AT379598B

AT379598B - Verfahren zur herstellung eines neuen polypeptids

Info

Publication number: AT379598B
Application number: AT328284A
Authority: AT
Original assignee: Ici Plc
Priority date: 1976-05-11
Filing date: 1984-10-15
Publication date: 1986-01-27
Also published as: ATA328284A

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptids, welches Luliberinagonisteigenschaften aufweist. Luliberin ist der international übliche Trivialname für LH-RF (luteinising hormone releasing factor)   (J. Biol. Chem., [1975],   250,3215). 



   Es ist bekannt (Dutta, Furr, Giles und Morley, Clinical Endocrinology, [1976], 5, Ergänzung, S. 291s bis 298s), dass der Einbau von a-Aza-aminosäuren an der   6- oder 10-Stellung   von Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) aus der Hypophyse weniger wirksam sind als das Ausgangsmolekül. Es wurde nun gefunden, dass der Einbau von Azaglycin an der 10-Stellung in Verbindung mit dem Einbau von verschiedenen D-a-   - Aminosäuren   an der 6-Stellung in Luliberin Verbindungen ergibt, die hinsichtlich der Freisetzung von Luteinisierungshormon aktiver sind als Luliberin. 



   Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Formel : 
 EMI1.1 
 in welcher A für D-Tyr,   D-Tyr (Me),   D-Ser,   D-Ser   (But), D-Phe-, D-Ala oder D-Trp steht und B für Leu oder MeLeu steht, in Form eines pharmazeutisch oder veterinär zulässigen Säureadditionssalzes. 



   In der Formel   (I)   und in der gesamten Beschreibung werden die Aminosäurereste durch ihre Standardabkürzungen (Pure and Applied Chemistry, [1974], 40,317 bis 331) bezeichnet. Ein a-Aza-   - aminosäurerest   ist ein solcher, in welchem das a-CH einer Aminosäure durch Stickstoff ersetzt worden ist. Die Abkürzung für eine   a-Aza-aminosäure   leitet sich von der entsprechenden Aminosäure durch Hinzufügung der   Vorsilbe"Az"ab.   Somit steht Azgly für Azaglycin. 



   Wenn die Konfiguration einer bestimmten Aminosäure nicht angegeben ist, dann besitzt diese Aminosäure (ausser der a-Aza-aminosäure, die benachbart zur Carboxygruppe kein asymmetrisches Zentrum enthält) die natürliche L-Konfiguration. 



   Eine spezielle Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist :
Verbindungen, in welche A für   D-Tyr (Me),   D-Ser,   D-Ser (But),   D-Phe, D-Ala oder D-Trp und B für Leu oder MeLeu steht. 



   Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen ist jene, in welcher A für D-Tyr (Me), D-Ser (But) oder D-Phe steht und B für Leu oder MeLeu steht. 



   Die drei bevorzugten erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen besitzen die folgenden Strukturen : 
 EMI1.2 
 
 EMI1.3 
 additionssalze sind beispielsweise Hydrochloride, Phosphate, Citrate oder Acetate. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel   Pro-Azgly-NH   in Form eines pharmazeutisch oder veterinär verwendbaren Säureadditionssalzes mit einer Verbindung der allgemeinen Formel 
 EMI1.4 
 einer Verbindung der allgemeinen Formel 
 EMI1.5 
 

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 worin   R 1 ein   Aktivester ist, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel 
 EMI2.1 
 in Gegenwart von   N, N 1 -Dicyclohexylcarbodiimid   umsetzt. 



   Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können aus bekannten Verbindungen durch Standardpeptidkupplungsreaktionen, Standardpeptidschutzreaktionen und Standard-   peptidschutzgruppenabspaltungsreaktionen   hergestellt werden, wie sie Fachleuten, auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind und wie sie in den Beispielen 1 bis 8 bzw. im Schema angegeben sind. 



   Wie bereits oben festgestellt, besitzen die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen Luliberinagonisteigenschaften, d. h., dass sie ähnliche Wirkungen wie Luliberin aufweisen, ein vom Hypothalamus sekretiertes natürliches Hormon, das auf die Hypophyse wirkt und diese zur Freisetzung von Luteinisierungshormon (LH) und Follikelstimulierungshormon (FSH) veranlasst. Diese beiden Hypophysenhormone spielen bei reproduktiven Prozessen eine Rolle, wobei letzteres, nämlich FSH, in den Ovarien eine Förderung der Reifung der Follikeln bewirkt und ersteres, nämlich LH, die Ovulation induziert. Die Verbindungen der Formel (I) sind in unerwarteter Weise hinsichtlich des Vermögens der Freisetzung von LH wesentlich wirksamer als Luliberin und eignen sich deshalb für die Beeinflussung und/oder Verbesserung der Vermehrung bei Tieren.

   Sie eignen sich insbesondere für die Züchtung von grossen Haustieren während eines Anöstrusses und bei jeder künstlich beeinflussten Züchtung zur genauen Bestimmung der Ovulation. Sie eignen sich auch für die Heilung von Unfruchtbarkeitszuständen bei Mann und Frau. 



   Der Luliberinagonisteffekt der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen kann beispielsweise durch das Vermögen demonstriert werden, eine Ovulation bei mit Androgen sterilisierten Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren oder LH und FSH (gemessen durch doppelte Antikörperradioimmunoassay) in das Blutplasma von unreifen männlichen Ratten oder in das Blutplasma von anöstrischen oder diöstrischen Mutterschafen abzugeben. 



   Der obige Test an mit Androgen sterilisierten Ratten wird wie folgt ausgeführt :
Mit Androgen sterilisierte weibliche Ratten, die durch Behandlung am 3., 4. und 5. Tag ihres Lebens mit 100   Ilg   Testosteronpropionat präpariert worden sind, zeigen einen beständigen östrischen Vaginalschleim und zahlreiche präovulatorische Follikeln in den Ovarien. Die Verabreichung von Luliberin und aktiven Analogen verursacht die Abgabe eines ovulierenden Anstiegs an LH und FSH, der durch die Anwesenheit von Eiern in den Fallopischen Tuben und frischen Corpora lutea in den Ovarien bestimmt werden kann. 



   Alle hier beispielsweise genannten Verbindungen sind hinsichtlich ihres Vermögens, eine Ovulation bei Ratten mit konstantem Östrus zu induzieren, aktiver als Luliberin und zeigen ausserdem keine giftigen Wirkungen, wenn sie in mindestens der 4fachen Dosis ihrer minimal aktiven Dosis verabreicht werden. Insbesondere sind die erfindungsgemäss erhältlichen bevorzugten Verbindungen, die in den Beispielen 4,6 und 7 beschrieben sind, annähernd 100mal so aktiv wie Luliberin. Sie zeigen ausserdem keinerlei toxische Effekte, wenn sie in der 100fachen Menge ihrer minimalen effektiven Dosis verabreicht werden. 



   Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen können in Form eines pharmazeutischen oder veterinär medinizischen Präparates verwendet werden. 



   Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert. 



   In den Beispielen bezieht sich Rf auf die aufsteigende Dünnschichtchromatographie   (t. l. c.)   auf Silicagelplatten (Kieselgel G). Die in dieser Chromatographie verwendeten Lösungsmittelsysteme 
 EMI2.2 
 Chloroform/Methanol/Wasser (11 : 8 : 2 V/V)   (RfK),   Chloroform/Methanol   (19 : 1   V/V) (RfP) und Chloroform/Methanol (9 : 1 V/V) (R Q) und n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin   (5 : 1 : 5 : 1   V/V)   (RfR).   

 <Desc/Clms Page number 3> 

 



   In allen diesen Fällen wurden die Platten unter   UV-Licht   geprüft und mit Fluorescamin, Ninhydrin und Chlor-Stärke-Jodid-Reagentien behandelt. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann bedeuten die angegebenen Rf-Werte, dass ein einziger Fleck durch diese Verfahren bestimmt wurde. 



   Beispiele 1 bis 6 : Synthese von   L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-     - L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamid.    
 EMI3.1 
    2 mMol- L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-B-L-arginin-hydrazid   in 0, 9 ml Dimethylformamid und   0, 7 ml   Dimethylsulfoxyd wurden 0,8 mMol 5,7n-Chlorwasserstoff in Dioxan zugegeben. Nach einem 5 min 
 EMI3.2 
 wässerigem Methanol mit einem Gehalt an zwei Äquivalenten Chlorwasserstoff über einem 5%igen   (CJC)   Palladium-auf-Holzkohle-Katalysator während 16 h] und aus   0,1 Mol   Triäthylamin in 1 ml 
 EMI3.3 
 Dimethylformamid als Eluiermittel verwendet wurde.

   Das Peptidhydrochlorid wurde weiter durch Verteilungschromatographie gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem   Rif R   n-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (5 : 1 : 5 : 1 V/V) verwendet wurde. Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen, die nach dem vorstehenden Verfahren hergestellt wurden, sind als Beispiele 1 bis 6 in der folgenden Tabelle angeführt. 
 EMI3.4 
 
 EMI3.5 
 
 EMI3.6 
 
<tb> 
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Ausbeute <SEP> % <SEP> Papierelektrophorese <SEP> RF
<tb> Nr.

   <SEP> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin)
<tb> RfA
<tb> pH <SEP> 2,1 <SEP> pH <SEP> 6,5
<tb> 1 <SEP> D-Ala <SEP> Leu <SEP> 32 <SEP> 0,97 <SEP> 1,0 <SEP> 0,30
<tb> 2 <SEP> D-Phe <SEP> Leu <SEP> 40 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0,71 <SEP> 0,27
<tb> 3 <SEP> D-Trp <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 0,37 <SEP> 0,37
<tb> 4 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> Leu <SEP> 15 <SEP> 0,92 <SEP> 0,87 <SEP> 0,25
<tb> 5 <SEP> D-Ser <SEP> (But) <SEP> Leu <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 
<tb> 6 <SEP> D-Tyr <SEP> (Me) <SEP> MeLeu <SEP> 26 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 90 <SEP> 0, <SEP> 34 <SEP> 
<tb> 
 
Die Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemässe Verfahren können so erhalten werden, wie es in dem folgenden Schema beschrieben ist. 



   In diesem Schema wurden die folgenden Abkürzungen verwendet :
Bzl = Benzyl
Boc = tert. Butoxycarbonyl 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 
 EMI4.1 
 
 EMI4.2 
 
 EMI4.3 
 
 EMI4.4 
 
 EMI4.5 
 
<tb> 
<tb> Beispiel <SEP> A <SEP> B <SEP> Papierelektrophorese <SEP> Rf
<tb> Nr. <SEP> (relativ <SEP> zu <SEP> Luliberin)
<tb> PH <SEP> 2, <SEP> 1 <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> RfA <SEP> 
<tb> 7 <SEP> D-Ser <SEP> Leu <SEP> 0, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 96 <SEP> 0,25
<tb> 8 <SEP> D-Phe <SEP> MeLeu <SEP> 0,84 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0,35
<tb>

Claims

EMI4.6 EMI4.7 EMI4.8 <Desc/Clms Page number 5> EMI5.1 einer Verbindung der allgemeinen Formel EMI5.2 worin R'ein Aktivester ist, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel EMI5.3 in Gegenwart von N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid umsetzt.