DE2720245A1 - Polypeptide - Google Patents

Description

PRIORITÄT: 11. Mai 1976 - Großbritannien - 19327/76

Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, welche Luliberinagonisteigenschaften besitzen. Luliberin ist der international übliche Trivialname für LH-RF (luteinising hormone releasing factor) (J. Biol. Chem., 1975, 250, 3215).

Es ist bekannt (Dutta, Furr, Giles und Morley, Clinical Endocrinology, 1976, j>, Ergänzung, S. 291s-298s), daß der Einbau von './.-Azaaminosäuren an der 6- oder ΙΟ-Stellung von

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Banivtrcir dung _: Bcver. Vereirubank München, Konto 6ΙΌ 404 ■ Poirsditckkonlc ■ München 270 44-602

Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich uv Trcisot zu ng von Luteiniaiorungshornion (LH) aus der !'vpe: r.yse weniger kräftig sii. . als das Ausgangsmolc-küi. ils wuru.· nunmehr gefunden, daß der Einbau von Azaglycin an der 1C-Steilen-· in Verbindung mit dem Einbau verschiedener D- ■ -Air. ir.osäurer; an der 6-Stellung in Luliberin oder der Einbau von A^agiycin odor Azalanin an der 6-Stellung in Verbindung mit den Ersatz des endständigen Glycinamids durch ein Äthylamir.oradikal in Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon aktiver sind als Luiiberin.

Gemäß der Erfindung werden also Polypeptide der E'ormol ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-3-Arg-Pro-E-F I

worin A für D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu ), D-Phe, D-AIa oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly stehi und F für ein Aminoradikal steht, oder A für Azgly oder Azala steht, B für Leu steht, E für eine direkte Bindung stehe und F für ein A'thylaminoradikal stehe, sowie die pharmazeutisch und Veterinär zulässigen Säureadditionssalze davon vorgeschlagen.

In der obigen Formel I und in der gesamten Beschreibung werden die Arninosäurereste durch ihre Standardabkürzungen (Pure ar.d Applied Chemistry, 1974, 40, 317-331) bezeichnet. Ein \-Aza-arainosäurerest ist ein solcher, in welchem das -CH einer Aminosäure durch Stickstoff ersetzt worden ist. Die Abkürzung für eine >.-Aza-aminosäure leitet sich von der entsprechenden Aminosäure durch Hinzufügung der Vorsilbe "Az" ab. Somit steht Azgly für Azaglycin und Azaia für Azalanin.

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V.c.'iii die Konfiguration der betreffenden Aminosäure nicht ana». je L cn ist, dann besitzt diese Aminosäure (außer der

-Aza-atiiinosäuren, die in der Nachbarschaft der Carboxylate kein asymmetrisches Zentrum enthalten) die natdrlicho L--Kor, f ig ur a tion.

Spezielle Gruppen von Verbindungen innerhalb der Erfindung sind die folgenden:

Verbindungen, worin A für D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Cer{Bu ), D-Phe, D-Ala oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.

Verbindungen, worin A für Azgly oder Azala steht, B für Leu steht, E für eine direkte Bindung steht und F für ein Sthylaminoradikal steht.

Verbindungen, worin A für D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(Bu ), D-Phe, D-Ala oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.

Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäßen Verbindungen wird durch diejenigen gebildet, worin A für D-Tyr(Me), D-Ser(Bu ) oder D-Phe steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.

Die drei bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die folgenden Strukturen:

^u3Iü-Kis-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-?ro-A3£ly-NH_o

•-C-lu-His-Trp-Ser-Tyr-B-TyrC-'ei-Leu-Arg-Pro-Azrly-NH^

Π t

^L31u-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu )-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH₂

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Spezielle pharnuizeutisch oder Veterinär zulässige cri indur.gsgemäße Säureadditionssalze sind beispielsweise Hydrochloride, Phosphate, Citrate oder Acetate.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch an sich bekannte Verfahren für die Herstellung von chemisch analogen Verbindungen erzeugt werden. Doshalb betrifft die Erfindung weiterhin die folgenden Verfahren, wobei A, B E oder F die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.

(a) Ein oder mehrere herkömmliche Pepcidschutzgruppen werden von einem geschützten Polypeptid entfernt, so daß die Verbindung der Forr.iel I entsteht;

(b) Umsetzung von "-Glu-OH, t-Glu-His-OH, -GIu-His-Trp-OH, ^Clu-His-Trp-Ser-OH, ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH,

--Clu-His-Trp-Ser-Tyr-A-OH, ¹GIu-HiS-TrP-SCr-TVr-A-B-CH,

-GIu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH bzw. -GIu-His-Trp-Ser-Tyr-A-

B-Arg-Pro-Orl, oder eines geeigneten aktivierter. Derivats davon n~.it H-His-Trp-Ser-Tyr-A-Ξ-ArE-Fro-E-F,

H-Tr?-£or-Tyr-A-3-Ar^-ri-o-I-F, K-Str-Tyr-A-B-Ars-Prc-E-F, H-Tyr-A-E-Arg-Fro-E-F, H-A-B-Arg-Pro-E-F,

H-E-Arj-Frc-Z-F, H-Ar-^-Frc-E-F, H-?ro-E-F bzw. H-AzcIy-NH^ oder einem geeigneten Derivat davon, in einer Standardpeptidkupplungsreaktion ; oder

(c) eine Carbonsäure der Formel

Mlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Prc-E-OK II

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cdc-r ein aktiviertes Derivat davon v;ird reit Ammoniak oder Äthylam in ungesetzt.

Bein Verfahren (a) können soviele Schutzgruppen im Ausgangsmaterial vorliegen, als Radikale vorhanden sind, die geschützt werden müssen, beispielsweise einige oder alle Radikale, die im Produkt als freie Radikale der Formel OH oder als basische Radikale der Formel NH vorliegen.

Beim Verfahren (a) kann die Schutzgruppe oder können die Schutzgruppen solche sein, die in einem Standardhandbuch über Peptidchemie zu finden sind, wie z.B. M. Bodansky und M.A. Ondetti, "Peptide Synthesis", Interscience, Nev/ York, 1966, Kapitel IV; F.M. Finn und K. Hofmann, "The Proteins", Band II, herausgegeben von K. Neurath und R.L. Hill, Academic Press Inc., New York , 1976, Seite 106; "Amino-acids, Peptides and Proteins" (periodische Spezialistenberichte),The Chemical Society, London, Bände 1 bis 8. Verschiedene Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppen sind in diesen Büchern ebenfalls beschrieben.

Beir.i Verfahren (a) ist eine besonders brauchbare Schutzgruppe für NH das Benzyloxycarbonylradikal und eine besonders brauchbare Schutzgruppe für OH das Benzylradikal. Beide diese Gruppen können leicht durch Hydrogenolyse entfernt werden, beispielsweise in Gegenwart eines Palladium-auf-Holzkohle-Katalysators.

Beim Verfahren (a) ist eine weitere besonders geeignete Schutzgruppe für NH das t-Butoxycarbonylradikal und eine weitere besonders geeignete Schutzgruppe für OH das t-Butylradikal. Beide diese Gruppen können leicht durch Behandlung mit einer Säure, wie z.B. Salzsäure oder Trifluoroessigsäure, entfernt werden.

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Dei πι Verfahren (a) ist c-L no weitere besonders oc.-.-· iqr>t ■ ::.ch.r;/-gruppe für KH das Benzyloxycarbonyl- oder t-i<u toxye ir. ' r,y 1 rad : k-.i I und i;.t eine weitere besonders günstige Schutzgruppe ϊ~·.ν Oil d ι:-; t-Buty!radikal. Diese Schutzgruppe^ können leicht durch Behandlung mit HBr in Essigsäure entfernt werden.

Beim Verfahren (b) kann irgendeine der Standardpectidkupolunqsreaktionen verwendet v/erden, wie sie beispielsweise; in einem Stap.dardhandbuch der Peptidchonie beschrieben sir.d, wl;-.· ?.ß. in dem obengenannten Handbuch von Bodansky und Ondet. n, K.!pi to L V, und in den Bänden 1 bis 8 der periodischen Spezialistenberichte der Chemical Society.

Beim Verfahren (b) ist eine spezielle Kupplungsreaktion eine Azidkuppiung, eine AktivesterkuppLung oder eine Kupplung, bei der ein N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Hydroxybenztriazol eine Rolle spielen. Eine bevorzugte Kupplungsreaktion i^t eine AzidKupplung, und zwar insbesondere eine derartige Kupplung, bei der sich die His-Trp-oder Ser-Tyr-Peptidbindung bildet.

Beim Verfahren (c) ist ein geeignetes aktiviertes Derivat des Ausgangsmaterials beispielsweise ein Ester oder Anhydrid. Im Falle eines aktivierten Derivats kann die Reaktion dadurch ausgeführt werden, daß man das aktivierte Derivat mit Ammoniak oder Äthylamin in Gegenwart eines Verdünnungsmittels oder Lösungsmittels zusamment-ingt. In den Fällen, in denen das Ausgangsmaterial die freie Säure der Formel II ist, wird die Reaktion mit Ammoniak oder Äthylamin zweckmäßig durch ein Standardpeptidkupplungsreagens, wie z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, zustande gebracht.

Die Ausgangsmaterialien für die Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren können aus bekannten Verbindungen durch Standardpeptidkupplungsreaktionen, Standardpeptidschutzreakt ionen und Standardpeptidschutzgruppenabspaltungsreaktionen hergestellt

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worden, wie sie Fachleuten auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind und wie sie in den Beispielen 1 bis 10 angegeben sind.

Wie bereits oben festgestellt, besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen Luliberinagonistcigenschaften, d.h., daß sie ähnliche Wirkungen wie Luliberin aufweisen, ein vorn Hypothalanvjs sekretiertes natürliches Hormon, das auf die Hypophyse wirkt und diese zur Freisetzung von Luteinisierungshornion (LiI) und Follikelstintulierungshormon (FSH) veranlaßt. Diese beiden Hypophysenhcrmone spielen bei reproduktiven Prozessen eine Rolle, wobei letzteres, nämliche FSH, in den Ovarien eine Föderung der Reifung der Follikeln bewirkt und ersteres,' nämlich LH, die Ovulation induziert. Die Verbindungen der Formel I sind in unerwarteter Weise hinsichtlich des Vermögens der Freisetzung von LH wesentlich kräftiger als Luliberin und eignen sich deshalb für die Beeinflussung und/oder Verbesserung der Vermehrung bei Tieren. Es eignet sich insbesondere für die Züchtung von großen Haustieren während eines Anöstrusses und bei jeder künstlich beeinflußten Züchtung zur genauen Bestinuriung der Ovulation. Es eignet sich auch für die Heilung von Unfruchtbarkeitszuständen bei Mann und Frau.

Der Luliberinagonisteffekt der erfindungsgemäßen Verbindungen kann beispielsweise durch das Vermögen demonstriert werden, eine Ovulation bei mit Androgen sterilisierten Ratten mit konstantem östrus zu induzieren oder LH und FSH (gemessen durch doppelte Antikörperradioimmunoassay) in das Blutplasma von unreifen männlichen Ratten oder in das Blutplasma von anöstrischen oder diöstrischen Mutterschafen abzugeben.

Der obige Test an mit Androgen sterilisierten Ratten wird wie folgt ausgeführt:

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Mit Androgen sterilisierte weibliche Ratten, die durch Behandlung am 3., 4. und 5. Tag ihres Alters mit 100 ,ug Testosteronpropionat präpariert worden sind, zeigen einen beständigen östrischen Vaginalschleim und zahlreiche präovulatorische Follikeln ir. den Ovarien. Die Verabreichung von Luliberin und aktiven Analogen verursacht die Abgabe eines ovulierenden Anstiegs an LH und FSH, der durch die /anwesenheit von 2iern in den Fallopischen Tuben und frischen Corpora lutea in den Ovarien bestimmt werden kann.

Alle in dieser Beschreibung genannten beispielhaften Verbindungen sind hinsichtlich ihres Vermögens, eine Ovulaticn bei Ratten mit konstanten Östrus zu induzieren, aktiver als Luliberin und zeigen außerdem keine giftigen Wirkunqcn, worin sie in ninoestc-ns der 4fachen Dosis ihrer minimal aktiven Dosis verabreicht werden. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen bevorzugten Verbindungen, die in den Beispielen 4, 6 und 7 beschrieben sind, annähernd lOOmal so aktiv als Luliberin. Sie zeigen außerdem keinerlei toxische Effekte, wenn sie ir. der lOOfachen Menge ihrer minimalen effektiven Dosis verabreicht werden.

Gemäß der Erfindung werden weiterhin pharmazeutische oder Veterinäre Zusammensetzungen vorgeschlagen, die als aktiven Bestandteil eine erfindungsgemäße Verbindung gemeinsam mit einem pharmazeutisch oder Veterinär zulässigen Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthalten.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können die verschiedensten Formen aufweisen, beispielsweise eine für orale oder buccale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Tabletten, Kapseln, Lösungen oder Suspensionen; eine für nasale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Sch:rjpfmittel, Nasenspray oder Nasentropfen; eine für vaginale oder rektale Verabreichung geeignete Form, wie z.B. Suppositorien; oder für eine paren-

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tirjle Verabreichung geeignete Form, wie z.B. sterile injizier-L)ji\: Lösungen odor Suspensionen.

Im all Gemeinen werden die obigen Zusammensetzungen in üblicher Woisc· unter Verwendung herkömmlicher Exzipienzien hergestellt. Zusammensetzungen für orale Verabreichung können jedoch eine Beschichtung aufweisen, um den aktiven Polypeptidbestandteil von den Wirkungen von Enzymen im Magen zu schützen.

Die erfinaungsgemäßen Zusammensetzungen können außerdem zusätzlich zu einem erfindungsgemäßen Polypeptid ein oder mehrere bekannte Wirkstoffe enthalten, die aus Prostaglandinderivaten ausgewählt sind, wie z.B. Prostaglandin-F-O'·. , Cloprostinol oder Fluprostinol, oder einen anderen Wirkstoff, wie z.B. Clomiphen oder Tamoxifen.

Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind solche, die sich für orale Verabreichung in Einheitsdosierungsform eiqron, wie z.B. eine Tablette, eine Kapsel, ein Trank oder ein Bolus, wobei dieselben 2,5 bis 5OO mg und vorzugsweise 10 bis Ιΰΰ ι;'.g eines Polypeptide in jeder Eirheitsdosierungsforir. aufweisen, oder solche, die sich für parenterale Verabreichung eignen, welche 5 ,ug bis 1 mg eines Poiypeptids je ml und vorzugsweise 10,Ug bis 100,ug eines Poiypeptids je ml Lösung enthalten.

Eine parenterale Zusammensetzung ist vorzugsweise eine Lösung in isotonischer Kochsalzlösung oder isotonischer Dextrose, nötigenfalls auf einen pH von 5 bis 9 gepuffert. Alternativ kann die parenterale Zusammensetzung so aufgebaut sein, daß sie den Wirkstoff langsam abgibt, in welchem Falle die Menge des Poiypeptids je Einheitsdosierungsform im allgemeinen größer ist, als sie erforderlich ist, wenn eine herkömmliche injizier-

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bare Form verwendet wird. Eine bevorzugte parenteral :.· Fcimju.,:- ruricj mit langsamer Wirkstoff abgabe enthält lOO.ug bis 1 iT:q PoI/-peptid je Einheitsdosierung.

Die t-rf indunqsqemäßen Zusammensetzungen werden ir.: a I J g ■•■-.κ¹ ir.cn so verabreicht, daß die tägliche Dosis 5O ug bis 20 tui/kg beträgt. Eine tägliche parenterale Dosis, beispielsweise durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion oder Infusion beträgt O,2.ug/kg bis 100_/ug/kg. Bei Mciscnon entsprechen diese Dosen einer gesamten täglichen Dosis von 3,5 mg bis 1,4 g bei oraler Verabreichung und eirer gesamten täglichem Dosis von 14,ug bis 7 mg bei parenteraler Verabreichung, Wenn die Verabreichung über die Schleinunembranen erfolgt, dann liegt die Dosis zwischen den oben angegebenen Bereichen für orale und parenterale Verabfolgarg.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele naher erläutert.

In der, Beispielen bezieht sich R_f auf die aufsteiqer.de Dünnschichtchromatografie (t.l.c.) auf Silicagelplatten (Y.iezel-^.i-l G). Die in dieser Chromatografie verwendeten Losung si:: i t r.elsystene waren Butan-1-ol/Essigsäure/Viasser (4:1:5 V/V) (R^A), Butan-1-ol/Essigsäure/V,⁷asser/Pyridin (15:3:12:10 V/V) (2_-D), Butan-2-ol/3% G/V wäßriges Airumoniumhydroxyd (3:1 VyV)(R-C), Acetonitril/Wasser (3:1 V/V) (R_fD), Aceton/Chlorofcim (1:1 V/V) (R_fE), Chloroform/Äthanol (1:4 V/V) (R_fF), Cyclohoxan/ Äthylacetat (1:1 V/V) (R^G), Cyclohexan/Äthylacetat/Mothanci (1:1:1 V/V) (R^H), Chloroform/Methanol/Wasser (11:δ:2 V/V) (R_fK), Chloroform/Methanol (19:1 V/V) (R_fP) und Chloroform/ Methanol (9:1 V/V) (R_fQ). In allen diesen Fällen wurden die Platten unter UV-Licht geprüft und mit Fluorescamin, Minnydrin und Chlor-Stärke-Jodid-Reagentien behandelt. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann bedeuten die angegebenen R_f-Werta, daß

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ein einziger Fleck durch diese Verfahren bestimmt wurde.

Säurehydrolysate aller in dieser Beschreibung beschriebenen Produkte wurden dadurch hergestellt, daß das Peptid oder geschützte Peptid mit 6 η Salzsäure, die 1 % (G/V) Phenol enthielt in einem verschlossenen evakuierten Rohr 16 st auf 100 C erhitzt v/urde. Die Aminosäurezusammensetzung eines jeden Hydrolysats wurde mit einem LoCarte-Aninosäjre-Analysator bestimmt. Die Zusammensetzung entsprach in jedem Fall der Erwartung. Der Ausdruck "in üblicher Weise aufgearbeitet", der in den Beispielen verwendet wird, besagt, daß nach der Umsetzung jeder feste Rückstand durch Filtration entfernt wurde, das Filtrat unter 40°C zur Trockne eingedampft wurde, der Rückstand in Äthylacetat mit einer 20%igen Zitronensäurelcsung, Wasser, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Kasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet v/urde und das Äthylacetat im Vakuum eingedampft wurde, wobei die Verbindung zurückblieb.

Beispiele 1 bis 10

Synthese von L-Pyroglatair.yl-L-histidy 1-L-tryptophyl-L-sery 1-L-tyrosyi-A-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-E-F. Allgemeines Verfahren (πι) . (Schemata 1 und 2)

Zu einer auf 0°C gekühlten und gerührten Suspension von 0,2 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidinhydrazid in 0,9 ml Dimethylformamid und 0,7 ml Dimethylsulfoxyd wurden 0,8 mMol 5,7n Chlorwasserstoff in Dioxan zugegeben. Nach einem 5 min dauernden heftigen Rühren wurde eine klare Lösung erhalten. Die Lösung wurde auf -20⁰C abgekühlt, 0,22 mMol t-Butylnitrit wurden zugegeben, und das Rühren wurde 25 min fortgesetzt. Die Temperatur wurde dann auf -30°C abgesenkt und die Lösung wurde durch Zusatz

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von 0,8 ir.Mol Triethylamin neutralisiert. Ein auf -20"C vorgekühl· tes Gemisch von 0,1 ir.Kol L-Tryptophyl-L-soryi-L-tryrcsyl-A-L-leucyl-L-arginyl-L-proiyl-E-F-dihydrochlorid (crhalίο;; Jurch Hydrogenolyse des N-Benzyloxycarbonylderivats in 607,1 ■; i:ir; iV/Vj wäßrigem Methanol mit einem Gehalt an zwei Äquivalenter. Chlorwasserstoff über einem 5%igen (G/G) Palladium-auf-Hoizkohle-Katalysator während 16 st) und aus 0,1 mMol Triäthylarrin in 1 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Re-aktionsgenisch wurde 24 st bei 4 C gerührt. Diitiethylfonr.ariid wurde in Vakuui.i abgedampft, und der Rückstand wurde auf Sephadex LK-20 chromategrafiert, wobei Dimethylionr.amid als Eluiemittel verwendet wurde. Das Peptid-hydrochlorid wurde weiter durch Verteilung?:- chromatografie auf Sephatex G-25 gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem n-3utanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (5:1:5:1 V/V) verwendet wurde.

Synthese von L-Pyroglutanyl-L-histidyl-L-tryptcpnyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-3-L-arginyl-L-prolyl-azaqlycinainiG. Allgemeines Verfahren (n) (Schenata 3, 4 und 5).

0, 2 rr.>5cl L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-serin-hydrazid wurden in 4 ml Dimethylformamid aufgelöst und so in das Azid überführt, wie es beim Verfahren (m) beschrieben ist. Dieses wurde, wie es beim Verfahren (n) beschrieben ist, mit 0,15 mMol L-Tyrosyl-A-B-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamid-hycrochlorid (hergestellt durch katalytische Reduktion von K-3enzyloxvcarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-A-L-leucyl-(N'^-nitro)-L-arginyl-L-prolyl-azaglycin-amid in 80%igem(V/V)wäßrigem Methanol während 20 st über einem 5%igen(G/G)Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator) ge); ..ppelt und das fertige Produkt wurde wie oben beschrieben als Hydrochlorid gereinigt.

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SyntfiGSG von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyroEyl-A-B-L-arginyl-L-prolyl-azaglycin-araid. Allgemeines Verfahren (ο) (Schemata 4 und 6) .

Eine Lösung von 50 mg des geschützten Decapeptidderivats, das Scr(Bu ) in der 6-Stellung oder Tyr(Bu ) in der 5-Stellung aufwies, in 5 ml 90%iger (V/V)wäßriger Trifluoroessigsäure wurde hergestellt. Drei Tropfen ß-Mercaptoäthanol wurden zugegeben und die Lösung wurde 4 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde einmal aus Wasser und zweimal aus t-Butanol gefriergetrocknet. Die Ausbeute war 90 bis 100%.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die durch eines dieser drei allgemeinen Verfahren hergestellt wurden, sind als Beispiele 1 bis 10 in der folgenden Tabelle aufgeführt.

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Die Ausgangsmaterialien für die Verwendung in den obigen Verfahren können so erhalten werden, wie es in den folgenden Schemata 1 und 2 (Verfahren (τη)), in den Schemata 3, 4 und 5 (Verfahren (n)) und in den Schemata 4 und 6 (Verfahren (o)) beschrieben ist.

Bei diesen Schemata wurden die folgenden Konzentrationen verwendet:

OCp = 2,4,5-Trichlorphenylester

BzI = Benzyl

Z = Benzyloxycarbonyl

Boc = t-Butoxycarbonyl

DMF = DinethyIformamid

Die eingekreisten Zahlen beziehen sich auf die betreffende Stufe.

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Stufe Ί) .

19,94 g (80 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-prolin und 8,8 ml (80 mMol) N-Methjlmorpholin wurden in 200 ml trockenem Tetrahydrofuran aufgelöst und die Lösung wurde auf -20 C abgekühlt. 7,15 ml (76 mMol) Äthylchloroformiat wurden tropfenweise zugegeben, und nach einem 2 Minuten dauernden Rühren wurden 20 ml (300 mMol) einer auf -20°C vorgekühlten 70'.; igen wäßrigen Lösung von Ä'thylamin zugegeben, worauf das Rühren 18 st bei 4°C fortgesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und der Rückstand wurde aus Äthylacetat / Petroläther (Kp 6O-8O°C) kristallisiert. Ausbeute 12,97 g (58,7%), Fp 1O7-1O8°C, f^J^⁵'⁵ -43,88° (c, 1 in Methanol), R_fD 0,69, R_fE 0,53, R_fF 0,67, R_fH 0,62, R_fP 0,57, R_fQ 0,66.

Stufe 'S) .

Katalytische Reduktion über 5% Pd/C in wäßrigem Äthanol mit einen Gehalt an 1 Äquivalent Chlorwasserstoff während 5 st bei Raumtemperatur.

Eine Lösung von 13,5 g (42,3 mMol) N ^-t-Butoxycarbonyl-N °- nitro-L-arginin, 7,15 g (47 mMol) L-Prolin-äthyl-amid-hydrochlorid, 11,5 g (85 mMol) 1-Hydroxybenztriazol und 6,58 ml (47 nMol) Triäthylamin in DMF wurde auf 0°C abgekühlt, und 9,13 g (44,4 mMol) Dicyclohexylcarbodiijnid wurden zügegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4 C gerührt und zur Entfernung von festem Material filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft wurde. Der Rückstand wurde zwischen Äthylacetat und Wasser durch eine Gegenstromverteilung (4 übergänge) verteilt. Die wäiirigen Phasen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft und der Rück-

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stand wurde zwischen N-Butanol und 5%iger(V/V)wäßriger Essigsäure durch Gegenstromverteilunq (12 Übergänge) verteilt. Das durch Eindampfen der vereinigten N-Butanolphasen erhaltene rohe Peptid wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform und iO%igem (V/V)Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft, und eine wäßrige Lösung des Rückstands wurde durch eine Anionenaustauschharzkolonne (AG 1-X2) hindurchgeführt, um dieses N ^-t-Butoxycarbonyl-N⁴⁰-nitro-arginin zu entfernen. Die Kolonne wurde dann mit Wasser gewaschen und die vereinigten wäßrigen Phasen und Waschflüssigkeiten wurden gefriergetrocknet, wobei das Azapeptidderivat

erhalten wurde. Ausbeute 16,67 g. (89%), Fp 109-111°C (Zer-

2 5 ο
Setzung), Γ°^7_Ώ -39,0 (c, 1 in Methanol), R_fA 0,62, R_fB 0,74, R_fC 0,59, R_fD 0,70, R_fE 0,20, R_fF 0,60, R_£H 0,61, R_fK 0,85, R_fQ 0,13.

Stufe 4^N .

Das tJ-t-Butoxycarbonylderivat wurde in Äthylacetat aufgelöst und mit 3n HCl in Äthylacetatlösüng ( 4 Äquivalente) während 1 st bei Raumtemperatur behandelt.

Stufe .5) . (R=H)

Eine Lösung von 2,90 g (22 mMol) t-Butoxycarbonylhydrazid und 11,71 g (20 mMol) des 2,4,5-Trichlorophenylesters von N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin in 40 ml Dimethylformamid wurde über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Aufarbeitung in der üblichen Weise und anschließende Umkristallisation des Rückstands aus Äther/Petroläther (Kp 60 bis 80⁰C) ergab das geschützte Hydrazid als weißes Pulver, 3,46 g, (67%), Fp 126 bis 127°C,/χ^β5 -13,2° (c, 1 in Methanol), R_fD 0,82, R_fE 0,65,

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R_fF O,63, R_fH 0,70.
Stufe (6). (R=H)

5,19 g (10 mMol) 1 -(N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl)-2-t-butoxycarbonyl-hydrazid wurden in 50 ml Äthylacetat aufgelöst und mit 8 ml (40 mMol) 5n Salzsäure in Äthylacetat 1 st bei Raumtemperatur behandelt. Das fithylacetat wurde im Vakuum entfernt, und das Hydrochlorid wurde mit Äther filtriert und getrocknet.

Stufe φ . (R=H)

Das obige Hydrochlorid wurde in 75 ml Tetrahydrofuran aufgenommen, und 1,15 g (8 mMol) Triäthylamin wurden zugegeben, worauf sich der Zusatz von 1,36 g (8 mKol) n-Carbonyl-L-leucinmethylester anschloß. Nach 1 6 st bei Raun ten per a tür v.-urde das Reaktionsgemisch in der üblichen Weise aufgearbeitet, worauf der Rückstand aus A'thylacetat/Petrcläther (Kp 6O-6O°C) umkristallisiert wurde. Dabei wurde das Azatripeptidderivat

24 ₃o D ~ ' (c, 1 in Methanol), R_fD 0,81, R_fE 0,45, R_fP 0,26, R_fQ 0,47.

erhalten, 4,57 g. (77,7%), Fp 156-157°C, /'7^

5 ml (100 mMol) Hydrazinhydrat wurden zu einer Lösung von 2,95 g (5 mMol) N-Benzyloxycarbcnyl-O-benzyl-L-tyrosylazaglycyl-L-leucin-methylesrer in 50 ml Methanol zugegeben. Nach 2 st bei Raumtemperatur wurde das Hydrazid mit Wasser ausgefällt und aus Methanol/Äther umkristallisiert. Ausbeute 2,74 g (92,8%), Fp 169-17O°C, f^J^ -9,05° (c, 1 in Dimethylformamid) R_fA 0,76, R_fB 0,75, R_fC 0,73, R_fD 0,63, R_fF 0,60, R_fH 0,55.

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Stufen 9"¹ und ib ( R=H)

1,18 g (2,0 raMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosylazaglycyl-L-leucin-hydrazid wurden in 10 ml Dimethylformamid aufgelöst und nach Abkühlen der Lösung auf -20°C wurden 1,46 ml (8 mMol) einer 5,49m Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan und schließlich 0,25 ml (2,2 mMol) t-Butylnitrit zugegeben. Nach 5 min wurde die Lösung auf -30 C abgekühlt, worauf ein vorgekühltes Gemisch von 0,836 g (2,2 mMol) N¹⁰ -Nitro-L-arginyl-L-prolin-äthylamid-hydrochlorid und 1,43 ml (10,2 mMol) Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 1 st bei -10 C und dann 48 st bei 4 C gerührt. Es wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet. Das Pentapeptidderivat wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform und 3%igem G//V) Methanol in Cnloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt, Ausbeute 0,695 g. (38,5%), R_fA 0,71, R_fB 0,72, R_fC 0,84.

Stufe 11 . (R=H)

Katalytische Reduktion mit 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in 80%iger (V/V) wäßriger Essigsäure mit einem Gehalt an 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff.

Stufe (1 2, .

Zu einer heftig gerührten und auf -20°C abgekühlten Lösung von 33,84 g (1OO mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan und 11,0 ml (100 mMol) N-Methylmorpholin in 200 ml Tetrahydrofuran wurden 9,0 ml (95 mMol) Äthylchloroformiat zugegeben. Nach 2 min wurde eine auf -20°C vorgekühlte Lösung von 17,10 g (11 mMol) L-Serinmethylester-hydrochlorid und 12,1 ml (11OmMoI) N-Methylmorpholin in 150 ml Dimethylformamid zugegeben und das Rühren wurde 30 min bei -20⁰C und 3 st bei Raumtemperatur fortgesetzt.

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Die übliche Aufarbeitung ergab ein öl. Zwei Kristallisationen aus Äthylacetat/Petroläther, Kp 6O-8O°C, gaben das Dipeptidderivat, Ausbeute 30,53 g (69,5%), Fp 14O,5-141°C, ⁴ -22,13° (c, 1,4 in Dimethylformamid).

Stufe 13.

30,53 g (69,5 mMol) des vorstehenden Esters wurden in 1 1 Methanol aufgelöst und 15 ml einer 62%igen (G/V) Lösung von Hydrazinhydrat wurden zugesetzt. Nach 16 st wurde das Hydrazid gesammelt, mit Methanol und Äther gewaschen und aus heißem Äthanol kristallisiert, Ausbeute 23,18 g (75,8%), Fp 178-179°C, /^yJ⁴ -25,27° (c, 1 in Dimethylformamid) R_fD 0,65, R_fE 0,20, R_fF 0,43, R_fH 0,50.

Stufen 14' und 15 >.

0,77 ml (4,64 mMol) 6,O2n Chlorwasserstoff in Dioxan wurden zu einer auf -20°C abgekühlten und gerührten Lösung von 0,502 g (1,16 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-serinhydrazid in 5 ml Dimethylformamid zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,14 ml (1,22 mMol) t-Butylnitrit anschloß. Nach 30 min wurde die Lösung auf -30°C abgekühlt und durch Zusatz von 0,65 ml (4,65 mMol) Triäthylamin neutralisiert. Ein auf -2O C vorgekühltes Gemisch von 0,547 g (0,77 mMol) L-Tyrosylazaglycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-äthylamid-dihydrochlorid und 0,108 ml (0,77 mMol) Triäthylamin in 5 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Rühren wurde 1 st bei -20°C und 48 st bei °C fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das rohe Peptid wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform,10%igem (V/V) Methanol in Chloroform und einem Gemisch von Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) als Eluierlösungsmittel gereinigt, Ausbeute 0,424 g (52,9%),

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7q⁵ -16,84° (c, 1,5 in Methanol), R_fA 0,61, R_fC 0,36, R_fD 0,67, R_fK 0,90.

Stufe 18' (R=Me)

Wie Stufe 5), Ausbeute 66%, Fp 1O2-1O4°C, f^ll^ -15,5° (c, 1 in Methanol), R_fD 0,76, R_fE 0,68, R_fF 0,76, R_fH 0,74.

Stufe 19) (R=Me)

Wie Stufe

Stufe 20; (R=Me)

Wie Stufe 7 ^:, Ausbeute 93%, Fp 145-146°C, /^;V/^⁵ +8,7° (c. 1,2 in Methanol), R_fA 0,88, R_fB 0,88, R_fC 0,83, R_fD 0,80, R_fE 0,59, R_fF 0,78, R_fH 0,73.

Stufe 21

12 ir.l (12 mMol) 1n Natriumhydroxyd wurden zu einer gerührten Losung von 2,41 g (4 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-azalanyl-L-leucin-methylester in 36 ml Methanol bei Rauntemperatur zugegeben, und das Rühren wurde 3 st fortgesetzt. Das Methanol wurde im Vakuum entfernt und 40 ml einer wäßrigen Lösung, die unter Verwendung des Rückstands hergestellt worden war, wurde mit Zitronensäure auf pH 3 angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Nach dem Waschen des Äthylacetatextrakts mit Wasser und Trocknen (Na-SO₄) wurde das Lösungsmittel eingedampft, worauf der Rückstand in 200 ml eines Gemische aus Dimethylformamid und Wasser (3:2 V/V) auf 100 ml einer Kolonne eines AG 1 x-2-Harzes aufgegeben wurde. Die Kolonne wurde mit 50 ml des obigen Lösungsmittels gewaschen und das Tripeptid wurde mit 0,2m Essigsäure in Dimethylformamid/ Wasser (3:2 V/V) eluiert. Die Tripeptid enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft und der Rückstand

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³¹ 2770245

(51,7%), Fp 195°C (Zersetzung), / ^/i?⁴ -25,4° (c, 1 in Di-

wurde mit Äther trituriert und gesammelt, Ausbeute 1,22 g (51 ,7%) , Fp 195^C
methylformamid).

Stufe (2^2) (R=Me)

Wie Stuf e (28 , Ausbeute 43%, /"⁰S/^⁵ -25,9° (c, 1 in Methanol), R_fA 0,72, R_fB 0,76, R_fC 0,85. '

Stufe fi?) (R=Me)
Wie Stufe'11) .

Stufe 24^N: (R=Me)

Wie Stufe 15 , außer daß das Endprodukt auch durch Gelfiltration auf Sephadex LH-20 in Dimethylformanid nach Silicagelkolonnon-

?5 c chromatografie gereinigt wurde, Ausbeute 63%, / /~ -24,76 ,

(c, 0,8 in Methanol), R_fA 0,58, R_fC 0,42, R_fD O,65, R_fK 0,95. Stufe 25

Zu 24,9 g (100 mMol) einer gerührten und auf 0^cC abgekühlten Suspension von N-Benzyloxycarbonyl-L-prolin, 11,2 g (100 mMol) Semicarbazidhydrochlorid und 14,5 ml (100 mMol) Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid wurden 20,6 g (100 inMol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Rühren wurde 16 st bei 4 C fortgesetzt. Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde auf ein kleines Volumen eingedampft. 200 ml Wasser wurden zugegeben und die Lösung wurde mit 3mal 50 ml Äthylacetat extrahiert. Das Produkt fiel aus der wäßrigen Lösung in ungefähr 1 st aus. Umkristallisation aus wäßrigem Methanol ergab das Dipeptidamid, Ausbeute 16,5 g (53,9%), Fp 189-19O°C, f*./^ -43,6° (c, 1,4 in Dimethylformamid), R_fD 0,54, R_fF 0,52, R_fH 0,38, R_fK 0,78.

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Stufe '26}

Katalytische Reduktion über 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in 80%igem (V/V) wäßrigem Dimethylformamid während 6 st bei Raumtemperatur in Gegenwart von 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff.

Stufe 27!

2,83 ml (29,5 mMol) Äthylchloroformiat wurden zu einer Lösung von 8,24 g (31 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin und 4,55 ml (32,5 mMol) Triäthylamin in 100 ml Tetrahydrofuran bei -10 bis -15 C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 min bei dieser Temperatur gerührt und wurde dann in eine heftig gerührte Lösung von 5,79 g (31 mMol) N~-Nitro-L-arginin in 15,5 ml (31 mMol) 2n Natriumhydroxyd und 50 ml Dimethylformarriid bei -10°C eingeschüttet. Das Rühren wurde 30 min bei -10°C und dann 1 st bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Lösungsmittel wurden iin Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zwischen 50 ml Äthylacetat und 50 ml Wasser verteilt. Die wäßrige Phase wurde abgetrennt und mit zwei weiteren Portionen Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit 25 ml Wasser gewaschen und verworfen. Die vereinigten wäßrigen Phasen wurden mit gesättigter Zitronensäurelösung angesäuert und mit dreimal 100 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, über Na₃SO₄ getrocknet und zur Trockene eingedampft. Umkristallisation des Rückstands aus Athylacetat/Petroläther (Kp 6O-8O°C) ergab das Dipeptid, Ausbeute 8,98 g, (62%), Fp 15O-165°C (Zersetzung).

Stufe 28

Eine Lösung von 9,2 g (20 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-(N" -nitro)-L-arginin, 4,2 g (20 mMol) L-Prolylazaglycinamidhydrochlorid, 5,4 g (40 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol und 3 ml

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³³ 2770245

(20 mMol) Triäthylamin in 2OO ml Dimethylformamid wurde auf 0 C abgekühlt und 8,2 g (40 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Umkristallisation des Rückstands aus Methanol/Äther ergab das Tetrapeptidderivat, Ausbeute 12,2 g (98,3%), Fp 88 bis 90⁰C, Z*^⁴ -30,2° (c, 1,6 i
R_fF 0,40, R_fH 0,26, R_fK 0,63.

90⁰C, Z*^⁴ -30,2° (c, 1,6 in Dimethylformamid), R_fD 0,57,

Hydrierung über 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in wäßrigem Äthanol während 16 st in Gegenwart von 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff.

Stufe '30}

6,434 g (11,OmMoI) N-Benzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosin-2, 4 ,. 5-trichlorcphenylester und 1,396 g (10 mMol) D-Alanin-raethylesterhydrochlorid wurden in 50 ml Dimethylformamid aufgelöst und 1,4 ml (10,0 mMol) Triäthylamin wurden zur Lösung zugegeben, die über Nacht bei Raumtemperatur gerührt v/urde. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und der Rückstand wurde aus heißem Äthylacetat kristallisiert, Ausbeute 3,782 g (77,2%), des geschützten Dipeptidmethylesters, Fp 163°C, /c^7q⁴'⁸ -12,84° (c, 1,1 in Dimethylformamid).

Stufe 31 ■

3,435 g (7,0 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanin-methylester wurden in 400 ml warmem Methanol aufgelöst und die Lösung wurde mit 10 ml (120 mMol) 62%igem (G/V) Hydrazinhydrat behandelt und das Gemisch wurde über Nacht bei 25°C

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stehen gelassen. Das Hydrazid wurde abfiltriert, mit Methanol und Äther gev/aschen und zweimal aus siedendem Methanol kristallisiert, Ausbeute 3,068 g (89,2%), Fp 217°C, f^/^ -20,44° (c, 1,1 in Dimethylformamid) R_fA 0,73, R_fB 0,75, R_fC 0,67, R_fD 0,70, R_fE 0,50, R_fF 0,54, R_fH 0,67, R_fK 0,85, R_fQ 0,25.

Stufen 32'und 33

Zu einer auf -20°C abgekühlten und gerührten Lösung von 1,18 g (2,4 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alaninhydrazid wurden1,6 ml (9,6 mMol) einer 6,02m Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,29 ml (2,52 mMol) t-Butylnitrit anschloß. Nach 15 min wurde eine auf -20 C vorgekühlte Lösung von 1,03 g (2,0 mMol) L-Leucyl-L-arginyl-L-prolylazaglycinamid-dihydrochlorid und 1,62 ml (11,6 mMol) Triäthylamin in 15 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Rühren wurde 24 st bei 4°C fortgesetzt. Triäthylaminhydrochlorid wurde duich Filtration entfernt und das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Silicagelkolonne aufgegeben und die Kolonne wurde mit 5%igem (V/V). Methanol in Chloroform, 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform und einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/ Wasser (11:8:2 V/V) eluiert. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft und das Peptid wurde nochmal auf einer Silicagelkolonne unter Verwendung von Acetonitril/Wasser (3:1 V/V) als Eluiermittel chromatografiert. Ausbeute 890 mg (46,4%), ZA/^⁵ -45,7° (c, 1,1 in Methanol), R_fA 0,54, R_fB 0,69, R_fC 0,41.

Stufe 34

Wie Stufe 11 '

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Stufe 35·

Wie Stufe 15), Ausbeute 43%, O~*-jV* -41,4° (c, 1,3 in Methanol), R_fA 0,80, R_fC 0,47, R_fD 0,65, R_fK 0,95.

Stufe 38*

Wie Stufe's*, Ausbeute 69%, Fp 135°C> R_fA 0,49, R_fB 0,65, R_fC O,46, R_fD 0,64, R_fF 0,35, R_fH 0,19, R_fK 0,86.

Stufe 39^N!

Wie Stufe 4

Stufe 40 (A=D-Phe)

Eine Lösung von 7,41 q (24,8 nMol) N-Beneyloxycarbony1-D-pheny1-alanin und 3,62 g (25 mMol) L-Leueinmc-thylestor in 10O x.l Äthylacetat wurde auf 0 C abgekühlt und 5,15 g (25 rriMcl) Dicyclohexy.lcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4 C gerührt. Die übliche Aufarbeitung und anschließende Umkristallisation des Rückstands aus Sthylacetat/Petroläther (Kp 60-8O⁰C) ergab das Dipeptid, Ausbeute 9,1 g (86%), Fp 123 bis 124°C, L \/^⁶ -18,7° (c, 2,1 in Methanol), R_fD 0,76, R_fE 0,65, R_fF O,74, R_fH 0,73.

Stufe 41 (A=D-Phe)

Katalytische Reduktion über einem 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in A'thanol mit einem Gehalt an 1 Äquivalent Chlorwasserstoff während 5 st.

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ORIGINAL INSPECTED

Stufe 42) (A=D-Phe)

Zu einer gerührten Lösung von 4,89 g (8,36 itiMol) N-Benzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlorphenylester und 2,5 g (7,6 mMol) D-Phenylalanyl-L-leucin-methylester-hydrochlorid in Dimethylformamid wurden 1,1 ml (7,6 mMol) Triethylamin zugegeben und das Rühren wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt. Triäthylaininhydrochlorid wurde abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Umkristallisation des Rückstands aus wäßrigem Methanol ergab das Tripeptidderivat, Ausbeute 3,6 g (69,7%), Fp 183-184°C, R_fD 0,82, R_fE 0,69, R_fH 0,78, R_fP 0,71, R_fQ 0,82.

Stufe 43 (A=D-Phe)

Eine Lösung von 3,42 g (5,04 mMol) des vorstehenden Methylesters und UO ITiMo 1 Hydrazinhydrat in 30 ml Dimethylformamid wurde bei Räumterrperatur 4 st lang gerührt und auf ein kleines Volumen konzentriert, worauf das Hydrazid durch Zusatz von 500 ml Wasser ausgefällt wurde. Es wurde gesammelt, mit Wasser, Methanol/Äther (1:4 V/V) und Äther gewaschen und getrocknet, Ausbeute 2,94 g, (85,93,), Fp 179-18O°C, R_fA 0,81, R_fB 0,79, R_fC 0,88, R_fD 0,69, R_fE 0,49, R_fF O,65, R_fH O,67, R_fP 0,25, R_fQ 0,57.

Stufen 44 und 45 (A=D-Phe)

1,83 ml (11 mMol) einer 6,o:?in Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan wurden zu einer Lösung von 1,85 g (2,75 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-hydrazid in 5 ml Dimethylformamid bei -20 C zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,33 ml (2,89 mMol) t-Butylnitrit anschloß. Nach 2 min wurde eine auf -20 C vorgekühlte Lösung von 1,89 ml (13,5 mMol) Triäthylamin und 1,02 g (2,5 mMol) N ^-Nitro-L-arginyl-L-prolylazaglycinamid-hydrochlorid in 10 ml Dimethylform-

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amid zugegeben, v/orauf das Reaktionsgemisch über Nacht bei 4°C gerührt wurde. Die übliche Aufarbeitung ergab das Hoxapeptidderivat, das weiter durch Silicagelkclonnencr.romatografie (120 g Silicagel) unter Verwendung von 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform, 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform und einem Gemisch von Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) als Eluierlcsungsmittel gereinigt wurde, Ausbeute 0,74 g, (29,3%), Fp 137-139°C, R_fA 0,68, R_fB 0,72, R_fC 0,58, R_fD 0,62, R_fH 0,39, R_fK 0,95.

Stufen 46 I, 47 und 48

10 πMol L-Pyroglutamyl-L-histidin-hydrazid warden in das Azid überführt, wie es bein Verfahren (a) beschrieben ist und dann mit 11 mMol L-Tryptophyl-L-serin-methylester (hergestellt durch Hydrierung des N-Benzyloxycarbonylderivats über einem 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in Dimethylforaai»id) während 30 min bei -10°C und 24 st bei 4°C gekuppelt. Triäthylaminhydrochlorid wurde durch Filtration entfernt u::d oas FiI trat wurde zur Trockene eingedampft. Das rohe Peptid wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von lOügen (V/V) Methanol in Chloroform, 20¹UgCm (V/V) Methanol in Chloroform and einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser (11:8:2 V/V) als Eluiermittel gereinigt, Ausbeute 703,, Fp 142-145°C, (Zersetzung), R_fA 0,39, R_fB 0,72, R-C 0,45, R_fD 0,48, R_fK 0,61.

Stufe 49

5,4 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-serin-nethyiester wurden in 70 ml Dimethylformamid aufgelöst und mit 1CO mMol Hydrazinhydrat 4 st behandelt. Dimethylformamid wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Äthanol trituriert, gesammelt, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet (88,2?), Fp 184 bis 189°C, R_fA 0,18, R_fB 0,55, R_fC 0,39, R_fD 0,27, R_fK 0,58.

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ORIGINAL INSPECTED

Stufe 50 (A=D-Trp)

4,87 g (23,6 mMcl) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu einer Lösung von 7,27 g (21,5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-D-tryptophan, 3,12 g (21,5 mMol) Leucinmethylester und 5,8 g (43 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol in 50 ml Dimethylformamid bei 0⁰C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und in der üblichen Weise aufgearbeitet. Umkristallisation aus Äthylacetat/Petroläther (Kp 6O-8O°C) ergab 9,55 g des Dipeptidderivats, welches bei Dünnschichtchromatografie Spuren von Verunreinigungen zeigte. Es wurde durch Silicageikolonnenchromatografie (300 g Silicagel) unter Verwendung von Chloroform und 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Ausbeute 9,18 g, (91,7%), Fp 151-153°C , R_fA 0,84, R_fB 0,80, R_fC 0,86, R_fD 0,78, R_fE 0,61, R_fF O,68, R_fH O,73, R_fP 0,55, RfQ O,73.

Stufe 51 (A=D-Trp)

Katalytische Reduktion in 80%igem (V/V) wäßrigem Dimethylformamid über 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator während 5 st.

Stufe 52 (A=D-Trp)

Eine Lösung von 11,69 g (20 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlorophenylester und 6,26 g (19 mMol) D-Tryptophyl-L-leucin-methylester in 100 ml Dimethylformamid wurde 60 st bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und der Rückstand wurde aus A'thylacetat/Petroläther (Kp 6O-8O°C) kristallisiert. Dabei wurde das Tripeptidderivat erhalten, Ausbeute 8,5 2 g, (62,5%), Fp 165-166°C, R_fA 0,78, R_fB 0,73, R_fC 0,84, R_fD 0,80, R_fE 0,62, R_fF 0,70, R_fH 0,76, R_fP 0,58, R_fQ 0,68.

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ORfGlNAL INSPECTED

Stufe 53. (A=D-Trp)

Eine Lösung von 7,26 g (10,1 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-bensyl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucin-methylester in einem Gemisch aus 200 ml Methanol und 50 nil Dimethylformamid wurde mit 100 mMol Hydrazinhydrat bei Raumtemperatur behandelt. Nach 24 st wurde die Lösung auf ungefähr 30 ml konzentriert, worauf 500 ml Wasser zugegeben wurden. Das Tripeptidhydrazid wurde gesammelt, mit Wasser, Methanol/Äther (1:4 V/V) und Äther gewaschen und getrocknet, Ausbeute 6,86 g, (94,6%), Fp 2OO-2O2°C, R_fA 0,90, R_fB 0,95, R_fC 0,90, R_fD 0,74, R_fQ 0,59.

Stufen 54' und 55 (A=D-Trp)

Eine gerührte und auf -20°C abgekühlte Lösung von 1,97 g (2,75 ir.Mol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyi-L-tyrcsyl-D-tryptcphyl-L-leucin-hydrazid in 10 rr.l Dimethylformamid wurde mit 1,83 ml (11 mMol) einer 6,02m Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan und dann mit 0,33 ml (2,89 mKci) t-Eutylnitrit bohandoJt. Nach 2 min wurde eine auf -20 C vorgekühlte Lösung vor. 1 ,02 g (2,5 mMol) N '* -Nitro-L-arginyl-L-prolyl-azaglycin-amid-hydrochlorid und 1,89 ml (13,5 mMol) Triäthyiarr.in in 10 ml Dimethylformamid zugegeben und das Reaktionsgeir.isch wurde über Nacht bei 4 C gerührt. Es wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet, und der Rückstand (1,27 g) wurde auf eine Silicagclko]cnne (230 g Silicagel) aufgegeben. Die Kolonne wurde mit Chloroform und 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform eluiert. Ausbeute 0,91 g (34,4%), Fp 139-14O°C (Zerse
R_fD 0,62, R_fH 0,34, R_fK 0,95

(34,4%), Fp 139-14O°C (Zersetzung), R_fA 0,67, R_fB 0,72, R_fC 0,58,

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ORIGINAL INSPECTED

Stufe _V56) (A=D-Tyr(Me))

Eine Lösung von 3,17 g (9,64 mMol) Z-D-Tyr(Me)-OH, 1,92 g (10,6 mMol) Leu-OMe.HCl, 2,6 g (19,2 mMol) 1 -Hydraxybenzotriazol und 1,6 ml (11 mMol) Triäthylamin in 30 ml Dimethylformamid wurde auf O⁰C abgekühlt und 2,29 g (11,1 mMol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid wurdan zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 4°C gerührt und in der üblichen Weise aufgearbeitet. Umkristallisation aus heißem Cyclohexan ergab das geschützte Dipeptidderivat. Ausbeute 1,41 g (95,2%), R_fD 0,83, R_fE 0,69, R_fP 0,72, R_fQ 0,76.

Stufe 57) (A=D-Tyr(Me))

Katalytische Reduktion über 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in Methanol/Dimethylformamid/Wasser (8:1:1) mit. einem Gehalt an 1,2 Äquivalenten Chlorwasserstoff während 3 st.

Stufe 58 (A=D-Tyr(Me))

Eine Lösung von 8,2 mMol Z-Tyr(BzI)-OCp, 8,2 mMol D-Tyr(Me)-Leu-OMe.HCl und 8,2 mMol Triäthylamin in 60 ml Dimethylformamid wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und das Gemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet. Das Produkt wurde mit Äther filtriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 81,2%, Fp 191-192°C, R_fD 0,85, R_fE 0,73, R_fF 0,72, R_fQ 0,78.

Stufe 59 (A=D-Tyr(Me))

12,9 mMol Hydrazinhydrat wurden zu einer Lösung von 4,59 g (6,4 mMol) Z-Tyr(BzI)-D-Tyr(Me)-Leu-OMe in 25 ml Dimethylformamid und 50 ml Methanol zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Methanol

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wurde im Vakuum entfernt und das Produkt wurde mit Wasser ausgefällt, gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Fp 212-213°C, R_fE 0,49, R_fF 0,66, R_fH 0,69, R_fQ 0,7O.

und 6^ (A=D-Tyr (Me))

3,54 g (5,0 mMol) des Hydrazids aus Stufe ^59j wurden in 10 ml DMF aufgelöst und die gerührte Lösung wurde auf -20°C abgekühlt. 3,38 ml (20 mMol) 5,92m HCl in Dioxan wurden zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0,6 ml (5,25 mMol) t-Butylnitrit anschloß. Nach 2 min wurde eine vorgekühlte Lösung von 2,04 g (5 mMol) Η-Arg (NO₂)-Pro-Azgly-NH₂·HCl und 3,55 ml (25 mMol) Triäthylamin in 10 ml DMF zugegeben und das Rühren wurde über Nacht bei 4 C fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und das rohe Produkt wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform, 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform und 10%igen (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Ausbeute 3,72 g (70,9%), R_fA 0,64, R_fB 0,72, R_fC 0,55, R_fD 0,66, R-F 0,40, R_fH 0,52.

Stufe 62 (A^D¹¹

Wie Stufe 56 . Das Produkt wurde aus wäßrigem Methanol kristallisiert .Ausbeute 90,4%, Fp 1O7-1O8°C, R_fD 0,80, R_fE 0,68, R_fF 0,73, R_fH 0,72, R_fP 0,72, R_fQ 0,74.

Stufe 63 (A=D-Ser(Bu^fc))

Katalytische Reduktion über 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkchle-Katalysator in DMF/Wasser (8:2) während 5 jain. ;

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Stufe'64. (A=D-Ser(Bu^fc))

Eine Lösung von 19,17 g (32,7 mMol) Z-Tyr(BzI)-OCp und 32,7 mMol H-Ser(Bu )-Leu-OMe in 100 ml Dimethylformamid wurde 72 st bei Raumtemperatur stehen gelassen, übliche Aufarbeitung ergab einen Feststoff, der gesammelt, mit Äther gewaschen und getrocknet wurde. Ausbeute 17,6 g (79,4%), Fp 135-137°C, R_fD 0,80, R_fH O,77, R_fQ 0,81.

Stufe 65, (A=D-Ser(Bu^t))

Wie Stufe (59;. ümkristallisation aus wäßrigem Methanol. Aus- beute 56,2%, Fp 134-136°C, R_fD 0,66, R_fH 0,64, R_fQ 0,64.

Stufen 66 und 67· (A=D-Ser(Bu ))

Wie Stufen 60 und 61 . Das Produkt wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform und 5%igeiTi (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlcsungsmittel gereinigt. Ausbeute 38,5*, Fp 142-145°C, R_fA 0,64, R_fB 0,71, R_fC 0,55, R_fD 0,65, R_fF 0,46, R_fH 0,43, R_fQ 0,16.

Stufe 68 (A=D-Tyr(Me))

5,13 g (24,9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu einer auf 0 C abgekühlten und gerührten Lösung von 22,6 mMol Z-D-Tyr-(Me)-OH, 5,98 g (24,9 mMol) H-MeLeu-OMe.HBr, 3,5 ml (24,9 mMol) Triäthylamin und 6,12 g (45,2 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol in 50 ml DMF zugegeben und das Rühren wurde über Nacht bei 4°C fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und das Produkt wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform als Lösungs mittel gereinigt. Ausbeute 55,2%, öl, R_fD 0,83, R_fE 0,78, R_fH 0,79, R_fP 0,80, R_fQ 0,79.

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-ίο-

Stufe 69 (A=D-Tyr(Me))

Katalytische Reduktion über 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in Methanol/Wasser (8:2 V/V) mit einem Gehalt an 1 Äquivalent Chlorwasserstoff während 6 st.

Stufe'TO! (A=D-Tyr (Me))

Wie Stufe (58 . Das Produkt wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Äther als Lösungsmittel gereinigt.

Stufe "''"7V (A=D-Tyr(Me))

Eine Lösung von 4,85 g (6,69 mMol) Z-Tyr(BzI)-D-Tyr(Me)-MeLeu-OMe und 120,7 mMol Hydrazinhydrat in 150 ml Methanol wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Hydrazid wurde durch Zusatz von Wasser ausgefällt, gesammelt und aus Methanol/ Nasser kristallisiert. Ausbeute 91,1%, Fp 129-131°C, R_fD 0,79, R_fE 0,60, R_fF 0,68, R_fH 0,73, R_fQ 0,77.

Stufen .72 und 73 (A=D-Tyr (Me))

Umkristallisiert aus Methanol/Äther, Ausbeute 23,8%, Fp 152 bis 154°C, R_fA 0,67, R_fB 0,68, R_fC 0,58, R_fD 0,59, R_fH 0,50, R_fK 0,94, R_fQ 0,35.

Stufe·74,

1,8 ml (18 mMol) Äthylchloroformiat wurden zu einer auf -15°C abgekühlten und gerührten Lösung von 5,99 g (20 mMol) Z-Phe-OH und 2,2 ml (20 mMol) N-Methylreorpholin in 60 ml DMF zugegeben. Nach 2 min wurde eine auf -15°C vorgekühlte Lösung von 4,8 g (20 mMol) H-MeLeu-OMe.HBr und 2,8 ml (20 mMol) Triethylamin in 20 ml DMF zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei

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O C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet. Ausbeute 7,54 (90%), öl.

Stufe 75,

Katalytische Reduktion über 5%igem (G/G) Palladiurn-auf-Holzkohle-Katalysator in Methanol mit einem Gehalt an 1 Äquivalent Chlorwasserstoff während 3 st.

Stufe '76

Hergestellt durch Kuppeln von 16,02 g (43,2 mMol) Z-Tyr(Bu^t)-OH und 13,15 g (40,0 mMol) H-D-Phe-MeLeu-OMe.HCl wie in Stufe 74 . Das Produkt wurde durch Silicagelkolonnenchromatografie unter Verwendung von Chloroform und 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform als Lösungsmittel gereinigt. Ausbeute 60%, Öl, R_fG 0,48, R_fP 0,71, R_fQ 0,73.

Stufe 77

Eine Lösung von 6,52 g (9,76 mMol) Z-Tyr(Bu^fc)-D-Phe-MeLeu-OMe und 97,6 mMol Hydrazinhydrat in 50 ml Methanol wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Methanol wurde im Vakuum entfernt und das Hydrazid wurde aus Methanol/Äther kristallisiert mit Methanol/Wasser (1:1 V/V) und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 5,2 g (80%), Fp 135°C, R_fD 0,75, R_fE 0,69, R_fF 0,66, R_fH 0,79, R_fQ 0,73.

Stufen 78 und 79.

Wie Stufen 60} und 61 . Während des Aufarbeitungsverfahrens fiel das Produkt aus Äthylacetat aus. Es wurde abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 58,5%, Fp 145-148°C, R_fD 0,72, R_fF 0,40, R_fH 0,53, R_fQ 0,18.

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Claims (12)

-A- PATENTANSPRÜCHE:

1./Polypeptide der Formel

worin A für D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Sor, D-Sef !Bu¹) , Γ-1-f.c, i'-Ala oder D-Trp steht, B für Leu oder MoLeu stellt, U tür Azt;\y steht und F für ein Anninoradikal steht oder A für Azqly oder Azala steht, B für Leu steht, E für eine cirt.Kta Bindung steht und F für ein Xthylarriinoradikal steht; sowie die pharmazeutisch und Veterinär zulässigen Säurc^ddicionssalze derselben.

2. Polypeptide nach Anspruch 1 , worin A für D-Tyr, ..-TyT(Mo¹I, D-Ser, D-£or(Bu ), D-Phe, D-AIa oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgiy steht und F für ein Aniinoradikal steht.

3. Polypeptide nach Anspruch 1, worin A für Azgly oder Azala steht, B für Leu steht, E für eine direkte Bindung steht und F für ein Äthylaminoradikal steht.

4. Polypeptide nach Anspruch 1, worin A für D-Tyr(Ke), D-Ser, D-Ser(Bu ), D-Phe, D-AIa oder D-Trp steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.

5. Polypeptide nach Anspruch 1, worin A für D-Tyr(Me), D-Ser(Bu") oder D-Phe steht, B für Leu oder MeLeu steht, E für Azgly steht und F für ein Aminoradikal steht.

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ORIGINAL INSPECTED

"j" 2770245

6. Das Polypepuid dor Formel

7. Das Polypeptid der Formel

"-Jl--f.i3-T:-p-!;e:-D--:-yr(Kc·) 3. Das Polypeptid der Formel

9. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptide nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

(a) Wegnahme ein oder mehrerer üblicher Peptidschutzgruppen von einen·: geschützten Polypeptid, so daß eine Verbindung der Formel I erhalten wird;

(b) Umsetzung von KUu-CH,Rlu-His-OH^-lu-Kis-Trp-CK, Mlu-His-Irp-Ser-CK ,Qiu-Kis-Trp-Ser-Tyr-CK, Ώlu-hiG-Trp-Ser-Tyr-A-CH, Kjlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-OK, i—ι

"-GIu-Kis-Trp-Ser-Tyr-A-E-Arg-CH bzw.

Qlu-Kis-Trp-Ser-Tyr—A-3-Ars-Pro-CH, oder eines geeigneten aktivierten Derivats davon mit

K-Hi3-Trp-£er-Tyr'-A-3-Ar-£-rro-E-F,

K-?rp-Ser-Tyr-A-E-Ars-Pro-E-F, il-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F,

K-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-Arg-Pro-E-?, K-E-Arg-Pro-E-F,

K-Arg-Prc-E-F, K-Pro-E-?

7fl-9R47/0899

ORIGINAL INSPECTED

3 2770245

bzw. H-AZgIy-NH₇ oder einca g^eign^ten aktiviert on Derivat davon in einer Standardpeptidx jpplurc; sroakt ior,; ocur

(c) umsetzung einar Carbonsäure der l-'onicl

^LG iu-Hi 2 -Trp--cr-Tyr--A-B-Ar,:-ⁿro -Z-Ch

oder eines aktivierten Derivats davon mit Ammoniak oder «thylamin.

10. Pharmazeutische oder Veterinäre Zusammensetzung, welche? ein Polypeptid nach Anspruch 1 gemeinsam mit einen r.icht-cjiftiner. pharmazeutisch oder Veterinär zulässiger. Verdünnungsmittel oder Trägermittel enthält.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, welche eine für orale Verabreichung geeignete Form aufweist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 10, welche eine für parentcrale Verabreichung geeignete Form aufweist.

l>»TCNT«KwltTf OB.-INO. H. FiNmr. PiTL -inn H BOMH rUINO. S. ST,«rG^r.R, Uh. rc. net. K.

7098A7/0899

ORIGINAL INSPECTED