wg „Pure and Applied Chemistry" 1974, 40, 317—331 (nomenklature polska stosowano wg pu¬ blikacji „Polskie slownictwo biochemiczne" pod redakcja A. Morawieckiego, PWN 1974).Reszta a-aza-aminokwasowa oznacza reszte ami¬ nokwasu, w którym czlon a-CH zostal zastapiony atomem azotu. Symbol a-aza-aminokwasu tworzy sie przez dodanie przedrostka „Az" do symbolu odpowiedniego aminokwasu. Tak wiec Azgly ozna¬ cza azaglicyne, a Azala oznacza azalanine. Amino¬ kwasy, przy których nie zaznaczono w opisie ich konfiguracji, maja naturalna konfiguracje L (nie dotyczy to a-aza-aminokwasów, które nie maja centrum asymetrii przylegajacego do grupy karbo¬ ksylowej).Do korzystnych zwiazków wytwarzanych w spo¬ sób wedlug wynalazku, naleza zwiazki o wyzej podanym wzorze, w którym A oznacza D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(But), D-Phe, D-Ala, lub D-Trp, B oznacza Leu lub MeLeu, E oznacza Azgly i F oznacza grupe aminowa.Korzystniejsza grupa zwiazków wytwarzanych w sposób wedlug wynalazku obejmuje te zwiazki, w których A oznacza D-Tyr(Me), D-Ser(But) lub D-Phe, B oznacza Leu lub MeLeu, E oznacza Azgly i F oznacza grupe aminowa. 104 362104 362 3 Trzy najkorzystniejsze zwiazki wytwarzane w sposób wedlug wynalazku maja nastepujace wzory: Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro- -Azgly-NH2 Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr(Me)-Leu-Arg-Pro- -Azgly-NH2 Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro- -Azgly-NH2 Korzystnymi dopuszczalnymi farmaceutycznie so¬ lami zwiazków Wytwarzanych w sposób wedlug wynalazku sa, na przyklad, chlorowodorek, fosfo¬ ran, cytrynian ioctan. 15 Wedlug wynalazku, sposób wytwarzania polipep- tydów o ogólnym wzorze Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -A-B-Arg-Pro-E-F, w którym A, B, E i F maja wyzej okreslone znaczenia, polega na tym, ze z chronionego polipeptydu usuwa sie jedna lub 20 wiecej typowych grup ochronnych z wytwarza¬ niem zwiazku o wzorze Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A- -B-Arg-Pro-E-F.Zwiazek wyjsciowy moze zawierac tyle grup ochronnych, ile jest grup wymagajacych ochrony, 25 to znaczy np. niektórych lub wszystkich wolnych grup OH lub zasadowych grup NH.Grupami ochronnymi moga byc grupy opisane w literaturze dotyczacej chemii peptydów, np. M. Bodansky i M. A. Ondetti „Peptide Synthe- 30 sis" Interscience, New York, 1966, rozdz. IV, F. M. Finn i K. Hofmann. „The proteins", tom II, wydany przez H. Neurath i R. L. Hill, Academic Press Inc., New York, 1976, str. 106, „Amino-acids, Peptides and Proteins" (Specialist Periodical Re- 35 ports), The Chemical Society, London, tomy 1—8.W powyzszej literaturze opisane sa takze rózne metody usuwania grup ochronnych.Szczególnie odpowiednia grupa ochronna dla NH jest grupa benzyloksykarbonylowa, a dla OH gru- M pa benzylowa. Obie te grupy mozna latwo usunac przez wodorolize, np. w obecnosci katalizatora pallad na weglu.Inna odpowiednia grupa, zabezpieczajaca dla NH jest grupa IHrz.-butoksykarbonylowa, a dla OH _ grupa IHrz.-butylowa. Obie te grupy mozna latwo usunac dzialaniem chlorowodoru lub kwasu trój- fluorooctowego. Grupy zabezpieczajace odpowied¬ nie dla NH jak benzyloksykarbonylowa, lub Illrz.-butoksykarbonylowa, a dla OH Hlrz.-butylo wa mozna latwo usunac, dzialajac roztworem bro mowodoru w kwasie octowym.Zwiazki wyjsciowe stosowane w sposobie wedlug wynalazku mozna wytworzyc ze zwiazków zna¬ nych, stosujac znane w praktyce peptydowej typo¬ we reakcje sprzegania peptydów, wprowadzania 55 grup ochronnych i ich usuwania z peptydów, np. jak opisano w przytoczonych przykladach I i II.Jak wyzej wspomniano, nowe zwiazki wykazuja dzialanie agonistyczne do luliberyny, to znaczy 60 nasladuja dzialanie luliberyny naturalnego hormo¬ nu wydzielanego przez podwzgórze, pod wplywem którego przysadka mózgowa wydziela hormon lu- teinizujacy (LH) i hormon folikostymulujacy (FSH).Te dwa hormony sa niezbedne do regulacji cyklu 95 50 plciowego. FSH pobudza dojrzewanie pecherzyków jajników, natomiast LH pobudza jajeczkowanie.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze zwiazki o wzorze Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, w którym A, B, E i F maja wyzej okreslone zna¬ czenia, sa aktywniejsze od luliberyny jako czynnik uwalniajacy LH i dzieki temu moga byc stosowa¬ ne do regulacji i/lub poprawy reprodukcji zwie¬ rzat. Zwiazki te znajduja szczególne zastosowanie przy reprodukcji duzych zwierzat hodowlanych w okresie bezrujowym (anoestrus) i przy sztucz¬ nym zapladnianiu do dokladnej regulacji czasu ja- jeczkowania. Zwiazki te moga miec zastosowanie do poprawy stanu bezplodnosci u mezczyzn i ko¬ biet.Agonistyczne do luliberyny dzialanie zwiazków wytwarzanych wedlug wynalazku mozna wykazac na przyklad w tescie na wywolywanie jajeczko- wania u sterylizowanych androgenem samic szczu¬ rów w utrzymujacej sie fazie rujowej albo na uwalnianie LH i FSH, do osocza krwi u niedojrza¬ lych samców szczurów lub do osocza krwi u sa¬ mic w fazie anoestrus lub dioestrus. Powyzszy test na sterylizowanych androgenem szczurach przepro¬ wadza sie w nastepujacy sposób: Sterylizowane androgenem samice szczurów przygotowuje sie podajac im w 3, 4 i 5 dniu zycia 100 [xg propionianu testosteronu. Samice te maja utrzymujace sie rozmazy pochwowe fazy rujowej oraz liczne przedowulacyjne pecherzyki nasienne w jejnikach. Podanie luliberyny i jej aktywnych analogów powoduje uwolnienie LH i FSH w ilosci wystarczajacej do spowodowania jajeczkowania, mozna stwierdzic na podstawie obecnosci ja¬ jeczka w jajowodzie i swiezego cialka zóltego w jajnikach.Wszystkie zwiazki podane w niniejszym opisie wykazuja wyzsza aktywnosc od luliberyny w wy¬ wolywaniu jajeczkowania u samic szczurów w utrzymujacej sie fazie rujowej, a oprócz tego zwiazki te nie wykazuja dzialania toksycznego w dawce co najmniej czterokrotnie wyzszej od mi¬ nimalnej dawki skutecznej.Korzystne zwiazki wedlug wynalazku, opisane w przykladach VI, VIII i IX, sa w przyblizeniu stukrotnie aktywniejsze od luliberyny i nie wyka¬ zuja dzialania toksycznego przy podaniu w dawce stukrotnie wiekszej od ich minimalnej dawki sku¬ tecznej.Polipeptydy wytworzone sposobem wedlug wy¬ nalazku moga byc stosowane w postaci srodka farmaceutycznego lub weterynaryjnego, w którym wystepuja jako substancja czynna lacznie z odpo¬ wiednim dopuszczalnym farmaceutycznie lub we¬ terynaryjnie rozcienczalnikiem lub nosnikiem.Srodek farmaceutyczny moze byc na przyklad w postaci odpowiedniej do podawania doustnego, np. w postaci tabletek, kapsulek, roztworu lub za¬ wiesiny, w postaci do podawania do nosa, np. w postaci proszku do wachania, jako spray lub krople do nosa, w postaci do podawania dopoch- wowego lub doodbytniczego, np. w postaci czop¬ ków albo w postaci do podawania pozajelitowego, np. w postaci jalowego roztworu lub zawiesiny do wstrzykiwan.104362 Powyzsze srodki farmaceutyczne mozna przygo¬ towac w standardowy sposób, stosujac typowe do¬ datki. Jednak w przypadku srodka do podawania doustnego moze byc korzystne, aby zawieral on odpowiednie powleczenie zabezpieczajace polipep- tydowa substancje czynna przed dzialaniem enzy¬ mów w zoladku.Srodek farmaceutyczny obok omawianego poli- peptydu moze zawierac dodatkowo jeden lub wie¬ cej znanych srodków leczniczych z grupy pochod¬ nych prostaglandyn, takie jak prostaglandyna F^a, cloprostenol lub fluprostenol albo inny lek jak clomiphene lub tamoxifen.Korzystna postacia srodka farmaceutycznego, za¬ wierajacego jako substancje czynna polipeptyd wytworzony sposobem wedlug wynalazku, jest postac do podawania doustnego, jak tabletki, kapsulki, wlewki doustne dla zwierzat lub pigulki, zawierajace dawke 2,5—500 mg, korzystnie —100 mg polipeptydu, albo postac do podawania pozajelitowego, zawierajaca od 5 pg do 1 mg poli¬ peptydu w mililitrze, korzystnie 10 pg—100. g poli¬ peptydu w mililitrze roztworu. 1 Srodek do podawania pozajelitowego korzystnie stanowi roztwór polipeptydu w izotonicznym roz¬ tworze soli lub w izotonicznym roztworze dekstro- zy, zbuforowanym w razie potrzeby do pH 5—9.Alternatywnie, srodek do podawania pozajelitowe¬ go moze byc w postaci o przedluzonym dzialaniu i w tym przypadku dawka jednorazowa bedzie wieksza niz w typowym preparacie do wstrzyki- wan. Srodek o przedluzonym dzialaniu do poda¬ wania pozajelitowego korzystnie zawiera od 100 fig do 1,0 mg polipeptydu w pojedynczej dawce.Srodek farmaceutyczny, zawierajacy jako sub¬ stancje czynna polipeptyd wytworzony w sposób wedlug wynalazku, normalnie powinien byc poda¬ wany tak, aby doustna dawka dzienna wynosila od 50 fig/kg do 20 mg/kg wagi ciala, a pozajelito¬ wa dawka dzienna, np. podana dozylnie, podskór¬ nie lub domiesniowo, przez* strzykniecie lub wlew¬ ke, wynosila od 0,2 /*g/kg do 100 ^g/kg. Dla ludzi dawki te odpowiadaja dawce dziennej wynoszacej od 3,5 mg do 1,4 g przy podaniu doustnym i od 14 fig do 7 mg przy podaniu pozajelitowym.W przypadku podawania przez blony sluzowe sto¬ suje sie dawke posrednia miedzy wyzej podana dawka doustna i dawka pozajelitowa.Wynalazek ilustruja nizej przytoczone przyklady.W przykladach tych Rf dotyczy wstepujacej chromatografii cienkowarstwowej na plytkach z zelem krzemionkowym (Kieselgel G). Jako ukla¬ dy rozwijajace w tej chromatografii stosowano na¬ stepujace mieszaniny: butanol-/kwas octowy/woda 45 w stos. obj. 4:1:5 (RfA), butanol-1/kwas octowy/ /woda/pirydyna w stos. obj. 15 : 3 :12 :10 (RfB), butanol-2/3% wag./obj. wodny roztwór amoniaku w stos. obj. 3:1 (RfC), acetonitryl/woda w stos. obj. 3 :1 (RfD), aceton/chloroform w stos. obj. 1:1 (RfE), chloroform/etanol w stos. obj. 1:4 (RfF), cykloheksan/octan etylu w stos. obj. 1 :1 (RfG), cykloheksan/octan etylu/metanol w stos. obj. 1:1:1 (RfH), chloroform/metanol/woda w stos. obj. 11:8:2 (RfK), chloroform/metanol w stos. obj. 19 :1 (RfP), chloroform/metanol w stos. obj. 9 :1 (RfQ). We wszystkich przypadkach plytki kontro¬ lowano w swietle ultrafioletowym i traktowano fluoreskamina, ninhydryna i odczynnikiem chlo- ro-jodo-skrobiowym. Jesli nie podano inaczej, po¬ dana wartosc Rf odnosi sie do pojedynczej plamy wywolanej tymi metodami.Hydrolizaty kwasowe wszystkich zwiazków, opi¬ sanych w tym opisie wytworzono przez ogrzewa¬ nie peptydu lub chronionego peptydu z 6N kwa¬ sem solnym zawierajacym 1% wag./obj. fenolu w zatopionej rurze prózniowej, w temperaturze 100°C, w ciagu 16 godzin. Sklad aminokwasów kaz¬ dego hydrolizatu okreslano za pomoca analizatora aminokwasów „Locarte Aminoacid Analyser" i w kazdym przypadku uzyskano przewidywane sklady aminokwasów. Stosowane w przykladach okreslenie „przerobiono w zwykly sposób" ozna¬ cza, ze po reakcji stala pozostalosc odsaczono, przesacz odparowano do sucha w temperaturze po¬ nizej 40°C, otrzymana pozostalosc przeniesiono do octanu etylu, przemyto 20% roztworem kwasu cy¬ trynowego, woda, nasyconym roztworem kwasnego weglanu sodowego i woda, nastepnie osuszono bezwodnym siarczanem sodowym i odparowano octan etylu pod zmniejszonym cisnieniem otrzy¬ mujac zadany zwiazek.Przyklady I—IJ. Wytwarzanie amidu L-pi- roglutamylo- L- histydylo- L- tryptofilo- L- sery- lo-L- tyrozylo- A-B-L- arginylo-L- prolilo- aza- glicyny 50 mg chronionej pochodnej dekapeptydu, zawie¬ rajacego Ser(But) w pozycji 6 lub TyrfBu*) w po¬ zycji 5, rozpuszczono w 5 ml 90% obj. uwodnione¬ go kwasu trójfluorooctowego, dodano trzy krople /?-merkaptoetanolu i roztwór pozostawiono na 45 minut. Nastepnie usunieto rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem, a otrzymana pozostalosc odparowywano ze stanu zamrozonego raz z woda i dwukrotnie z IHrz.-butanolem. Wyniki zestawio¬ no w tabeli 1, przy czym wydajnosci wynosily: w przykl. I — 95%, a w przykl. II — 46%.Tabela 1 Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F Przy¬ klad I II A D-Ser D-Phe B Leu MeLeu E Azgly Azgly F NH, Elektroforeza bibulowa Rf (w stos. do luliberyny) pH2,l 0,94 0,84 pH 6,5 0,96 0,87 RfA 0,25 0,35104 362 Zwiazki wyjsciowe stosowane w sposobie wedlug wynalazku mozna wytworzyc wedlug nizej za¬ mieszczonych schematów 1 i 2.W schematach zastosowano nastepujace oznacze¬ niaskrótowe: 5 But — IIIrz.-butyl Ocp — 2,4,5-trójchlorofenoksy 8 Bzl — benzyl Z — benzyloksykarbonyl Boc — Illrz.-butoksykarbonyl DMF — dwumetyloformamid Cyfry w nawiasach oznaczaja poszczególne, da¬ lej opisane, etapy, które nalezy przeprowadzic.Glu E[is T (3) rp Ser Tyr A Leu Arg z— Z- z- z- NHNH2 Z— N3 H- Z- Z- Bzl —OCp H- Bzl (6) Bzl (7) Bzl (8) T Bzl ;9) OH H- (4) (8) (5) (10) (12) (13) (14) (15) OMe OMc OMc OMc NTTNH„ 1STTT TT iNrij n N02 N02 Pro H+ H+ (2) Azgly ] l ] i ¦NH2 -NH2 -NH2 -NH2 A = D — Ser(But) Schemat 1 Glu His Trp Ser Tyr D-Phe MeLeu Arg Pro Azgly (3) NHNH2 -N, Z- z— Z— Z— z- H- Z- z— But OH H- But But But But But But OH H- (16) (17) (18) (19) (20) (21) Schenlat 2 OMe mvi OMr om NHNH2 "MTT TT N02 H+ H+ H+ (2) "MTT XTTJ INxl2 MTT iNn2 "NTTT 1N±12104 362 9 10 Etap 1. Pochodna N-III-rzed.butoksykarbonylo- wa rozpuszczono w octanie etylu, zadano 3N kwa¬ sem solnym (4 równowazniki) i odstawiono na go¬ dzine w temperaturze pokojowej.Etap 2. Jak etap 1.Etap 3. 5,4 milimola estru metylowego L-piro- glutamylo-L-histydylo-L-tryptofilo-L-seryny roz¬ puszczono w 70 ml dwumetyloformamidu i podda¬ no reakcji ze 100 milimolami wodzianu hydrazyny w ciagu 4 godzin. Nastepnie oddestylowano dwu- metyloformamid pod zmniejszonym cisnieniem, a otrzymana pozostalosc utarto z etanolem, odsa¬ czono, przemyto etanolem i eterem, a nastepniex osuszono. Otrzymano 88,2% wydajnosci produktu o temperaturze topnienia 184—189°C i RfA 0,18, RfB 0,55, RfC 0,39, RfD 0,27, RfK 0,58.Etap 4. [A = D-Tyr(Me)]. Do roztworu 3,17 g (9,64 mmola) Z-D-Tyr-(Me)-OH, 192 g (10,6m mo¬ la) Leu-OMe-HCl, 2,6 g (19,2 mmola) 1-hydroksy- benzotriazolu w 30 ml dwumetyloformamidu, schlo¬ dzonego do temperatury 0°C, dodano 2,29 g (11,1 mmoia) N^-dwucykloheksylokarbodwuimidu. Ca¬ losc mieszano w temperaturze 4°C przez noc, a na¬ stepnie przerobiono w zwykly sposób.4 Produkt przekrystalizowano z goracego cykloheksanu.Otrzymano 1,41 g (95,2%) zabezpieczonej pochod¬ nej dwupeptydu o RfD 0,83, RfE 0,69, RfP 0,72, RfQ 0,76.Etap. 5. [A = D-Tyr(Me)]. Redukcja katalityczna na 5% wag./wag. palladzie na weglu, w mieszani¬ nie metanol/dwumetyloformamid/woda 8:1:1, za¬ wierajacej 1,2-równowaznika chlorowodoru, w cia¬ gu trzech godzin.Etap 6. [A = D-Tyr(Me)]. Roztwór 8,2 mmola Z-Tyr/Bzl-OCp i 8,2 mmola D-Tyr(Me)-Leu-OMe- -HC1 i 8,2 mmola trójetyloaminy w 60 ml dwu- metyloformamidzie mieszano w temperaturze po¬ kojowej przez noc, po czym mieszanine reakcyjna przerobiono w zwykly sposób. Produkt przesaczo¬ no z eterem, przemyto eterem i wysuszono. Wy¬ dajnosc 81,2% produktu o temperaturze topnienia 191—192°C i RfD 0,85, RfE 0,73, RfF 0,72, RfQ 10,78.Etap 7. [A = D-Tyr(Me)]. 12,9 milimola wódzia^ nu hydrazyny dodano do roztworu 4,59 g (6,4 mo¬ la) Z-Tyr-Bzl/-D-Tyr(Me)-Leu-OMe w mieszani¬ nie 25 ml dwumetyloformamidu i 50 ml metanolu i calosc pozostawiono w temperaturze pokojowej na noc. Nastepnie oddestylowano metanol pod zmniejszonym cisnieniem i wytracono produkt woda. Produkt odsaczono, przemyto woda i wy¬ suszono. Otrzymano zwiazek o temperaturze top-; nienia 212—213°C i RfE 0,49, RfF 0,66, RfH 0,69, RfQ 0,70.Etapy 8 i 9. [A = D-Tyr(Me)]. 3,54 g (5,0 mmoli) hydrazydu wytworzonego w etapie 59 rozpuszczo¬ no w 10 ml dwumetyloformamidu i otrzymany roztwór schlodzono przy mieszaniu do temperatury —20°C, po czym dodano 3,38 ml 5,92 M roztworu chlorowodoru (20 mmoli) w dioksanie, a nastepnie 0,6 ml (5,25 mmola) azotynu Illrz.-butylu. Po dwóch minutach dodano schlodzony roztwór 2,04 g (5 mmoli) H-Arg(N02)-Pro-Azgly-NH2: HC1 i 3,55 ml (25 mmoli) trójetyloaminy w 10 ml dwu¬ metyloformamidu i calosc mieszano w tempera¬ turze 4°C przez noc. Mieszanine reakcyjna przero- 45 55 65 biono w zwykly sposób i otrzymany surowy pro¬ dukt oczyszczono metoda chromatografii kolumno¬ wej na zelu krzemionkowym, stosujac jako elu- enty 5% obj./obj. i 10% obj./obj. roztwór metano¬ lu w chloroformie. Otrzymano 3,72 g (70,9%) pro¬ duktu o RfA 0,64, RfB 0,72, RfC RfF 0,40, RfH 0,52.Etap 10. [A = D-Ser(But)]. Jak etap 4. Produkt krystalizowano z uwodnionego metanolu. Wydaj¬ nosc 90,4% produktu o temperaturze topnienia 107—108°C i RfD 0,80, RfE 0,68, RfF 0,73, RfH 0,72, RfP 0,72, RfQ 0,74.Etap 11. [A = D-Ser(But)]. Redukcja katalitycz¬ na na 5% wag./wag. palladzie na weglu, w mie¬ szaninie dwumetyloformamid/woda 8 : 2, w ciagu godzin.Etap 12. [A = D-Ser(But)]. Rozwór 19,17 g (32,7 mmola) Z-Tyr(Bzl)-OCp i 32,7 milimola H- Ser(But)-Leu-OMe w 100 ml dwumetyloformami¬ du pozostawiono w temperaturze pokojowej na 72 godziny. Nastepnie mieszanine przerobiono w zwy¬ kly sposób otrzymujac osad, który zebrano, prze¬ myto eterem i wysuszono. Otrzymano 17,6 g (79,4%) produktu o temperaturze topnienia 135— 137°C i RfD 0,80, RfH 0,77, RfQ 0,81.Etap 13. [A = D-Ser(But)]. Jak etap 7. Produkt krystalizowano z uwodnionego metanolu. Otrzy¬ mano 56,2% wydajnosci produktu o temperaturze topnienia 134—136°C i JtfD 0,66, RfH 0,64, RfQ 0,64.Etapy 14 i 15. [A = D-Ser(But)]. Jak etapy 8 i 9. Produkt oczyszczono metoda chromatografii kolumnowej na zelu krzemionkowym, stosujac ja¬ ko eluenty chloroform i 5% obj./obj. roztwór me¬ tanolu w chloroformie. Otrzymano produkt z 38,5% wydajnoscia o temp. top. 142—145°C; RfA 0,64, RfB 0,71, RfC 0,55, RfD 0,65, RfF 0,46, RfH 0,43 i Rf 0,16.Etap 16. Do mieszanego i chlodzonego do tempe¬ ratury —15°C roztworu 5,99 g (20 mmoli) Z-Phe- -OH i 2,2 ml (20 mmoli) N-metylomorfoliny w 60 ml dwumetyloformamidu dodano 1,8 ml (18 mmoli) chloromrówczanu etylu. Po dwóch minu¬ tach dodano schlodzony do temperatury —15°C roztwór 4,8 g (20 mmoli) H-MeLeu-OMe-HBr i 2,8 ml (20 mmoli) trójetyloaminy w 20 ml dwu¬ metyloformamidu i calosc mieszano w tempera¬ turze 0°C w ciagu 30 minut -i w temperaturze po¬ kojowej przez noc. Nastepnie mieszanine reakcyj¬ na przerobiono w zwykly sposób. Otrzymano 7,54 g (90%) produktu w postaci.pleju.Etap 17. Redukcja katalityczna na 5% wag. palladzie na weglu, w metanolu zawierajacym 1 równowaznik chlorowodoru, w ciagu trzech go¬ dzin.Etap 18. Postepujac jak w etapie 74 przeprowa¬ dzono sprzeganie 16,02 g (43,2 mmola) Z^Tyr(But)- -OH i 13,15 g 40,0 mmoli) H-D-Phe-MeLeu- -Ome • HC1. Produkt oczyszczono metoda chroma¬ tografii kolumnowej na zelu krzemionkowym, sto¬ sujac jako eluent 5% obj. roztwór metanolu w chloroformie. Otrzymano 60% wydajnosci pro¬ duktu w postaci oleju o RfG 0,48, RfP 0,71, RfQ 0,73.Etap 19. Roztwór 6,52 g (9,76 mmola) Z-Tyr(But)-104 362 11 -D-Phe-MeLeu-OMe i 97,6 milimola wódziami hy¬ drazyny w 50 ml metanolu pozostawiono w tem¬ peraturze pokojowej przez noc. Nastepnie oddesty¬ lowano metanol pod zmniejszonym cisnieniem i otrzymany hydrazyd przekrystalizowano z mie¬ szaniny metanol/wola. Produkt przemyto miesza¬ nina metanol/woda w stos. obj. 1:1 i eterem, po czym wysuszono. Otrzymano 5,2 g (80%) hydra¬ zydu o temperaturze topnienia 135°C, RfD 0,75, RfE 0,69, RfF 0,66, RiH 0,79, RfQ 0,73. 12 Etapy 20 i 21. Jako etapy 8 i 9. W czasie prze¬ róbki produkt wytracil sie z octanu etylu. Osad odsaczono, przemyto octanem etylu i eterem, po czym wysuszono. Otrzymano 58,5% wydajnosci produktu o temperaturze topnienia 145—148°C i RfD 0,72, RfF 0,40, RfH 0,53, RfQ 0,18.Przyklady III—XII. Postepowano podobnie jak opisano w przykladach I i II, i otrzymano zwiazki zestawione w tabeli 2.Tabela 2 Glu-His-Trp-Ser-A-B-Arg-Pro-E-F Przy¬ klad III IV V VI VII VIII IX X A Azgly Azala D-Ala D-Phe D-Trp D-Tyr(Me) D-Ser(But) D-Tyr(Me) B Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu MeLeu E Azgly Azgly Azgly Azgly Azgly Azgly F NHC2H5 NHC2H5 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 Elektroforeza bibulowa Rf (w stosunku do luliberyny) pH 2,1 | pH 6,5 0,98 0,97 0,97 1,0 0,53 0,92 0,94 0,87 1,03 1,0 1,0 0,71 0,37 0,87 0,96 0,90 RfA 0,28 0,30 0,30 0,27 0,37 0,25 0,25 0,34 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.