DE69816409T2

DE69816409T2 - Kristallines Parathyroidhormon

Info

Publication number: DE69816409T2
Application number: DE69816409T
Authority: DE
Inventors: Faming Zhang
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2018-12-17
Also published as: CA2315103A1; KR20010033268A; NO20003131L; AU748271B2; WO1999031137A1; EA200000672A1; DE69816409D1; EP0926158A1; HUP0100075A2; NO20003131D0; JP2002508395A; PE20000056A1; EP0926158B1; ATE245165T1; PL341209A1; CN1281467A; TR200002179T2; AU1632699A; US6590081B1; ES2202729T3

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine reine kristalline Form eines Parathormons. Insbesondere betrifft die Erfindung die kristalline Form von Teriparatid PTH(1-34) und Verfahren zur Herstellung und Reinigung des fragmentierten Hormons.
Hintergrund der Erfindung
Das Parathormon (PTH) ist ein sekretiertes, 84 Aminosäuren langes Produkt der Nebenschilddrüse des Säugers, das die Calciumspiegel durch dessen Wirkung auf die verschiedenen Gewebe, einschließlich des Knochens, kontrolliert. Studien beim Menschen mit bestimmten Formen von PTH haben eine anabole Wirkung auf den Knochen gezeigt und ein signifikantes Interesse für dessen Verwendung zur Behandlung von Osteoporose und verwandten Knochenstörungen hervorgerufen.
Unter Verwendung der N-terminalen 34 Aminosäuren des Hormons vom Rind und vom Menschen, die gemäß aller veröffentlichter Daten zum Vollängenhormon biologisch äquivalent sein sollten, wurde beim Menschen gezeigt, daß das Parathormon das Knochenwachstum fördert, insbesondere wenn es in einer pulsartigen Weise auf subkutanen und intravenösen Wegen verabreicht wird. Eine leicht unterschiedliche Form von PTH, das humane PTH(1-38), hat ähnliche Ergebnisse gezeigt.
Die PTH Präparationen wurden aus frischem oder lyophilisiertem Hormon rekonstituiert und umfassen verschiedene Formen von Trägern, Hilfsstoffen und Vehikeln. Die meisten werden in Wasser-basierten Vehikeln hergestellt, wie Kochsalzlösung oder Wasser, das typischerweise mit Essigsäure zur Solubilisierung des Hormons angesäuert wurde. Die Mehrzalil der beschriebenen Formulierungen enthalten auch Albumin als Stabilisator (siehe beispielsweise Reeve et al., Br. Med. J. 1980, 280: 6228, Reeve et al., Lancet, 1976, 1: 1035, Reeve et al., Calcif. Tissue res., 1976, 21: 469, Hodsman et al., Bone Miner, 1990, 9(2): 137, Tsai et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1989, 69(5), 1024, Isaac et al., Horm. Metab. Res. 1980, 12(9): 487, Law et al., J. Clin. Invest. 1983, 72(3): 1106 und Hulter, J. Clin. Hypertens. 1986, 2(4): 360). Andere beschriebene Formulierungen haben einen Hilfsstoff wie Mannit eingearbeitet, der entweder im lyophilisierten Hormon oder im Rekonstitutionsvehikel vorhanden ist. Formulierungen, die für die repräsentativ sind, welche für die Humanstudien verwendet wurden, umfassen eine humane PTH (1-34) (SEQ ID. Nr. 2) Präparation, die nach der Rekonstitution aus Mannit, hitzeinaktiviertes humanes Serumalbumin und Capronsäure (einem Proteaseinhibitor) als Absorptionsförderer enthält (siehe Reeve et al., 1976, Calcif. Tissue Res., 21, Suppl., 469–477), eine humane PTH (1-38) Präparation, die in einem Kochsalzvehikel rekonstituiert ist (siehe Hodsman et al. 1991, 14(1), 67–83) und eine Rinder-PTH (1-34) Präparation in einem wässrigen Vehikel, wobei der pH mit Essigsäure eingestellt ist und die Albumin enthält. Es existiert auch eine internationale Referenzpräparation, die für humanes PTH (1-84) (SEQ ID Nr. 1) aus 100 ng Hormon besteht, das sich mit 250 μg humanem Serumalbumin und 1,25 mg Lactose in einer Ampulle befindet (1981) und für Rinder-PTH (1-84) aus 10 mg lyophilisiertem Hormon in 0,01 M Essigsäure und 0,1% G/V Mannit besteht (siehe Matindale, The Extra Pharmacoepia, The Pharmaceutical press, London, 29. Ausgabe, 1989, Seite 1338).
Die kommerzielle Nutzung des Parathormons erfordert die Entwicklung einer Formulierung, die in Bezug auf die Lagerstabilität und Einfachheit der Anwendung annehmbar ist. Da es ein Protein ist und somit viel empfindlicher ist als die traditionellen niedermolekularen Arzneimittel, liefert die Formulierung des Parathormons Herausforderungen, mit denen die pharmazeutische Industrie gewöhnlich nicht konfrontiert wird. Darüberhinaus ist PTH, wie andere Proteine, die erfolgreich formuliert wurden, insbesondere gegenüber Oxidation, Desaminierung und Hydrolyse empfindlich und erfordert ferner, daß deren N-terminale und C-terminale Sequenzen intakt bleiben, um die Bioaktivität zu erhalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zur Herstellung von kristallinen Formen eines fragmentierten Parathormons (PTH), die vorher nicht beschrieben wurden. Die Vorteile einer kristallinen Form des Hormons sind die Reinheit des Produkts und die Lagerstabilität. So kann beispielsweise eine kristalline Form von PTH leicht in einer sterilen Lösung in Gläschen für eine parenterale Verabreichung gelöst werden. Als kristallines Material kann PTH auch erforderlichenfalls in andere Zusammensetzungen formuliert werden, wie beispielsweise Tabletten, Kapseln oder Zäpfchen.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt eine neue kristalline Form eines Parathormons, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) und PTH(1-41) und insbesondere kristallinem, humanem PTH (1-34) (SEQ ID Nr. 2), das im allgemeinen als Teriparatid bekannt ist, in Form von tetragonalen Platten oder kubischen Kristallen, die beide eine Raumgruppe P422 aufweisen und die folgenden Einheitszellenkonstanten haben: a = b = 91,071 Å, c = 37,665 Å, α = β = γ = 90°.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung eines Parathormons, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellung einer wäßrigen Lösung des Hormons mit einer Konzentration von 5 bis 40 mg pro ml,
(b) Mischen der Lösung mit einer Stammlösung, die ein organisches Lösemittel mit einer Konzentration von 5 bis 50 Volumenprozent und einen Puffer mit einer Konzentration enthält, um den pH der Lösung zwischen 6,0 und 12,0 zu halten, und
(c) Stehenlassen der Lösung für eine vorbestimmte Zeit bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 4°C bis sich plattenähnliche Kristalle bilden.

Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung eines Parathormons, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellung einer wäßrigen Lösung des Hormons mit einer Konzentration von 5 bis 40 mg/ml,
(b) Mischen dieser Lösung mit einer Stammlösung, die ein Phosphat- oder Formiatfällungssalz mit einer Konzentration von 0,5 M bis 2,5 M und wahlweise eine wäßrige Pufferlösung oder ein Gemisch hiervon mit einer Konzentration enthält, um den pH zwischen 4,0 und 6,0 zu halten, und
(c) Stehenlassen der Lösung für eine vorbestimmte Zeit zwischen Raumtemperatur und 4°C bis sich kubische Kristalle bilden.

Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine neue kristalline Form eines Parathormons, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) und PTH(1-41) und insbesondere kristallinem, humanem PTH (1-34) (SEQ ID Nr. 2) in Form von hexagonalen Kristallen mit einer Raumgruppe P622 und der folgenden Einheitszellenkonstanten: a = b = 30,169 Å, c = 110,597 Å, α = β = 90°, γ = 120°.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung als fünften Aspekt ein Verfahren zur Reinigung eines Parathormons, das gekennzeichnet ist durch:

(a) Bereitstellung einer Lösung eines Parathormons, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) und PTH(1-41) mit einer Konzentration von 5 bis 40 mg/ml in 10 bis 30 Volumenprozent Glycerin,
(b) Mischen dieser Lösung mit einer Stammlösung, die ein organisches Lösemittel mit einer Konzentration von 5 bis 50 Volumenprozent, Ammoniumsulfat mit einer Konzentration von 0,5 M bis 3,0 M und einen Puffer mit einer Konzentration enthält, um den pH der Lösung zwischen 3,0 und 7,0 zu halten, und
(c) Stehenlassen der Lösung für eine vorbestimmte Zeit bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 4°C bis sich hexagonale Kristalle bilden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 ist eine Photographie, die PTH (1-34) Kristalle zeigt, welche in Beispiel 1 erzeugt wurden.
Die 2 ist eine Photographie, die PTH (1-34) Kristalle zeigt, welche in Beispiel 4 erzeugt wurden.
Detaillierte Beschreibung
Die Endung betrifft eine reine kristalline Form eines fragmentierten Parathormons in dessen stabilster Form für die Lagerung und für die direkte Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verabreichung an Humanpatienten.
Das kristalline Material kann als Wirkstoff Fragmente oder Varianten von Fragmenten von humanem PTH oder von PTH der Ratte, des Schweins oder des Rinds enthalten, die humane PTH Aktivität aufweisen, wie dies im ovarektomierten Rattenmodell der Osteoporose bestimmt wird, wie es von Kimmel et al, Endocrinology, 1993, 32(4): 1577 berichtet wurde.
Die Parathormonfragmente enthalten zumindest die ersten 34 N-terminalen Reste, wie PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) und PTH(1-41). Alternativen in Form von PTH Varianten enthalten die 1 bis 5 Aminosäuresubstitutiouen, die die PTH Stabilität und Halbwertszeit verbessern, wie der Ersatz der Methioninreste an den Positionen 8 und/oder 18 durch Leucin oder anderen hydrophoben Aminosäuren, die die PTH Stabilität gegenüber Oxidation verbessern und der Austausch der Aminosäuren in der Region 25–27 durch Trypsin-unempfindliche Aminosäuren. wie Histidin oder andere Aminosäuren, die die PTH Stabilität gegenüber Protease verbessern. Diese PTH Formen werden durch den Ausdruck "Parathormon" umfaßt, wie er hierin allgemein verwendet wird. Das bevorzugte Hormon ist humanes PTH (1-34) (SEQ ID. Nr. 2), das auch als Teriparatid bekannt ist. Die Hormone können durch rekombinante oder synthetische Verfahren erhalten werden, wie sie in US 4 086 196 A beschrieben sind, die hiermit eingeführt ist.
Die PTH Kristalle, die Gegenstand der Erfindung sind, können aus einer Stammlösung oder Fälllösung, die einen Puffer enthält und wahlweise einem organischen Lösemitel oder Salz hergestellt oder gezogen werden, wobei die Konzentration der Reagenzien und der pH sorgfältig innerhalb der vorgeschriebenen Grenzen kontrolliert wird. Es kann jede der gut bekannten grundlegenden Kristallisationstechniken zum Ziehen der Hormonkristalle verwendet werden. Die Kristalle können beispielsweise bei Raumtemperatur und hinunter bis zu 4°C durch einen sitzenden Tropfen, einen hängenden Tropfen, Animpf- und/oder Batchkristallisationsgerät gezogen werden. Das Batchverfahren ist für Präparationen im großen Maßstab bevorzugt.
Beim Verfahren des hängenden Tropfens wird ein kleiner Tropfen einer Proteinlösung auf ein Deckgläschen oder eine Glasplatte gegeben, die umgedreht über ein Gefäß mit Lösung gegeben und verschlossen wird. Die Lösung im Gefäß enthält ein Fällmittel, das ebenfalls in einer geringeren Menge im Proteintropfen vorhanden ist. Das Fällmittel hat eine zweifache Funktion. Erstens weist die Lösung im Gefäß anfänglich einen geringeren Dampfdruck auf, als der Proteintropfen, so daß die Verdampfung mit einer festgelegten Geschwindigkeit durch den Unterschied zwischen dein Dampfdruck und dein Abstand fortschreitet, den der Dampf (gewöhnlich Wasser) diffundieren muß. Zweitens verringert das Fällmittel die Löslichkeit des Proteins in Lösung durch die Konkurrenz mit dem Protein um verfügbares Lösemittel und so wird die bezüglich des Proteins übersättigt, wenn die Verdampfung aus dem Proteintropfen einsetzt. Unter den geeigneten Bedingungen, einschließlich pH, Proteinkonzentration und Temperatur tritt dann die Kristallisation des Proteins oder Makromoleküls auf.
Das Batchverfahren umfaßt im allgemeinen die langsame Zugabe eines Fällmittels zu einer wässrigen Proteinlösung, bis die Lösung trüb wird, wobei zu diesem Zeitpunkt der Behälter verschlossen wird und für eine bestimmte Zeit ungestört steht.
Die PTH Kristalle können entweder mittels basischer Bedingungen oder saurer Bedingungen mit einem der obigen Verfahren erhalten werden.
Unter basischen Bedingungen wird das PTH Fragment zuerst in gereinigter, lyophilisierter Form erhalten. Das lyophilisierte Protein wird in Wasser bei einer Konzentration von 5 mg/ml bis 40 mg/ml, vorzugsweise 5 mg/ml bis 20 mg/ml gelöst. Die wässrige Proteinlösung wird dann mit einer Stammlösung gemischt, die 5 bis 50 Volumenprozent, vorzugsweise 10 bis 20 Volumenprozent eines organischen Lösemittels und einen Puffer in einer Menge enthält, um den pH Bereich von etwa 6,0–12,0 aufrechtzuerhalten. Die wässrige Lösung und die Stammlösung werden vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt.
Das verwendete organische Lösemittel kann beispielsweise unter anderem Methanol Ethanol, Isopropanol, Polyethylenglycol, Ethylenglycol oder ein Gemisch hiervon sein. Es kann jeder Puffer verwendet werden, vorzugsweise jeder biologische Puffer, beispielsweise die Trishydroxymethylaminomethansalze, wie das Maleat oder das Hydrochlorid, oder ein Glycinpuffer. Alkalimetallsalze können auch in Abhängigkeit des gewünschten pH verwendet werden. Beispielsweise kann eine Citratquelle, wie Natriumcitrat, als leicht basischer Puffer verwendet werden.
Die Kristallisation unter basischen Bedingungen ergibt plättchenartige Kristalle. Insbesondere werden beispielsweise plättchenähnliche Teriparatidkristalle unter Verwendung der oben beschriebenen basischen Bedingungen innerhalb von etwa 48 Stunden bei Raumtemperatur und bei 4°C mit einer ungefähren Größe von 0,1 mm × 0,1 mm × 0,05 mm erzeugt.
Unter sauren Bedingungen wird das PTH Fragment auf dieselbe Weise in einer wäßriggen Lösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml bis 40 mg/ml, vorzugsweise 5 mg/ml bis 20 mg/ml hergestellt. Die das Protein enthaltende, wäßige Lösung wird mit einer Stmmlösung gemischt, die ein Salz und/oder einen Puffer in einer Menge enthält, um einen pH zwischen 4,0 und 6,0 aufrechtzuerhalten. Die Protein- und Pufferlösungen werden vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt.
Die Stammlösung enthält ein Fällsalz, wie beispielsweise ein Phosphatformiat mit einer Konzentration von 0,5 M bis 2,5 M.
Der in der Stammlösung verwendete Puffer kann jeder biologisch annehmbare Puffer in einem pH Bereich von 4,0–6,0 sein. Solche Puffer sind beispielsweise verschiedene Phosphate, Formiate, Acetate, Tartrate und dergleichen, einscliließlich Gemische hiervon, die in Form ihrer jeweiligen Alkalimetallsalze vorliegen, beispielsweise Natrium und/oder Kalium. Wenn ein Phosphat oder Formiatsalz als Fällsalz verwendet wird, kann ein zusätzlicher Puffer nur dann zugegeben werden, wenn dies erwünscht ist.
Die Kristallisation in sauren Medien ergibt kubische Kristalle. Daher werden beispielsweise kubische Teriparatidkristalle innerhalb von 48 Stunden mittels der oben beschriebenen sauren Bedingungen bei Raumtemperatur und bei 4°C mit einer ungefähren Größe von 0,1 mm × 0,1 mm × 0,1 mm angezogen.
Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die kristalline Form des Teriparatids, nämlich humanes PTH (1-34) (SEQ ID Nr. 2). Kristallines Teriparatid, das durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wird durch Röntgenkristallographie mit einem Kristallsystem aus tetragonalen Platten oder kubischen Kristallen mit einer Symmetrie oder Raumgruppe von P422 und der folgenden Zellendimension mit den Einheitszellenkonstanten charakterisiert:
a = b = 91,071 Angström (Å)
c = 37,665 Å
α = β = γ = 90°
In einer alternativen Ausführungsform wird das wie oben beschrieben erhaltene PTH Fragment in einer Lösung gelöst, die 10 bis 30 Volumenprozent Glycerin, vorzugsweise 20 Volumenprozent enthält, wobei die Proteinkonzentration 5 mg bis 40 mg/ml, vorzugsweise 5 mg/ml bis 2 mg/ml beträgt. Die Glycerinproteinlösung wird dann mit einer Stammlösung gemischt, die 5 bis 50 Volumenprozent, vorzugsweise 5 bis 20 Volumenprozent eines organischen Lösemittels und einen Puffer in einer Menge enthält, um einen pH Bereich von 3,0 bis 7,0 aufrechtzuerhalten. Die Proteinlösung und die Stammlösung werden vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt.
Die organischen Lösemittel sind die vorher beschriebenen. Isopropanol ist bevorzugt. Puffer, die vorher beschrieben wurden, können in Abhängigkeit des gewünschten pH Werts im Bereich von 3–7 verwendet werden. Als Puffer bevorzugt ist ein Citratsalz, beispielsweise Natriumcitrat. Zusätzlich zum obigen Lösemittel und Puffer enthält die Stammlösung ein Fällsalz, wie Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 0,5 bis 3,0 M.
Die Kristallisation in Glycerimnedien ergibt hexagonalartige Kristalle. So werden beispielsweise hexagonalartige Kristalle von humanem PTH (1-34) (SEQ ID Nr. 2) innerhalb von etwa 12 bis 24 Stunden mittels der oben beschriebenen Bedingungen bei Raumtemperatur und bei 4°C mit einer geeigneten Größe von 0,2 mm × 0,2 mm × 0,6 mm erzeugt. Die Röntgenkristallographie der hexagonalartigen Kristalle zeigt ein Kristallsystem mit einer Symmetrie- oder Raumgruppe P622 und den folgenden Zellendimensionen mit Einheitszellenkonstanten: a = b = 30,169 Å, c = 110,597 Å, α = β = 90°C, γ = 120°.
Der Vorteil einer kristallinen Form für fragmentiertes PTH und insbesondere für Teriparatid ist, daß das kristalline Material, das einmal erhalten wurde, den therapeutischen Wirkstoff in seiner reinsten und stabilsten Form liefert. Daher kann das kristalline Material mit einer längeren Haltbarkeit als vorherige Formen des Hormons oder Lösung hiervon gelagert werden. Das kristalline Material kann dann direkt zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen zur Verabreichung an Patienten verwendet werden. So kann das kristalline PTH beispielsweise direkt mit sterilen Lösungen in Gläschen oder Kartuschen für eine parenterale Verabreichung gelöst werden.
Die PTH Lösung enthält PTH in einer medizinisch wirksamen Menge, ein Ausdruck, der in Bezug auf Mengen verwendet wird, die entweder therapeutisch oder bei medizinischer Diagnose brauchbar sind. Die bestimmte Menge an Parathormon, die in die Präparation eingearbeitet wird, kann auf der Grundlage des ausgewählten PTH Typs und der beabsichtigten Endverwendung der Präparation vorher bestimmt werden. In einer Anwendung werden die Präparationen für therapeutische Zwecke verwendet und insbesondere zur Behandlung der Osteoporose. Die Osteoporosetherapie umfaßt die Verabreichung der rekonstituierten Präparation durch Injektion, vorteilhafterweise subkutane Injektion in Einheitsdosen, die den vorgeschriebenen Behandlungsplan widerspiegeln, die beispielsweise für humanes PTH (1-34) (SEQ ID. Nr. 2) im Bereich von 25 μg PTH/ml injizierter Lösung bis 1000 μg/ml injizierter Lösung pro Patient liegen, wobei die Injektionsvolumina vorteilhafterweise 0,02 bis 1,3 ml betragen. Demnach wird kristallines hPTH (1-34) (SEQ ID Nr. 2) vorteilhafterweise mit einem Puffer und einem Hilfsstoff unter Bildung einer wässrigen Lösung eingearbeitet, die PTH in einem Konzentrationsbereich von 25 μg/ml bis 1000 μg/ml, vorzugsweise 100 μg/ml bis 500 μg/ml enthält.
In einer Ausführungsform werden die Präparationen in einer Form bereitgestellt, die einen Einheitsbehälter von 100–500 μg humanes PTH (1-34) (SEQ ID Nr. 2) nach einer Rekonstitution in etwa 1 ml (0,8–1,2 ml) des Rekonsututionsvehikels ergibt und die Gläschen werden demnach mit etwa 1 ml der wässrigen PTH Präparation für eine anschließende Gefriertrocknung befüllt.
Wenn die Präparation als wässrige Lösung erhalten wird, die die gewünschten Mengen und Konzentrationen des Puffers, Hilfsstoffs und PTH enthält, werden die einzelnen Gläschen mit der Lösung bis zum gewünschten Volumen gefüllt. Der Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die obige Lösung mit sterilem Wasser ohne einen Gefriertrocknungsprozeß hergestellt werden kann.
Zusätzlich zu ihrer therapeutischen Verwendung kann die PTH Zusammensetzung zur Mithilfe in der medizinischen Diagnose formuliert und verabreicht werden und insbesondere, um beim Aufbau der Diagnose von Hypoparathyreoidismus und Pseudohyopoparathyreoidismus bei hypercalzämischen Patienten zu helfen. Bis auf die Dosis an PTH bleibt die Zusammensetzung der PTH Präparation bestehen, wie sie hierin für die therapeutische Verwendung beschrieben ist. Eine intravenös infundierte, einzelne Dosis an humanem PTH (1-34) (SEQ ID. Nr. 2), die 200 internationalen Einheiten an PTH Aktivität entspricht, ist für diesen diagnostischen Zweck geeignet. Dann wird eine Diagnose durch die Bestimmung des Effekts des verabreichten PTH oder der cAMP Mengen im Urin erstellt, wobei die cAMP Erhöhung den Hypoparathyreoidismuszustand anzeigt und nicht die Pseudoform.
Da fragmentiertes PTH jetzt in reiner kristalliner Form erhältlich ist, können andere Dosierungsformen, wie Tabletten, Kapseln, Zäpfchen und dergleichen auch für eine therapeutische oder diagnostische Verabreichung hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele sind für die Erfindung erläuternd und sollen nicht beschränkend wirken.
Beispiele
Beispiel 1
Rekombinantes, humanes rhPTH (1-34) (SEQ ID Nr. 2) wird aus Material hergestellt, das vorher gereinigt und lyophilisiert wird. Das lyophilisierte Protein wird in Wasser mit einer Konzentration von 5 mg/ml bis 20 mg/ml gelöst. Das Protein wird mit der Stammlösung (20% Isopropanol, 0,2 M Natriumcitrat, 0,1 M Tris-HCl Puffer, pH = 8,0) mit einem Verhältnis von 1 : 1 auf siliconbeschichteten Deckgläschen gemischt. Diese Deckgläschen werden umgedreht und über Gefäßen abgedichtet, die 1 ml Stammlösung enthalten. Die Kristalle erscheinen als tetragonale Platten innerhalb von 48–96 Stunden mit der Größe von 0,1 mm × 0,1 mm × 0,05 mm. Das Produkt wird durch Massenspektrometrie bestätigt. Eine Photographie der gezogenen Kristalle ist in 1 gezeigt.
Die Röntgenkristallographie der tetragonalen Platten zeigt eine Raumgruppe P422 und die folgenden Einheitszellenkonstanten: a = b = 91,071 Å, c = 37,665 Å; α = β = γ = 90°.
Beispiel 2
Dasselbe Experiment wie in Beispiel 1 wiederholt und mit einer Stammlösung aus 10 % Isopropanol, 10 Polyethylenglycol und 0,1 M Glycinpuffer pH = 8,5 gemischt.
Beispiel 3
Batchkristallisation: rhPTH (SEQ ID. Nr. 1) mit einer Konzentration von 10 mg/ml wird mit 50% Isopropanol, 100 mM Tris, pH = 7,5, 0,2 M Natriumcitrat mit einem Verhältnis von 1 : 1 in einem Teströhrchen gemischt. Kristalle erscheinen innerhalb von 48–96 Stunden mit der Größe von 0,1 mm × 0,1 mm × 0,05 mm.
Beispiel 4
Das Protein wird auf dieselbe Weise hergestellt, wie in Beispiel 1 und in einem Verhältnis von 1 : 1 mit einer Stammlösung (0,8 M Kaliumphosphat, 0,8 M Natriumphosphat, pH = 5,0) gemischt. Innerhalb von 48 Stunden erscheinen bei Raumtemperatur kubische Kristalle mit einer Größe von 0,1 mm × 0,1 mm × 0,1 mm. Eine Photographie der gezogenen Kristalle ist in 2 gezeigt.
Eine Röntgenkristallographie der kubischen Kristalle zeigt eine Raumgruppe P422 und die folgenden Einheitszellenkonstanten: a = b = 91,071 A, c = 37,665 A, α = ß = γ = 90°.
Beispiel 5
Das Protein wird auf dieselbe Weise hergestellt, wie in Beispiel 1 und in einem Verhältnis von 1 : 1 mit einer Stammlösung (0,8 M Natriumformiat, 0,1 M Natriumacetatpuffer bei pH = 4,5) gemischt. Es erscheinen dieselben Kristalle wie in Beispiel 4.
Beispiel 6
rhPTH (1-34) (SEQ ID Nr. 2) wird aus Material hergestellt, das vorher gereinigt und lyophilisiert wurde. Das lyophilisierte Protein wird in 20% Glycerin mit einer Konzentration von 5 mg/ml bis 20 mg/ml gelöst. Das Protein wird mit Stammlösung (2,4 M Ammoniumsulfat, 5% Isopropanol, 0,2 Natriumcitratpuffer pH = 5,0) mit einem Verhältnis von 1 : 1 auf siliconbeschichteten Deckgläschen gemischt. Diese Deckgläschen werden umgedreht und über Gefäßen abgedichtet, die 1 ml Stammlösung enthalten. Es erscheinen hexagonale Kristalle innerhalb von 12–24 Stunden mit der Größe von 0,2 mm × 0,2 mm × 0,6 mm.
Die Röntgenkristallographie der hexagonalen Kristalle zeigt eine Raumgruppe P622 und die folgenden Einheitszellenkostanten: a = b = 30,169 Å, c = 110,597 Å; α = β = 90°, γ = 120°.
Sequenzliste

Claims

Parathormon in kristalliner Form, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) und PTH(1-41).
Kristallines Hormon nach Anspruch 1, wobei das Hormon PTH(1-34) (SEQ ID Nr. 2) ist.
Kristallines Hormon nach Anspruch 2 in Form von tetragonalen Platten mit einer Raumgruppe P422 und der folgenden Einheitszellenkonstanten: a = b = 91,071 Å, c = 37,665 Å, α = β = γ = 90°.
Kristallines Hormon nach Anspruch 2 in kubisch kristalliner Form mit einer Raumgruppe P422 und der folgenden Einheitszellenkonstanten: a = b = 91,071 Å, c = 37,665 Å, α = β = γ = 90°.
Kristallines Hormon nach Anspruch 2 in hexagonal kristalliner Form mit einer Raumgruppe P622 und der folgenden Einheitszellenkonstanten: a = b = 30,169 Å, c = 110,597 Å, α = β = 90°, γ = 120°.
Verfahren zur Reinigung eines Parathormons, gekennzeichnet durch (a) Bereitstellung einer wäßrigen Lösung eines Parathormons, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) und PTH(1-41) mit einer Konzentration von 5 bis 40 mg pro ml, (b) Mischen der Lösung mit einer Stammlösung, die ein organisches Lösemittel mit einer Konzentration von 5 bis 50 Volumenprozent und einen Puffer mit einer Konzentration enthält, um den pH der Lösung zwischen 6,0 und 12,0 zu halten, und (c) Stehenlassen der Lösung für eine vorbestimmte Zeit bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 4°C bis sich plattenähnliche Kristalle bilden.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Hormon humanes PTH(1-34) ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das organische Lösemittel ein Vertreter ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Methanol, Ethanol, Isopropanol, Polyethylenglycol, Ethylenglycol und einem Gemisch hiervon.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Honnonkonzentration 5 bis 20 mg/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das organische Lösemittel in einer Konzentration von 10 bis 20 Volumenprozent vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die wäßrige Lösung und die Stammlösung in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt werden.
Verfahren zur Reinigung eines Parathormons, gekennzeichnet durch (a) Bereitstellung einer wäßrigen Lösung eines Parathormons, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) und PTH(1-41) mit einer Konzentration von 5 bis 40 mg/ml, (b) Mischen dieser Lösung mit einer Stammlösung, die ein Phosphat- oder Formiatfällungssalz mit einer Konzentration von 0,5 M bis 2,5 M und wahlweise eine wäßrige Pufferlösung oder ein Gemisch hiervon mit einer Konzentration enthält, um den pH zwischen 4,0 und 6,0 zu halten, und (c) Stehenlassen der Lösung für eine vorbestimmte Zeit zwischen Raumtemperatur und 4°C bis sich kubische Kristalle bilden.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das Hormon Humanes PTH(1-34) (SEQ ID Nr. 2) ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der Puffer ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Phosphaten, Formiaten, Acetaten, Tartraten und Gemischen hiervon.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Hormonkonzentration 5 bis 20 mg/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die wäßrige Hormonlösung und die Pufferlösung in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt werden.
Verfahren zur Reinigung eines Parathormons, gekennzeichnet durch: (a) Bereitstellung einer Lösung eines Parathormons, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PTH(1-34), PTH(1-37), PTH(1-38) und PTH(1-41) mit einer Konzentration von 5 bis 40 mg/ml in 10 bis 30 Volumenprozent Glycerin, (b) Mischen dieser Lösung mit einer Stammlösung, die ein organisches Lösemittel mit einer Konzentration von 5 bis 50 Volumenprozent, Ammoniumsulfat mit einer Konzentration von 0,5 M bis 3,0 M und einen Puffer mit einer Konzentration enthält, um den pH der Lösung zwischen 3,0 und 7,0 zu halten, und (c) Stehenlassen der Lösung für eine vorbestimmte Zeit bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 4°C bis sich hexagonale Kristalle bilden.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das Hormon humanes PTH(1-34) (SEQ ID Nr. 2) ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das organische Lösemittel ein Vertreter der Gruppe ist, die besteht aus Methanol, Ethanol, Isopropanol, Polyethylenglycol, Ethylenglycol und einem Gemisch hiervon.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Hormonkonzentration 5 bis 20 mg/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 17, worin der Puffer ein Citrat ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Hormonlösung und die Pufferlösung in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt werden.