AT379818B

AT379818B - Verfahren zur herstellung eines neuen polypeptids

Info

Publication number: AT379818B
Application number: AT328384A
Authority: AT
Original assignee: Ici Plc
Priority date: 1976-05-11
Filing date: 1984-10-15
Publication date: 1986-03-10
Also published as: ATA328384A

Description


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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids, welches Luliberinagonisteigenschaften aufweist. Luliberin ist der international übliche Trivialname für LH-RF   (luteinising   hormone releasing factor) (J. Biol : Chem., 1975,250, 3215). 



   Es ist bekannt (Dutta, Furr, Giles und Horley, Clinical Endocrinology, 1976,5, Ergänzung, S.   29-lys   bis 298s), dass der Einbau von a-Azaaminosäuren an der 6-oder 10-Stellung von Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) aus der Hypophyse weniger wirksam sind als das Ausgangsmolekül. Es wurde nun gefunden, dass der Einbau von Azaglycin an der 10-Stellung in Verbindung mit dem Einbau von verschiedenen D-a-Aminosäuren an der 6-Stellung in Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon aktiver sind als Luliberin. 
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 für Leu oder MeLeu steht, in Form eines pharmazeutisch oder veterinär zulässigen Säureadditionssalzes. 



   In der Formel   (I)   und in der gesamten Beschreibung werden die Aminosäurereste durch ihre Standardabkürzungen (Pure and Applied Chemistry, 1974,40, 317 bis 331) bezeichnet. Ein a-Aza- 
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   Wenn die Konfiguration einer bestimmten Aminosäure nicht angegeben ist, dann besitzt diese Aminosäure (ausser der   a-Aza-aminosäure,   die benachbart zur Carboxygruppe kein asymmetrisches Zentrum enthält) die natürliche L-Konfiguration. 
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 und B für Leu oder MeLeu steht. 



   Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist jene, in welcher A für   D-Tyr (Me), D-Ser (But)   oder D-Phe steht und B für Leu oder MeLeu steht. 



   Die drei bevorzugten erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen besitzen die folgenden Strukturen : 
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 tionssalze sind beispielsweise Hydrochloride, Phosphate, Citrate oder Acetate. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel : 
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 dung der allgemeinen Formel : 
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 einer Verbindung der allgemeinen Formel 

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Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können aus bekannten Verbin- dungen durch Standardpeptidkupplungsreaktionen, Standardpeptidschutzreaktionen und Standard- peptidschutzgruppenabspaltungsreaktionen hergestellt werden, wie sie Fachleuten auf diesem Ge- biet allgemein bekannt sind und wie sie in den Beispielen 1 bis 8 bzw. in den Schemata 1 bis 3 angegeben sind. 



   Wie bereits oben festgestellt, besitzen die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen Luliberinagonisteigenschaften,   d. h.   dass sie ähnliche Wirkungen wie Luliberin aufweisen, ein vom Hypothalamus sezerniertes natürliches Hormon, das auf die Hypophyse wirkt und diese zur Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) und Follikelstimulierungshormon (FSH) veranlasst. Diese beiden Hypophysenhormone spielen bei reproduktiven Prozessen eine Rolle, wobei letzteres nämlich FSH, in den Ovarien eine Förderung der Reifung der Follikeln bewirkt und ersteres, nämlich LH, die Ovulation induziert. Die Verbindungen der Formel   (I)   sind in unerwarteter Weise hinsichtlich des Vermögens der Freisetzung von LH wesentlich wirksamer als Luliberin und eignen sich deshalb für die Beeinflussung und/oder Verbesserung der Vermehrung bei Tieren.

   Sie eignen sich insbesondere für die Züchtung von grossen Haustieren während eines Anöstrus und bei jeder künstlich beeinflussten Züchtung zur genauen Bestimmung der Ovulation. Sie eignen sich auch für die Heilung von Unfruchtbarkeitszuständen bei Mann und Frau. 



   Der Luliberinagonisteffekt der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen kann beispielsweise durch das Vermögen demonstriert werden, eine Ovulation bei mit Androgen sterilisierten Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren oder LH und FSH (gemessen durch doppelte Antikörperradioimmunoassay) in das Blutplasma von unreifen männlichen Ratten oder in das Blutplasma von anöstrischen oder di östrischen Mutterschafen abzugeben. 



   Der obige Test an mit Androgen sterilisierten Ratten wird wie folgt ausgeführt :
Mit Androgen sterilisierte weibliche Ratten, die durch Behandlung am 3., 4. und 5. Tag ihres Lebens mit 100   jig   Testosteronpropionat präpariert worden sind, zeigen einen beständigen östrischen Vaginalschleim und zahlreiche präovulatorische Follikeln in den Ovarien. Die Verabreichung von Luliberin und aktiven Analogen verursacht die Abgabe eines ovulierenden Anstieges an LH und FSH, der durch die Anwesenheit von Eiern in den Fallopischen Tuben und frischen Corpora lutea in den Ovarien bestimmt werden kann. 



   Alle hier beispielsweise genannten Verbindungen sind hinsichtlich ihres Vermögens, eine Ovulation bei Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren, aktiver als Luliberin und zeigen ausserdem keine giftigen Wirkungen, wenn sie in mindestens der 4fachen Dosis ihrer minimal aktiven Dosis verabreicht werden. Insbesondere sind die erfindungsgemäss erhältlichen bevorzugten Verbindungen, die in den Beispielen 4,6 und 7 beschrieben sind, annähernd 100mal so aktiv wie Luliberin. Sie zeigen ausserdem keinerlei toxische Effekte, wenn sie in der 100fachen Menge ihrer minimalen effektiven Dosis verabreicht werden. 



   Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen können in Form eines pharmazeutischen oder veterinär medizinischen Präparates verwendet werden. 



   Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert. 



   In den Beispielen beziehen sich Rf auf die aufsteigende Dünnschichtchromatographie   (t. I. c.)   
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 und Chlor-Stärke-Jodid-Reagentien behandelt. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann bedeuten die angegebenen Rf-Werte, dass ein einziger Fleck durch diese Verfahren bestimmt wurde. 



   Beispiele 1 bis 6 : Synthese von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-A- 
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 wässerigem Methanol mit einem Gehalt an zwei Äquivalenten Chlorwasserstoff über einem 5%igen (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator während 16   h]   und aus   0,1 Mol   Triäthylamin in 1 ml Dimethylformamid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 24 h bei   40C   gerührt. Dimethylformamid wurde im Vakuum abgedampft, und der Rückstand wurde chromatographiert, wobei Dimethylformamid als Eluiermittel verwendet wurde. Das Peptid-hydrochlorid wurde weiter durch Verteilungschromatographie gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem   RfR   n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin   (5 : 1 : 5 :   1 V/V) verwendet wurde. 



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen, die nach dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurden, sind als Beispiele 1 bis 6 in der folgenden Tabelle angeführt. 
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 EMI3.5 
 
<tb> 
<tb> Papierelektrophorese <SEP> RF
<tb> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin)
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Ausbeute <SEP> % <SEP> RfA
<tb> Nr.

   <SEP> PH <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> 1 <SEP> D-Ala <SEP> Leu <SEP> 32 <SEP> 0,97 <SEP> 1,0 <SEP> 0,30
<tb> 2 <SEP> D-Phe <SEP> Leu <SEP> 40 <SEP> 1,0 <SEP> 0,71 <SEP> 0,27
<tb> 3 <SEP> D-Trp <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0,53 <SEP> 0,37 <SEP> 0,37
<tb> 4 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0,92 <SEP> 0,87 <SEP> 0,25
<tb> 5 <SEP> D-Ser <SEP> (Bu <SEP> t) <SEP> Leu <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 
<tb> 6 <SEP> D-Tyr(Me) <SEP> MeLeu <SEP> 26 <SEP> 0,87 <SEP> 0,90 <SEP> 0,34
<tb> 
 
 EMI3.6 
 :Bzl = Benzyl Z = Benzyloxycarbonyl Boc =   tert. Butoxycarbonyl   DMF = Dimethylformamid Die eingekreisten Zahlen beziehen sich auf die betreffende Stufe. 

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  Schema 1 
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 A = D-Phe, D-Trp 

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 Schema 2 
 EMI5.1 
 A = D-Tyr(Me), D-Ser(But) 

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 Schema 3 
 EMI6.1 
 

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Stufe     
Zu einer heftig gerührten und   auf-20 C   abgekühlten Lösung von 33, 84 g (100 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan und 11, 0 ml (100 mMol) N-Methylmorpholin in 200 ml Tetrahydrofuran wurden 9, 0 ml (95 mMol) Äthylchlorformiat zugegeben. Nach 2 min wurde eine   auf-20 C   vorgekühlte Lösung von 17, 10 g (11 mMol) L-Serinmethylester-hydrochlorid und 12, 1 ml (110 mMol) N-Methylmorpholin in 150 ml Dimethylformamid zugegeben, und das Rühren wurde 30 min   bei-20 C   und 3 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die übliche Aufarbeitung ergab ein Öl.

   Zwei Kristallisationen 
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 und das Filtrat wurde auf ein kleines Volumen eingedampft. 200 ml Wasser wurden zugegeben und die Lösung wurde mit dreimal 50 ml Äthylacetat extrahiert. Das Produkt fiel aus der wässerigen Lösung in ungefähr 1 h aus. Umkristallisation aus wässerigem Methanol ergab das Dipeptidamid, 
 EMI7.2 
 
5(V/V) wässerigem Dimethylformamid während 6 h bei Raumtemperatur in Gegenwart von 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff. 



   Stufe   (i)  
Eine Lösung von 13, 5 g   (42,3 mMol) N&alpha;-t-Butoxycarbonyl-N#-nitro-L-arginin, 7,15   g (47 mMol) 
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 von festem Material filtriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft wurde. Der Rückstand wurde zwischen Äthylacetat und Wasser durch eine Gegenstromverteilung (4 Übergänge) verteilt. Die wässerigen Phasen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde zwischen N-Butanol und   5% iger (V/V)   wässeriger Essigsäure durch Gegenstromverteilung (12 Übergänge) verteilt.

   Das durch Eindampfen der vereinigten N-Butanolphase erhaltene rohe 
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 Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft, und eine wässerige Lösung des Rückstandes wurde durch eine Anionenaustauschharzkolonne (AG 1-X2) hindurchgeführt, um dieses   N -t-Butoxycarbonyl-N"'-nitro-arginin   zu entfernen. Die Kolonne wurde dann mit Wasser gewaschen und die vereinigten wässerigen Phasen und Waschflüssigkeiten wurden gefriergetrocknet, wobei das Azapeptidderivat erhalten wurde. Ausbeute 16, 67 g (89%), Fp. 109 bis 1110C (Zers. ), 
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 lösung (4 Äquivalente) während 1 h bei Raumtemperatur behandelt. 



   Stufe      (A=D-Phe)
Eine Lösung von 7, 41 g (24,8 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanin und 3, 62 g (25 mMol) L-Leucinmethylester in 100 ml Äthylacetat wurde auf 0 C abgekühlt und 5, 15 g (25 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei   40C   gerührt.

   Die übliche Aufarbeitung und anschliessende Umkristallisation des Rückstandes aus Äthylacetet/Petrol- 
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 Stufe   &commat;   (A=D-Phe) Katalytische Reduktion über einem 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in 
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    an 1- 2, 4, 5-trichlorphenylester   und 2, 5 g   (7, 6 mMol) D-Phenylalanyl-L-leucin-methylester-hydrochlorid   in Dimethylformamid wurden 1, 1 ml (7,6 mMol) Triäthylamin zugegeben und das   Rühren   wurde über Nacht bei Raumtemperatur fortgesetzt.

   Triäthylaminhydrochlorid wurde abfiltriert und das Filtrat 
 EMI8.2 
 
Eine Lösung von 3, 42 g (5,04 mMol) des vorstehenden Methylesters und 60 mMol Hydrazinhydrat in 30 ml Dimethylformamid wurde bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt und auf ein kleines Volumen konzentriert, worauf das Hydrazid durch Zusatz von 500 ml Wasser ausgefällt wurde. Es 
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 : 41, 83 ml (11 mMol) einer 6, 02 m Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan wurden zu einer Lösung von 1, 85 g (2,75 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin- - hydrazid in 5 ml Dimethylformamid   bei-20 C   zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0, 33 ml (2,89 mMol) t-Butylnitril anschloss.

   Nach 2 min wurde eine   auf-20 C   vorgekühlte Lösung von 1, 89 ml (13,5 mMol) Triäthylamin und 1, 02 g   (2, 5 mMol) N -Nitro-L-arginyl-L-prolylazaglycinamid-   
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 ser (11 : 8 : 2 V/V) als Eluierlösungsmittel gereinigt wurde, Ausbeute 0, 74 g   (29, 3%),   Fp. 137 bis 139 C, RfA0,68,RfB0,72RfC0,58,RfD0,62,RfH0,39,RfK0,95. 



   Stufen   &commat;,     ü   und   &commat;  
10 mMol L-Pyroglutamyl-L-histidin-hydrazid wurden in das Amid überführt, wie es beim Verfahren (a) beschrieben ist und dann mit 11 mMol L-Tryptophyl-L-serin-methylester (hergestellt durch Hydrierung des N-Benzyloxycarbonylderivats über einem 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in Dimethylformamid) während 30 min bei -10 C und 24 h bei   4 C   gekuppelt. Triäthylaminhyrochlorid wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft. Das rohe Peptid wurde durch Silicagelkolonnenchromatographie unter Verwendung von 
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 methylformamid aufgelöst und mit 100 mMol Hydrazinhydrat 4 h behandelt.

   Dimethylformamid wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde mit Äthanol trituriert, gesammelt, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet   (88, 2%),   Fp. 184 bis   189 C,     RfA 0, 18, RfB 0, 55, RfC 0, 39, RfD   0, 27, RfK 0, 58. 



   Stufe   (5)   (A=D-Trp)
4, 87 g (23,6 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden zu einer Lösung von 7, 27 g (21,5 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-D-tryptophan,   3, 12   g (21,5 mMol) Leucinmethylester und 5, 8 g (43 mMol)   1-Hydroxybenzotriazol   in 50 ml Dimethylformamid bei   0 C   zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und in der üblichen Weise aufgearbeitet. Umkristallisation aus Äthylacetat/Petroläther (Kp. 60 bis   800C)   ergab 9, 55 g des Dipeptidderivats, welches bei Dünnschichtchromatographie Spuren von Verunreinigungen zeigt.

   Es wurde durch Silicagelkolonnenchroma- 

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Stufen   &commat;   und   @   [A=D-Tyr   (Me    
3, 54 g (5,0 mMol) des Hydrazids aus Stufe wurden in 10 ml DMF aufgelöst und die gerührte Lösung wurde   auf-20 C   abgekühlt. 3, 38 ml (20 mMol) 5, 92 m HCl in Dioxan wurden zugegeben, worauf sich der Zusatz von 0, 6 ml (5,25 mMol) t-Butylnitrit anschloss. Nach 2 min wurde eine vorgekühlte Lösung von 2, 04 g (5 mMol) H-Arg   (N02) -Pro-Azgly-NH2. HCl   und 3, 55 ml (25 mMol) Triäthylamin in 10 ml DMF zugegeben und das Rühren wurde über Nacht bei 4 C fortgesetzt.

   Das Reaktionsgemisch wurde in der üblichen Weise aufgearbeitet und das rohe Produkt wurde durch Silicagelkolonnenchromatographie unter Verwendung von Chloroform, 5%igem (V/V) Methanol in Chloroform und 10%igem (V/V) Methanol in Chloroform als Eluierlösungsmittel gereinigt. Ausbeute 3, 72 g 
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Katalytische Reduktion über 5%igem (G/G) Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator in DMF/Wasser (8 : 2) während 5 min. 



   Stufe   &commat;   [A=D-Ser(But)]
Eine Lösung von 19, 17 g (32,7 mMol) Z-Tyr(Bzl)-OCp und 32,7 mMol H-Ser(But)-Leu-OMe in 100 ml Dimethylformamid wurde 72 h bei Raumtemperatur stehengelassen. Übliche Aufarbeitung ergab einen Feststoff, der gesammelt, mit Äther gewaschen und getrocknet wurde. Ausbeute 17, 6 g 
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 Wasser (8 : 2 V/V) mit einem Gehalt an 1 Äquivlanet Chlorwasserstoff während 6 h. 



   Stufe   &commat; [A=D-Tyr (Me)]   
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 dung von Äther als Lösungsmittel gereinigt. 



   Stufe   @   [A=D-Tyr(Me)]
Eine Lösung von 4, 85 g (6,69 mMol) Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-MeLeu-OMe und 120,7 mMol Hydrazinhydrat in 150 ml Methanol wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Hydrazid wurde durch Zusatz von Wasser ausgefällt, gesammelt und aus Methanol/Wasser kristallisiert. Ausbeute 91, 1%, Fp. 129 bis   131 C,   RfD 0,79, RfE 0,60, RfF 0,68 RfH 0,73, RfQ 0,77. 



   Stufen      und   &commat;     [A=D-Tyr     (mye) 1  
Umkristallisiert aus Methanol/Äther, Ausbeute   23, 8%,   Fp. 152 bis 154 C, RfA 0,67, RfB 0,68, RfC0,58, RfD0,59,RfH0,50,RfK0,94,RfQ0,35. 



   Beispiele 7 und 8 : Durch Anwendung des für die Beispiele 1 bis 6 beschriebenen Verfahrens kann man die folgenden Verbindungen herstellen : 

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 EMI11.1 
 
 EMI11.2 
 
<tb> 
<tb> Papier-elektrophorese
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Rf <SEP> (realtiv <SEP> zu <SEP> Luliberin) <SEP> RfA
<tb> Nr.
<tb> 



  PH <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 5
<tb> 7 <SEP> D-Ser <SEP> Leu <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 
<tb> 8 <SEP> D-Phe <SEP> MeLeu <SEP> 0, <SEP> 84 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 35 <SEP> 
<tb>

Claims

EMI11.3 EMI11.4 EMI11.5 Leu oder MeLeu steht, in Form eines pharmazeutisch oder veterinär verwendbaren Säureadditionssalzes, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel EMI11.6 EMI11.7 dung der allgemeinen Formel : EMI11.8 einer Verbindung der allgemeinen Formel EMI11.9 EMI11.10 EMI11.11 EMI11.12